一種細胞孵化器的制造方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種細胞孵化器，它包括外管、設于外管內且與外管等長的若干根中空濾管；中空濾管兩端外緣通過密封膜與外管兩端內緣密封固定；外管上設有細胞培養(yǎng)基進口和細胞培養(yǎng)基出口；所述細胞培養(yǎng)基進口和細胞培養(yǎng)基出口均與中空濾管、密封膜及外管圍成的腔室連通；所述外管上端設有密封上蓋，密封上蓋頂端設有動脈端口；所述外管下端設有密封下蓋，密封下蓋下端設有靜脈端口；所述中空濾管內壁上設有細胞抗體層。由于孵化器本身不帶有細胞，而是在植入體內后才捕獲并培養(yǎng)自體細胞，因此，血液相容性顯著提高，不會引發(fā)免疫反應，不會激活凝血，滿足長時間連續(xù)性在體細胞培養(yǎng)需要。生理環(huán)境中獲得的細胞層面，具備成熟、穩(wěn)定、可自行更新等優(yōu)點。
【專利說明】一種細胞孵化器
【技術領域】
[0001]本實用新型屬再生醫(yī)學【技術領域】，具體涉及一種細胞孵化器。
【背景技術】
[0002]據報道，全世界每年約有上千萬人遭受各種形式的創(chuàng)傷，有數百萬人因在疾病康復過程中重要器官發(fā)生纖維化而導致功能喪失，有數十萬人迫切希望進行各種器官移植。但令人遺憾的是，一方面，目前的組織器官修復無論是體表還是內臟，仍然停留在瘢痕愈合的解剖修復層面上，離人們所希望的“再生出一個完整的受損器官”差距甚遠；另一方面，器官移植作為一種替代治療方法盡管有其巨大的治療作用，但它仍然是一種“拆東墻補西墻”的有損傷和有代價的治療方法。由于移植器官來源受限及倫理學等方面的限制，人們更加迫切需要復制所需要的組織或器官來進行替代性治療。隨著細胞生物學、分子生物學、免疫學及遺傳學等基礎學科的迅猛發(fā)展，以及干細胞和組織工程技術在現(xiàn)代醫(yī)學基礎和臨床的應用，使得現(xiàn)代再生醫(yī)學在臨床應用方面顯示出良好的發(fā)展前景。如在再生腎領域，有學者提出通過3D打印技術，“打印”一個具備腎臟輪廓及微細結構的器官，并以此為支撐材料，進行體外細胞培養(yǎng)，在支撐材料上培育出腎臟細胞，以實現(xiàn)腎臟的再造。也有在支架材料表面種植肝細胞，通過體外培養(yǎng)獲得生物人工肝，替代受損肝臟，發(fā)揮生物合成及解毒作用。但是，該些技術建立在體外細胞培養(yǎng)技術基礎之上，體外培養(yǎng)細胞無法獲取機體相同的生長環(huán)境，因而，培育出來的細胞在植入機體后，不能適應機體的生理環(huán)境。因而，目前在復制組織器官方面，仍然缺少一個理想的細胞培育方法。市面上有中空濾管外套、外管的裝置，但其主要用于水處理或血液過濾，目前有學者嘗試采用該裝置研制人工腎臟，即在體外培養(yǎng)腎臟細胞，然后將腎臟細胞注入中空管中。然而，該研制方法仍然建立在體外細胞培養(yǎng)技術之上。體外細胞培養(yǎng)需時長，存在較高的污染風險。而且，即使細胞培育成功，在移植體內后，也不能承受血流沖刷而脫落。實驗證明:體外培養(yǎng)獲得的人工腎臟接體循環(huán)I個小時即開始有細胞脫落，24小時幾乎脫落完全，離實現(xiàn)移植物的長期存活目標相去甚遠。另外，體外培養(yǎng)的細胞在植入體內后可能會產生排異反應，效果并不理想。與此同時，現(xiàn)有的人造肝臟、心臟等研究也存在同樣的技術問題。
實用新型內容
[0003]本實用新型旨在克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種在體細胞孵化器。
[0004]為了達到上述目的，本實用新型提供的技術方案為:
[0005]所述細胞孵化器，它包括外管、設于外管內且與外管等長的若干根中空濾管；中空濾管兩端外緣通過密封膜與外管兩端內緣密封固定；外管上設有細胞培養(yǎng)基進口和細胞培養(yǎng)基出口；所述細胞培養(yǎng)基進口和細胞培養(yǎng)基出口均與中空濾管、密封膜及外管圍成的腔室連通；所述外管上端設有密封上蓋，密封上蓋頂端設有動脈端口 ；所述外管下端設有密封下蓋，密封下蓋下端設有靜脈端口 ；所述中空濾管內壁上設有細胞抗體層。
[0006]其中，所述細胞抗體層通過層粘連蛋白與中空濾管內壁結合；所述腔室內填充含有細胞生長因子及抗凝劑的半固態(tài)或液態(tài)細胞培養(yǎng)基；所述細胞培養(yǎng)基的PH值為7.2~
7.4 ;所述細胞培養(yǎng)基為MEM、DMEM、RPM1-1640、199細胞培養(yǎng)基系列或天然培養(yǎng)基等；所述細胞生長因子為血管內皮細胞生長因子、上皮細胞生長因子、肝細胞生長因子、成纖維細胞生長因子等；所述抗凝劑為:肝素、阿加曲班、水蛭素等。所述細胞抗體層為干細胞抗體層。所述干細胞抗體為MSC抗體。
[0007]下面以腎小球細胞孵化器為例，結合原理、制備方法及使用方法對本實用新型作進一步說明:
[0008]本實用新型的細胞孵化器(以下簡稱“孵化器”)外形可采用現(xiàn)有的血濾器，或用聚羥基丁酸酯、聚碳酸酯、聚氨酯等可降解材料制作。首先通過浸潰法在中空濾管內壁涂覆細胞外基質成分(層黏連蛋白、膠原蛋白溶液等):將細胞外基質成分溶液注入中空濾管，將孵化器置于37°C孵箱中孵育一段時間，之后抽去溶液，再將孵化器置于37°C恒溫干燥箱中干燥。用電鏡掃描中空濾管，可見中空濾管內表面附著有細胞外基質成分。然后通過浸潰法將骨髓間充質干細胞(MSC)抗體固定于中空濾管內壁:將MSC抗體溶液注入中空濾管后,將孵化器置于37°C孵箱中孵育一段時間，然后將溶液抽出，再將孵化器置于37°C恒溫干燥箱中干燥，備用。從細胞培養(yǎng)基進口或細胞培養(yǎng)基出口向腔室注入包含血管內皮細胞生長因子及抗凝劑的細胞培養(yǎng)基(培養(yǎng)基PH在7.2~?.4，PH<7.2時更換培養(yǎng)基)，密封、消毒后于2-8 0C保存，該孵化器保存期為I月?；蛘邔⒅锌諡V管被固定MSC抗體后的孵化器植入體內后，再從細胞培養(yǎng)基進口向腔室注入包含血管內皮細胞生長因子及抗凝劑的細胞培養(yǎng)基(培養(yǎng)基PH在7.2~7.4，PH<7.2時更換培養(yǎng)基)。
[0009]使用孵化器時需要將孵化器植入體內，將孵化器動脈端口與股動脈(頸動脈)連接，將靜脈端口與股靜脈(頸靜脈)連接，形成動脈一孵化器一靜脈的血液循環(huán)通路。血流中干細胞和中空濾管內的干細胞抗體結合，在腔室細胞培養(yǎng)基作用下，增殖分化形成血管內皮細胞層，從而獲得完美血液相容性界面，維持血液循環(huán)順利進行，同時保留中空濾管的濾過性能。成束的中空濾管類似腎小球的小動脈叢,并且同樣具備小動脈的內皮細胞層,故而符合腎小球的基本生理結構特點，實現(xiàn)了腎小球的再生；另外，通過改變細胞培養(yǎng)基的配方，還可實現(xiàn)肝臟、心臟等多種組織細胞的再生。使用時，定期更換包含細胞生長因子及抗凝劑的細胞培養(yǎng)基即可。
[0010]本實用新型另辟蹊徑，在體外構建腎小球細胞“孵化器”，該孵化器具備腎小球的大體結構特點，由類似腎小球動脈的多根中空濾管組成，中空濾管內表面固定有MSC抗體，能捕獲血流中的MSC。所捕獲的MSC在中空濾管內壁能增殖分化成內皮細胞表層。中空濾管浸泡于細胞培養(yǎng)基中，細胞培養(yǎng)基可定期更換，誘導所捕獲的MSC細胞定向有序分化。植入機體后，將血流引入中空濾管內表面，通過表面MSC抗體特異性結合血流中的MSC，從而將MSC固定在中空濾管內表面，中空濾管內壁內皮細胞層形成后，能避免管材料和血流直接接觸，防止免疫反應和促發(fā)凝血，實現(xiàn)連續(xù)性的血液循環(huán)和溶質濾過。采用在體細胞培養(yǎng)技術，可將固定的干細胞培育為血管內皮細胞。獲得的血管內皮細胞層可將中空濾管和血流隔開，從而避免免疫反應，并保留中空濾管的濾過功能，實現(xiàn)腎小球的再生。MSC是機體多種組織細胞的祖始細胞，通過 改變“孵化器”中空濾管內培養(yǎng)基配方，還可將MSC培養(yǎng)培養(yǎng)成肝臟、心臟、胰腺等多種組織細胞。本實用新型中應用到的細胞捕獲技術，是近些年在細胞工程領域興起的一項技術，其原理是:將細胞抗體固定在材料表面，利用該抗體能特異性結合相應細胞的能力,捕獲血流中的目標細胞。該技術在構建自體內皮祖細胞捕獲血管支架研究中，已經取得了成功并日趨成熟。
[0011]與現(xiàn)有技術相比，本實用新型的有益效果包括:
[0012]由于細胞孵化器本身不帶有細胞，而是在植入體內后才培育細胞，因此，血液相容性顯著提高，不會引發(fā)免疫反應，不會激活凝血。生理環(huán)境中獲得的自體細胞層面，具備成熟、穩(wěn)定、可自行更新等優(yōu)點。另外，本實用新型的細胞孵化器可批量生產，有較高的經濟效益，同時作為再造人體器官研究的一部分，為再造人體器官的研發(fā)提供新思路，具備較高的社會價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本實用新型細胞孵化器結構示意圖；
[0014]圖2為圖1A處的放大圖。
[0015]圖中:1、外管；2、中空濾管；3、密封膜；4、細胞培養(yǎng)基進口 ；5、細胞培養(yǎng)基出口 ；
6、腔室；7、密封上蓋；8、動脈端口 ；9、密封下蓋；10、靜脈端口 ；11、細胞抗體層。
【具體實施方式】
[0016]實施例1腎小球細胞孵化器
[0017]參見圖1，所述細胞孵化器包括外管1、設于外管I內且與外管I等長的若干根中空濾管2 ;中空濾管2兩端外緣通過密封膜3與外管I兩端內緣密封固定；外管I上設有細胞培養(yǎng)基進口 4和細胞培養(yǎng)基出口 5 ;所述細胞培養(yǎng)基進口 4和細胞培養(yǎng)基出口 5均與中空濾管2、密封膜3及外管I圍成的腔室6連通；所述外管2上端設有密封上蓋7，密封上蓋7頂端設有動脈端口 8 ;所述外管2下端設有密封下蓋9，密封下蓋9下端設有靜脈端口 10 ；其特征在于，所述中空濾管2內壁上設有MSC抗體層11。所述MSC抗體層11通過膠原蛋白與中空濾管2內壁結合。所述腔室6內填充含有血管內皮細胞生長因子及抗凝劑的細胞培養(yǎng)基。所述MSC抗體層11通過層粘連蛋白與中空濾管2內壁結合。
[0018]其中，所述細胞培養(yǎng)基的PH值為7.2?7.4。所述細胞培養(yǎng)基為MEM細胞培養(yǎng)基。所述細胞生長因子為血管內皮細胞生長因子；所述抗凝劑為阿加曲班。
[0019]上述孵化器的制備及效果檢測如下:
[0020](I)孵化器外形制備。備血濾器(AV400，0.7m2，費森尤斯)，用作孵化器外形。先用無血清的MEM培養(yǎng)基沖洗，再把無血清MEM配制的層黏連蛋白10ug/ml注入中空濾管中，置于37°C孵箱中孵育I h，之后將溶液抽去。37°C恒溫干燥箱中干燥備用。修飾后中空濾管經掃描電鏡檢測，可見中空濾管內表面全部被修飾物覆蓋，并附著均勻；
[0021](2)中空濾管內壁MSC抗體固定。將MSC抗體溶液注入中空濾管，37°C孵箱中孵育過夜，之后將溶液抽去。37°C恒溫干燥箱中干燥備用；
[0022](3)腔室充填細胞培養(yǎng)基及抗凝成分。孵化器外腔注滿含5%(質量百分比含量)胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，內含血管內皮細胞生長因子(20ug/L)以及抗凝成分阿加曲班(IOmg/L)。
[0023](4)MSC在體培養(yǎng)。通過動脈端、靜脈端對接將孵化器植入機體。維持動脈-中
空濾管一靜脈的有效血流循環(huán)。PH〈7.2時更換培養(yǎng)基。注意循環(huán)管路凝血情況，及時調整抗凝成分用量；
[0024]( 5)內皮細胞形態(tài)及功能檢測。6個月后，掃描電鏡檢測見中空濾管內壁完全被覆內皮細胞，形態(tài)正常，沿長軸密集排列，成單層生長于中空濾管內腔內。6個月后，收集培養(yǎng)基，進行內皮素水平測定(32.3±7.9pg/ml)證明內皮細胞存活并保持正常的分泌功能。
[0025](6)進行連續(xù)的血液凈化實驗。抽出孵化器腔室培養(yǎng)基及抗凝成分，進行連續(xù)的血液凈化。動物實驗中觀察到該再生腎小球在不應用任何抗凝劑的情況下，連續(xù)順利進行血液凈化最長時間達I個月，且中空濾管內表面內皮細胞可自行更新。理論上，該再生腎小球可望實現(xiàn)永久的血液凈化。
[0026](7)再生腎小球溶質轉運功能測定。經檢測，尿素氮清除率210.7±55.3(ml/min)、肌酐清除率192.6±34.5(ml/min)，提示其小分子物質轉運功能和血濾器無統(tǒng)計學差別。維生素B12清除率68.l±15.7(ml/min)，提示其較大分子物質轉運能力較血濾器有輕度下降，但通過連續(xù)的血液凈化，該溶質轉運能力完全可以得到補償。
[0027]實施例2腎小球細胞孵化器
[0028]參見圖1，所述細胞孵化器包括外管1、設于外管I內且與外管I等長的若干根中空濾管2 ;中空濾管2兩端外緣通過密封膜3與外管I兩端內緣密封固定；外管I上設有細胞培養(yǎng)基進口 4和細胞培養(yǎng)基出口 5 ;所述細胞培養(yǎng)基進口 4和細胞培養(yǎng)基出口 5均與中空濾管2、密封膜3及外管I圍成的腔室6連通；所述外管2上端設有密封上蓋7，密封上蓋7頂端設有動脈端口 8 ;所述外管2下端設有密封下蓋9，密封下蓋9下端設有靜脈端口 10 ；其特征在于，所述中空濾管2內壁上設有MSC抗體層11。所述MSC抗體層11通過膠原蛋白與中空濾管2內壁結合。所述MSCs抗體層11通過膠原蛋白與中空濾管2內壁結合。
[0029]上述孵化器的制備及效果檢測如下:
[0030](I)孵化器外形制備。以聚羥基丁酸酯為原料，采用靜電紡絲技術制備中空濾管。將中空濾管成束放入成形的外管內，外管與中空濾管之間采用聚氨脂(密封膜)進行密封，外管兩端用端蓋密封。外管留有細胞培養(yǎng)基進出口，端蓋留有動、靜脈端口。外管和端蓋材料為聚碳酸酯，封口膠材料為聚氨酯膠，在外管和端蓋之間設一密封圈，密封圈材料為硅膠；
[0031](2)中空濾管內壁修飾。取膠原蛋白溶液3mg/ml，將PH調至7.2?7.4，加入交聯(lián)劑EDAC (0.lmg/mg膠原)，配制膠原蛋白交聯(lián)溶液。將該溶液注入中空濾管內，置于37°C孵箱中孵育I h，之后將溶液抽去。37°C恒溫干燥箱中干燥備用。反復多次獲得膠原蛋白多層膜；
[0032](3)中空濾管內壁MSC抗體固定。將MSC抗體溶液注入中空濾管內，37°C孵箱中孵育過夜，之后將其抽去。37°C恒溫干燥箱中干燥備用；
[0033](4) MSC在體培養(yǎng)。通過動脈端、靜脈端對接將前述方法制備的孵化器植入機體。維持動脈一中空管一靜脈的有效血流循環(huán)。注意循環(huán)管路凝血情況，及時調整抗凝成分用量。在腔室中注入內皮細胞培養(yǎng)基(含5% (質量百分比含量)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，含血管內皮細胞生長因子濃度為20ug/L、肝素抗凝劑濃度12500IU/L)，定期更換，保持培養(yǎng)基PH值>7.2 ;
[0034](5)內皮細胞形態(tài)及功能檢測。6個月后，掃描電鏡檢測見中空濾管內表面完全被覆內皮細胞，形態(tài)正常，沿長軸密集排列。留取細胞培養(yǎng)基進行內皮素水平測定(52.7±11.6pg/ml)證明內皮細胞存活并保持正常的分泌功能。
[0035](6)進行連續(xù)的血液凈化實驗。動物實驗血液凈化中觀察到所獲得的再生腎小球在不應用任何抗凝劑的情況下，連續(xù)順利進行血液凈化最長時間達30天。
[0036](7)再生腎小球溶質轉運功能測定。經檢測，尿素氮清除率230±61.7(ml/min)、肌酐清除率203.3±74.5(ml/min)，維生素B12清除率93.2±21.9 (ml/min)，尿素氮、肌酐、維生素B12轉運能力和血濾器無統(tǒng)計學差別。
[0037]實施例3肝細胞孵化器
[0038]參見圖1，所述細胞孵化器包括外管1、設于外管I內且與外管I等長的若干根中空濾管2 ;中空濾管2兩端外緣通過密封膜3與外管I兩端內緣密封固定；外管I上設有細胞培養(yǎng)基進口 4和細胞培養(yǎng)基出口 5 ;所述細胞培養(yǎng)基進口 4和細胞培養(yǎng)基出口 5均與中空濾管2、密封膜3及外管I圍成的腔室6連通；所述外管2上端設有密封上蓋7，密封上蓋7頂端設有動脈端口 8 ;所述外管2下端設有密封下蓋9，密封下蓋9下端設有靜脈端口 10 ；其特征在于，所述中空濾管2內壁上設有MSC抗體層11。所述MSC抗體層11通過膠原蛋白與中空濾管2內壁結合。
[0039]上述孵化器的制備及效果檢測如下:
[0040](I)孵化器外形制備。以聚羥基丁酸酯為原料，采用靜電紡絲技術制備中空濾管。將中空濾管成束放入成形的外管內，外管與中空濾管之間采用聚氨脂(密封膜)進行密封，外管兩端用端蓋密封。外管留有細胞培養(yǎng)基進出口，端蓋留有動、靜脈端口。外管和端蓋材料為聚碳酸酯，封口膠材料為聚氨酯膠，在外管和端蓋之間設一密封圈，密封圈材料為硅膠；
[0041](2)中空濾管內壁修飾。取膠原蛋白溶液3mg/ml，將PH調至7.2，加入交聯(lián)劑EDAC(0.lmg/mg膠原)，配制膠原蛋白交聯(lián)溶液。將該溶液注入中空濾管內，置于37°C孵箱中孵育I h，之后將溶液抽去。37°C恒溫干燥箱中干燥備用。反復多次獲得膠原蛋白多層膜；
[0042](3)中空濾管內壁MSC抗體固定。將MSC抗體溶液注入中空濾管內，37°C孵箱中孵育過夜，之后將其抽去。37°C恒溫干燥箱中干燥備用；
[0043](4) MSC在體培養(yǎng)。通過動脈端、靜脈端對接將前述方法制備的孵化器植入機體。維持動脈一中空管一靜脈的有效血流循環(huán)。注意循環(huán)管路凝血情況，及時調整抗凝成分用量。在腔室中注入肝細胞培養(yǎng)基(為含10% (質量百分比含量)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加肝細胞生長因子濃度為20ug/L，抗凝劑重組水蛭素濃度為10mg/L)，定期更換，保持培養(yǎng)基PH值7.2?7.4 ；
[0044](5)肝細胞形態(tài)及功能檢測。6個月后，掃描電鏡檢測見中空濾管內表面完全被覆肝細胞，形態(tài)正常，沿長軸密集排列。留取細胞培養(yǎng)基進行肝細胞標志物甲胎蛋白(AFP)水平測定為0.83±0.02ug/L，證明肝細胞生成并存活。經檢測，培養(yǎng)基中白蛋白含量表達較原培養(yǎng)增加2.47±0.03g/L，證明肝細胞具備合成蛋白功能。
【權利要求】
1.一種細胞孵化器，它包括外管(I)、設于外管(I)內且與外管(I)等長的若干根中空濾管(2 );中空濾管(2 )兩端外緣通過密封膜(3 )與外管(I)兩端內緣密封固定；外管(I)上設有細胞培養(yǎng)基進口(4)和細胞培養(yǎng)基出口(5);所述細胞培養(yǎng)基進口(4)和細胞培養(yǎng)基出口(5)均與中空濾管(2)、密封膜(3)及外管(I)圍成的腔室(6)連通；所述外管(2)上端設有密封上蓋(7 )，密封上蓋(7 )頂端設有動脈端口( 8 );所述外管(2 )下端設有密封下蓋(9 )，密封下蓋(9)下端設有靜脈端口(10);其特征在于，所述中空濾管(2)內壁上設有細胞抗體層(11)。
2.如權利要求1所述的孵化器，其特征在于，所述細胞抗體層(11)通過層粘連蛋白或膠原蛋白與中空濾管(2)內壁結合。
3.如權利要求1或2所述的孵化器，其特征在于，所述細胞抗體層(11)為干細胞抗體層。
4.如權利要求3所述的孵化器，其特征在于，所述干細胞抗體為MSC抗體。
【文檔編號】A61F2/02GK203677312SQ201320835127
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權日:2013年12月18日
【發(fā)明者】張義雄 申請人:張義雄