豬a型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁滅活疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬A型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：1）刮取因梭菌脹氣而死亡的病豬的腸內(nèi)容物；2）高壓滅菌牛奶作為培養(yǎng)基，待牛奶培養(yǎng)基冷卻到80℃將病料倒入培養(yǎng)基中，繼續(xù)厭氧培養(yǎng)；3）離心過濾沉淀，得到澄清的毒素液；4）加入毒素液總重0.4%的甲醛，滅活脫毒；5）將滅活脫毒的毒素液與氫氧化鋁佐劑按照4：1的重量比混合，高速攪拌合成疫苗。本發(fā)明的有益效果為：以牛奶作為培養(yǎng)基生產(chǎn)A型梭菌疫苗，成本低廉，培養(yǎng)過程簡(jiǎn)單、方便、快速；以氫氧化鋁作為佐劑，加強(qiáng)滅活苗的作用，并能減少注射疫苗后的不良反應(yīng)；本滅活疫苗免疫保護(hù)率高，因此，是安全、有效的豬A型魏氏梭菌氫氧化鋁滅活疫苗。
【專利說明】豬A型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁滅活疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種豬A型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁滅活疫苗的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium Perfringens),又稱魏氏梭菌(Clostridium welchii)，本菌可產(chǎn)生多種外毒素及酶類。根據(jù)魏氏梭菌所合成分泌的主要毒素，可以將其分為A，B，C，D，E型，其中A型能夠感染到人，形成氣腫疽，死亡率不一，B、C、D型特別與動(dòng)物的腸道感染關(guān)系密切。該菌株各種普通培養(yǎng)基中均能迅速生長(zhǎng)，最突出的生化特性是對(duì)石蕊牛乳培養(yǎng)基的“爆裂發(fā)酵”，可用于快速診斷。該菌在體內(nèi)能形成明顯的莢膜，無鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)。在自然界常以芽孢形式存在，但芽孢形成較困難。芽孢的抵抗力非常強(qiáng)，10%福爾馬林10分鐘才能將其致死。該菌廣泛分布于自然界，遍布世界各地，同時(shí)也是腸道中常在的菌群之一，在一定條件下，可引起各種嚴(yán)重疾病。該菌能產(chǎn)生多種強(qiáng)烈的外毒素，目前發(fā)現(xiàn)的有 12 種(α，β，Y，η , δ , ε , θ , ι，κ，λ，μ，ν )，其中，α，β，ε和ι是主要的致死毒素。依據(jù)主要致死毒素與其抗毒素的中和試驗(yàn)，可將此菌分為Α，B，C，D，E五個(gè)型。
[0003]A型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要引起胃腸道的病變，是人畜氣性壞疽病，兔梭菌性下痢，馬壞死性腸炎及人食物中毒的主要致病菌，也是引起鹿出血性腸炎的主要致病菌。該型菌產(chǎn)生的多種外毒素中，最主要的是α毒素。
[0004]為了控制產(chǎn)氣莢膜梭菌病毒流行，許多學(xué)者曾在細(xì)胞水平上研究過產(chǎn)氣莢膜梭菌的單聯(lián)和多聯(lián)滅活菌苗用于預(yù)防。陳錫全等進(jìn)行了 “兔病毒性出血癥”和A型產(chǎn)氣莢膜梭菌聯(lián)苗的研究；姚湘燕等采用三個(gè)不同地方的牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌研制過牛產(chǎn)氣莢膜梭菌濃縮氫氧化鋁滅活苗，證實(shí)該苗安全性好，免疫后30天以2個(gè)致死量強(qiáng)毒攻擊，可獲100%保護(hù),免疫后200天內(nèi)以同樣劑量攻擊仍可獲90%保護(hù)；閻喜軍等對(duì)吉林鹿出血性腸炎流行情況進(jìn)行了調(diào)查，之后研制了鹿魏氏梭菌單價(jià)滅活苗，疫苗使用安全，免疫效果可靠；譚詩文等曾經(jīng)進(jìn)行了羔羊痢疾，大腸桿菌病，羊猝疽，羊腸毒血癥四聯(lián)油佐劑滅活苗的研制；屠偉英等研制了仔豬產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒血癥疫苗；徐為中等研制了兔病毒性出血癥，多殺性巴氏桿菌病，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌病三聯(lián)濃縮滅活苗，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的保護(hù)率達(dá)8 O %以上；寧玉容等研制了羊四種梭菌病疫苗，該苗的免疫期限為一年，腸毒血癥暫定為半年。
[0005]已研制出的疫苗在使用中尚存在一些需要進(jìn)一步解決的問題:1.家畜接種反應(yīng)較重；2.注射劑量大，使用多有不便；3.制備過程繁瑣，時(shí)間較長(zhǎng)。因此，需要改進(jìn)制備過程和篩選培養(yǎng)基和佐劑，以快速制備出高效的疫苗，來提高疫苗免疫原性和集體免疫應(yīng)答水平。 [0006]佐劑的種類很多，按其作用機(jī)理分為吸附佐劑，顆粒佐劑，免疫調(diào)節(jié)因子等；也可按其來源分為植物來源，微生物及生物來源，人工合成有機(jī)物和無機(jī)鹽等。有些是由不同來源的物質(zhì)配制而成的。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種豬A型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁滅活疫苗的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足。
[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
一種豬A型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟:
1)將由梭菌致死的病豬挑選病料，刮取腸道內(nèi)容物，冷藏或冷凍；
2)用純牛奶作為培養(yǎng)基，高壓鍋內(nèi)121°C高壓滅菌，待到溫度降到80°C時(shí)，把病料倒入高壓鍋內(nèi)，厭氧培養(yǎng)；
3)將步驟2)中高壓厭氧培養(yǎng)的菌液過濾離心，得到上清液為毒素液；
4)在步驟3)中得到的毒素液中加入0.4%的甲醛，充分振搖，滅活脫毒；以及
5)將滅活脫毒的毒素液與氫氧化鋁佐劑按照4:1的重量比混合，高速攪拌后合成疫苗。
[0009]進(jìn)一步的，所述步驟I)中，冷凍溫度為_20°C。
[0010]進(jìn)一步的，所述步驟2)中，厭氧培養(yǎng)條件為在37°C下培養(yǎng)10-18 h。
[0011]進(jìn)一步的,所述步驟3)中，過濾離心條件為在3000 r/min下離心20min。
[0012]進(jìn)一步的，所述步驟4)中，滅活脫毒條件是37 °C下滅活脫毒3-5天。
[0013]進(jìn)一步的，所述步驟4)`中，滅活脫毒期間每隔4小時(shí)間斷振搖。
[0014]本發(fā)明的有益效果為:1、刮取腸道內(nèi)容物為病原，以優(yōu)勢(shì)牛奶爆裂發(fā)酵而產(chǎn)生多量的毒素液。
[0015]2、以牛奶為培養(yǎng)基和以氫氧化鋁為佐劑，成品低廉，用料方便，生產(chǎn)快速，疫苗刺激性小，不影響精神，食欲，注射局部無腫脹，無壞死。
[0016]3、該疫苗可在較大的溫度范圍下保存運(yùn)輸，0-30°C環(huán)境中保存6個(gè)月不變色，不分層，不影響免疫期。
[0017]4、本發(fā)明在疫苗制備工藝中選用純牛奶做為培養(yǎng)基，用高壓鍋進(jìn)行高壓滅菌，厭氧培養(yǎng)和爆裂發(fā)酵，培養(yǎng)出來的菌苗質(zhì)量好，保護(hù)率高。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明實(shí)施例所述的一種豬A型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟:
1)將由梭菌致死的病豬挑選病料，刮取腸道內(nèi)容物，冷藏或冷凍；
2)用純牛奶作為培養(yǎng)基，高壓鍋內(nèi)121°C高壓滅菌，待到溫度降到80°C時(shí)，把病料倒入高壓鍋內(nèi)，厭氧培養(yǎng)；
3)將步驟2)中高壓厭氧培養(yǎng)的菌液過濾離心，得到上清液為毒素液；
4)在步驟3)中得到的毒素液中加入0.4%的甲醛，充分振搖，滅活脫毒；以及
5)將滅活脫毒的毒素液與氫氧化鋁佐劑按照4:1的重量比混合，高速攪拌后合成疫
苗；
所述步驟I)中，冷凍溫度為-20°C ;所述步驟2)中，厭氧培養(yǎng)條件為在37°C下培養(yǎng)10-18 h ;所述步驟3)中，過濾離心條件為在3000 r/min下離心20min ;所述步驟4)中，滅活脫毒條件是37°C下滅活脫毒3-5天；所述步驟4)中，滅活脫毒期間每隔4小時(shí)間斷振搖。
[0019]豬A型魏氏梭菌疫苗的檢驗(yàn)方法
I)本品靜置后，上層為無色液體，下層為乳白色沉淀，振搖后呈均勻混懸液。
[0020]2)無菌檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。
[0021]3)安全檢驗(yàn)用2-6月齡健康易感豬5只，各皮下注射疫苗6ml，連續(xù)觀察10日，應(yīng)全部健活。
[0022]4)效力檢驗(yàn)用2-6月齡健康易感豬5只，各皮下注射疫苗2ml,同時(shí)設(shè)不接種對(duì)照豬5只。免疫后14天采血，分離血清，分別測(cè)定抗梭菌HI抗體，免疫豬抗梭菌HI抗體均應(yīng)^ 1:32，對(duì)照豬抗梭菌HI抗體均應(yīng)< 1:4。
[0023]甲醛殘留量測(cè)定
按《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)符合獸用生物制品通則的規(guī)定。
[0024]豬A型魏氏梭菌滅活疫苗安全性試驗(yàn)
(I)最小使用日齡豬一次單劑量接種疫苗的安全性試驗(yàn)取30日齡健康易感豬20只，隨機(jī)分成4組，5只/組。前3組分別脖子肌肉注射按本發(fā)明提供的方法制備的3個(gè)批次的疫苗(第I批、第2批和第3批)，2ml/只；第4組不接種作為對(duì)照。相同條件下飼養(yǎng)，觀察10日，每日觀察犬精神、飲食、糞便是否正常，注射部位及全身有無不良反應(yīng)。
[0025]結(jié)果:經(jīng)肌肉注射一次單劑量后，豬精神狀態(tài)、飲食、糞便均正常，注射部位及全身未見不良反應(yīng)，所有豬均健活。
[0026](2)單劑量重復(fù)接種 疫苗的安全性試驗(yàn)取30日齡健康易感豬20只，隨機(jī)分成4組，5只/組。前3組分別肌肉接種以上制備的3個(gè)批次的疫苗，2ml/只，14日后加強(qiáng)免疫一次，2ml/只；第4組不接種作為對(duì)照。相同條件下飼養(yǎng)，觀察10日，每日觀察豬精神、飲食、糞便是否正常，注射部位及全身有無不良反應(yīng)。
[0027]結(jié)果:經(jīng)肌肉途徑重復(fù)接種疫苗后，豬精神狀態(tài)、飲食、糞便均正常，注射部位及全身未見不良反應(yīng)，所有豬均健活。
[0028](3)—次超劑量接種疫苗的安全性試驗(yàn)取30日齡健康易感豬20只，隨機(jī)分成4組，5只/組。前3組分別肌肉接種3個(gè)批次疫苗，6ml/只；第4組不接種作為對(duì)照。相同條件下飼養(yǎng)，觀察10日，每日觀察豬精神、飲食、糞便是否正常，注射部位及全身有無不良反應(yīng)。
[0029](4)疫苗對(duì)懷孕母豬的安全性試驗(yàn)取懷孕母豬10只，隨機(jī)分成2組，5只/組。第I組于產(chǎn)前20日肌肉接種疫苗，8ml/只；第2組不接種作為對(duì)照。相同條件下飼養(yǎng)，觀察10日，每日觀察豬精神、飲食、糞便是否正常，注射部位及全身有無不良反應(yīng)，并跟蹤觀察其產(chǎn)仔情況。
[0030]結(jié)果:懷孕母豬于產(chǎn)前20齡經(jīng)肌肉超劑量接種后，母豬精神狀態(tài)、飲食、糞便均正常，注射部位及全身未見不良反應(yīng)，所有豬均健活，且產(chǎn)仔正常。
[0031](5)結(jié)論用3批豬A型魏氏梭菌滅活苗進(jìn)行了一次單劑量接種的安全試驗(yàn)、單劑量重復(fù)接種的安全性試驗(yàn)、一次超劑量接種的安全試驗(yàn)，結(jié)果均是安全的。表明該疫苗用于免疫接種豬是安全的。
[0032]豬A型魏氏梭菌滅活疫苗效力試驗(yàn)
取以上本發(fā)明人制備的3批豬A型魏氏梭菌滅活疫苗，取健康易感豬20只，隨機(jī)分為4組，5只/組。1、2、3組豬分別肌肉接種3批疫苗2ml/只，對(duì)照組不進(jìn)行免疫。3個(gè)免疫組合對(duì)照組在免疫后14日口服梭菌活培養(yǎng)液15ml攻毒，觀察10日，記錄發(fā)病情況。
[0033]結(jié)果:3批疫苗試驗(yàn)結(jié)果無明顯差異。疫苗免疫后14日，對(duì)梭菌活培養(yǎng)液攻毒的保護(hù)率均為100%。
[0034]本發(fā)明不局限于上述最佳實(shí)施方式，任何人在本發(fā)明的啟示下都可得出其他各種形式的產(chǎn)品，但不論在其形 狀或結(jié)構(gòu)上作任何變化，凡是具有與本申請(qǐng)相同或相近似的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種豬A型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將由梭菌致死的病豬挑選病料，刮取腸道內(nèi)容物，冷藏或冷凍； 2)用純牛奶作為培養(yǎng)基，高壓鍋內(nèi)121°C高壓滅菌，待到溫度降到80°C時(shí)，把病料倒入高壓鍋內(nèi)，厭氧培養(yǎng)； 3)將步驟2)中高壓厭氧培養(yǎng)的菌液過濾離心，得到上清液為毒素液； 4)在步驟3)中得到的毒素液中加入0.4%的甲醛，充分振搖，滅活脫毒；以及 5)將滅活脫毒的毒素液與氫氧化鋁佐劑按照4:1的重量比混合，高速攪拌后合成疫 苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬A型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁滅活疫苗的制備方法，其特征在于:所述步驟I)中，冷凍溫度為-20°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬A型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁滅活疫苗的制備方法，其特征在于:所述步驟2)中，厭氧培養(yǎng)條件為在37°C下培養(yǎng)10-18 h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬A型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁滅活疫苗的制備方法，其特征在于:所述步驟3)中，過濾離心條件為在3000轉(zhuǎn)/分鐘下離心20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬A型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁滅活疫苗的制備方法，其特征在于:所述步驟4)中，滅活脫毒條件是37°C下滅活脫毒3-5天。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬A型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁滅活疫苗的制備方法，其特征在于:所述步驟4)中，滅活脫毒期間每隔4小時(shí)間斷振搖。
【文檔編號(hào)】A61K39/08GK103721254SQ201310749053
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】楊耀光, 張俊清, 高志勇, 郝俊飛, 黃建華, 趙建紅 申請(qǐng)人:鄂爾多斯市旭和畜牧有限責(zé)任公司, 內(nèi)蒙古中草藥防治動(dòng)物疾病研究院