布魯氏菌的非編碼小rna分子bsr0601及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明布魯氏菌的非編碼小RNA分子BSR0601及其應用，提供了一個來源于布魯氏菌的非編碼小RNA分子BSR0601。Northern?blot實驗證實了BSR0601與布魯氏菌的胞內(nèi)生存相關(guān)。通過構(gòu)建BSR0601的缺失突變株和過表達株，表明BSR0601過表達以后，布魯氏菌在模擬巨噬細胞內(nèi)環(huán)境的壓力條件下的生存能力明顯減弱，而且在小鼠體內(nèi)的生存能力也下降，還表明BSR0601與布魯氏菌的毒力相關(guān)，BSR0601過表達以后，布魯氏菌的毒力減弱。因此，可以BSR0601過表達載體為活性成分制備抗布魯氏菌藥物。本發(fā)明將在布魯氏菌病的預防和治療中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。
【專利說明】布魯氏菌的非編碼小RNA分子BSR0601及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細菌非編碼小RNA (small non-coding RNA, sRNA),特別是涉及一個來源于布魯氏菌的非編碼小RNA分子BSR0601及其功能鑒定與應用。
【背景技術(shù)】
[0002]細菌非編碼小RNA (small non-coding RNA，sRNA)是近年來在細菌等原核生物中發(fā)現(xiàn)的一類RNA調(diào)控子，它們不編碼蛋白質(zhì)，通常位于基因間區(qū)，長度在50~500個核苷酸之間，廣泛參與體內(nèi)多種生命活動的調(diào)控。細菌sRNA是細菌代謝、毒力和適應環(huán)境壓力的重要調(diào)節(jié)因子，在應對環(huán)境變化的基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用。sRNA主要通過堿基配對與靶標mRNA結(jié)合來發(fā)揮生物調(diào)控作用。迄今為止，大部分細菌sRNA的研究集中在大腸桿菌等模式生物，但隨著研究的深入，已有越來越多的研究轉(zhuǎn)向致病菌，如霍亂弧菌、產(chǎn)單核細胞李斯特菌、銅綠假單胞菌、結(jié)核桿菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌等。在這些病原菌中，已經(jīng)證實sRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，并在壓力應答和毒力調(diào)控中發(fā)揮重要作用。
[0003]布魯氏菌病是由布魯氏菌入侵機體引起的人畜共患傳染病，在我國廣泛流行，不僅給我國畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失，也嚴重威脅人民的健康生活，是一個重要的公共衛(wèi)生問題。布魯氏菌是胞內(nèi)寄生菌，主要寄生于機體的單核細胞(主要是巨噬細胞)內(nèi)，胞內(nèi)生存和復制是布魯氏菌致病的關(guān)鍵，而適應胞內(nèi)的環(huán)境又是布魯氏菌實現(xiàn)胞內(nèi)生存的關(guān)鍵。因此，了解布魯氏菌如何適應胞內(nèi)的惡劣環(huán)境并在其中生存對于理解布魯氏菌的致病機理至關(guān)重要。由于sRNA是細菌適應環(huán)境壓力的重要調(diào)節(jié)因子，發(fā)明人推測識別布魯氏菌的sRNA并對其功能進行研 究將有助于理解布魯氏菌的致病機理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個目的是提供一個與布魯氏菌的胞內(nèi)生存和毒力相關(guān)的來源于布魯氏菌的非編碼小RNA分子。
[0005]本發(fā)明所提供的來源于布魯氏菌的非編碼小RNA分子(small non-coding RNA,sRNA)，命名為BSR0601，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，或與序列表中SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并與布魯氏菌毒力和生存能力相關(guān)的核苷酸序列，或為序列表中SEQ IDNO:1所示核苷酸序列經(jīng)硫代修飾或/和甲氧基修飾得到的核苷酸序列。
[0006]BSR0601缺失突變載體和BSR0601過表達載體也屬于本
【發(fā)明內(nèi)容】
。
[0007]所述BSR0601缺失突變載體具體可為BSR0601-NC-T，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2 所示。
[0008]所述BSR0601過表達載體具體可為BSR0601-MCS，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO:3 所示。
[0009]轉(zhuǎn)化有BSR0601缺失突變載體的布魯氏菌BSR0601缺失突變株和轉(zhuǎn)化有BSR0601過表達載體的布魯氏菌BSR0601過表達株也屬于本
【發(fā)明內(nèi)容】
。
[0010]以布魯氏菌(Brucella melitensis)16M為出發(fā)菌株,構(gòu)建的BSR0601缺失突變株為 16MABSR0601。
[0011]以布魯氏菌(Brucella melitensis)16M為出發(fā)菌株,構(gòu)建的BSR0601過表達株為16M-BSR0601。
[0012]BSR0601過表達后布魯氏菌的毒力和生存能力減弱，因此，可以BSR0601過表達載體為活性成分制備抗布魯氏菌藥物。
[0013]因此，非編碼小RNA分子BSR0601在與布魯氏菌的胞內(nèi)生存和/或毒力相關(guān)的研究試劑或藥用產(chǎn)品(如，抗布魯氏菌藥物)制備中的應用也屬于本
【發(fā)明內(nèi)容】
。
[0014]本發(fā)明用生物信息學的方法從布魯氏菌(Brucella melitensis) 16M的染色體序列龐雜的信息中預測和分析出一個與布魯氏菌的胞內(nèi)生存和毒力相關(guān)的布魯氏菌非編碼小RNA BSR0601。Northern blot實驗證實了 BSR0601與布魯氏菌的胞內(nèi)生存相關(guān)。通過構(gòu)建BSR0601的布魯氏菌缺失突變株和過表達株，對BSR0601的功能進行了分析，實驗結(jié)果表明:BSR0601過表達以后，布魯氏菌在模擬巨噬細胞內(nèi)環(huán)境的壓力條件下的生存能力明顯減弱；此外，BSR0601還與布魯氏菌的毒力相關(guān)，BSR0601過表達以后，布魯氏菌的毒力減弱。因此，可以BSR0601過表達載體為活性成分制備抗布魯氏菌藥物。本發(fā)明將在布魯氏菌病的預防和治療中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。
[0015]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為BSR0601在布魯氏菌(Brucella melitensis) 16M不同生長時期表達情況的Northern blot檢測結(jié)果
[0017]圖2為BSR0601在酸、熱、營養(yǎng)缺乏、氧化應激等模擬巨噬細胞內(nèi)環(huán)境的不同應激條件下的轉(zhuǎn)錄情況
[0018]圖3A為BSR0601缺失突變載體BSR0601-NC-T的物理圖譜
[0019]圖3B為BSR0601過表達載體BSR0601-MCS的物理圖譜
[0020]圖 4 為 BSR0601 突變株 16M Δ BSR0601 和 BSR0601 過表達株 16M-BSR0601 的 RT-PCR
鑒定結(jié)果
[0021]圖5 為 BSR0601 突變株 16M Δ BSR0601 和 BSR0601 過表達株 16M-BSR0601 在模擬巨噬細胞內(nèi)環(huán)境的壓力條件下的生存能力分析結(jié)果
[0022]圖6 為 BSR0601 突變株 16M Δ BSR0601 和 BSR0601 過表達株 16M-BSR0601 的小鼠
毒力競爭實驗結(jié)果
【具體實施方式】
[0023]在了解布魯氏菌如何適應胞內(nèi)的惡劣環(huán)境及其致病機理中，基于sRNA是細菌適應環(huán)境壓力的重要調(diào)節(jié)因子，發(fā)明人推測sRNA應該在布魯氏菌的胞內(nèi)生存和毒力中發(fā)揮一定的作用。鑒于此，發(fā)明人用生物信息學的方法從布魯氏菌(Brucella melitensis) 16M的染色體序列龐雜的信息中找到一個與布魯氏菌的胞內(nèi)生存和毒力相關(guān)的布魯氏菌非編碼小RNA BSR0601。本發(fā)明對布魯氏菌的sRNA BSR0601進行了鑒定及相關(guān)功能分析，并最終確定了
【發(fā)明內(nèi)容】
，以下詳述。
[0024]本發(fā)明中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見“〈MolecularCloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David ff.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd edition,2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0025]所述百分比濃度如無特別說明均為質(zhì)量/質(zhì)量(W/W)百分比濃度、質(zhì)量/體積(W/V，單位g/100mL)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。
[0026]實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發(fā)明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用。
[0027]所用引物和探針由大連寶生物公司合成，質(zhì)粒由上海生工生物工程有限公司合成。
[0028]實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，實施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1、獲得布魯氏菌的非編碼小RNA分子BSR0601的序列
[0029]從NCBI(ftp://ftp.ncb1.nih.gov/genomes/Bacteria/)下載布魯氏菌(Brucellamelitensis)16M的染色體序列(NC_003317.1和NC_003318.1兩條染色體，命名為I和II)，從下載的序列中提取基因間區(qū)(指的是兩個開放閱讀框之間的序列)片段。在基因間區(qū)用pftools2.3(http://www.1srec.1sb-sib.ch/ftp-server/pftools/)尋找啟動子(cut-off(閾值)值取255 (對啟動子的尋找設(shè)定一個限制條件)，用RNAMotif尋找終止子，其中的motif descriptor (主題描述符,作用是用于終止子的尋找)來自(http://www.tufts, edu/sackler/waldorlab/sRNA`Predict/),然后再在去冗余(指的是重復的序列)基礎(chǔ)上預測出具有完整轉(zhuǎn)錄單元的基因間區(qū)，去除含有tRNA和rRNA的序列，最后，通過BLAST比對，找出保守的基因間區(qū)作為候選的(small non-coding RNA, sRNA)序列。候選的sRNA序列數(shù)量為21個。
[0030]在候選的sRNA序列中，分析得知，BSR0601是在布魯氏菌(Brucella melitensis)16M II號染色體上預測的非編碼小RNA，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:1所示，其5’端為635957 (指的是Genbank里面的序列號),3’端為636123 (指的是Genbank里面的序列號)，長167nt，其編碼基因位于布魯氏菌(Brucella melitensis) 16M的BMEI10601 (指的是Genbank里面的位點號碼)和BMEI10602 (指的是Genbank里面的位點號碼)之間的基因間區(qū)。由于BSR0601的轉(zhuǎn)錄方向與兩側(cè)的放性閱讀框(ORF)均相反，說明BSR0601是單獨轉(zhuǎn)錄的，符合sRNA的特征。BLAST比對結(jié)果表明，BSR0601在布魯氏菌菌種間的同源性達到100%，說明BSR0601具有高度的保守性，這一點也符合sRNA的特征。
[0031]實施例2、BSR0601在布魯氏菌16M不同生長時期表達情況的Northern blot驗證
[0032]Northern blot是鑒定非編碼小RNA的金標準。由于非編碼小RNA的表達通常具有生長時期依賴性，因此，可用Northern blot檢測BSR0601在布魯氏菌16M不同生長時期的表達情況。具體方法包括以下步驟:
[0033]I)根據(jù)BSR0601的編碼序列設(shè)計引物，并在反向引物外側(cè)添加T7啟動子序列，弓丨物序列為 BSR0601-p-F:CCAATCCCAACTITTGTCCAG 和 BSR0601-p-R: TAATACGACTCACTATAGGGGGCGGCGTTTTCGTTTC (帶下劃線序列為T7啟動子序列)。
[0034]2)首先以羊布魯氏菌16M的基因組為模版，用引物BSR0601-P-F和BSR0601-p-RPCR擴增制備探針的DNA模板，PCR反應體系為:10Xbuffer2.5 μ 1，dNTPs (2.5mmol/L)2y I，上游引物(10 μ mol/L) 0.5 μ I，下游引物(10 μ mol/L) 0.5 μ 1，EXTaq (5U/mL)0.2y 1，模板 DNA 3 μ 1，ddH2017 μ 1，總體積 25 μ I。PCR 反應條件為:95°C7min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，30 個循環(huán)；72°C IOmin0
[0035]3)以步驟2)獲得的DNA為模板，用T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄制備BSR0601的地高辛標記探針，轉(zhuǎn)錄體系為:模板DNAl μ g, DIG-11-UTP Mix2 μ 1, 5 X Transcription buffer4 μ 1，RiboLock?RNase Inhibitor(40U/μ I) I μ I, T7RNA Polymerase(20U/μ 1)1.5 μ 1，DEPC水定容到20 μ 1，混勻。轉(zhuǎn)錄條件為:在PCR儀中37°C體外轉(zhuǎn)錄反應a ;加入I μ I DNase I(2U/y I) 37°C處理消化DNA30min ;然后加入2μ I EDTA (0.2Μ，ρΗ8.0)終止反應；加入30 μ I DEPC處理過的水，使總體積達到50 μ I ;加入1/10體積的5Μ乙酸銨(5 μ I)渦旋混勻和3倍體積預冷的無水乙醇(150 μ 1)，-20°C放置過夜；12，000rpm、4°C離心15min，75%乙醇漂洗2次，棄上清，空氣干燥。用50μ1 DEPC水溶解RNA探針。并向其中加入20U RNaseInhibitor, 5 μ I 分裝，_80°C保存。 [0036]探針序列為:
[0037]CCAATCCCAACTTTTGTCCAGTTGGGCGGCGGAAGAACGTTCTCTTTGAGGGCATTGAAACGGTATGGATGCGGGATAGCAAAGCAGCTTGAAGAAACGAAAACGCCGCC。
[0038]4)將布魯氏菌(Brucella melitensis) 16M分別培養(yǎng)至對數(shù)生長早期(EP,OD600=0.5)、中期(MP，OD6tl0=L 2)和平臺期(ST，0D_=2.5)，采用 Trizol 法提取布魯氏菌 16M的總RNA,以布魯氏菌的總RNA為模版,用步驟3)制備的探針進行Northern blot驗證。
[0039]Northern blot驗證結(jié)果如圖1 (EP表示對數(shù)生長早期,MP表示對數(shù)生長中期,ST表示平臺期)所示，BSR0601在布魯氏菌16M的對數(shù)生長中期和平臺期有轉(zhuǎn)錄，證明在布魯氏菌16M中確實存在BSR0601。
[0040]實施例3、BSR0601在模擬巨噬細胞內(nèi)環(huán)境的不同應激條件下的表達分析
[0041]細菌sRNA的表達與應激條件有關(guān)，因此，可用RT-PCR的方法對BSR0601在酸、營養(yǎng)缺乏、氧化應激等模擬巨噬細胞內(nèi)環(huán)境的不同應激條件下的轉(zhuǎn)錄情況進行了檢測。具體方法包括以下步驟:
[0042]I)將培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(OD6qq=L 2)的布魯氏菌(Brucella melitensis) 16M菌液進行離心，收集菌體，將菌體分別在①TSB7.0 (大豆胰蛋白胨肉湯，購自生物梅里埃公司，pH為7.0，為標準37°C )、②GEM7.0(營養(yǎng)缺乏培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中含MgSO4.7H200.2g，Citric acid.Η202.0g, K2HPO4I0.0g, NaNH4HPO4.4Η203.5g，葡萄糖 20g,調(diào) pH 為 7.0)、③ TSB7.0，42°C (熱刺激)、④ TSB4.0 (酸性條件，pH 為 4.0)、⑤ TSB7.0，1.5mM H2O2 (高氧)五種條件下培養(yǎng)30min。
[0043]2)采用Trizol法提取在不同條件培養(yǎng)的布魯氏菌(Brucella melitensis) 16M的 RNA，RNA 用 DNAse I 消化后作為模版，用引物 BSR0601-RT-F:CCAATCCCAACTTTTGTCCAG和 BSR0601-RT-R:GGCGGCGTTTTCGTTTC 檢測 BSR0601 的表達水平，用引物 16sRNA_RT_F:CACTGGACCATTACTGACGC 和 16sRNA_RT_R:ACTAAGGGCGAGGGTTGC 檢測 16S rRNA 的表達水平，16S rRNA為陽性內(nèi)對照基因，25μ I PCR反應體系為:2XonestepSYBR RT-PCRBufferl2.5 μ I, Takara ExTaqC5U/ μ 1)0.5 μ I,RT Enzyme Mix H0.5 μ I,Forward primer(10 μ M) I μ I, Reverse primer (10 μ M) I μ I, RNase free Η208.5 μ I, Total RNAlOOng ；PCR 反應條件為:42°C 5min ；95°C IOs ；95°C 5s, 56°C 30s, 72°C 30s，45 個循環(huán)。
[0044]3)相對定量的計算采用2_Λ "et方法分析，即ACt目標基因=Ct(目標基因)_Ct(同一樣本16S rRNA) ； Δ Δ Ct目標基因=ACt目標基因(實驗組)-ACt目標基因(對照組)，相對倍數(shù)(實驗組/對照組實驗進行3次，以TSB7.0條件為對照組(相對轉(zhuǎn)錄水平設(shè)為I )，其余條件為實驗組。重復實驗3次，計算平均值。
[0045]檢測結(jié)果如圖2所示，可以看出，BSR0601在酸(TSB4.0)、營養(yǎng)缺乏(GEM7.0)、氧化應激條件(H2O2)和熱(42°C)等模擬巨噬細胞內(nèi)環(huán)境的應激條件下的表達量明顯增加，提示BSR0601可能與布魯氏菌適應巨噬細胞內(nèi)環(huán)境和細胞內(nèi)生存有關(guān)。
[0046]實施例4、BSR0601的功能分析
[0047]為了進一步分析BSR0601在布魯氏菌胞內(nèi)生存和毒力中發(fā)揮的作用，構(gòu)建了BSR0601的缺失突變株和過表達株，并進行了相關(guān)表型實驗。
[0048]UBSR0601缺失突變株和過表達株的構(gòu)建及驗證
[0049]以布魯氏菌(Brucella melitensis) 16M的基因組DNA為模板，用引物BSR0601-N-F 和 BSR0601-N-R 擴增 BSR0601 的 N 端同源臂，用引物 BSR0601-C-F 和BSR0601-C-R擴增BSR0601的C端同源臂。以PUC19K (購自大連寶生物公司)為模板，用引物Kana-F和Kana-R擴增卡那霉素抗性基因(Kan基因)。PCR擴增產(chǎn)物用DNA膠純化回收試劑盒(購自Promega公司)回收后，將N端同源臂、C端同源臂和Kan基因等摩爾比混合作為模板，進行融合PCR擴增 。PCR擴增分兩輪進行，分別命名為PCR-1和PCR-2。
[0050](I)引物序列
[0051 ] BSR0601-N-F:GTACAAAAAAGCAGGCTTAGGTACCACGATATAGGGATTGGAGAAG
[0052]BSR0601-N-R:GCTGACATTCATCCCAGGTGGCACTCACAATATTTCAATAATTG ；
[0053]BSR0601-C-F:ACTCTGGGGTTCGAAATGACCGTGATCTTGATTCACGATGTTG
[0054]BSR0601-C-R:TGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCAGATTACGAAACCATCTGCTCCG ；
[0055]Kan-F:ATCAGGACATAGCGTTGGC
[0056]Kan-R:GGCAAGAAAGCCATCCAGT ；
[0057]pBBR-F:GCGAAAGGGGGATGTGCTGC
[0058]pBBR-R:AGCGCGCAATTAACCCTCAC ；
[0059]BSR16-RT-F: CCAATCCCAACTTTTGTCCAG
[0060]BSR16-RT-R:GGCGGCGTTTTCGTTTC ；
[0061]16sRNA-RT-F: CACTGGACCATTACTGACGC
[0062]16sRNA-RT-R:ACTAAGGGCGAGGGTTGC。
[0063](2)融合PCR擴增
[0064]PCR-1反應體系:
[0065]Pyrobest polymerase0.2 μ 1，
IOXPCR Buffer (Mg2+ Plus)2μ l,
dNTP Mixture (各 2.5mM)2 μ 1，
模板3 μ l，
加去離子水.個:2.5 μl;
[0066]PCR-1 反應條件:94°C 5min ；94°C 30s，66°C 30s，72°C 60s, 10 個循環(huán)。
[0067]將得到的PCR-1液稀釋10倍作為第二步PCR(PCR_2)的模板，進行第二輪PCR擴
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[0068]PCR-2反應體系:
[0069]
LA polymerase0.5 μ l,
IOXLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus)5 μ 1，
dNTP Mixture(2.5mM each)4μ l,
BSR0601-N-F (20 μ Μ)1μ l,
BSR0601-C-R (20 μ Μ)1μl,
模板3μ l,
加去離子水至50μl;
[0070]PCR-2 反應條件-MV 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 60s, 30 個循環(huán)；72°C IOmin0將PCR-2反應產(chǎn)物用DNA膠純化回收試劑盒進行切膠回收，得到的回收片段即為BSR0601缺失突變盒，將其命名為BSR0601-NC。
[0071](3)構(gòu)建BSR0601缺失突變載體
[0072]將缺失突變盒BSR0601-NC和pMD18-T Simple Vector(購自大連寶生物公司)進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布氨芐(100μ g/mL)抗性LB平板，對平板上的抗性克隆用引物BSR0601-N-F和BSR0601-C-R進行菌落PCR鑒定。擴增出2077bp DNA片段(此DNA片段為BSR0601-NC)的為陽性克隆，將鑒定為陽性的克隆提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒用Kpn I酶和HindIII酶進行雙酶切鑒定，經(jīng)雙酶切獲得4579bp (此DNA片段為BSR0601-NC-T/Kpn I +HindIII^P190bp (此 DNA 片段為 BSR0601-NC_T/Kpn I +HindIII)DNA片段的陽性質(zhì)粒，表明BSR0601缺失突變載體BSR0601-NC-T構(gòu)建成功，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示,物理圖譜如圖3A所示。
[0073](4) BSR0601缺失突變株的篩選與鑒定
[0074]將缺失突變載體BSR0601-NC-T質(zhì)粒DNA與80 μ I布魯氏菌(Brucellamelitensis) 16M感受態(tài)細胞充分混勻，預冷15min,然后于18kV/cm、400Q條件下進行電擊，電擊后立即加入ImL TSB培養(yǎng)基重懸細菌，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中37V復蘇24h，復蘇后的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)系列稀釋后涂布含有50 μ g/mL卡那霉素的TSA平板，37°C培養(yǎng)72h以上，篩選卡那霉素抗性克隆，即為BSR0601缺失突變株，將其命名為16MABSR0601。
[0075](5)構(gòu)建BSR0601過表達載體[0076]以布魯氏菌(Brucellamelitensis) 16M 的基因組 DNA 為模板，以 BSR0601-N-F和BSR0601-C-R為引物進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA膠純化回收試劑盒切膠回收后用Kpn I和Pst I雙酶切，與經(jīng)同樣酶雙酶切的質(zhì)粒pRRlMCS-4 (參見文獻KovachM, Elzer P,Steven Hill D, et al.Four new derivatives of the broad-host-rangecloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene, 1995，166:175 - 176.)用T4DNA Ligase連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布氨芐霉素(100μ g/mL)抗性LB平板，對平板上的抗性克隆用引物pBBRl-F和pBBRl-R進行PCR鑒定。擴增出1287bp DNA片段(此DNA片段為含BSR0601的一段DNA片段)的為陽性克隆，將鑒定為陽性的克隆提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒即為過表達載體，將其命名為BSR0601-MCS，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，物理圖譜如圖3B所示。
[0077](6)BSR0601過表達菌株的篩選
[0078]將過表達載體BSR0601-MCS質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化至16MABSR0601電感受態(tài)細胞，涂布含有50 μ g/mL卡那霉素和100 μ g/mL氨芐青霉素的TSA雙抗性平板，37°C培養(yǎng)72h以上，篩選雙抗性克隆，雙抗性克隆即為BSR0601過表達菌株，命名為16M-BSR0601。
[0079](7) 16M Δ BSR0601 和 16M-BSR0601 的 RT-PCR 驗證
[0080]為了驗證BSR 0601缺失突變株和BSR0601過表達株，可用RT-PCR的方法分析布魯氏菌16Μ、16Μ Δ BSR0601和16M-BSR0601這三株菌中BSR0601的轉(zhuǎn)錄情況，從轉(zhuǎn)錄水平對BSR0601缺失突變株和BSR0601過表達株進行驗證。將這三株菌在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(0D_=1.2)，然后采用Trizol RNA提取方法抽提總RNA?？俁NA用DNAseI消化后，以隨機引物為逆轉(zhuǎn)錄引物，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應體系和反應條件為:2μ g的總RNA加上I μ g隨機引物，將PCR管于PCR儀中70°C放置lOmin，解開模板中的二級結(jié)構(gòu)；迅速將PCR管置于冰上停留5min以防止二級結(jié)構(gòu)重新形成；短暫離心，將溶液收集到管底；按如下順序?qū)⑾铝谐煞旨尤氲揭锖湍０宓幕旌衔镏?M_MLV5Xreaction buffer5 μ I,dNTP (2.5mM each) 5 μ I, RNasin? Ribonuclease Inhibitor (40U/ μ I) 25U, M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200υ/μ 1)1μ 1，水(無核酸酶)至25 μ I ;輕彈管壁，混合反應液，37°C孵育60min。再以cDNA為模板，用針對BSR0601的引物BSR0601-RT-F和BSR0601-RT-R進行RT-PCR驗證，PCR反應體系為:模板Ιμ?，dNTPs (2.5mM each) 2 μ 1，上游引物(20 μ Μ) 0.5 μ 1，下游引物(20 μ Μ) 0.5 μ 1,10XPCR Buffer2.5 μ 1，rTaq(5U/ μ 1)0.125 μ I，無菌去離子水至 25 μ I ；PCR 反應條件為:95°C 5min ；95°C 30s,60°C 30s、72°C 30s, 30 個循環(huán)；72°C 7min。
[0081]結(jié)果如圖4所示，可以看出，布魯氏菌16Μ、16Μ Λ BSR0601和16M-BSR0601中16sRNA的表達量是相同的，說明這三株菌的cDNA量是一致的。因此，可以進行這三株菌的BSR0601 表達分析。16Μ Δ BSR0601 中沒有 BSR0601 的表達，而 16M-BSR0601 中 BSR0601 的表達量高于野生株，實驗結(jié)果證實BSR0601缺失突變株16Μ Δ BSR0601和BSR0601過表達株16M-BSR0601構(gòu)建成功。
[0082]2、BSR0601缺失突變株和過表達株在模擬巨噬細胞內(nèi)環(huán)境的壓力條件下的生存能力分析
[0083]布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，在巨噬細胞的內(nèi)環(huán)境中包含多種殺(抑)菌機制，因此布魯氏菌必須適應這些機制才能在胞內(nèi)生存繁殖。為分析BSR0601在布魯氏菌抵抗和適應這些條件中的作用，可在體外模擬多個胞內(nèi)條件，包括氧化壓力、熱休克、酸壓力、高滲透壓等，分別將布魯氏菌16M、16MABSR0601、16M-BSR0601在這些條件下進行處理，然后觀察它們各自在這些條件作用下的存活率。
[0084]具體實驗方法:將培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(0D_=1.2)的布魯氏菌16M、16MΔ BSR0601U6M-BSR0601菌液離心，PBS洗I次后將菌體重懸并振蕩培養(yǎng)于①含440mMH2O2 的 TSB 液體(40min)中50°C預熱的 TSB 液體(60min);③ ρΗ3.0 的 TSB 液體(IOmin);④1.5M的NaCl水溶液(30min) 37°C的TSB液體(40min，對照)等不同的培養(yǎng)基中，倍比稀釋后涂布TSA平板進行計數(shù)，觀察布魯氏菌16M、16M Δ BSR0601、16M-BSR0601在氧化壓力、高鹽、熱壓力、酸壓力、高滲透壓環(huán)境中的存活力。結(jié)果以百分比表示，將對照組細菌的生存率設(shè)為100%。重復實驗3次，計算平均值。
[0085]結(jié)果如圖5所示，可以看出，與布魯氏菌野生株16M相比，BSR0601過表達株16M-BSR0601在各種刺激條件下的生存能力明顯減弱，結(jié)果提示，BSR0601過表達以后，布魯氏菌在體外刺激條件下的生存能力減弱；與布魯氏菌野生株16M相比，BSR0601缺失突變株16MABSR0601在氧化、酸和熱刺激條件下的生存能力減弱，在滲透壓刺激條件下的生存力增強，結(jié)果提示，BSR0601缺失以后，布魯氏菌在體外刺激條件下的生存能力發(fā)生變化。實驗結(jié)果表明，BSR0601的正確表達對于布魯氏菌在模擬巨卩遼細胞內(nèi)環(huán)境的壓力條件下的生存是必需的。因為，選取的刺激條件是模擬巨噬細胞內(nèi)環(huán)境的，因此，BSR0601過表達株在這些刺激條件下的生存率下降，表明BSR0601過表達株在巨噬細胞內(nèi)的生存能力減弱。
[0086]3.BSR0601缺失突變株和過表達株的小鼠毒力競爭實驗
[0087]布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，布魯氏菌在感染后，首先侵襲的是宿主的局部淋巴結(jié)，而后再遷移到其它的器官和組織。脾臟是一種免疫細胞豐富的器官，而布魯氏菌主要寄生于吞噬細胞，因此脾臟是布魯氏菌寄居的主要場所之一。布魯氏菌致病性的重要指標之一是脾臟的載菌數(shù)。為了進一步確定BSR0601在布魯氏菌胞內(nèi)生存和毒力中的作用，又進行了小鼠毒力競爭實驗。`
[0088]按照I X IO5CFU/只的感染劑量免疫小鼠，具體步驟如下:將布魯氏菌16M、16MΔBSR0601U6M-BSR0601培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(0D_=1.2)，分為三個組:(1)布魯氏菌16M與16MABSR0601的混合物(個數(shù)比=1:1) ; (2)布魯氏菌16M與16M-BSR0601的混合物(個數(shù)比=1:1) ；(3) PBS陰性對照組。每組細菌的濃度為5X 105CFU/mL，每只小鼠免疫200μ I。在免疫小鼠前，先要分別涂板計數(shù)，確認原始的布魯氏菌野生株16Μ、突變株16MABSR0601、過表達株16M-BSR0601的數(shù)量一致。感染后24h時，處死小鼠，無菌條件下迅速取出脾臟，加入ImL含有0.1% Triton X-100的磷酸鹽緩沖液，用玻璃勻漿器研磨，制成勻漿，將組織勻漿液進行10倍系列稀釋，從中選取適當稀釋度的勻漿液各100 μ I涂布TSA平板，計算CFU。涂板計數(shù)時，要分別涂抗性平板和非抗性平板來進行計數(shù)(野生型布魯氏菌16Μ無抗性、缺失突變株16MABSR0601為卡那抗性、過表達株16M-BSR0601為氨芐抗性)。競爭指數(shù)=缺失突變株/野生株或過表達株/野生株。
[0089]結(jié)果如圖6所示，可以看出，BSR0601過表達株16M-BSR0601與野生株16Μ(16M-BSR0601/16M)的競爭指數(shù)為0.3，表明BSR0601過表達株在小鼠體內(nèi)的生存力明顯低于16Μ野生株，也就是說BSR0601過表達時布魯氏菌的生存力下降、毒力減弱。相反，BSR0601缺失突變株16MABSR0601與野生株16Μ( 16Μ Λ BSR0601/16M)的競爭指數(shù)為1.46，表明BSR0601缺失突變株在小鼠體內(nèi)的生存力高于野生株。因此，有可能BSR0601對靶基因是負調(diào)控，當BSR0601缺失時，靶基因表達水平提高，導致布魯氏菌在小鼠體內(nèi)生存能力提高； 當BSR0601過表達時，其調(diào)控的靶基因表達水平降低，導致小鼠的毒力減弱。小鼠毒力實驗結(jié)果證實，BSR0601與布魯氏菌的毒力相關(guān)。
【權(quán)利要求】
1.來源于布魯氏菌的非編碼小RNA分子(smallnon-coding RNA, sRNA),命名為BSR0601，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，或與序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并與布魯氏菌毒力和生存能力相關(guān)的核苷酸序列，或為序列表中SEQ IDNO:1所示核苷酸序列經(jīng)硫代修飾或/和甲氧基修飾得到的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述非編碼小RNA分子，其特征在于，其與布魯氏菌毒力和/或生存能力相關(guān)。
3.BSR0601缺失突變載體，命名為BSR0601-NC-T，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO:2所示。
4.BSR0601過表達載體，命名為BSR0601-MCS，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
5.以布魯氏菌(Brucellamelitensis) 16M為出發(fā)菌株，構(gòu)建的轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求3所述BSR0601缺失突變載體BSR0601-NC-T的布魯氏菌BSR0601缺失突變株，命名為16MABSR0601。
6.以布魯氏菌(Brucellamelitensis) 16M為出發(fā)菌株,構(gòu)建的轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求4所述BSR0601過表達載體BSR0601-MCS的布魯氏菌BSR0601過表達株，命名為16M-BSR0601。
7.權(quán)利要求4所述BSR0601過表達載體在制備抗布魯氏菌藥物中的應用。
8.權(quán)利要求6所述過表達株16M-BSR0601在制備抗布魯氏菌藥物中的應用。
9.序列表中SEQID NO:1所示非編碼小RNA分子BSR0601在與布魯氏菌的胞內(nèi)生存和/或毒力相關(guān)的研究試劑或藥用產(chǎn)品制備中的應用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述應用，其特征在于，所述藥用產(chǎn)品為抗布魯氏菌藥物。
【文檔編號】A61P31/04GK103710345SQ201310741087
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】王玉飛, 陳澤良, 黃留玉, 王立貴, 柯躍華, 杜昕穎, 汪舟佳, 宋宏彬 申請人:中國人民解放軍疾病預防控制所