多臂聚乙二醇修飾劑的新用途及其在修飾門冬酰胺酶中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了多臂聚乙二醇修飾劑的新用途及其在修飾門冬酰胺酶中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的多臂PEG修飾劑可用于加強(qiáng)多亞基蛋白的亞基間作用力，使多亞基蛋白保持聚合的形式，從而增加多聚體蛋白的穩(wěn)定性，增強(qiáng)或保持多亞基蛋白的生物活性，同時(shí)減少各亞基解聚后抗原位點(diǎn)暴露的幾率，降低免疫原性。此外，本發(fā)明中制備的PEG修飾后的門冬酰胺酶和市售的PEG化門冬酰胺酶產(chǎn)品“培門冬酶”相比，具有低免疫原性，高活性、高穩(wěn)定性，PEG不會(huì)脫落等優(yōu)點(diǎn)，更適用于抗腫瘤藥物的制備。
【專利說明】多臂聚乙二醇修飾劑的新用途及其在修飾門冬酰胺酶中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多臂聚乙二醇修飾劑的新用途及其在修飾門冬酰胺酶中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]聚乙二醇(PEG)是一種線性、在溶液中可自由卷曲的不帶電荷的聚合物，具有無毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它來共價(jià)修飾蛋白質(zhì)，可以增加蛋白質(zhì)的體內(nèi)循環(huán)半衰期和減小其抗原性，增加蛋白質(zhì)的溶解性并會(huì)改變蛋白質(zhì)在人體內(nèi)的生物學(xué)分布。自 1977 年 Abuchowski，Davis(J.B1l.Chem.1977, 252:3578-3581.)等人首次報(bào)道用 PEG修飾蛋白質(zhì)以來，PEG修飾技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】得到了廣泛的應(yīng)用，PEG已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)，多肽類藥物的修飾研究。目前蛋白質(zhì)PEG化技術(shù)已經(jīng)成為降低蛋白質(zhì)生物藥物的免疫原性，以及改善其藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)性質(zhì)最有效的方法之一，且已通過FDA認(rèn)證可用于藥物、食品和化妝品。
[0003]在大多數(shù)情況下，與未修飾的原蛋白相比，聚乙二醇化的蛋白藥物的活性會(huì)降低，一般修飾后的蛋白活性僅有原蛋白的30%-40%，甚至更低。例如Schering-Plough公司的PEG-1ntron,是用分子量為5000的PEG修飾干擾素，修飾后其活性只有原蛋白的8%。此外，一般隨著PEG分子量的增大，修飾后的蛋白質(zhì)活性降低更明顯。例如用分子量為20KDa、30KDa、40KDa的PEG修飾促紅細(xì)胞生成素(EPO)后，活性隨著PEG分子量的增大而顯著減小(Yin-jue Wang, journal of controlled release, 2010 (145): 306-313)。Bailon 等米用分支型40kDa PEG修飾Interferon- a -2a,所得單修飾物獲得較長(zhǎng)的循環(huán)半衰期，但是僅僅保留了 7% 的體外活性(Bailon P, B1conjugate Chem.，2001，12:195-202.)。
[0004]聚乙二醇修飾技術(shù)經(jīng)歷了幾十年的發(fā)展，目前雖然已經(jīng)比較成熟。但并不能找出一種通用的聚乙二醇修飾劑以及修飾方法來對(duì)所有的蛋白藥物進(jìn)行修飾。蛋白的結(jié)構(gòu)以及所用PEG的分子量、形狀以及修飾的位點(diǎn)等對(duì)聚乙二醇化的蛋白質(zhì)的生物活性以及藥效有很大的影響。對(duì)于特定藥物的修飾，聚乙二醇修飾劑是影響修飾產(chǎn)物理化性質(zhì)、體內(nèi)外生物活性、藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)以及修飾產(chǎn)物臨床表現(xiàn)最重要的因素。因此，修飾劑的選擇(修飾劑種類、分子量大小)以及修飾反應(yīng)的控制在聚乙二醇修飾技術(shù)中占有重要地位。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)天然蛋白質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)行為，而在蛋白偶聯(lián)上PEG以后由于引入了許多新的變量如分子量、修飾劑種類等，對(duì)于PEG偶聯(lián)物的藥代動(dòng)力學(xué)行為預(yù)測(cè)變得更加不可能。為此，針對(duì)不同的蛋白質(zhì)藥物，需要通過選擇不同種類以及不同分子量的修飾劑，并通過理化性質(zhì)檢測(cè)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)等確定最佳方案。
[0005] 多亞基蛋白質(zhì)(寡聚或多聚亞基蛋白質(zhì))指的是由兩個(gè)以上彼此獨(dú)立的亞基通過分子之間相互作用結(jié)合在一起的聚合體。其中，每個(gè)亞基一般由一條肽鏈組成，但也有兩條以上肽鏈經(jīng)二硫鍵相連組成。每個(gè)亞基自身折疊成一定的空間構(gòu)型，不同亞基之間依靠疏水作用、氫鍵、離子鍵與作用力聚集在一起，形成蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)，亞基之間相互作用構(gòu)成有生物化學(xué)活性的整體。在自然界中，這種多亞基蛋白質(zhì)在整個(gè)蛋白質(zhì)家族中為數(shù)不少。例如，堿性磷酸酶由二個(gè)亞基構(gòu)成，每個(gè)亞基分子量約為28KDa,整個(gè)分子的分子量約為56KDa ;人腫瘤壞死因子就是三個(gè)亞基構(gòu)成，每個(gè)亞基分子量約為17KDa，整個(gè)分子的分子量約為51KDa;L-門冬酰胺酶的活性形式為4個(gè)亞基組成的同源四聚體結(jié)構(gòu)，每一亞基由326個(gè)氨基酸組成，整個(gè)蛋白分子的分子量約為140KDa ；Hp尿素酶單體由A、B兩個(gè)亞單位組成，呈六聚體，A、B兩個(gè)亞單體的分子量分別為30KDa和64KDa左右，其比例為1:1。多亞基蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性常常與其聚集體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。人腫瘤壞死因子TNF-α三聚體的生物學(xué)活性最高，是每個(gè)亞基單獨(dú)存在時(shí)活性的8倍。而L-門冬酰胺酶只有在4個(gè)亞基組成的同源四聚體結(jié)構(gòu)才能具有相應(yīng)的生物學(xué)活性。另一方面，多亞基類蛋白解聚后不僅其活性一般會(huì)有顯著降低，且作為藥物在體內(nèi)降解后，容易暴露出更多抗原表位，引起免疫反應(yīng)，從而降低藥效，引起副反應(yīng)。因此，保持多亞基蛋白的生物學(xué)活性的重點(diǎn)在于如何防止亞基的解聚。
[0006]具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白(通常被稱為L(zhǎng)-天冬酰胺酶，L-門冬酰胺酶，或門冬酰胺酶)可以有效的治療兒童或成人中的急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)。最近幾年，含有L-天冬酰胺酶的藥物已經(jīng)用于聯(lián)合化療方案來治療NK/T細(xì)胞淋巴瘤，并取得了較好的治療效果。NK/T細(xì)胞淋巴瘤是中特殊類型的非霍奇金淋巴瘤，多見于亞洲和拉丁美洲，我國(guó)發(fā)病率相對(duì)較高。根據(jù)腫瘤發(fā)生部門，NK/T細(xì)胞淋巴瘤可分為鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤和非鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤。另外L-天冬酰胺酶還被用于治療何杰金氏病，急性骨髓白血病，急性骨髓單核細(xì)胞白血病，慢性淋巴細(xì)胞白血病，淋巴肉瘤，網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤和黑素肉瘤(Kotzia and labrou, J.B1technol.127 (2007) 657-669)。L-門冬酰胺酶的活性形式為 4個(gè)亞基組成的同源四聚體結(jié)構(gòu)，每一亞基由326個(gè)氨基酸組成。L-天冬酰胺酶最初從若干生物體中純化，包括大腸桿菌(E.coli)和軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)。在哺乳動(dòng)物中，僅在豚鼠(Cav1idea超科)和某些闊鼻猴(New World monkey)中發(fā)現(xiàn)略高于痕量的L-天門冬酰胺酶。但是，由于它來源于外源生物，對(duì)人而言是一種外源蛋白，有較強(qiáng)的免疫原性，臨床上常見進(jìn)行性免疫反應(yīng)和全身性過敏反應(yīng)，而限制了其臨床應(yīng)用。(張麗娜，宮道華.江蘇醫(yī)藥.左旋門冬酰胺酶治療小兒急性淋巴細(xì)胞性白血病的毒副反應(yīng).2005，31 (5):392;王寧玲，劉芝璋等.左旋門冬酰胺酶治療兒童白血病的毒副作用及防治.中國(guó)小兒血液，2005，10 (3):133)。
[0007]目前針對(duì)L-門冬酰胺酶的聚乙二醇修飾研究已有很多。國(guó)外利用聚乙二醇修飾的L-門冬酰胺酶的產(chǎn)品Oncaspar (Enzon inc)早在1994年就已上市，并在2006年起被批準(zhǔn)作為兒童和成人的ALL的一線療法。但是Oncaspar使用的PEG是琥拍酰亞胺琥拍酸酯(SS-PEG)，這種PEG含有對(duì)酶的水解敏感的、或者在微堿性PH值時(shí)不穩(wěn)定的酯鍵(美國(guó)專利號(hào)4670417)。這些性質(zhì)顯著降低了體外和體內(nèi)的穩(wěn)定性并且副作用也較大。而國(guó)內(nèi)目前上市的PEG修飾的L-門冬酰胺酶只有恒瑞公司的“培門冬酶”，它是Oncaspar的仿制藥，也存在著PEG容易降解脫落的問題。
[0008]國(guó)內(nèi)相關(guān)的已授權(quán)的專利主要有兩個(gè)，分別是連云港新陽(yáng)醫(yī)藥有限公司的“聚乙二醇修飾門冬酰胺酶的制備方法”(申請(qǐng)?zhí)?2149328.6)，和上海醫(yī)藥工業(yè)研究院的“聚乙二醇修飾的L-門冬酰胺酶”(申請(qǐng)?zhí)?00610027026.0)。其中連云港新陽(yáng)醫(yī)藥有限公司的專利中所采用的修飾方法是兩步反應(yīng)法，首先用分子量較小的PEG修飾劑進(jìn)行修飾，然后再用分子量較大的PEG修飾劑進(jìn)行二次修飾。這種修飾方法步驟繁多，而且修飾產(chǎn)物的均一性難以控制，純化方法復(fù)雜。而上海醫(yī)藥工業(yè)研究院的專利中使用的PEG修飾劑與門冬酰胺酶結(jié)合后不易水解，但修飾后活性損失較大，保留了原蛋白60%的活性。國(guó)外的阿利茲第二藥物公司最近也申請(qǐng)了關(guān)于PEG修飾L-門冬酰胺酶的專利。這個(gè)專利中所使用的PEG修飾劑也是較常用的隨機(jī)修飾氨基的修飾劑，修飾的L-門冬酰胺酶是歐文氏菌來源的。另外國(guó)內(nèi)外也有多篇PEG修飾L-門冬酰胺酶的論文發(fā)表，用的都是常規(guī)的單甲氧基PEG修飾劑。所有的這些專利和文章中PEG修飾后的L-門冬酰胺酶和未修飾的原蛋白比較，免疫原性有了降低，但依然存在有免疫原性的問題。并且，這些專利和文章也都沒有涉及解決多亞基蛋白質(zhì)的亞基解聚的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的之一是提供多臂聚乙二醇修飾劑在修飾多亞基蛋白中的應(yīng)用。
[0010]所述聚乙二醇修飾劑優(yōu)選與多亞基蛋白質(zhì)的氨基偶聯(lián)。
[0011]優(yōu)選的，本發(fā)明使用的聚乙二醇修飾劑為醛基活化的或酯活化的四至八臂聚乙二醇修飾劑。優(yōu)選為四臂聚乙二醇修飾劑。
[0012]更優(yōu)選的，本發(fā)明使用的多臂聚乙二醇修飾劑的結(jié)構(gòu)式分別如式(I)或式(II)所示:
[0013]

【權(quán)利要求】
1.多臂PEG在修飾多亞基蛋白中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的多臂PEG選自以下任意一種結(jié)構(gòu)所示的PEG:
其中n選自I到2000整數(shù)值，k為I或2，m選自2_16之間的整數(shù)，p選自1_4之間的整數(shù)，多臂PEG的分子量在I~10kDa之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的η選自2-500之間的整數(shù)值，優(yōu)選為25-100之間的整數(shù)；所述的k為1，m為4，ρ為2 ;多臂PEG的分子量在I~40kDa之間，優(yōu)選為5~1kDa0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的多臂PEG為醛基活化的或酯活化的多臂聚乙二醇衍生物；其中酯活化的聚乙二醇衍生物選自4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺乙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯中的任意一種；醛基活化的聚乙二醇衍生物選自4臂聚乙二醇丙醛、4臂聚乙二醇丁醛、4臂聚乙二醇乙醛、4臂聚乙二醇戊醛中的任意一種，優(yōu)選4臂聚乙二醇丙醛。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述的多亞基蛋白選自堿性磷酸酶、門冬酰胺酶或尿素酶中的任意一種。
6.一種利用多臂PEG修飾多亞基蛋白的方法，其特征在于包含以下步驟； (O需要修飾的蛋白和PEG修飾劑按比例混合后在緩沖液中進(jìn)行修飾反應(yīng)； (2)修飾反應(yīng)結(jié)束后用離子交換層析去除掉修飾產(chǎn)物中未與蛋白發(fā)生反應(yīng)的PEG修飾劑； (3)用凝膠過濾層析對(duì)修飾產(chǎn)物進(jìn)行純化，收集目的修飾產(chǎn)物； 其中所述的PEG修飾劑選自以下任意一種結(jié)構(gòu)所示的PEG:
其中n選自I到2000整數(shù)值，k為I或2，m選自2_16之間的整數(shù)，p選自1_4之間的整數(shù)，多臂PEG的分子量在I~10kDa之間。
7.根據(jù)權(quán)利要 求6所述的方法，其特征在于所述的η選自2-500之間的整數(shù)值，優(yōu)選為25-100之間的整數(shù)；所述的k為1，m為4，ρ為2 ;多臂PEG的分子量在I~40kDa之間，優(yōu)選為5~1kDa0
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述的多臂PEG為醛基活化的或酯活化的多臂聚乙二醇衍生物；其中酯活化的聚乙二醇衍生物選自4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺乙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯中的任意一種，優(yōu)選4臂聚乙二醇琥珀酰亞胺乙酸酯；醛基活化的聚乙二醇衍生物選自4臂聚乙二醇丙醛、4臂聚乙二醇丁醛、4臂聚乙二醇乙醛、4臂聚乙二醇戊醛中的任意一種，優(yōu)選4臂聚乙二醇丙醛。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述的多亞基蛋白選自堿性磷酸酶、門冬酰胺酶或尿素酶中的任意一種。
10.多臂PEG修飾的多亞基蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多臂PEG修飾的多亞基蛋白，其特征在于所述的多臂PEG修飾的多亞基蛋白按照權(quán)利要求6~9中任一項(xiàng)所述的方法獲得。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多臂PEG修飾的多亞基蛋白，其特征在于所述的多臂PEG修飾的多亞基蛋白為多臂PEG修飾的門冬酰胺酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多臂PEG修飾的多亞基蛋白，其特征在于所述的多臂PEG修飾劑選自以下任意一種結(jié)構(gòu)所示的PEG:
其中n選自I到2000整數(shù)值，k為I或2，m選自2_16之間的整數(shù)，p選自1_4之間的整數(shù)，多臂PEG的分子量在I~10kDa之間。
14.一種藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物含有如權(quán)利要求12所述的多臂PEG修飾的門冬酰胺酶和藥學(xué)上可接受的輔料；所述的藥物組合物的劑型優(yōu)選凍干粉針制劑。
15.權(quán)利要求12所述的多臂PEG修飾的門冬酰胺酶或權(quán)利要求14所述的藥物組合物在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
16.權(quán)利要求12所述的多臂PEG修飾的門冬酰胺酶或權(quán)利要求14所述的藥物組合物在制備治療急性白血病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK104046600SQ201310745273
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】馬永, 王俊, 吳鼎龍, 邱晶, 徐春林, 陳晨, 王耀方 申請(qǐng)人:江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司, 常州京森生物醫(yī)藥研究所有限公司