部分mhc構建體及使用方法
【專利摘要】本文公開了分離的主要組織相容性復合物(MHC)II類α1結構域多肽和使用方法。在一些實施方案中，所述分離的多肽包含MHC?II類α1結構域多肽(或其一部分)或由其組成，并且不包含MHC?II類α2、β1和β2結構域。所公開的MHC?II類α1結構域多肽用于治療或抑制受試者中的疾病，例如炎性和/或自身免疫性疾病。還公開了評估使用多肽治療受試者的功效或優(yōu)化所述治療的方法，所述多肽包含MHC?II類α1結構域多肽(或其一部分)或包含MHC?II類α1結構域和β1結構域的多肽(例如β1α1RTL)。
【專利說明】部分MHC構建體及使用方法
[〇〇〇1] 相關專利申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年1月6日提交的美國臨時申請No. 61/584,045的優(yōu)先權，該臨 時申請以引用的方式全文納入本文。 【技術領域】
[0003] 本公開涉及部分主要組織相容性復合物多肽和使用方法，特別是在治療或抑制炎 性或自身免疫性疾病中的使用方法。
[0004] 政府資助的聲明
[0005] 本發(fā)明在美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)授予的基金號 NS47661、AI43960和DK0688861以及由退伍軍人事務部授予的Merit Review和研究增強 獎勵計劃基金（Research Enhancement Award Program grants)的美國政府資助下完成。 美國政府在本發(fā)明中享有某些權利。 【背景技術】
[0006] 哺乳動物中針對特異性抗原的免疫應答的起始是通過將所述抗原呈遞至T細胞 引起的。在主要組織相容性復合物（MHC)的背景下抗原被呈遞至T細胞。MHC位于抗原呈 遞細胞（APC)表面上；MHC的三維結構包括適合所呈遞的抗原進入的溝（groove)或裂隙 (cleft)。當在存在必需的共刺激信號的情況下T細胞上的適當受體與APC上的MHC/抗原 復合物相互作用時，所述T細胞被刺激，觸發(fā)充分表征的免疫系統(tǒng)激活事件的級聯(lián)的多個 方面，包括誘導細胞毒性T細胞功能、誘導B細胞功能和刺激細胞因子產生。
[0007] 多發(fā)性硬化的病理學特征在于針對中樞神經系統(tǒng)的異常免疫應答。具體地，認為 對髓磷脂抗原具有反應性的T淋巴細胞在中樞神經系統(tǒng)內起始炎癥應答。所產生的炎癥應 答包括募集T淋巴細胞，活化巨噬細胞、B淋巴細胞和漿細胞。由這些炎癥細胞釋放的可溶 性介質導致脫髓鞘并且在較輕的程度上導致軸突變性。類似地，許多自身免疫性疾病中的 炎癥應答導致常常會不斷加重的組織損傷。盡管最近有一些進展，但是仍需要對自身免疫 性和炎性疾病有效的療法。
【發(fā)明內容】

[0008] 本文公開的是分離的主要組織相容性復合物（MHC) II類α 1結構域多肽和使用方 法。在一些實施方案中，所述分離的多肽包含MHC II類α 1結構域多肽（或其一部分）或 由其組成，并且不包含MHC II類α2、β?和β2結構域。在一些實例中，所述MHC II類 α 1結構域與抗原決定簇共價連接，例如通過肽接頭、化學接頭或直接的共價鍵。
[〇〇〇9] 所公開的MHC II類α 1結構域多肽用于治療或抑制受試者中的疾病，所述疾病包 括炎性和/或自身免疫性疾病。在一些實施方案中，給予患有炎性和/或自身免疫性疾病 或病癥的受試者對治療或抑制所述疾病有效的量的所述MHC II類α 1結構域多肽（例如 α 1多肽或具有抗原肽的α 1多肽）或其一部分。在一些實例中，所述MHC II類α 1結構 域多肽降低⑶74的表達和/或活性。
[〇〇1〇] 還公開了確定或評估使用多肽治療受試者的功效或優(yōu)化所述治療的方法，所述多 肽包含MHC II類α 1結構域或包含MHC II類α 1結構域（或其部分）和β 1結構域（例 如β 1 α 1多肽）。在一些實施方案中，所述方法包括確定來自所述受試者的樣品中的⑶74 表達或活性，將所述CD74表達或活性與對照進行比較，以及基于CD74表達和/或活性水平 確定所述治療的功效或確定是否應該調整所述多肽的劑量。
[〇〇11] 從參照附圖進行的以下詳細描述中，本公開的上述和其他特征將變得更加清楚。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 在附圖和整個說明書中，以下術語互換使用：pDR2/mM0G-35-55與RTL342M互換 使用；PDR2/無肽與RTL302-5D互換使用；pDR2/MBP-85-99與RTL340互換使用；pDR2/ hM0G35-55 與 RTL1000 互換使用。
[0013] 圖1A的兩幅圖示出了用mM0G-35-55肽/弗氏完全佐劑（CFA) /Ptx免疫的 DR*1501-Tg小鼠的平均臨床EAE每日得分（左）或累積疾病指數(shù)（CDI ;右）。當疾病發(fā)作 時（臨床EAE得分彡2)，使用指示的載體、pDR2/mM0G-35-55、pDR2/無肽或pDR2/MBP-85-99 治療小鼠。箭頭指示對小鼠進行治療的日期。對于pDR2/mM0G-35-55相對于載體、pDR2/ MBP-85-99 和 pDR2/ 無肽，*ρ〈0· 003。
[0014] 圖1Β的兩幅圖示出了用hM0G-35-55肽/CFA/Ptx免疫的DR*1502-Tg小鼠的平均 臨床EAE每日得分（左）或CDI(右）。當疾病發(fā)作時（臨床EAE得分>2)，使用指示的載 體、pDR2/mM0G-35-55、pDR2/無肽或pDR2/MBP-85-99治療小鼠。箭頭指示對小鼠進行治療 的日期。對于 pDR2/hM0G-35-55 相對于載體、pDR2/MBP-85-99 和 pDR2/ 無肽，*ρ〈0· 0023。
[0015] 圖2Α的兩幅流式細胞術散點圖示出了用于鑒定單核細胞的單核細胞門的設置。 當細胞落入左圖所示的前向散射/側向散射散點圖中的圓圈所示的區(qū)域中時，就將其鑒定 為單核細胞，并且如右圖中所示排除碘化丙啶（ΡΙ)陽性的死細胞。
[0016] 圖2Β示出了在注射500 μ g的標記的pDR2之前和注射15分鐘后從首次用于實 驗的DR*1501-Tg小鼠采集的血液的流式細胞術散點圖，根據所述單核細胞門和用于觀察 ⑶lib (首行）、⑶19 (第二行）、⑶11c (第三行）和⑶3 (底端行）的表達的藻紅蛋白染色 和用于觀察標記的PDR2衍生物的結合的FITC染色（X-軸）來進行分選。左圖示出了無 RTL對照的結合，中間圖出了 RTL342M(pDR2/mM0G-35-55)的結合，右圖示出了 RTL1000(單 體 pDR2/hM0G-35-55)的結合。
[0017] 圖2C示出了采集自首次用于實驗的DR*1501-Tg小鼠并與500μ g的標記的pDR2 體外孵育的血液的流式細胞術散點圖，根據單核細胞門和用于觀察CDI lb (首行）、CD19 (第 二行）、CDllc (第三行）和CD3 (底端行）表達的藻紅蛋白染色和用于觀察標記的pDR2衍 生物的結合的FITC染色（X-軸）來進行分選。左圖示出了無 RTL的對照的結合，中間圖示 出了 RTL342M的結合，右圖示出了 RTL1000的結合。
[0018] 圖2D為來自用10 μ g/ml標記有Alexa-546的RTL342M治療40分鐘的DR*1501/ GFP轉基因小鼠的GFP+⑶llb+細胞并通過熒光顯微術進行評估所得的數(shù)字圖像。
[0019] 圖3A的兩幅散點圖示出了通過前向散射和側向散射分析的淋巴細胞門的設置。 當細胞落入左圖所示的前向散射/側向散射散點圖中的圓圈所示的區(qū)域中時，就將其鑒定 為單核細胞，并且如右圖所示排除碘化丙啶（PI)陽性的死細胞。
[0020] 圖3B示出了在注射500 μ g的標記的RTL之前和注射后15分鐘從首次用于實驗的 DR*1501-Tg小鼠采集的血液的流式細胞術散點圖，根據淋巴細胞門和用于觀察CDllb (首 行）、CD19(第二行）、CDllc (第三行）和CD3(底端行）表達的藻紅蛋白（PE)染色和用于 觀察標記的PDR2衍生物的結合的FITC染色（X-軸）來進行分選。左圖示出了無 RTL對照 的結合，中間圖示出了 RTL342M的結合，右圖示出了 RTL1000的結合。
[0021] 圖3C示出了采集自首次用于實驗的DR*1501-Tg小鼠并與500 μ g的標記的RTL 體外孵育的血液的流式細胞術散點圖，根據所述淋巴細胞門和用于觀察CDllb (首行）、 CD19(第二行）、CDllc(第三行）和CD3(底端行）表達的藻紅蛋白（PE)染色和用于觀察 標記的RTL衍生物的結合的FITC染色（X-軸）來進行分選。左圖示出了無 RTL對照的結 合，中間圖示出了 RTL342M的結合，右圖示出了 RTL1000的結合。
[0022] 圖4A包括一組從首次用于實驗的DR*1501_Tg小鼠采集的外周血單核細胞（PBMC) 的流式細胞術散點圖（左）和條狀圖（右）。所述流式細胞術散點圖根據圖2A的單核 細胞門來進行設門，在將所述外周血單核細胞與單獨的載體（左圖）、所述PDR特異的 Fablbll (中間圖）或所述對照FabD2(右圖）孵育90分鐘后進行染色用于觀察⑶lib的 表達和FITC-DR2構建體的結合。所述條狀圖代表被歸一化為不存在Fab的情況下pDR2/ mM0G-35-55 的結合的百分數(shù)的 pDR2/mM0G-35-55 的結合。*#ρ〈(λ 0001。
[0023] 圖4Β的兩幅圖示出了在疾病發(fā)作時每天使用如圖所示的載體、RTL342M、 RTL342M+Fab lb 11、RTL342M+FabD2 或單獨的 Fab lb 11 治療 3 天的患有 ΕΑΕ 的 DR* 1501-Tg 小 鼠的每日平均臨床EAE得分（上圖）和⑶I (下圖）。在治療之前將Fab片段與pMHC進行 孵育。*Ρ〈〇· 05 ;***ρ〈0· 0001 ;#ρ〈0· 0005。
[0024] 圖4C，上圖為將RTL342M與FablBll或與對照FabD2進行預孵育后，或不使用RTL 或者使用單獨的FablBll的CD74的平均熒光強度（MFI)的直方圖。下圖為對來自所述上 圖的數(shù)據進行總結的條狀圖。*Ρ〈〇· 05 ;#ρ〈0· 005, *#ρ〈0· 0005。
[0025] 圖4D左圖為在臨床體征發(fā)作時每天靜脈注射100 μ g RTL342M(pDR2/ mM0G-35-55)、等摩爾（10 μ g)游離mM0G-35-55多肽或載體治療5天的患有mM0G-35-55/ CFA/Ptx誘導的EAE的DR*1501-Tg小鼠的臨床EAE得分的線圖。右圖為示出了所述相 同動物的累積疾病指數(shù)的條狀圖。相對于載體治療的組或游離mM0G35-55治療的組， *ρ〈0· 05 (每日得分）#ρ〈0· 01 (CDI 得分）。
[0026] 圖5Α為RTL1000與脾細胞的結合的線圖。將首次用于實驗的脾細胞與指示濃度的 AlexaFluor4g8?標記的RTL1000進行孵育。將細胞裂解于6M尿素中，通過SDSPAGE分 離所述蛋白，并通過熒光光密度測定法對所述蛋白進行定量。所述數(shù)據最佳擬合2個結合 位點的模型（R 2 = 〇. 998)。所述兩個結合位點的KD值，對于較高親和力的位點為2. 65ηΜ， 對于較低親和力的位點為131. ΟηΜ。
[0027] 圖5Β的線圖示出了在量遞增的所指示的未標記競爭物的存在下標記的RTL1000 與分離自DR*1501-Tg小鼠的全細胞的結合。
[0028] 圖5C的線圖示出了在量遞增的所指示的未標記競爭物的存在下標記的RTL1000 與分離自敲除MHC II類的小鼠的全細胞的結合。
[0029] 圖6為兩幅與pDR2結合的蛋白的免疫沉淀物印跡的數(shù)字圖像。對來自DR*1501_Tg 小鼠的脾細胞進行表面生物素化，然后用含有CHAPS的緩沖液進行裂解。將裂解物與 RTL1000進行孵育，然后向所述裂解物中加入DR2特異的單克隆抗體TU39。洗滌免疫復合 物以去除未結合的物質，通過在還原性電泳樣品緩沖液中煮沸8-10分鐘而將所述結合蛋 白從所述免疫復合物中分離。將從免疫沉淀物中回收的蛋白通過SDS-PAGE分離，印跡至濾 膜上，然后用鏈親和素 PE (左）或Quantum-Red標記的DR2HK14抗體（右）進行探測。
[0030] 圖7的曲線圖示出了通過表面等離子體共振測量的RTL1000與組蛋白復合物的 結合。通過胺偶聯(lián)使組蛋白復合物與CD5傳感芯片結合，并將所述指示濃度的RTL1000與 所述復合物結合。結合曲線擬合具有漂移基線的1:1朗繆爾（Langmuir)結合模型（Ka = 5.74父103]?^;1((1 = 3.3\10^;1-- = 223冊；〇112 = 9.89)，產生的近似親和力常數(shù) KD 為 575nM。
[0031] 圖8A為與⑶74結合的蛋白的免疫沉淀物的蛋白質印跡的數(shù)字圖像。對來自 DR*1501-Tg小鼠的脾細胞進行表面生物素化并裂解。將裂解物與綴合至CD74抗體的蛋白 L微珠混合。將這些在4°C下孵育過夜。將蛋白從所述免疫復合物中回收并印跡，并使用鏈 親和素-PE進行可視化。Μ指示分子量標記物；T指示總裂解物；CD74IP指示免疫沉淀的 CD74。
[0032] 圖8Β為兩幅⑶74蛋白復合物的SDS-PAGE凝膠的數(shù)字圖像，從表面生物素化的 DR* 1501-Tg脾細胞中免疫沉淀出所述CD74蛋白復合物，然后將所述CD74蛋白復合物與25 納摩爾的指示的FITC標記的RTL分子進行孵育。對所述凝膠進行掃描以鑒定FITC的存在。
[0033] 圖9A為⑶74蛋白復合物的SDS-PAGE凝膠的數(shù)字圖像，從表面生物素化的 DR*1501_Tg脾細胞中免疫沉淀出所述⑶74蛋白復合物，然后在存在未標記的DR-α 1和 DR2-i3 1的情況下將所述⑶74蛋白復合物與FITC標記的RTL1000分子進行孵育。
[0034] 圖9B的圖示出了 DR- a 1以劑量依賴的方式抑制RTL1000的結合。使用Bio-Rad Imager FX?掃描儀檢測聚丙烯酰胺凝膠上的FITC標記的RTL1000條帶，接著通過光密度 測定法使用Quantity One?軟件對所述RTL1000條帶進行定量。將數(shù)據進行歸一化并相 對于DR- α 1的濃度進行標繪，使用GraphPad Prism?軟件將所述曲線擬合一個位點或兩 個位點的競爭模型。最佳擬合為一個位點的競爭方程，EC5(I為447nM，R 2為0. 956。
[0035] 圖10A的曲線圖示出了當與免疫吸附的CD74進行孵育時，遞增量的FITC標記的 RTL1000、RTL342M、RTL340 (pDR2/MBP-85-99)、RTL302-5D (單體 pDR2/ 無肽）和 DR- α 1 的 結合情況。使用GraphPad Prism⑩軟件對數(shù)據進行一個位點或兩個位點結合的分析，對于 所有結合配體來說R2>〇. 95。
[0036] 圖10B的曲線圖示出了當與富集的MHC II類進行孵育時，遞增量的FITC標記的 尺111000、1?113421、1?11340、1?11302-^)和01?-〇1的結合情況，所述腿(：11類是通過綴合至 L243單克隆抗體的蛋白-L微珠從CD74耗盡的裂解物中免疫吸附出來的。
[0037] 圖11A的直方圖示出了相對于首次用于實驗的小鼠，EAE小鼠中單核細胞上的 ⑶74的表達。插圖示出了來自首次用于實驗的小鼠 （η = 4)和mM0G-35-55免疫的患有EAE 的小鼠 （η = 4)的單核細胞中⑶74表達的平均熒光強度的平均值。**p〈0. 01。
[0038] 圖11B的條狀圖示出了用載體或RTL342M(100l·! g)治療的患有EAE的小鼠的血液 和脾中CD74表達。*ρ〈0·05。
[0039] 圖11C的兩幅散點圖示出了使用載體（左）或Κ--342Μ(100μ8;右）治療的小鼠 的脊髓中的單核細胞中CD74表達。
[0040] 圖12Α的一組散點圖示出了用指示濃度的RTL1000處理的⑶llb+單核細胞中的 RTL1000FITC結合（上）和CDM表達（下）。
[0041] 圖12B的一組線圖示出了⑶74表達和指示的RTL的結合百分數(shù)。右下圖是所有 所述構建體的線性回歸分析，示出了 RTL結合與CD74表達之間的逆相關。
[0042] 圖13A的一組散點圖示出了使用載體處理（無 pMHC處理）的⑶llb+人單核細胞 上的RTL結合（上）和⑶74表達（下）。
[0043] 圖13B的一組散點圖示出了⑶llb+人單核細胞上的1 μ g RTL342M的結合（上） 和CD74表達（下）。
[0044] 圖13C的一組散點圖示出了⑶llb+人單核細胞上的1 μ g RTL1000的結合（上） 和CD74表達（下）。
[0045] 圖13D的一組散點圖示出了⑶llb+人單核細胞上的5μ g RTL1000的結合（上） 和CD74表達（下）。
[0046] 圖13E的一組散點圖示出了⑶llb+人單核細胞上的5yg RTL340的結合（上） 和CD74表達（下）。
[0047] 圖13F的線圖示出了在分析之前在培養(yǎng)物中用不同濃度的RTL1000處理的人單核 細胞中的RTL1000的結合相對于⑶74表達的線性回歸。原始數(shù)據示于圖13A-E。
[0048] 圖14A的線圖示出了通過使用MBP-85-99免疫而誘導了 EAE的小鼠的平均臨床 EAE每日得分（左），條狀圖示出了所述小鼠的CDI(右）。疾病發(fā)作后（圖上由箭頭所指 示）使用載體、RTL342M、RTL1000、RTL340 或 RTL302-? 對 MBP-TCR/DR2-Tg 小鼠進行 5 天 的治療。對于EAE每日平均得分和峰值疾?。ㄗ髨D），對于RTL342M相對于載體*p〈0. 02， 對于RTL340和RTL1000相對于載體，***p〈0. 002。對于CDI (右圖），對于RTL342M相對于 載體#ρ〈0· 0014,對于 RTL340 和 RTL1000 相對于載體，*#ρ〈0· 001。
[0049] 圖14Β的線圖示出了通過使用mM0G-35-55免疫而誘導了 ΕΑΕ的小鼠的平均臨床 EAE每日得分（左），條狀圖示出了所述小鼠的⑶I (右）。在發(fā)作時使用RTL340 (100 μ g)、 尺113421(10(^8)、1?11302-50(10(^8,5次每日治療），或1?11302-50(111^)或 RTL342M(100 μ g，2次每日治療）對患有EAE的DR*1501小鼠進行治療。所述載體組和未 治療組彼此之間沒有顯著差異而被合并。對于EAE每日平均得分和峰值疾?。ㄗ髨D），相 對于載體 / 未治療，*P〈〇.〇4, RTL302-5D(lmgX2)，***p〈0.0001，RTL342M(100ygX5)， #ρ〈0·01，RTL342M(100ygX2);對于 CDI，相對于載體 / 未治療，*#ρ〈0·0001。 RTL342M(100y gX2,5 次每日治療），ρ〈0· 013, RTL302-5D(lmgX2 次每日治療）。
[0050] 圖14C的圖示出了圖14B中所示的小鼠組的⑶llb+細胞上的⑶74水平與平均 ⑶I之間的關系。
[0051] 圖15的線圖示出了使用具有共價連接的mM0G-35-55的pDR2(100y g)、不具有肽 的pDR2 (1000 μ g)、DR- α 1 (750 μ g)或單獨的載體治療的小鼠的臨床EAE得分（上），條狀 圖示出了所述小鼠的⑶I (下）。每個治療組由三只小鼠組成。*P〈〇. 〇5pDR2mMOG-35-55相 對于未治療；#P〈〇. 〇5pDR2/無肽相對于未治療；Φρ〈0. 05DR-a 1相對于未治療。
[0052] 圖16的線圖示出了使用載體（未治療）、修飾的不具有肽的pDR2 (RTL302-5D)、修 飾的具有共價結合的mM〇G-35-55的pDR2 (RTL342M)或DR- α 1治療的小鼠的臨床EAE得分 (上部），條狀圖示出了所述小鼠的CDI (下部）。每個治療組由三只小鼠組成。
[0053] 圖17的一系列條狀圖示出了在來自按指示治療的EAE DR2_Tg小鼠的脊髓的 ⑶llb+單核細胞上的⑶74(圖17A)、ICAM(圖17B)和⑶80(圖17C)的表達。
[0054] 圖18A的圖示出了通過實時PCR測量的在分離自三只首次用于實驗的DR*1501_Tg 小鼠的脾細胞中的ICAM-1的相對表達，所述小鼠是用10μ g/ml RTL342M或緩沖液治療1 小時，接著在使用或不使用l〇〇ng/ml MIF的情況下進行10ng/ml LPS刺激持續(xù)1小時所得 到的。*Ρ〈〇·〇5。
[0055] 圖 18Β 是來自用 50μ g/ml RTL342M 治療的 DR*1501/GFP-Tg 小鼠的 GFP+CDllb+ 細胞的持續(xù)2個小時的平均追軌跡速度的條狀圖。通過實時熒光顯微術對10個慢速拍攝 區(qū)域（5個未治療的區(qū)域，5個治療的區(qū)域）進行成像。***p〈0. 0005。
[0056] 圖18C是如圖18B所述分離和治療的細胞的平均軌跡位移長度的條狀圖。 ***ρ〈0· 0005〇
[0057] 圖18D的兩幅圖示出了來自4個有代表性的區(qū)域的單個細胞（每個區(qū)域中9-11 個細胞）的軌跡。細胞是如圖18Β所述分離和治療所得到的。
[0058] 圖19的MHC II類α鏈氨基酸序列的一部分的示例性比對示出了所述DRAa 1氨 基酸第 38-58 位區(qū)域（加框）。所述序列如下：DR2(SEQ ID N0:110)、DR4(SEQ ID N0:111)、 DP2(SEQ ID N0:112)、DQ2(SEQ ID N0:113)、IAs(SEQ ID N0:114)、IAg7(SEQ ID N0:115) 和 RT1.B(SEQ ID N0:116)。
[0059] 圖20的蛋白質印跡的圖像，它證實了 RTL構建體不干擾⑶74抗體與⑶74的結合。 將DR*1501裂解物與無配體、15μ g的RTL342M或DR-a 1在4°C下進行預孵育15小時。將 所述裂解物加入到吸附至蛋白/微珠的ln-lAb中。對免疫復合物用1% CHAPS/TEN緩沖 液洗滌4次，然后用TEN洗滌4次。通過在含有2 % SDS的樣品緩沖液中煮沸7-9分鐘而 將物質從微珠上洗脫。然后將樣品在10-20%聚丙烯酰胺凝膠中進行分析，轉到PVDF，再用 抗-CD74mAb Ιη-IFITC 探測以檢測 CD74。
[0060] 圖21是一組三幅散點圖，X軸為⑶74表達，Y軸為⑶lib表達。在臨床體征發(fā)作 時，每天使用100 μ g RTL342M, 500 μ g DR2- β 1或載體治療患有mM0G35-55/CFA/Ptx誘導 的EAE的DR*1501-Tg小鼠持續(xù)三天。*p〈0. 05。
[0061] 圖22左圖的線圖示出了如圖21所述進行治療的小鼠的臨床EAE得分。右圖的條 狀圖為所述相同小鼠的的累積疾病指數(shù)。**P〈〇. 01，***P〈〇. 〇〇1。
[0062] 圖23左圖的線圖示出了在臨床體征發(fā)作時使用載體、?Κ2-β1(50〇μ8)、 DR-a 1(1〇〇μ g)、DR_a 1(300μ g)、DR_a 1(500μ g)、DR_a 1(1〇〇〇μ g)或RTL342M(100y g) 治療的患有mM〇G-35-55/CFA/Ptx誘導的EAE的DR*1501-Tg小鼠的臨床EAE得分。 *ρ〈0· OOTR a 1 相對于載體；δ ρ〈〇· 04RTL342M、DR- a 1 (300 μ g)、DR- a 1 (500 μ g)、 DR- a 1 (1000 μ g)相對于 DR2- β 1 ;#p〈0. 0003RTL342M、DR- a 1 (300 μ g)、DR- a 1 (500 μ g)、 DR- a 1 (1000 μ g)相對于載體；φ p<0.05 DR- a 1 (100 μ g)相對于 DR2- β 1。右圖的條形 圖示出了所述相同動物的累積疾病指數(shù)。*Ρ〈〇. 05 ;**p〈0. OOOTR-a 1(1〇〇μ g)相對于載體 vehicle ;***ρ〈0· 0005 相對于載體。
[0063] 序列表
[0064] 本文及所附序列表中列出的任何核酸和氨基酸序列都用如37C. F. R. § 1. 822所 定義的核苷酸堿基的標準字母縮寫和氨基酸的三字母編碼來顯示。至少在一些情況下，只 顯示了每個核酸序列一條鏈，但是應該理解為任何對所顯示的鏈提及均包含了互補鏈。
[0065] SEQ ID N0:1-49為示例性MHC II類α鏈多肽的氨基酸序列。
[0066] SEQ ID Ν0:50-85為示例性抗原決定簇肽的氨基酸序列。
[0067] SEQ ID勵:86-108為來自與？01?2/1^(?35-55結合的蛋白的肽的氨基酸序列。
[0068] SEQIDN0:109為MHCDRA38-58 位殘基片段的氨基酸序列。
[0069] SEQ ID N0:110-116為MHC II類α鏈氨基酸序列的部分氨基酸序列。 【具體實施方式】
[〇〇7〇] 先前已經證明了包含共價連接的MHC II類β 1和α 1結構域的有兩個結 構域的MHC構建體（β?α 1多肽，也稱為重組Τ細胞受體配體（RTL))能夠在不存 在共刺激分子的情況下直接與同源Τ細胞受體相互作用（McMahan et al.，J. Biol. Chem. 278:30961-30970, 2003)，充當部分T細胞受體激動劑，并觸發(fā)欠佳的下游信號傳 導和細胞因子改變（Burrows et al.，J. Immunol. 167:4386-4395,2001 ;Wang et al.，J. Immunol. 171:1934-1940,2003)。參見，例如，美國專利 No. 6,270,772 ;美國專利公開 No. 2005/0142142和2009/0280135 ;這些文獻以引用的方式納入本文。以前已經成功地利 用RTL--包含系在一起的髓磷脂肽--來治療患有實驗性自身免疫性腦脊髓炎的小鼠 (Burrows, Curr. Drug Targets Inf lamm. Allergy4:185-193, 2005)，也在多發(fā)性硬化患者 中進行的 I 期試驗中利用了所述RTL(Yadav et al.，Neurol.74:A293-294,2010;0ffner et al. , J. Neuroimmunol. 231:7-14, 2011) 〇
[0071] 如本文所公開的，目前已經意外地發(fā)現(xiàn)所述兩個結構域的RTL與復合物結合，所 述復合物包含MHC II類不變鏈（⑶74)、細胞表面組蛋白和MHC II類本身。具體地，與⑶74 的結合涉及MHC II類α 1結構域與CD74之間的相互作用，所述相互作用導致單核細胞上 CD74的快速的劑量依賴性的下調。這種下調是由兩個結構域的RTL和單獨的α 1結構域引 起的。此外，已經出乎意料地發(fā)現(xiàn)，單獨使用MHC II類α?結構域進行的治療降低了小鼠 中ΕΑΕ的嚴重程度，表明所述α 1結構域可用作例如用于炎性和/或自身免疫性疾病的治 療組合物。
[0072] 包含MHC II類α 1結構域而不包含其他MHC II類結構域的治療劑的一個優(yōu)點 是減少了在治療之前對患者進行HLA亞型歸類的需求。在HLA-DR的情況下尤其如此，所 述HLA-DR具有單個α鏈多肽，該α鏈多肽與所有DRi3鏈多肽相互作用。因此，認為可將 DRa 1結構域多肽給予所有個體而不需要進行HLA分型，而目前使用含有DRi3 1結構域的多 肽的治療則需要進行HLA分型。對于其他HLA亞型，只需要對所述α結構域等位基因進行 亞型歸類，而不需要對α和β等位基因都進行亞型歸類。并且，由于所公開的MHC II類 a 1結構域多肽的大小比包含β1結構域的多肽（例如β 1 a 1多肽）更小，因此可以更加 快速和低價地大量生產所公開的MHC II類a 1結構域多肽，并且可以以合成肽的形式生產 所述a 1結構域的片段，甚至進一步提高生產的簡便性和速度。
[〇〇73] 發(fā)現(xiàn)MHC II類β 1 a 1多肽和a 1結構域多肽在治療小鼠中的實驗性自身免疫性 腦脊髓炎（EAE)中的功效與其意想不到的下調CD74的能力緊密相關，如下文的實施例中所 示。因此，可以利用⑶74水平（例如⑶74表達或活性）作為在受試者中使用MHC II類 β?α多肽或MHC II類α?結構域多肽進行治療的治療功效的標記物。類似地，可以使用 ⑶74水平來優(yōu)化使用MHC II類β 1 α 1多肽或MHC II類α 1結構域多肽對受試者進行的 治療（例如優(yōu)化或調整劑量）。
[0074] I.縮寫
[0075] APC 抗原呈遞細胞
[0076] CDI 累積疾病指數(shù)
[0077] ΕΑΕ 實驗性自身免疫性腦脊髓炎
[0078] HLA 人白細胞抗原
[0079] ΜΒΡ 髓磷脂堿性蛋白
[0080] MIF 巨噬細胞游走抑制因子
[0081] MHC 主要組織相容性復合物
[0082] M0G 髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白
[0083] PBMC外周血單核細胞
[0084] pMHC 部分 MHC ( β 1 α 1)多肽
[0085] PLP 蛋白脂質蛋白
[0086] RTL 重組T細胞受體配體
[0087] II.術語
[0088] 除非另有說明，技術術語以常規(guī)用法使用。分子生物學中的常用術 語的定義可見于 Benjamin Lewin, genes V,由 Oxford University Press 出 版，1994(ISBN0-19-854287-9) ;Kendrew 等（eds. ), The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)和 Robert A. Meyers(ed. ), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference,由 VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN1-56081-569-8)。
[0089] 除非另有說明，本文所用的所有技術術語和科學術語的含義與本公開所屬技術領 域普通技術人員通常所理解的相同。除非上下文中另有明確說明，單數(shù)術語"一"、"一個"和 "該"包括復數(shù)指代物。類似地，除非上下文中另有明確說明，詞語"或"意欲包括"和"。因 此，"包含A或B"意指包括A或B，或A和B。還應該理解，給出的核酸或多肽的全部堿基大 小或氨基酸大小以及全部分子量或分子質量值是近似值，并用于表述目的。下文描述了適 合的方法和材料，但是與本文描述的方法和材料相似或等價的方法和材料可以用于本公開 的實施或測試。
[0090] 本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻以引用的方式全文納入 本文。本文提到的所有GenBank登錄號以引用的方式全文納入本文，如同在2012年1月6 日存在于GenBank中一樣。如果出現(xiàn)沖突，以本說明書（包括對術語的解釋）為準。另外， 材料、方法和實例僅是示例性的，不意欲進行限制。
[0091] 為了便于閱讀本公開的各個實施方案，提供了以下對具體術語的解釋：
[0092] 抗原：可在動物體內刺激抗體產生或T細胞應答的化合物、組合物或物質，包括被 注射或吸收進入動物體內的組合物?？乖c特異性體液免疫或細胞免疫的產物反應，所述 產物包括由異源免疫原誘導的那些。術語"抗原"包括所有相關的抗原表位。"表位"或"抗 原決定簇"是指抗原上B細胞和/或T細胞對其作出應答的的位點。在一個實施方案中，當 表位與MHC分子一同呈遞時，Τ細胞對表位作出應答。表位可以由連續(xù)的氨基酸或由于蛋 白質的三級折疊而并排的不連續(xù)的氨基酸形成。由連續(xù)的氨基酸形成的表位暴露在變性溶 劑后通常仍然存在，而三級折疊形成的表位在用變性溶劑處理后通常不再存在。表位在獨 特的空間構象中一般包括至少3個并且更常見地至少8個氨基酸（例如約8-50或8-23個 氨基酸）。確定表位空間構象的方法包括，例如X-射線晶體法和二維核磁共振。
[〇〇93] 抗原可為組織特異性抗原，或疾病特異性抗原。這些術語不是排他性的，因為組織 特異性抗原也可以是疾病特異性抗原。組織特異性抗原在有限量的組織例如單個組織中表 達。組織特異性抗原可由多于一種組織表達，例如，但不限于，在中樞神經系統(tǒng)或周圍神經 系統(tǒng)中表達的抗原。
[0094] ⑶74 :也稱為⑶74分子，主要組織相容性復合物、II類不變鏈或Π 。⑶74是為免 疫應答調節(jié)抗原呈遞的伴侶分子。其還是巨噬細胞游走抑制因子（MIF)的細胞表面受體。
[0095] ⑶74的核酸和蛋白質序列是公眾可得的。例如，GenBank登錄號ΝΜ_001025158、 ΝΜ_004355和ΝΜ_001025159公開了示例性的人CD74核酸序列，GenBank登錄號 NP_001020329、NP_004346和NP_001020330公開了示例性人CD74氨基酸序列。類似地， GenBank登錄號ΝΜ_001042605和ΝΜ_010545公開了示例性小鼠 Cd74核酸序列，GenBank登 錄號ΝΡ_001036070和NP_034675公開了示例性小鼠 Cd74氨基酸序列。這些序列各自以引 用的方式納入本文，如同在2012年1月6日存在于GenBank中一樣。
[〇〇96] 保守變體：氨基酸殘基被具有類似生物化學性質的另一個氨基酸殘基置換。"保守 的"氨基酸置換為那些基本上不影響或不降低MHC II類多肽（例如MHC II類α 1多肽） 的活性的置換。多肽可以包括一個或多個氨基酸置換，例如1-10個保守置換、2-5個保守置 換、4-9個保守置換，例如1、2、5或10個保守置換。保守置換的具體非限制性實例包括以下 實例：
[0097] 原始氨基酸 保守置換 Ala Set Arg Lys Am Gin. His A,sp Glu Cys Set Gin Asn Glu Asp Hh Asn： Gin He Leu. ￥al Leu lie; Val Lys Arg; Glo; Glu Met Leu; lie Phe Met: Leu; Tyr Ser Thr Thr Ser Tip Tyr Tyr Tip: Phe Val lie; Leu
[0098] 對照："對照"是指用于與實驗樣品進行比較的樣品或標準品。在一些實施方案 中，對照為從健康受試者或健康受試者群體獲得的樣品。在其他實施方案中，對照為歷史對 照或標準參考值或值域（例如以前測試的對照樣品，例如代表基線或正常值的樣品組，例 如健康受試者中CD74表達或活性的水平）。在其他實例中，對照來自接受治療前的受試者 (例如在使用MHC II類β 1 α 1多肽或MHC II類α 1結構域多肽進行治療之前的⑶74表 達水平或活性水平）。
[〇〇99] 結構域：多肽或蛋白質的氨基酸序列的不連續(xù)部分。其可等同于特定功能。例如， 組成MHC II類分子的α和β多肽各自都被認為具有2個結構域，分別為α 1、α 2和β 1、 β 2。各個結構域一般通過連接氨基酸序列（linking amino acid sequence)來連接。在 一個實施方案中，通過將序列延伸以包括全部或部分接頭或相鄰結構域，而將整個結構域 序列包括在重組分子中。例如，當選擇MHC II類分子的α?結構域時，所選擇序列可從所 述α鏈的第1位氨基酸殘基延伸，通過整個α 1結構域并包括位于約第76-90位氨基酸殘 基的接頭序列（在α 1結構域的羧基末端，α 1和α 2結構域之間）的全部或一部分。各 個MHC分子結構域中的氨基酸的精確數(shù)目根據哺乳動物的物種而有所不同，以及在種內不 同類基因之間也有所不同。選擇用于重組分子中的序列的關鍵方面是保持結構域功能，而 不是基于氨基酸數(shù)目進行精確結構定義。本領域普通技術人員應理解，即使使用了略少于 所選擇結構域全長氨基酸序列的序列，也可以保持結構域功能。例如，可以刪除α 1結構域 氨基或羰基末端的一些氨基酸，而不會影響結構域功能。
[0100] 可以在本公開提供的MHC II類多肽（例如α 1或β 1 α 1多肽）的背景下評估所 具體選擇的結構域的功能活性，例如Τ細胞增殖和/或CD74結合測定。
[〇1〇1] 有效量：指定的化合物足以抑制疾病或病癥的進展，或引起疾病或病癥的消退，或 者能夠緩解由疾病或病癥引起的癥狀的劑量或量。例如，有效量可為治療或抑制疾病例如 炎性疾病和/或自身免疫性疾病所必需的公開的MHC分子的量或劑量。在一個實施方案 中，有效量為單獨或與一種或多種額外的治療劑一起在受試者中誘導所期望的應答（例如 治療或抑制炎性疾病或自身免疫性疾病或其他疾病或病癥）的量。
[0102] 炎癥：由組織損傷引起的局部保護性應答，其起到隔絕致炎因子（inflammatory agent)的作用。炎癥是由血管組織對有害刺激物產生的復雜生物學應答所精細安排的，所 述有害刺激物例如病原體、損傷細胞或刺激劑（irritant)。炎癥是生物體為組織去除有害 刺激物以及起始愈合過程所作出的保護性努力。炎癥應答由白細胞在全身或在炎癥部位的 局部累積來表征?？赏ㄟ^許多本領域熟知的方法測量炎癥應答，所述方法例如白細胞的數(shù) 目、多形核中性白細胞（PMN)的數(shù)目、PMN激活程度的測量例如魯米那（luminal)增強的化 學發(fā)光法，或細胞因子存在量的測量。原發(fā)性炎癥疾病是由所述炎癥自身引起的疾病。繼 發(fā)性炎癥疾病是由另一疾病引起的炎癥。炎癥可導致許多炎性疾病，所述炎性疾病包括但 不限于風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、炎性肺?。ò宰枞苑尾。?、炎性腸?。ò冃?結腸炎和克羅恩?。?、牙周病、風濕性多肌痛、動脈粥樣硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化 病、肖格倫綜合征（Sjogren's Syndrome)、哮喘、變應性鼻炎和皮膚病（包括皮肌炎和銀屑 ?。┑鹊取０ㄑ仔圆糠值淖陨砻庖咝约膊。òǖ幌抻诙喟l(fā)性硬化）也可被認為是炎 性疾病。
[0103] 抑制或治療疾?。?抑制"疾病是指抑制疾病的充分發(fā)展，例如在已知易患上疾病 (例如炎性疾病或自身免疫性疾?。┑娜酥?。抑制疾病的范圍可從部分抑制疾病到基本上 完全抑制（預防）疾病，例如在患有疾病或病癥或具有患上疾病或病癥的風險的受試者中。 在一些實例中，術語"抑制"是指減輕或推遲疾病的發(fā)生和發(fā)展。待給予有效量的藥物化合 物以抑制或治療疾病或病癥的受試者可通過這類病癥的標準診斷技術（例如基本家族史、 或患上所述疾病或病癥的風險因素）來鑒定。與之不同，"治療"是指在疾病或病理狀態(tài)開 始出現(xiàn)之后減輕其征兆或癥狀的治療性介入。
[0104] 分離的："分離的"生物組分（例如核酸、肽或蛋白質）已被從該組分存在的生物 體的細胞中的其他生物組分基本上分離開、單獨產生或純化出來，所述其他生物組分例如 染色體DNA和RNA和染色體外DNA和RNA以及蛋白質。因此，已經"分離的"核酸、肽和蛋 白質包括通過標準純化方法純化的核酸和蛋白質。該術語還包括通過在宿主細胞中重組表 達制備的核酸、肽和蛋白質，以及化學合成的核酸。
[0105] 接頭：共價連接兩個分子（例如2個多肽）的分子。接頭（例如肽接頭或化 學接頭）可包含在本公開的重組MHC多肽中，例如在α?結構域與抗原肽之間。通常 長度為2-25個氨基酸的肽接頭序列是本領域公知的，并且包括但不限于Chaudhary et al. (Nature339:394-397，1989)描述的甘氨酸（4)-絲氨酸間隔物。類似地，化學接頭（例 如巰基鍵或交聯(lián)劑）是本領域公知的。
[0106] MHC II類：MHC II類分子由2個非共價連接的蛋白質--α鏈和β鏈形成。所 述α鏈包含α 1和α 2結構域，所述β鏈包含β1和β 2結構域。通過α 1和β1結構 域的相互作用形成適合抗原進入的裂隙。α 2和β 2結構域是跨膜的免疫球蛋白（Ig)折疊 樣結構域，其將α鏈和β鏈錨定到APC細胞膜中。當MHC II類復合物與抗原連接時（并 且在適當?shù)墓泊碳ば盘柕拇嬖谙拢琈HC II類復合物刺激CD4T細胞。CD4T細胞的主要功 能是起始炎性應答，以調節(jié)免疫系統(tǒng)中的其他細胞，以及幫助Β細胞進行抗體合成。
[0107] 可藥用載體：用于本公開的可藥用載體是常規(guī)的。Remington:The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, Editor, Lip pincott, Williams, &Wilkins, Philadelphia, PA, 21st Edition (2005)描述了適用于本文所 公開的蛋白質的藥物遞送的組合物和劑型。
[0108] 多肽：其中單體是通過酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物。當氨基酸是 α -氨基酸時，可使用L-光學異構體或D-光學異構體，優(yōu)選L-異構體。本文使用的術語 "多肽"、"蛋白質"或"肽"意欲涵蓋任何氨基酸序列，包括修飾的序列，例如糖蛋白。術語 "多肽"或"蛋白質"或"肽"特別地意欲包括天然存在的蛋白質以及那些通過重組或合成產 生的蛋白質。應該注意的是，術語"多肽"或"蛋白質"包括天然存在的修飾形式的蛋白質， 例如糖基化形式、磷酸化形式或泛素化形式。
[〇1〇9] 純化的：術語純化的不需要絕對純，而是意圖用作相對的術語。因此，例如純化的 肽制備物是其中所述肽或蛋白比所述肽或蛋白在其環(huán)境中（例如細胞中或制備物中）更富 集的制備物。優(yōu)選地，制備物被純化，以使所述蛋白或肽占所述制備物中總肽或蛋白含量的 至少50 %。在一些實施方案中，純化的制備物含有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少 85 %、至少90 %、至少95 %或更多的所述蛋白或肽。
[〇11〇] 重組的：重組的核酸或多肽是指具有非天然存在的序列或具有通過人工結合兩個 或多個原本分離的序列片段來制造的序列的核酸或多肽。所述人工結合通常通過化學合成 來實現(xiàn)或者更常見地通過對分離的核酸片段進行人工操作例如通過遺傳工程技術來實現(xiàn)。
[0111] 樣品：從受試者中獲得的含有核酸（例如，DNA或RNA (包括mRNA))、蛋白質或它們 的組合的生物樣品。實例包括但不限于外周血、細針抽吸物（fine needle aspirate)、尿、唾 液、組織活檢、手術標本和尸體剖檢材料。在一個實例中，樣品包括血液樣品（例如血液；血 液的衍生物和血液的一部分，例如血清）或分離的或純化的細胞群（例如，T細胞、B細胞、 PBMC、淋巴細胞等，包括部分分離的或部分純化的細胞群）。
[0112] 序列同一性：兩個核酸序列或兩個氨基酸序列之間的相似性以序列之間的相似性 表示，也被稱為序列同一性。序列同一性通常根據百分比同一性（或相似性或同源性）來 度量；百分比越高，兩個序列越相似。
[0113] 比對序列以進行比較的方法是本領域公知的。多種程序和比對算法描 述于：Smith&Waterman, AdV. Appl. Math. 2:482，1981 ;Needleman&Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970 ；Pearson&Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:2444, 1988 ；Higgins& Sharp, Gene, 73:237-244, 1988 ；Higgins&Sharp, Comput. Appl. Biosci. 5:151-153, 1989 ； Corpet et al. , Nucl. Acids Res. 16, 10881-90, 1988 ；Huang et al. , Comput. Appl. Biosci. 8, 155-65, 1992;和 Pearson, Methods Mol. Biol. 24:307-331，1994。Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)提出了對序列比對方法和同源性計算 的詳細見解。NCBI的基本局部比對搜索工具（BLAST) (Altschul et al.，J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)可以從幾個來源獲得，所述來源包括美國國家生物技術信息中心 (NCBI，Bethesda，MD)和互聯(lián)網，用于與序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn 和 tblastx結合使用。
[0114] 由于遺傳密碼的簡并性，未表現(xiàn)出高度序列同一性的核酸序列卻可以編碼相似的 氨基酸序列。應理解，使用這種簡并性可以改變核酸序列，以產生都基本上編碼相同蛋白質 的多種核酸分子。
[0115] 受試者：活的多細胞脊椎生物--一個包括人和非人哺乳動物的類別。
[0116] 111.]\^(：11類〇1多肽
[0117] 本文公開的是包括MHC II類α 1結構域或其片段并且不包括MHC II類 α2、β 1或β2結構域的分離的多肽。哺乳動物MHC II類α和β鏈蛋白的氨基酸 序列以及編碼這些蛋白的核酸是本領域公知的，并可獲自很多來源（包括GenBank)。 不例性序列提供于 Auffray et al· (Nature308:327-333, 1984)(人 HLA DQa); Larhammar et al· (Proc. Natl. Acad. Sci. USA80:7313-7317，1983)(人 HLA DQβ); Das et al· (Proc. Natl. Acad. Sci. USA80:3543-3547，1983)(人 HLA DR a) ;Tonnelle et al· (ΕΜΒ0 J. 4:2839-2847, 1985)( AHLADRP);Lawranceetal.(Nucl. Acids Res. 13: 7515-7528, 1985)(人 HLA DP a) ;Kelly and Trowsdale (Nucl. Acids Res. 13:1607-1621，1985)(人 HLA DPP) ;Syha et al· (Nucl. Acids Res. 17:3985, 1989) (大鼠 RTl.Ba) ;Syha_Jedelhauser et al· (Biochim.Biophys.Actal089:414_416，1991) (大鼠 RTl.BP);Benoist et al· (Proc. Natl. Acad. Sci. USA80:534-538, 1983)(小鼠 I-A a ) ;Estess et al· (Proc. Natl. Acad. Sci. USA83:3594-3598, 1986)(小鼠 Ι-Αβ)中， 所有這些參考文獻以引用的方式納入本文。本領域普通技術人員可從公共數(shù)據庫鑒定其 他MHC II類α和β鏈多肽，所述數(shù)據庫例如頂GT/HLA數(shù)據庫（可在萬維網ebi.ac.uk/ imgt/hla/ 上得到）。
[0118] 在一些實施方案中，公開的多肽包括MHC II類α 1結構域，例如DR-α l、DP_a 1、 DQ-a 1、DM-a 1或D〇-a 1結構域，或其一部分。在具體的實施方案中，所述MHC II類a 1 結構域是人HLA-DRA多肽。所述a 1結構域是在哺乳動物MHC II類a鏈蛋白中是明確定 義的。在一些實例中，MHC II類a鏈包括前導序列，所述前導序列參與運輸所述多肽，并 且經過蛋白水解而被去除以產生成熟的a多肽。通常認為所述a 1結構域包含所述成熟 (經蛋白水解處理的）a鏈的約第1-90位殘基。所述MHC II類蛋白中a 1和a 2結構域之 間的天然肽接頭區(qū)的范圍為從所述成熟a鏈的約第76位氨基酸至約第93位氨基酸，這取 決于具體考慮的a鏈。本文提供了示例性的MHC II類a多肽（例如SEQ ID N0:1-49)。 因此，a 1結構域可包括所述成熟a鏈的約第1-90位氨基酸殘基，但本領域普通技術人員 應理解，沒有必要精確界定該結構域的C末端界限（cut-off)，并且，例如，該界限可能存在 于所述成熟a鏈的第70-100位氨基酸殘基之間的任意一點。在一個實例中，所述al結 構域包括成熟的 MHC II 類 a 結構域的第 1-70、1-71、1-72、1-73、1-74、1-75、1-76、1-77、 卜 78、1-79U-80、1-81U-82、1-83U-84、1-85U-86、1-87U-88、1-89、1-90、1-91U_92、 1-93、1-94、1-95、1-96、1-97、1-98、1-99或1-100位氨基酸。在其他實例中，a 1結構域包 括全長MHC II類a多肽（例如本文公開的SEQ ID N0:1-49)的約第20-120位殘基（例 如約第 20-110、24-110、24-109、25-100、25-109、26-110、26-109、30-120、32-120、32-115、 26-90、26-85、26-84位殘基，或其他重疊區(qū)域）。在一些實例中，所述MHC II類al結構域 不包括N末端甲硫氨酸；然而，可以存在N末端甲硫氨酸，例如由于在細菌、酵母或哺乳動物 系統(tǒng)中表達。
[0119] 在其他實例中，所述a 1結構域可包括在5' -和/或3' -末端缺失或添加少許氨 基酸，例如從5' -或3' -末端添加或缺失約1-10個氨基酸，例如添加或缺失1、2、3、4、5、 6、7、8、9或10個氨基酸，或它們的組合（例如從一個末端缺失并且在另一末端添加）。所 述a 1結構域的組成還可在這些參數(shù)之外變化，這取決于哺乳動物物種和考慮的具體a 鏈。本領域普通技術人員應理解，所述氨基酸序列的精確個數(shù)參數(shù)不如結構域功能（例如， ⑶74結合或下調）的保持重要。
[0120] 在其他實例中，所述a 1結構域多肽包含所述a 1結構域的一部分或由所述a 1 結構域的一部分組成，例如能夠結合⑶74和/或降低⑶74的表達或活性的所述a 1結構 域的一部分。例如，所述MHC II類al多肽可包含或由以下組成：成熟HLA-DRA多肽的第 38-58位氨基酸（例如，KKETVWRLEEFGRFASFEAQG ;SEQ ID N0:109)或其一部分（例如其5個 或更多個連續(xù)氨基酸，例如，5-16、8-15、8-10或12-15個連續(xù)氨基酸），或HLA-DP、HLA-DQ、 HLA-DM或HLA-D0多肽的同源區(qū)。示例性比對示于圖19中。本領域普通技術人員可鑒定其 他MHC II類a結構域多肽的同源區(qū)，例如利用多序列比對工具。
[0121] 在一些實施方案中，MHC II類a多肽包含SEQ ID N0:1-49所示的氨基酸序列或 由其組成。在另外的實施方案中，MHC II類a多肽的序列具有與SEQ ID N0:1-49之一所 示的氨基酸序列或其片段至少75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。 例如，所述多肽的氨基酸序列具有與SEQ ID N0:1-49所示的氨基酸序列之一或其片段至少 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。可使用可在互聯(lián)網上容易得到的計算 機程序和本文示出的氨基酸序列獲得示例性序列。在一些實例中，所述多肽保持所述MHC II類α 1多肽的功能，例如結合CD74。示例性MHC II類α 1結構域多肽包括表1所示的 那些序列。
[0122] 表1.示例性MHC II類α 1結構域多肽
[0123]
【權利要求】
1. 一種分離的多肽，包含： 主要組織相容性復合物（MHC) II類α 1結構域，其中所述多肽不包含MHC II類α 2、 β1或β 2結構域；或 MHC II類α 1結構域的一部分，其中所述MHC II類α 1結構域的一部分能夠與⑶74 結合或降低⑶74的表達或活性。
2. 權利要求1的分離的多肽，其中所述α 1結構域包括人MHC II類α 1結構域。
3. 權利要求2的分離的多肽，其中所述α 1結構域包括DR-α l、DQ_a l、DP_a 1、 DM-a 1或DO-a 1結構域。
4. 權利要求1-3任一項的分離的多肽，其中所述MHC II類a 1結構域包含成熟MHC II 類α鏈的第1-75位氨基酸殘基，或其至少5個連續(xù)的氨基酸。
5. 權利要求1-5任一項的分離的多肽，其中所述a 1結構域包含來自α鏈的a 1結構 域，所述α鏈包含SEQ ID NO: 1-49的任一條序列所示的氨基酸序列。
6. 權利要求1的分離的多肽，其中所述MHC II類a 1結構域的一部分包含成熟DR-a 鏈的第38-58位氨基酸殘基或其一部分，或者DP α或DQ α的同源區(qū)。
7. 權利要求1-6任一項的分離的多肽，還包含抗原決定簇。
8. 權利要求7的分離的多肽，其中所述抗原決定簇與所述a 1結構域共價連接。
9. 權利要求6的分離的多肽，其中所述共價連接包括肽接頭或化學交聯(lián)劑。
10. 權利要求7-9任一項的分離的多肽，其中所述抗原決定簇包括髓磷脂蛋白肽抗原、 乳糜瀉病相關的肽抗原、風濕性關節(jié)炎相關的肽抗原、葡萄膜炎相關的肽抗原或I型糖尿 病相關的肽抗原。
11. 權利要求10的分離的多肽，其中所述抗原決定簇為包括髓磷脂少突膠質細胞糖蛋 白（M0G)肽、髓磷脂堿性蛋白（MBP)肽或蛋白脂質蛋白（PLP)肽的髓磷脂蛋白肽抗原。
12. 權利要求11的分離的多肽，其中所述髓磷脂蛋白肽抗原包括M0G35-55、MBP85-99、 MBP149-171 或PLP139-151。
13. 權利要求10的分離的多肽，其中所述抗原決定簇為包含胰島素 B: 16-23的I型糖 尿病相關的肽抗原。
14. 編碼權利要求1-13任一項的多肽的分尚的核酸分子。
15. -種載體，包含可操作地與啟動子連接的權利要求14的分離的核酸分子。
16. -種藥物組合物，包含權利要求1-13任一項的分離的多肽或權利要求14或權利要 求15的分尚的核酸分子和可藥用載體。
17. 治療或抑制受試者中的疾病的方法，所述方法包括將有效量的權利要求1-13任一 項的分離的多肽、權利要求14或權利要求15的分離的核酸分子、或權利要求16的藥物組 合物給予所述受試者，從而治療或抑制所述疾病。
18. 權利要求17的方法，其中所述疾病包括炎性和/或自身免疫性疾病。
19. 權利要求18的方法，其中所述炎性和/或自身免疫性疾病包括多發(fā)性硬化、乳糜瀉 病、風濕性關節(jié)炎、I型糖尿病、炎性腸病、強直性脊柱炎、肺出血性腎炎綜合征、橋本氏甲狀 腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、葡萄膜炎、視神經炎。
20. 權利要求17的方法，其中所述疾病包括視網膜疾病、中風或物質成癮。
21. 權利要求20的方法，其中所述物質成癮包括安非他明濫用。
22. 權利要求17-21任一項的方法，其中所述多肽、核酸或藥物組合物是經胃腸外給予 或口服給予的。
23. 權利要求17-22任一項的方法，其中所述受試者被給予約10 μ g-約lg的所述多 肽、核酸或藥物組合物。
24. 權利要求17-22任一項的方法，其中所述治療或抑制所述疾病包括與對照相比時 降低⑶74的表達或活性。
25. 權利要求17-24任一項的方法，還包括確定來自所述受試者的樣品中的⑶74表達 水平或活性水平。
26. 權利要求24或25的方法，其中所述⑶74表達水平包括⑶74RNA和/或蛋白表達 水平。
27. 權利要求24或權利要求25的方法，其中所述CD74活性水平包括NF κ B活性、細胞 增殖、細胞凋亡、或其中兩種或多種的組合。
28. 權利要求25-27任一項的方法，其中來自所述受試者的樣品包括單核細胞、B細胞、 ⑶llb+細胞、⑶34+細胞、⑶4+細胞、⑶19+細胞、⑶74+細胞、或其中兩種或多種的組合。
29. 權利要求25-28任一項的方法，還包括將所述⑶74表達水平或活性水平與對照進 行比較，并且如果所述CD74表達水平或活性水平比所述對照高，那么就增加所述分離的多 肽、所述分離的核酸或所述藥物組合物的劑量或頻率。
30. 確定使用多肽治療受試者中的疾病的功效的方法，所述多肽包含MHC II類α?結 構域、MHC II類β 1結構域、或它們的組合，其中所述多肽不包含α 2結構域或β 2結構域， 所述方法包括： 確定來自所述受試者的樣品中的CD74表達或活性； 將所述CD74表達水平或活性水平與對照進行比較；和 確定治療的功效，其中如果所述CD74表達水平或活性水平比所述對照低或與所述對 照相等，那么就認為所述治療是有效的。
31. 優(yōu)化治療受試者中的疾病的功效的方法，所述方法包括： 給予患有所述疾病的受試者多肽，所述多肽包含MHC II類α 1結構域、MHC II類β 1 結構域、或它們的組合，其中所述多肽不包含α 2結構域和β 2結構域； 確定來自所述受試者的樣品中的CD74表達水平或活性水平； 將所述CD74表達水平或活性水平與對照進行比較；和 確定隨后給予所述受試者的多肽的劑量，其中比所述對照高的CD74表達水平或活性 水平表明應該增加所述多肽的劑量，其中比所述對照低或與所述對照相等的CD74表達水 平或活性水平表明應該減少所述多肽的劑量，從而優(yōu)化治療所述受試者中的所述疾病的功 效。
32. 治療或抑制受試者中的疾病的方法，所述方法包括： 給予患有所述疾病的受試者一定劑量的多肽，所述多肽包含MHC II類α 1結構域、MHC II類β 1結構域、或它們的組合，其中所述多肽不包含α 2結構域和β 2結構域，其中如果 來自所述受試者的樣品中的CD74表達水平或活性水平比對照高，那么就增加所述多肽的 劑量，或者，如果來自所述受試者的樣品中的CD74表達水平或活性水平比對照低或與對照 相等，那么就減少所述多肽的劑量。
33. 權利要求30-32任一項的方法，其中所述⑶74表達水平包括⑶74RNA和/或蛋白 表達水平。
34. 權利要求30-32任一項的方法，其中所述⑶74活性水平包括NF κ B活性、細胞增 殖、細胞凋亡、或它們的組合。
35. 權利要求30-34任一項的方法，其中所述多肽包含： 主要組織相容性復合物（MHC) II類α 1結構域，其中所述多肽不包含MHC II類α 2、 β1和β 2結構域；或 MHC II類α 1結構域的一部分，其中所述MHC II類α 1結構域的一部分能夠與⑶74 結合或降低⑶74的表達或活性。
36. 權利要求30-34的方法，其中所述多肽包含MHC II類β 1和MHC II類α 1結構 域，其中所述α 1結構域的氨基末端與所述β 1結構域的羧基末端共價連接，并且其中所述 多肽不包含α 2和β 2結構域。
37. 權利要求35或權利要求36的方法，其中所述α 1結構域包括人MHC II類α 1結 構域。
38. 權利要求37的方法，其中所述α 1結構域包括DR-α、DQ_a l、DP_a l、DM_a 1、或 DO-a 1結構域。
39. 權利要求35-38任一項的方法，其中所述MHC II類a 1結構域包含所述MHC II類 α鏈的第1-75位氨基酸殘基，或其至少5個連續(xù)的氨基酸。
40. 權利要求37-39任一項的方法，其中所述a 1結構域包含來自α鏈的a 1結構域， 所述α鏈包含SEQ ID NO: 1-49的任一條序列所示的氨基酸序列。
41. 權利要求37的方法，其中所述MHC II類a 1結構域的一部分包含所述DR-α鏈的 第38-58位氨基酸殘基，或者DP-α或DQ α的同源區(qū)。
42. 權利要求41的方法，其中所述β 1結構域包括DR、DQ或DP β 1結構域。
43. 權利要求30-42任一項的方法，其中所述多肽還包含抗原決定簇。
44. 權利要求43的方法，其中所述抗原決定簇是與所述a 1結構域共價連接的。
45. 權利要求44的方法，其中所述共價連接包括肽接頭或化學交聯(lián)劑。
46. 權利要求43-45任一項的方法，其中所述抗原決定簇包括髓磷脂蛋白肽抗原、乳糜 瀉病相關的肽抗原、風濕性關節(jié)炎相關的肽抗原、葡萄膜炎相關的肽抗原或I型糖尿病相 關的肽抗原。
47. 權利要求46的方法，其中所述抗原決定簇為包括髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白 (M0G)肽、髓磷脂堿性蛋白（MBP)肽、或蛋白脂質蛋白（PLP)肽的髓磷脂蛋白肽抗原。
48. 權利要求47的方法，其中所述髓磷脂蛋白肽抗原包括M0G35-55、MBP85-99、 MBP149-171、或 PLP139-151。
49. 權利要求47的方法，其中所述抗原決定簇是包括胰島素 B: 16-23的I型糖尿病相 關的肽抗原。
50. 權利要求30-49任一項的方法，其中來自所述受試者的樣品包括單核細胞、B細胞、 ⑶11B+細胞、⑶34+細胞、⑶4+細胞、⑶19+細胞、⑶74+細胞、或它們的組合。
51. 權利要求30-50任一項的方法，其中所述疾病包括炎性和/或自身免疫性疾病。
52. 權利要求51的方法，其中所述炎性和/或自身免疫性疾病包括多發(fā)性硬化、乳糜瀉 病、風濕性關節(jié)炎、I型糖尿病、炎性腸病、強直性脊柱炎、肺出血性腎炎綜合征、橋本氏甲狀 腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、葡萄膜炎、視神經炎。
53. 權利要求30-50任一項的方法，其中所述疾病包括視網膜疾病、中風或物質成癮。
54. 權利要求30-53任一項的方法，還包括將后續(xù)劑量的所述多肽給予所述受試者，其 中所述劑量基于所述⑶74表達水平或活性水平進行調整。
55. 降低細胞中的CD74表達水平或活性水平的方法，所述方法包括將所述細胞與多肽 接觸，所述多肽包含： 主要組織相容性復合物（MHC) II類α 1結構域，其中所述多肽不包含MHC II類α 2、 β1和β 2結構域；或 MHC II類α 1結構域的一部分，其中所述MHC II類α 1結構域的一部分能夠與⑶74 結合或降低⑶74的表達或活性。
56. 權利要求1-13任一項的分離的多肽、權利要求14或權利要求15的分離的核酸分 子、或所述藥物組合物在治療或抑制受試者中的疾病中的用途。
57. 權利要求56的用途，其中所述疾病包括炎性和/或自身免疫性疾病、視網膜疾病、 中風或物質成癮。
【文檔編號】A61K39/00GK104105503SQ201380004958
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年1月4日 優(yōu)先權日:2012年1月6日
【發(fā)明者】A·A·范登巴克, G·G·伯羅斯, R·梅薩-羅梅羅, G·貝內德克, S·安德魯, J·穆尼 申請人:俄勒岡健康科學大學, 由退伍軍人事務部代表的美國政府