化學(xué)合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明化學(xué)合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。本發(fā)明是通過計算機分析，篩選出HSV2病毒gE糖蛋白內(nèi)的強抗原表位，第21個氨基酸至第414個氨基酸，共394個氨基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技術(shù)，表達(dá)該基因片段、制備HSV2病毒gE糖蛋白的強抗原表位片段。表達(dá)的HSV2病毒gE糖蛋白的強抗原表位片段，可用于HSV2疫苗研制、抗體的檢測及用于免疫制備抗HSV2病毒單抗和多抗等。
【專利說明】化學(xué)合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是化學(xué)合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)的全新基因片段，利用基因工程技術(shù)，制備重組HSV2病毒gE糖蛋白。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外區(qū)片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)，表達(dá)的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗體或抗原的檢測等，本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)、疫苗和診斷試劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]單純皰疫病毒(Herpers simplex virus, HSV)屬于皰疫病毒科α亞科,是人類感染的常見病毒之一，根據(jù)血清型可分為I和II型兩種。其中，I型主要通過口面部感染，也存在性傳播，II型主要通過性傳播，并且和女性宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。近期越來越多的研究表明，HSV I對阿茲海默癥的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，HIV的感染和HSV II也有聯(lián)系。HSV在全球普遍流行，HSV I型在成人血清中陽性率高達(dá)85%以上，HSV II型全球血清陽性率約為20%，并且發(fā)病人數(shù)以每年25%速度增加。
[0003]HSV可在感染組織或附近部位繁殖形成原發(fā)病灶，并在三叉神經(jīng)核脊神經(jīng)建立終身的潛伏感染，當(dāng)機體受到外界刺激或免疫力下降是，HSV病毒下行至表皮大量增殖，形成復(fù)發(fā)感染。HSV反復(fù)發(fā)作與HSV免疫逃逸相關(guān)，HSV通過躲避人體免疫系統(tǒng)的攻擊實現(xiàn)潛伏感染和復(fù)發(fā)感染，因此HSV —旦感染，很難被清除，患者受到長期疾病折磨。
[0004]病毒糖蛋白(glycoproteins, gp)是病毒毒粒表面的抗原決定簇，目前已發(fā)現(xiàn)并正式命名的包膜糖蛋白共有12個(gB、gC、gD、gE、gG、gH、g1、gK、gL和gM等)。gB和gD糖蛋白參與病毒與宿主細(xì)胞的吸附和融合，已被選作候選疫苗，對其研究較多。近年研究發(fā)現(xiàn)，gE2是免疫逃逸相關(guān)的包膜糖蛋白。HSV病毒包膜蛋白gE與IgG Fe端結(jié)合，從而阻斷多個補體介導(dǎo)的免疫途徑，使HSV病毒成功躲避機體的免疫系統(tǒng)攻擊。因此他是造成病毒潛伏感染的蛋白分子之一。選取gE糖蛋白用于免疫機體，阻斷病毒的潛伏感染，有希望成為理想的候選疫苗。
[0005]本發(fā)明通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外區(qū)片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有較好的抗原性和特異性，表達(dá)的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗體或抗原的檢測等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明是化學(xué)合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)的全新基因片段，利用基因工程技術(shù)，制備重組HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)片段。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)片段，第21個氨基酸一第414個氨基酸，共394個氨基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)該基因。表達(dá)的蛋白可用于疫苗、HSV2病毒抗體或抗原的檢測及用于免疫制備抗HSV2病毒單抗和多抗等。
[0007]本發(fā)明通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外區(qū)片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有較好的抗原性和特異性，表達(dá)的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗體或抗原的檢測等。
[0008]化學(xué)合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)基因片段及其表達(dá)、應(yīng)用是釆取以下步驟實現(xiàn)的:
1.HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成:
利用ANTHEWIN等軟件，通過計算機分析HSV2病毒gE糖蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)gE糖蛋白的N端(第21氨基酸一第414氨基酸)含有較強的抗原決定簇。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成全新的基因序列，并且在5’端增加了及^RI酶切位點(下劃線部分)、起始密碼子(ATG)、信號肽(GGCTGGAGCTGTATTATCCTGTTCCTGGTCGCCACTGCCACTGGAGITCAITCTGCC)，在3’ 端增加了His標(biāo)記(CAC CAC CAC CAC CAC CAC)、終止密碼子(TGA)取Himd III酶切位點(下劃線部分)，使該基因片段易于克隆至質(zhì)粒PMCE5內(nèi)的及^RI和Himd III酶切位點內(nèi)。
[0009]篩選的HSV2病毒gE糖蛋白內(nèi)的抗原表位氨基酸序列(第21個aa —第414個aa):
【權(quán)利要求】
1.一種化學(xué)合成的HSV2病毒gE糖蛋白的胞外區(qū)基因片段，該基因片段編碼含強抗原表位的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外區(qū)基因片段，即第21個氨基酸至第414個氨基酸，共419個氨基酸，在5’端增加了 AcoRI酶切位點(下劃線部分)、起始密碼子(ATG)、信號肽(GGCTGGAGCTGTATTATCCTGTTCCTGGTCGCCACTGCCACTGGAGTTCA TTCTGCC)，在 3’ 端增加了 His 標(biāo)記(CAC CAC CAC CAC CAC CAC)、終止密碼子(TGA)和歷III酶切位點(下劃線部分)，化學(xué)合成的基因序列全長1282 bp，序列如下:
GAATTC GCC GCC ACC ATG GGC TGG AGC TGT ATT ATC CTG TTC CTG GTC GCC ACT GCCACT GGA GTT CAT TCT GCC GCC CCT CGG ACA TCT TGG MA AGG GTG ACC AGC GGA GAG GATGTG GTC CTG CTG CCT GCA CCA GCT GAA AGG ACA CGA GCA CAC MG CTG CTG TGG GCA GCTGAG CCT CTG GAC GCA TGC GGT CCA CTG CGA CCA TCT TGG GTG GCC CTG TGG CCA CCT AGGCGG GTC CTG GAG ACC GTG GTC GAT GCA GCC TGT ATG AGA GCT CCC GAA CCT CTG GCA ATCGCC TAC TCT CCA CCC TTC CCA GCA GGC GAT GAG GGA CTG TAT AGT GAA CTG GCT TGG AGAGAC CGC GTG GCA GTG GTC AAC GAG TCC CTG GTC ATC TAC GGC GCC CTG GAA ACA GAT AGCGGA CTG TAT ACT CTG TCA GTG GTC GGA CTG TCC GAC GAG GCA CGA CAG GTG GCT TCC GTGGTC CTG GTG GTC GM CCA GCA CCA GTG CCT ACT CCA ACC CCA GAC GAT TAC GAC GAG GAAGAC GAT GCT GGC GTG ACT AAC GCA AGA CGC TCA GCC TTC CCT CCA CAG CCA CCT CCA AGGAGG CCC CCT GTG GCA CCA CCA ACC CAC CCA CGC GTC ATC CCA GAG GTG TCC CAC GTC CGAGGA GTG ACT GTC CAT ATG GAG ACC CTG GAA GCT ATT CTG TTC GCA CCT GGG GAA ACA TTTGGT ACT AAT GTG AGT ATC CAC GCT ATT GCA CAT GAC GAT GGA CCC TAT GCT ATG GAC GTGGTC TGG ATG CGA TTT GAT GTG CCT TCC AGC TGC GCC GAC ATG AGG ATC TAC GAG GCT TGTCTG TAT CAT CCT CAG CTG CCA GM TGC CTG TCC CCT GCC GAT GCT CCA TGT GCC GTG TCTAGT TGG GCC TAC CGA CTG GCT GTG CGT AGC TAT GCT GGC TGC TCT AGG ACC ACA CCT CCACCC CGG TGT TTC GCA GAG GCC AGA ATG GAA CCT GTG CCA GGA CTG GCT TGG CTG GCA AGTACA GTG AAC CTG GAG TTT CAG CAC GCA TCA CCA CAG CAT GCC GGG CTG TAC CTG TGC GTGGTC TAT GTG GAC GAT CAC ATC CAT GCC TGG GGT CAT ATG ACC ATT AGC ACA GCT GCA CAGTAC AGG AAT G CT GTG GTC GAG CAG CAC CTG CCA CAG CGT CAG CCA GAG CCT GTG GAA CCAACC CGC CCT CAT GTC AGA GCA CCC CAC CCC GCC CCT TCA GCC AGA GGA CCC CTG CGT CACCAC CAC CAC CAC CAT TGA TAAGCTT 。
2.權(quán)利要求1所述的化學(xué)合成的基因片段，采用基因工程技術(shù)表達(dá)該基因序列編碼的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外區(qū)基因片段，純化表達(dá)的蛋白片段，具體方法如下: 表達(dá)HSV2病毒的gE糖蛋白胞外區(qū)基因片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建: 用I琳Himd III雙酶切質(zhì)粒pMCE5和化學(xué)合成的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外區(qū)基因片段，電泳回收后，用T4 DNA連接酶連接，使HSV2病毒的gE糖蛋白胞外區(qū)基因片段插入到載體PMCE5內(nèi)的I熱Himd III位點之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達(dá)一個融合蛋白，全長419個氨基酸，該融合蛋白N端融合了載體上的19個氨基酸，C端包含HSV2病毒的gE糖蛋白內(nèi)的第21個氨基酸至第414個氨基酸及His標(biāo)簽(6個氨基酸)，全長419氨基酸序列如下:
Ala Ala Pro Arg Thr Ser Trp Lys Arg Val Thr Ser Gly Glu Asp Val Val Leu LeuPro Ala Pro Ala Glu Arg Thr Arg Ala His Lys Leu Leu Trp Ala Ala Glu Pro Leu AspAla Cys Gly Pro Leu Arg Pro Ser Trp Val Ala Leu Trp Pro Pro Arg Arg Val Leu GluThr Val Val Asp Ala Ala Cys Met Arg Ala Pro Glu Pro Leu Ala lie Ala Tyr Ser ProPro Phe Pro Ala Gly Asp Glu Gly Leu Tyr Ser Glu Leu Ala Trp Arg Asp Arg Val AlaVal Val Asn Glu Ser Leu Val He Tyr Gly Ala Leu Glu Thr Asp Ser Gly Leu Tyr ThrLeu Ser Val Val Gly Leu Ser Asp Glu Ala Arg Gln Val Ala Ser Val Val Leu Val ValGlu Pro Ala Pro Val Pro Thr Pro Thr Pro Asp Asp Tyr Asp Glu Glu Asp Asp Ala GlyVal Thr Asn Ala Arg Arg Ser Ala Phe Pro Pro Gln Pro Pro Pro Arg Arg Pro Pro ValAla Pro Pro Thr His Pro Arg Val He Pro Glu Val Ser His Val Arg Gly Val Thr ValHis Met Glu Thr Leu Glu Ala He Leu Phe Ala Pro Gly Glu Thr Phe Gly Thr Asn ValSer He His Ala He Ala His Asp Asp Gly Pro Tyr Ala Met Asp Val Val Trp Met ArgPhe Asp Val Pro Ser Ser Cys Ala Asp Met Arg lie Tyr Glu Ala Cys Leu Tyr His ProGln Leu Pro Glu Cys Leu Ser Pro Ala Asp Ala Pro Cys Ala Val Ser Ser Trp Ala TyrArg Leu Ala Val Arg Ser Tyr Ala Gly Cys Ser Arg Thr Thr Pro Pro Pro Arg Cys PheAla Glu Ala Arg Met Glu Pro Val Pro Gly Leu Ala Trp Leu Ala Ser Thr Val Asn LeuGlu Phe Gln His Ala Ser Pro Gln His Ala Gly Leu Tyr Leu Cys Val Val Tyr Val AspAsp His He His Ala Trp Gly His Met Thr He Ser Thr Ala Ala Gln Tyr Arg Asn AlaVal Val Glu Gln His Leu Pro Gln Arg Gln Pro Glu Pro Val Glu Pro Thr Arg Pro HisVal Arg Ala Pro His Pro Ala Pro Ser Ala Arg Gly Pro Leu Arg 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定: 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂布含氨芐青霉素(100 μ g / ml) LB平板，置.37 0C過夜；次日隨機挑取轉(zhuǎn)化菌落、I個對照菌(質(zhì)粒PMCE5轉(zhuǎn)化菌)I個陽性對照菌(pUC57-gE2)，菌液PCR擴增HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)基因片段，含HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)基因片段的陽性重組質(zhì)粒，應(yīng)擴增出長約1282bp的基因片段；在提取陽性單菌落質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定及測序； 重組質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中的表達(dá)鑒定: CHO細(xì)胞在不含血清的細(xì)胞表達(dá)培養(yǎng)基在錐形瓶中震蕩培養(yǎng)，370C，5% CO2,轉(zhuǎn)染前一天，以適當(dāng)?shù)臐舛葘HO細(xì)胞接種于不含血清的細(xì)胞表達(dá)培養(yǎng)基中，震蕩懸浮培養(yǎng)，37°C，5%CO2 ;用DNA和PEI混合物轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后第五天收集細(xì)胞上清，檢測蛋白表達(dá)水平，第六天收集所有上清用于純化重組蛋白； 重組蛋白的純化、鑒定和濃度檢測: 收集細(xì)胞上清100ml，離心后將上清以lml/min的速度加入His Trap? FF crudecolumn 中；10 倍體積平衡液(I XPBS, 0.5mol/L NaCl, 20mmol/L imidazole,ρΗ7.4)洗脫雜蛋白，再加入 Iml 洗脫液(I XPBS, 0.5mol/L NaCl, 500mmol/L imidazole,pH7.4)洗脫目的蛋白，靜置20分鐘后洗脫，收集洗脫液，用透析液(lXPBS，0.5mol/L NaCl，pH7.4)透析過夜，即為純化的目的蛋白，SDS-PAGE、Western Blot檢測，并測定蛋白濃度；純化獲得的gE2蛋白分子量約為55kD。
3.權(quán)利要求1所述的化學(xué)合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)的基因片段序列，利用細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動植物進(jìn)行重組表達(dá)、制備。
4.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的方法制備的HSV2病毒gE糖蛋白胞外區(qū)片段，用于HSV2病毒亞 單位疫苗的研制及抗體檢測。
【文檔編號】A61P31/22GK103740736SQ201310751325
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】李越希, 潘英, 周潔, 尚彥紅, 徐悅玥, 許桂麗, 張素芬, 馬穎, 袁敬宇, 李素芹, 李丙軍, 陳樂如, 蔡冉 申請人:李越希