熒光檢測(cè)儀的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種熒光檢測(cè)儀，包括激光合束模塊、共焦掃描模塊、光譜成像模塊、熒光顯微鏡和控制顯示模塊；激光合束模塊包括兩個(gè)近紅外光連續(xù)激光器、激光準(zhǔn)直鏡、反射鏡和合束鏡；共焦掃描模塊包括可相互切換的三個(gè)二色鏡、三個(gè)濾光片、掃描振鏡、掃描透鏡、針孔透鏡和針孔；光譜成像模塊包括分光棱鏡、聚焦鏡、三個(gè)狹縫及三個(gè)光電倍增管；熒光顯微鏡包括全反射棱鏡、筒鏡、顯微物鏡、納米位移臺(tái)和樣品臺(tái)；控制顯示模塊用于對(duì)激光器、掃描振鏡、光電倍增管和納米位移臺(tái)進(jìn)行控制及對(duì)圖像進(jìn)行顯示；所述熒光檢測(cè)儀可突破現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)深度低的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)厘米級(jí)的熒光檢測(cè)，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)熒光定位和組分分析兩種功能，在活體熒光檢測(cè)領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景。
【專利說明】熒光檢測(cè)儀
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及光譜技術(shù)應(yīng)用和生物醫(yī)學(xué)工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種用于小動(dòng)物活體熒光檢測(cè)的熒光檢測(cè)儀。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生物熒光成像技術(shù)的發(fā)展，越來越多的熒光檢測(cè)儀器被用于食品安全、工業(yè)檢測(cè)、藥物研發(fā)和疾病診斷等領(lǐng)域。由于受到熒光穿透深度的限制，目前的熒光檢測(cè)儀器大多是對(duì)被檢樣品表面成像。例如在熒光檢測(cè)中廣泛應(yīng)用的共聚焦顯微鏡，可以對(duì)被檢樣品進(jìn)行高分辨率的三維層切成像，同時(shí)結(jié)合光譜成像可以進(jìn)行樣品成分分析，但其檢測(cè)深度一般不超過200微米。
[0003]為了解決更深組織活體熒光的檢測(cè)問題，美國(guó)Bio-Rad公司于1997年推出了雙光子掃描顯微鏡。雙光子顯微鏡使用近紅外光激發(fā)熒光團(tuán)，一個(gè)熒光分子一次吸收兩個(gè)近紅外光光子，自發(fā)躍遷后輻射出頻率略小于兩倍入射光頻率的熒光光子，由于近紅外光在活體組織中具有更高的穿透深度和更低的散射，使得雙光子顯微鏡可在更深的組織內(nèi)成像。據(jù)最新報(bào)道，海外著名的顯微鏡技術(shù)和研究期刊《Microscopy and ananlysis》刊登了使用奧林巴斯FV1000-MPE多光子顯微鏡拍攝的小鼠腦片三維圖像樣品，成像深度達(dá)到4mm。目前，雙光子、多光子顯微鏡預(yù)示著深度組織活體熒光檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展方向，但是，這些檢測(cè)系統(tǒng)中超快脈沖近紅外連續(xù)激光器成本昂貴的問題，極大地限制了其應(yīng)用范圍；并且，由于熒光光子依然處于 可見光范圍，限制了檢測(cè)深度，因此仍難以滿足活體熒光檢測(cè)的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是:提出一種新型的熒光檢測(cè)儀，其采用近紅外連續(xù)激光激發(fā)，近紅外二區(qū)熒光檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)厘米級(jí)的熒光成像和光譜分析，便于應(yīng)用于小動(dòng)物的活體熒光檢測(cè)。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種熒光檢測(cè)儀，其包括:
[0006]激光合束模塊，其包括分別出射第一路近紅外激光和第二路近紅外激光的第一近紅外連續(xù)激光器和第二近紅外連續(xù)激光器、分別對(duì)所述第一路近紅外激光和所述第二路近紅外激光進(jìn)行準(zhǔn)直的第一激光準(zhǔn)直器和第二激光準(zhǔn)直器、對(duì)所述第一路近紅外激光進(jìn)行反射的反射鏡及對(duì)所述第一路近紅外激光與/或所述第二路近紅外激光進(jìn)行合束的合束鏡；
[0007]共焦掃描模塊，其包括第一二色鏡、第二二色鏡、第三二色鏡、第一濾光片、第二濾光片、第三濾光片、掃描振鏡、掃描透鏡、針孔透鏡及針孔，所述第一二色鏡、所述第二二色鏡及所述第三二色鏡與所述第一濾光片、所述第二濾光片及所述第三濾光片一一對(duì)應(yīng)；
[0008]光譜成像模塊，其包括分光棱鏡、聚焦鏡、第一狹縫、第二狹縫、第三狹縫、第一光電倍增管、第二光電倍增管及第三光電倍增管；
[0009]熒光顯微鏡，其包括全反射棱鏡、筒鏡、顯微物鏡、納米位移臺(tái)和用于放置樣品且設(shè)置于所述納米位移臺(tái)的樣品臺(tái)；[0010]用于對(duì)所述第一近紅外連續(xù)激光器、所述第二近紅外連續(xù)激光器、所述掃描振鏡、所述第一光電倍增管、所述第二光電倍增管、所述第三光電倍增管和所述納米位移臺(tái)進(jìn)行控制以及對(duì)圖像進(jìn)行顯示的控制顯示模塊；及
[0011]用于將經(jīng)過所述針孔的熒光匯聚準(zhǔn)直至所述分光棱鏡的準(zhǔn)直透鏡，其設(shè)置于所述針孔和所述分光棱鏡之間；[0012]所述第一二色鏡、所述第二二色鏡及所述第三二色鏡與所述第一濾光片、所述第二濾光片及所述第三濾光片根據(jù)所述第一近紅外連續(xù)激光器和所述第二近紅外連續(xù)激光器的開啟，由所述控制顯示模塊控制切換至三個(gè)不同的工作狀態(tài)；
[0013]第一種工作狀態(tài)時(shí)，所述第一二色鏡和所述第一濾光片處于所述第一路近紅外激光的光路中，所述第一路近紅外激光通過所述第一激光準(zhǔn)直鏡準(zhǔn)直為平行光束后，經(jīng)所述反射鏡和所述合束鏡后入射到所述第一二色鏡，被所述第一二色鏡反射到所述掃描振鏡形成掃描光束，經(jīng)過所述掃描透鏡、所述全反射棱鏡、所述筒鏡和所述顯微物鏡后聚焦到樣品上一點(diǎn)；樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)過相同光路返回至所述第一二色鏡，由所述第一二色鏡透射后經(jīng)所述第一濾光片濾除反射雜光后，經(jīng)過所述針孔透鏡聚焦到所述針孔；經(jīng)過所述準(zhǔn)直透鏡后匯聚準(zhǔn)直至所述分光棱鏡，經(jīng)所述分光棱鏡光譜分光后，經(jīng)所述聚焦鏡聚焦并射向所述第一狹縫；需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被所述第一狹縫透射后進(jìn)入所述第一光電倍增管，其他波段的熒光被反射到所述第二光電倍增管與/或所述第三光電倍增管；射向所述第二狹縫的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到所述第二光電倍增管；射向所述第三狹縫的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到所述第三光電倍增管；所述第一光電倍增管、所述第二光電倍增管和所述第三光電倍增管將接收到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并進(jìn)行放大，經(jīng)過積分放大電路后進(jìn)行采集；
[0014]第二種工作狀態(tài)時(shí)，所述第二二色鏡和所述第二濾光片處于所述第二路近紅外激光的光路中，所述第二路近紅外激光通過所述第二激光準(zhǔn)直鏡準(zhǔn)直為平行光束后，經(jīng)所述反射鏡和所述合束鏡后入射到所述第二二色鏡，被所述第二二色鏡反射到所述掃描振鏡形成掃描光束，經(jīng)過所述掃描透鏡、所述全反射棱鏡、所述筒鏡和所述顯微物鏡后聚焦到樣品上一點(diǎn)；樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)過相同光路返回至所述第二二色鏡，由所述第二二色鏡透射后經(jīng)所述第二濾光片濾除反射雜光后，經(jīng)過所述針孔透鏡聚焦到所述針孔；經(jīng)過所述準(zhǔn)直透鏡后匯聚準(zhǔn)直至所述分光棱鏡，經(jīng)所述分光棱鏡光譜分光后，經(jīng)所述聚焦鏡聚焦并射向所述第一狹縫；需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被所述第一狹縫透射后進(jìn)入到所述第一光電倍增管，其他波段的熒光被反射到所述第二光電倍增管與/或所述第三光電倍增管；射向所述第二狹縫的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到所述第二光電倍增管；射向所述第三狹縫的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到所述第三光電倍增管；所述第一光電倍增管、所述第二光電倍增管和所述第三光電倍增管將接收到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并進(jìn)行放大，經(jīng)過積分放大電路后進(jìn)行采集；
[0015]第三種工作狀態(tài)時(shí)，所述第三二色鏡和所述第三濾光片處于所述第一路近紅外激光和所述第二路近紅外激光的光路中，所述第一路近紅外激光通過所述第一激光準(zhǔn)直鏡準(zhǔn)直為平行光束后射向所述反射鏡，并被反射至所述合束鏡，所述第二路近紅外激光通過所述第二激光準(zhǔn)直器準(zhǔn)直為平行光束后射向所述合束鏡，所述第一路近紅外激光和所述第二路近紅外激光經(jīng)所述合束鏡后入射到所述第三二色鏡，被所述第三二色鏡反射到所述掃描振鏡形成掃描光束，經(jīng)過所述掃描透鏡、所述全反射棱鏡、所述筒鏡和所述顯微物鏡后聚焦到樣品上；樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)過相同光路返回至所述第三二色鏡，由所述第三二色鏡透射后經(jīng)所述第三濾光片濾除反射雜光后，經(jīng)過所述針孔透鏡聚焦到所述針孔；經(jīng)過所述準(zhǔn)直透鏡后匯聚準(zhǔn)直至所述分光棱鏡，經(jīng)所述分光棱鏡光譜分光后，經(jīng)所述聚焦鏡聚焦并射向所述第一狹縫；需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被所述第一狹縫透射后進(jìn)入到所述第一光電倍增管，其他波段的熒光被反射到所述第二光電倍增管與/或所述第三光電倍增管；射向所述第二狹縫的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到所述第二光電倍增管；射向所述第三狹縫的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到所述第三光電倍增管；所述第一光電倍增管、所述第二光電倍增管和所述第三光電倍增管將接收到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并進(jìn)行放大，經(jīng)過積分放大電路后進(jìn)行采集。
[0016]下面對(duì)上述技術(shù)方案進(jìn)一步解釋:
[0017]本發(fā)明一較佳實(shí)施方式中，所述第一近紅外連續(xù)激光器和所述第二近紅外連續(xù)激光器的波長(zhǎng)范圍為750nm~850nm。
[0018]本發(fā)明一較佳實(shí)施方式中，所述掃描透鏡的鍍膜使其在750nm~1600nm范圍具有較高的透射率。
[0019]本發(fā)明一較佳實(shí)施方式中，所述針孔透鏡的鍍膜使其在900nm~1600nm范圍具有較高的透射率。
[0020]本發(fā)明一較佳實(shí)施方式中，所述分光棱鏡的材料及鍍膜使其在900nm~1600nm范
圍具有較高的透射率。
[0021]本發(fā)明一較佳實(shí)施方式中，所述聚焦鏡的鍍膜使其在900nm~1600nm范圍具有較高的透射率。
`[0022]本發(fā)明一較佳實(shí)施方式中，所述顯微物鏡具有不低于Icm的工作距離，且其在750nm~1600nm范圍具有較高的透射率。
[0023]本發(fā)明一較佳實(shí)施方式中，所述納米位移臺(tái)在控制模塊的控制下可沿Z方向移動(dòng)。
[0024]本發(fā)明一較佳實(shí)施方式中，用于標(biāo)記所述樣品的熒光染料的激發(fā)波長(zhǎng)范圍為750nm~850nm，且在900nm~1600nm范圍具有較高的熒光發(fā)射效率。
[0025]本發(fā)明一較佳實(shí)施方式中，所述熒光檢測(cè)儀進(jìn)一步包括用于對(duì)所述第一近紅外連續(xù)激光器、所述第二近紅外連續(xù)激光器、所述掃描振鏡、所述第一光電倍增管、所述第二光電倍增管及所述第三光電倍增管供電的電源模塊，其電性連接于所述第一近紅外連續(xù)激光器、所述第二近紅外連續(xù)激光器、所述掃描振鏡、所述第一光電倍增管、所述第二光電倍增管及所述第三光電倍增管。
[0026]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0027]本發(fā)明提供的所述熒光檢測(cè)儀采用近紅外連續(xù)激光激發(fā)活體標(biāo)記樣品，近紅外二區(qū)熒光檢測(cè)，突破現(xiàn)有檢測(cè)手段檢測(cè)深度低的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)厘米級(jí)的熒光檢測(cè)；通過熒光成像和光譜成像相結(jié)合，同時(shí)實(shí)現(xiàn)熒光定位和組分分析兩種功能，在活體熒光檢測(cè)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】[0028]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的熒光檢測(cè)儀結(jié)構(gòu)示意圖；
[0029]圖2為圖1所示熒光檢測(cè)儀處于單激光單染料檢測(cè)工作方式時(shí)的第一種工作狀態(tài)示意圖；
[0030]圖3為圖1所示熒光檢測(cè)儀處于單激光單染料檢測(cè)工作方式時(shí)的第二種工作狀態(tài)示意圖；
[0031]圖4為圖1所示熒光檢測(cè)儀處于雙激光單染料檢測(cè)工作方式時(shí)的第三種工作狀態(tài)示意圖。
[0032]其中:10_熒光檢測(cè)儀，100-激光合束模塊，101-第一近紅外連續(xù)激光器，102-第二近紅外連續(xù)激光器，103-第一激光準(zhǔn)直鏡，104-第二激光準(zhǔn)直鏡，105-反射鏡，106-合束鏡，200-共焦掃描模塊，201-第一二色鏡1，202-第一濾光片，203-第二二色鏡，204-第二濾光片，205-第三二色鏡，206-第三濾光片，207-掃描振鏡，208-掃描透鏡，209-針孔透鏡，210-針孔，300-光譜成像模塊，301-分光棱鏡，302-聚焦鏡，303-第一狹縫，304-第二狹縫，305-第三狹縫，306-第一光電倍增管，307-第二光電倍增管，308-光電倍增管，400-熒光顯微鏡，401-全反射棱鏡，402-筒鏡，403-顯微物鏡，404-納米位移臺(tái)，405-樣品臺(tái)，500-控制顯示模塊，600-電源模塊，700-準(zhǔn)直透鏡，A-樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合附圖及具 體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0034]請(qǐng)參考圖1，本發(fā)明提供一種熒光檢測(cè)儀10，用于小動(dòng)物活體熒光檢測(cè)，其包括激光合束模塊100、共焦掃描模塊200、光譜成像模塊300、熒光顯微鏡400、控制顯示模塊500、電源模塊600及準(zhǔn)直透鏡700。
[0035]激光合束模塊100包括第一近紅外連續(xù)激光器101、第二近紅外連續(xù)激光器102、第一激光準(zhǔn)直鏡103、第二激光準(zhǔn)直鏡104、反射鏡105及合束鏡106。本實(shí)施例中，第一近紅外連續(xù)激光器101和第二近紅外連續(xù)激光器102分別出射第一路近紅外激光和第二路近紅外激光，用于對(duì)不同熒光染料標(biāo)記的樣品進(jìn)行有效激發(fā)，其波長(zhǎng)范圍為750nm~850nm。第一激光準(zhǔn)直鏡103和第二激光準(zhǔn)直鏡104分別用于將第一近紅外連續(xù)激光器101出射的第一路近紅外激光和第二近紅外連續(xù)激光器102出射的第二路近紅外激光準(zhǔn)直為需要大小的光斑。反射鏡105用于對(duì)第一近紅外連續(xù)激光器101出射的第一路近紅外激光進(jìn)行合束，其對(duì)第一路近紅外激光具有較高的反射率。合束鏡106用于對(duì)第二近紅外連續(xù)激光器102出射的第二路近紅外激光進(jìn)行合束，其對(duì)第一路近紅外激光具有較高的透射率，對(duì)第二近紅外激光具有較高的反射率。
[0036]本實(shí)施例中，第一近紅外連續(xù)激光器101和第二近紅外連續(xù)激光器102單獨(dú)開啟或者同時(shí)開啟時(shí)，熒光檢測(cè)儀10對(duì)應(yīng)著不同的工作方式，具體地，第一近紅外連續(xù)激光器101和第二近紅外連續(xù)激光器102單獨(dú)開啟時(shí)，熒光檢測(cè)儀10處于單激光單染料檢測(cè)的工作方式，第一近紅外連續(xù)激光器101和第二近紅外連續(xù)激光器102同時(shí)開啟時(shí)，熒光檢測(cè)儀10處于雙激光雙染料檢測(cè)的工作方式。
[0037]共焦掃描模塊200包括第一二色鏡201、第一濾光片202、第二二色鏡203、第二濾光片204、第三二色鏡205、第三濾光片206、掃描振鏡207、掃描透鏡208、針孔透鏡209和針孔210。所述第一二色鏡201、所述第二二色鏡203及所述第三二色鏡205與所述第一濾光片202、所述第二濾光片204及所述第三濾光片206 對(duì)應(yīng)。第一二色鏡201、第二二色鏡203和第三二色鏡205均用于對(duì)激光和突光進(jìn)行分束,其中，第一二色鏡201對(duì)第一路近紅外激光有較高的反射率，對(duì)熒光有較高的透射率；第二二色鏡203對(duì)第二路近紅外激光有較高的反射率，對(duì)熒光有較高的透射率；第三二色鏡205對(duì)第一路近紅外激光和第二路近紅外激光都有較高的反射率，對(duì)熒光有較高的透射率。第一濾光片202對(duì)第一路近紅外激光具有很高的截止率，對(duì)熒光有較高的透射率；第二濾光片204對(duì)第二路近紅外激光具有很高的截止率，對(duì)熒光有較高的透射率；第三濾光片206對(duì)第一路近紅外激光和第二路近紅外激光都有很高的截止率，對(duì)熒光有較高的透射率。掃描振鏡207用于形成掃描光束，通過控制掃描振鏡207在XY方向的擺動(dòng)，達(dá)到激光在樣品A上一定范圍內(nèi)的熒光激發(fā)，本實(shí)施例中，掃描振鏡207用于將第一路近紅外激光與/或第二路近紅外激光形成掃描光束。掃描透鏡208用于校正光束大視場(chǎng)角下的畸變,使得掃描振鏡207形成的掃描光束的掃描位置與掃描角度形成線性關(guān)系，本實(shí)施例中，掃描透鏡206的鍍膜保證在750nm~1600nm范圍有較高的透射率。針孔透鏡209用于將熒光聚焦于針孔210，本實(shí)施例中，針孔透鏡29的鍍膜保證在900nm~1600nm范圍有較高的透射率。針孔210用于熒光的空間濾波，從而使得只有樣品A上與針孔210共軛位置的熒光成像，從而可以有效提高橫向和切向分辨率。
[0038]本實(shí)施例中，第一二色鏡201和第一濾光片202對(duì)應(yīng)第一路近紅外激光,第二二色鏡203和第二濾光片204對(duì)應(yīng)第二路近紅外激光，第三二色鏡205和第三濾光片206同時(shí)對(duì)應(yīng)第一路近紅外激光和第二路近紅外激光。第一二色鏡201、第二二色鏡203和第三二色鏡
205之間根據(jù)所需的工作方式(單激光單染料檢測(cè)和雙激光雙染料檢測(cè))由所述控制顯示模塊500控制進(jìn)行切換，第一濾光片202、第二濾光片204和第三濾光片206之間相應(yīng)地由所述控制顯示模塊500控制進(jìn)行切換。具體地，熒光檢測(cè)儀10處于單激光單染料檢測(cè)的工作方式時(shí):如單獨(dú)開啟第一近紅外連續(xù)激光器101，則相應(yīng)地切換第一二色鏡201和第一濾光片202至工作狀態(tài)，使第一二色鏡201和第一濾光片202處于第一近紅外激光的光路中；如單獨(dú)開啟第二近紅外連續(xù)激光器102，則相應(yīng)地或者切換第二二色鏡203和第二濾光片204至工作狀態(tài)，使第二二色鏡203和第二濾光片204處于第二近紅外激光的光路中。熒光檢測(cè)儀10處于雙激光單染料檢測(cè)的工作方式時(shí):同時(shí)開啟第一近紅外連續(xù)激光器101和第二近紅外連續(xù)激光器102，此時(shí)相應(yīng)地切換第三二色鏡205和第三濾光片206至工作狀態(tài)，使第三二色鏡205和第三濾光片206處于第一路近紅外激光和第二近紅外激光的光路中。
[0039]光譜成像模塊300包括分光棱鏡301、聚焦鏡302、第一狹縫303、第二狹縫304、第三狹縫305、第一光電倍增管306、第二光電倍增管307及光電倍增管308。分光棱鏡301用于熒光的光譜分光，本實(shí)施例中，分光棱鏡301的材料及鍍膜保證在900nm~1600nm范圍有較高的透射率。聚焦鏡302用于將熒光聚焦于第一光電倍增管306的感光面，本實(shí)施例中，聚焦鏡302的鍍膜保證在900nm~1600nm范圍有較高的透射率。第一狹縫303用于將需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光透射到第一光電倍增管306，并將其他波段的熒光反射到第二光電倍增管307與/或第三光電倍增管308。第二狹縫304用于將需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光透射到第二光電倍增管307。第三狹縫305用于將需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光透射到第三光 電倍增管308。第一光電倍增管306、第二光電倍增管307及第三光電倍增管308均用于將接收到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并進(jìn)行放大，經(jīng)過積分放大電路(圖未示)后進(jìn)行米集。[0040]熒光顯微鏡400包括全反射棱鏡401、筒鏡402、顯微物鏡403、納米位移臺(tái)404和樣品臺(tái)405。全反射棱鏡401用于轉(zhuǎn)折光路，其對(duì)激光和熒光均具有較高反射率。筒鏡402用于和顯微物鏡403配合成像。顯微物鏡403用于將激光聚焦于樣品A，本實(shí)施例中，顯微物鏡403具有不低于Icm的工作距離，且在750nm~1600nm范圍有較高的透射率。納米位移臺(tái)404在控制顯示模塊500的控制下可沿Z方向高精度地移動(dòng)。樣品臺(tái)405用于固定小動(dòng)物活體樣品A，以便進(jìn)行熒光檢測(cè)，本實(shí)施例中，樣品臺(tái)405設(shè)置于納米位移臺(tái)404上。
[0041]可以理解的是，控制顯示模塊500結(jié)合納米位移臺(tái)404的位置坐標(biāo)和第一光電倍增管306、第二光電倍增管307及第三光電倍增管308產(chǎn)生的電信號(hào)，可以生成樣品A的二維和三維熒光圖像。 [0042]本實(shí)施例中，用于標(biāo)記小動(dòng)物樣品A的熒光染料的激發(fā)波長(zhǎng)在750nm~850nm范圍，且在900nm~1600nm范圍具有較高的熒光發(fā)射效率，具有很好的生物相容性。
[0043]控制顯示模塊500用于對(duì)第一近紅外連續(xù)激光器101、第二近紅外連續(xù)激光器102、掃描振鏡207、第一光電倍增管306、第二光電倍增管307、第三光電倍增管308和納米位移臺(tái)404進(jìn)行控制以及對(duì)圖像進(jìn)行顯示。本實(shí)施例中，控制顯示模塊500電性連接于第一近紅外連續(xù)激光器101、第二近紅外連續(xù)激光器102、掃描振鏡207、第一光電倍增管306、第二光電倍增管307、第三光電倍增管308和納米位移臺(tái)404。
[0044]可以理解的是，控制顯示模塊500可以具有一個(gè)控制單元及一個(gè)顯示單元，其中控制單元可以為計(jì)算機(jī)，顯示單元可以為顯示屏。
[0045]電源模塊600用于為第一近紅外連續(xù)激光器101、第二近紅外連續(xù)激光器102、掃描振鏡207、第一光電倍增管306、第二光電倍增管307及第三光電倍增管308供電，以提供第一近紅外連續(xù)激光器101、第二近紅外連續(xù)激光器102、掃描振鏡207、第一光電倍增管306、第二光電倍增管307及第三光電倍增管308正常工作的電壓。本實(shí)施例中，電源模塊600電性連接于第一近紅外連續(xù)激光器101、第二近紅外連續(xù)激光器102、掃描振鏡207、第一光電倍增管306、第二光電倍增管307及第三光電倍增管308。
[0046]可以理解的是，控制顯示模塊500和電源模塊600均電性連接于第一二色鏡201、第一濾光片202、第二二色鏡203、第二濾光片204、第三二色鏡205及第三濾光片206，以實(shí)現(xiàn)不同工作方式之間進(jìn)行切換時(shí)的控制及所需工作電源。
[0047]準(zhǔn)直透鏡700設(shè)置于共焦掃描模塊200和光譜成像模塊300之間，用于將經(jīng)過共焦掃描模塊200的熒光匯聚準(zhǔn)直至光譜成像模塊300中的分光棱鏡301。具體地，準(zhǔn)直透鏡700將經(jīng)過針孔210的熒光匯聚準(zhǔn)直至所述分光棱鏡301，其設(shè)置于所述針孔210和所述分光棱鏡301之間。
[0048]實(shí)施例
[0049]本發(fā)明提出的熒光檢測(cè)儀10包括兩種工作方式:單激光單染料檢測(cè)和雙激光雙染料檢測(cè)?？梢岳斫獾氖?，熒光檢測(cè)儀10的兩種工作方式包含了三種工作狀態(tài)，即:單獨(dú)開啟第一近紅外連續(xù)激光器101時(shí)的第一種工作狀態(tài)、單獨(dú)開啟第二近紅外連續(xù)激光器102時(shí)的第二種工作狀態(tài)、以及同時(shí)開啟第一近紅外連續(xù)激光器101和第二近紅外連續(xù)激光器102時(shí)的第三種工作狀態(tài)。
[0050]請(qǐng)參閱圖2，在單激光單染料工作方式下，以第一路近紅外激光為例，即單獨(dú)開啟第一近紅外連續(xù)激光器101,此時(shí),通過控制顯不模塊500控制切換第一二色鏡201和第一濾光片202至工作狀態(tài),使第一二色鏡201和第一濾光片202處于第一路近紅外激光的光路中。本實(shí)施例中，第一近紅外連續(xù)激光器101采用808nm近紅外連續(xù)激光器，激光(即第一路近紅外激光)通過第一激光準(zhǔn)直鏡103后準(zhǔn)直為直徑2_的平行光束，經(jīng)反射鏡105和合束鏡106后入射到第一二色鏡201,第一二色鏡201將激光反射到掃描振鏡207,形成掃描光束，經(jīng)過掃描透鏡208、全反射棱鏡401、筒鏡402和顯微物鏡403后聚焦到樣品A上一點(diǎn)；樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)過相同光路返回至第一二色鏡201，由第一二色鏡201透射后經(jīng)第一濾光片202濾除反射雜光，經(jīng)過針孔透鏡209聚焦到針孔210 ;經(jīng)過準(zhǔn)直透鏡700后匯聚準(zhǔn)直至分光棱鏡301，被分光棱鏡301光譜分光后，經(jīng)聚焦鏡302聚焦并射向第一狹縫303 ；需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被第一狹縫303透射后進(jìn)入到第一光電倍增管306，其他波段的熒光被反射到第二光電倍增管307與/或第三光電倍增管308 ;射向第二狹縫304的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到第二光電倍增管307;射向第三狹縫305的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到第三光電倍增管308 ;第一光電倍增管306、第二光電倍增管307和第三光電倍增管308將接收到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并進(jìn)行放大，經(jīng)過積分放大電路后進(jìn)行采集。由此，即可實(shí)現(xiàn)第一種熒光染料標(biāo)記樣品A的檢測(cè)。
[0051]本實(shí)施例中，針孔210與照明光點(diǎn)、樣品A聚焦點(diǎn)處于共軛位置，使得只有聚焦點(diǎn)位置的熒光能夠成像，實(shí)現(xiàn)了點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的成像。掃描振鏡207在XY方向擺動(dòng)達(dá)到樣品A —定范圍內(nèi)的二維成像，納米位移臺(tái)404沿Z軸高精度移動(dòng)形成樣品A不同層面的二維熒光圖像，最終通過圖像重建完成樣品A的三維熒光檢測(cè)。由于針孔210的空間濾波作用，有效地提高了橫向和縱向的檢測(cè)精度。針孔210后的光譜成像模塊300采用分光棱鏡301進(jìn)行分光，共分成三路，通過狹縫(第一狹縫303、第二狹縫304和第三狹縫305)移動(dòng)的方法來實(shí)現(xiàn)不同譜段熒光的選擇，探測(cè)熒光信號(hào)的探測(cè)器采用光電倍增管(第一光電倍增管306、第二光電倍增管307及第三光電倍增管308)。
[0052]請(qǐng)參閱圖3，可以理解的是，單獨(dú)開`啟第二近紅外連續(xù)激光器102時(shí)，關(guān)閉第一近紅外連續(xù)激光器101，此時(shí)通過控制顯示模塊500切換第二二色鏡203和第二濾光片204至工作狀態(tài)，使第二二色鏡203和第二濾光片204處于第二路近紅外激光的光路中，即可實(shí)現(xiàn)第二種熒光染料標(biāo)記樣品A的檢測(cè)。
[0053]請(qǐng)參閱圖4，在雙激光雙染料工作方式下，第一近紅外連續(xù)激光器101和第二近紅外連續(xù)激光器102同時(shí)開啟，通過控制顯示模塊500切換第三二色鏡205和第三濾光片
206至工作狀態(tài),使第三二色鏡205和第三濾光片206處于第一路近紅外激光和第二近紅外激光的光路中，第一路近紅外激光通過第一激光準(zhǔn)直鏡103準(zhǔn)直為平行光束后射向反射鏡105，被反光鏡105反射至合束鏡106 ;第二路近紅外激光通過第二激光準(zhǔn)直器104準(zhǔn)直為平行光束后射向合束鏡106 ;第一路近紅外激光和第二路近紅外激光經(jīng)合束鏡106后入射到第三二色鏡205，被第三二色鏡205反射到掃描振鏡207形成掃描光束；經(jīng)過掃描透鏡208、全反射棱鏡401、筒鏡402和顯微物鏡403后聚焦到樣品A上；樣品A激發(fā)出的熒光經(jīng)過相同光路返回至第三二色鏡205，由第三二色鏡205透射后經(jīng)第三濾光片206濾除反射雜光后，經(jīng)過針孔透鏡209聚焦到針孔210 ;經(jīng)過準(zhǔn)直透鏡700后匯聚準(zhǔn)直至分光棱鏡301，經(jīng)分光棱鏡301光譜分光后，經(jīng)聚焦鏡302聚焦并射向第一狹縫303 ;需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被第一狹縫303透射后進(jìn)入到第一光電倍增管306，其他波段的熒光被反射到第二光電倍增管307與/或所述第三光電倍增管308 ;射向第二狹縫304的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到第二光電倍增管307 ;射向第三狹縫305的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到第三光電倍增管308 ;第一光電倍增管306、第二光電倍增管307和第三光電倍增管308將接收到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并進(jìn)行放大，經(jīng)過積分放大電路后進(jìn)行采集。由此，即可實(shí)現(xiàn)兩種不同熒光染料標(biāo)記樣品A的同時(shí)檢測(cè)。
[0054]所述熒光檢測(cè)儀10采用近紅外連續(xù)激光激發(fā)活體標(biāo)記樣品A，近紅外二區(qū)熒光檢測(cè)，突破現(xiàn)有檢測(cè)手段檢測(cè)深度低的缺點(diǎn)，實(shí)可現(xiàn)厘米級(jí)的熒光檢測(cè)；通過熒光成像和光譜成像相結(jié)合，同時(shí)實(shí)現(xiàn)熒光定位和組分分析兩種功能，在活體熒光檢測(cè)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。[0055]當(dāng)然本發(fā)明的熒光檢測(cè)儀還可具有多種變換及改型，并不局限于上述實(shí)施方式的具體結(jié)構(gòu)?？傊?，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)包括那些對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的變換或替代以及改型。
【權(quán)利要求】
1.一種突光檢測(cè)儀，其特征在于，包括: 激光合束模塊，其包括分別出射第一路近紅外激光和第二路近紅外激光的第一近紅外連續(xù)激光器和第二近紅外連續(xù)激光器、分別對(duì)所述第一路近紅外激光和所述第二路近紅外激光進(jìn)行準(zhǔn)直的第一激光準(zhǔn)直器和第二激光準(zhǔn)直器、對(duì)所述第一路近紅外激光進(jìn)行反射的反射鏡及對(duì)所述第一路近紅外激光與/或所述第二路近紅外激光進(jìn)行合束的合束鏡；共焦掃描模塊，其包括第一二色鏡、第二二色鏡、第三二色鏡、第一濾光片、第二濾光片、第三濾光片、掃描振鏡、掃描透鏡、針孔透鏡及針孔，所述第一二色鏡、所述第二二色鏡及所述第三二色鏡與所述第一濾光片、所述第二濾光片及所述第三濾光片一一對(duì)應(yīng)； 光譜成像模塊，其包括分光棱鏡、聚焦鏡、第一狹縫、第二狹縫、第三狹縫、第一光電倍增管、第二光電倍增管及第三光電倍增管； 熒光顯微鏡，其包括全反射棱鏡、筒鏡、顯微物鏡、納米位移臺(tái)和用于放置樣品且設(shè)置于所述納米位移臺(tái)的樣品臺(tái)； 用于對(duì)所述第一近紅外連續(xù)激光器、所述第二近紅外連續(xù)激光器、所述掃描振鏡、所述第一光電倍增管、所述第二光電倍增管、所述第三光電倍增管和所述納米位移臺(tái)進(jìn)行控制以及對(duì)圖像進(jìn)行顯示的控制顯示模塊；及 用于將經(jīng)過所述針孔的熒光匯聚準(zhǔn)直至所述分光棱鏡的準(zhǔn)直透鏡，其設(shè)置于所述針孔和所述分光棱鏡之間； 所述第一二色鏡、所述第二二色鏡及所述第三二色鏡與所述第一濾光片、所述第二濾光片及所述第三濾光片根據(jù)所述第一近紅外連續(xù)激光器和所述第二近紅外連續(xù)激光器的開啟，由所述控制顯示模塊控制切換至三個(gè)不同的工作狀態(tài)； 第一種工作狀態(tài)時(shí)，所述第一二色鏡和所述第一濾光片處于所述第一路近紅外激光的光路中，所述第一路近紅外激光通過`所述第一激光準(zhǔn)直鏡準(zhǔn)直為平行光束后，經(jīng)所述反射鏡和所述合束鏡后入射到所述第一二色鏡，被所述第一二色鏡反射到所述掃描振鏡形成掃描光束，經(jīng)過所述掃描透鏡、所述全反射棱鏡、所述筒鏡和所述顯微物鏡后聚焦到樣品上一點(diǎn)；樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)過相同光路返回至所述第一二色鏡，由所述第一二色鏡透射后經(jīng)所述第一濾光片濾除反射雜光后，經(jīng)過所述針孔透鏡聚焦到所述針孔；經(jīng)過所述準(zhǔn)直透鏡后匯聚準(zhǔn)直至所述分光棱鏡，經(jīng)所述分光棱鏡光譜分光后，經(jīng)所述聚焦鏡聚焦并射向所述第一狹縫；需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被所述第一狹縫透射后進(jìn)入所述第一光電倍增管，其他波段的熒光被反射到所述第二光電倍增管與/或所述第三光電倍增管；射向所述第二狹縫的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到所述第二光電倍增管；射向所述第三狹縫的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到所述第三光電倍增管；所述第一光電倍增管、所述第二光電倍增管和所述第三光電倍增管將接收到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并進(jìn)行放大，經(jīng)過積分放大電路后進(jìn)行采集； 第二種工作狀態(tài)時(shí)，所述第二二色鏡和所述第二濾光片處于所述第二路近紅外激光的光路中，所述第二路近紅外激光通過所述第二激光準(zhǔn)直鏡準(zhǔn)直為平行光束后，經(jīng)所述反射鏡和所述合束鏡后入射到所述第二二色鏡，被所述第二二色鏡反射到所述掃描振鏡形成掃描光束，經(jīng)過所述掃描透鏡、所述全反射棱鏡、所述筒鏡和所述顯微物鏡后聚焦到樣品上一點(diǎn)；樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)過相同光路返回至所述第二二色鏡，由所述第二二色鏡透射后經(jīng)所述第二濾光片濾除反射雜光后，經(jīng)過所述針孔透鏡聚焦到所述針孔；經(jīng)過所述準(zhǔn)直透鏡后匯聚準(zhǔn)直至所述分光棱鏡，經(jīng)所述分光棱鏡光譜分光后，經(jīng)所述聚焦鏡聚焦并射向所述第一狹縫；需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被所述第一狹縫透射后進(jìn)入到所述第一光電倍增管，其他波段的熒光被反射到所述第二光電倍增管與/或所述第三光電倍增管；射向所述第二狹縫的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到所述第二光電倍增管；射向所述第三狹縫的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到所述第三光電倍增管；所述第一光電倍增管、所述第二光電倍增管和所述第三光電倍增管將接收到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并進(jìn)行放大，經(jīng)過積分放大電路后進(jìn)行采集； 第三種工作狀態(tài)時(shí)，所述第三二色鏡和所述第三濾光片處于所述第一路近紅外激光和所述第二路近紅外激光的光路中，所述第一路近紅外激光通過所述第一激光準(zhǔn)直鏡準(zhǔn)直為平行光束后射向所述反射鏡，并被反射至所述合束鏡，所述第二路近紅外激光通過所述第二激光準(zhǔn)直器準(zhǔn)直為平行光束后射向所述合束鏡，所述第一路近紅外激光和所述第二路近紅外激光經(jīng)所述合束鏡后入射到所述第三二色鏡，被所述第三二色鏡反射到所述掃描振鏡形成掃描光束，經(jīng)過所述掃描透鏡、所述全反射棱鏡、所述筒鏡和所述顯微物鏡后聚焦到樣品上；樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)過相同光路返回至所述第三二色鏡，由所述第三二色鏡透射后經(jīng)所述第三濾光片濾除反射雜光后，經(jīng)過所述針孔透鏡聚焦到所述針孔；經(jīng)過所述準(zhǔn)直透鏡后匯聚準(zhǔn)直至所述分光棱鏡，經(jīng)所述分光棱鏡光譜分光后，經(jīng)所述聚焦鏡聚焦并射向所述第一狹縫；需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被所述第一狹縫透射后進(jìn)入到所述第一光電倍增管，其他波段的熒光被反射到所述第二光電倍增管與/或所述第三光電倍增管；射向所述第二狹縫的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到所述第二光電倍增管；射向所述第三狹縫的熒光中，需要檢測(cè)的波段范圍內(nèi)的熒光被透射后進(jìn)入到所述第三光電倍增管；所述第一光電倍增管、所述第二光電倍增管和所述第三光電倍增管將接收到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并進(jìn)行放大，經(jīng)過積分放大電路后進(jìn)行采集。
2.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)儀，其特征在于，所述第一近紅外連續(xù)激光器和所述第二近紅外連續(xù)激光器的波 長(zhǎng)范圍為750nm~850nm。
3.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)儀，其特征在于，所述掃描透鏡的鍍膜使其在750nm~1600nm范圍具有較高的透射率。
4.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)儀，其特征在于，所述針孔透鏡的鍍膜使其在900nm~1600nm范圍具有較高的透射率。
5.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)儀，其特征在于，所述分光棱鏡的材料及鍍膜使其在900nm~1600nm范圍具有較高的透射率。
6.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)儀，其特征在于，所述聚焦鏡的鍍膜使其在900nm~1600nm范圍具有較高的透射率。
7.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)儀，其特征在于，所述顯微物鏡具有不低于Icm的工作距離，且其在750nm~1600nm范圍具有較高的透射率。
8.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)儀，其特征在于，所述納米位移臺(tái)在控制模塊的控制下可沿Z方向移動(dòng)。
9.如權(quán)利要求 1所述的熒光檢測(cè)儀，其特征在于，用于標(biāo)記所述樣品的熒光染料的激發(fā)波長(zhǎng)范圍為750nm~850nm，且在900nm~1600nm范圍具有較高的熒光發(fā)射效率。
10.如權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)儀，其特征在于，進(jìn)一步包括用于對(duì)所述第一近紅外連續(xù)激光器、所述第二近紅外連續(xù)激光器、所述掃描振鏡、所述第一光電倍增管、所述第二光電倍增管及所述第三光電倍增管供電的電源模塊，其電性連接于所述第一近紅外連續(xù)激光器、所述第二近紅外連續(xù)激光器、所述掃描振鏡、所述第一光電倍增管、所述第二光電倍增管及所述第三光電倍增管 。
【文檔編號(hào)】A61B5/00GK103735249SQ201310737650
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】張欣, 張運(yùn)海 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所