包含tenc1表達或活性抑制劑的預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，其中包括TENC1（包含磷酸酶的張力蛋白樣C1結(jié)構(gòu)域）表達或活性抑制物，更具體地說，涉及到一種用于預(yù)防或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，其抑制由于TENC1的PTPase活性導(dǎo)致的IRS-1降解（胰島素受體底物-1），或抑制由于TENC1的PTPase活性導(dǎo)致的IRS-1磷酸化。根據(jù)本發(fā)明的用于預(yù)防或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，其包括作為活性成分的TENC1表達或活性抑制物，該藥物組合物預(yù)期可以廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥，因為藥物組合物能有效地預(yù)防肌肉萎縮癥和減少糖吸收，這是由于通過抑制TENC1所致的IRS-1降解，在IRS-1中減少。
【專利說明】包含TENC1表達或活性抑制劑的預(yù)防或治療糖尿病的藥物 組合物 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，其包含作 為活性成分的TENC1 (張力蛋白像包含磷酸酶的C1結(jié)構(gòu)域）活性或表達的抑制劑，更具 體地說，涉及一種用于預(yù)防或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，其由于TENC1的 PTPase活性，抑制IRS-1 (胰島素受體底物-1)的磷酸化或IRS-1的降解。 【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種以高血糖（血糖水平高）為特征的代謝疾病，其由于胰島素分泌不 足或功能障礙引起。高血糖會導(dǎo)致多種癥狀和體征，并且葡萄糖隨著尿液排出。此外，隨著 時間的流逝，會在神經(jīng)、腎臟、視網(wǎng)膜等處引起血管疾病和功能障礙，導(dǎo)致死亡。
[0003] 糖尿病有兩種類型：1型和2型。1型糖尿病被稱為"青少年糖尿病"，不產(chǎn)生胰島 素時會導(dǎo)致1型糖尿病。2型糖尿病是由于胰島素相對缺乏而導(dǎo)致的，其特點是胰島素抵 抗（由于胰島素的功能降低，細(xì)胞不能有效處理血糖，降低血糖水平）。2型糖尿病主要是 由于環(huán)境因素，如在西方化飲食中的商卡路里、商脂肪、商蛋白食物，以及缺乏運動，并承受： 壓力所導(dǎo)致的。除了環(huán)境因素，糖尿病可能是由于特定的基因缺陷，胰腺癌手術(shù)、感染或藥 物導(dǎo)致的。
[0004] 近來，由于西方化飲食、壓力、缺乏鍛煉等，慢性和與生活方式相關(guān)的成人疾病，如 動脈硬化、高血壓和糖尿病在增加。特別是，在韓國，糖尿病的發(fā)病率持續(xù)增加：在20世紀(jì) 70年代不到1 %的人口，在20世紀(jì)80年代末大約3 %，在20世紀(jì)90年代為5?8 %。因 此，到目前為止，已經(jīng)開發(fā)出各種類型的糖尿病治療藥物，但是尚未開發(fā)出令人滿意的治療 方法或藥物。
[0005] 胰島素抵抗是2型蛋白質(zhì)的特征，其是由胰島素分泌缺陷引起的，胰島素抵抗降 低了胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，最近新提出的治療糖尿病的方法是增加胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為 此，正在開發(fā)一種抑制蛋白質(zhì)表達的方法，所述蛋白質(zhì)如PTP1B(蛋白酪氨酸磷酸酶1B)抑 制膜島素受:體的功能。然而，在2型糖尿病中，膜島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)問題通常是由IRS-1 (膜島 素受體底物-1)功能降低（減少蛋白質(zhì)的數(shù)量和IRS-1酪氨酸磷酸化）引起的，而非胰島 素受體的功能退化。因此，能夠調(diào)節(jié)IRS-1功能的蛋白質(zhì)是非常重要的，因為它是治療糖尿 病和糖尿病并發(fā)癥的靶標(biāo)。然而，與糖尿病有關(guān)的作為IRS-1的PTPase (蛋白酪氨酸磷酸 酶）具有直接影響力的蛋白質(zhì)尚未報道。同時調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的數(shù)量和IRS-1磷酸化的PTPase 的例子也尚未報道。
[0006] 通過這種方式，能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)數(shù)量和IRS-1磷酸化減少的蛋白質(zhì)，是糖尿病或 糖尿病并發(fā)癥治療藥物的有效靶標(biāo)。因此，發(fā)現(xiàn)這種糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的靶蛋白以及 開發(fā)其使用都是必要的。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問題
[0008] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療或糖尿病并發(fā)癥 的藥物組合物，其包含作為活性成分的TENC1 (包含磷酸酶的張力蛋白樣C1結(jié)構(gòu)域，Tensin like Cldomain containing phosphatase)表達或活性的抑制劑。此外，本發(fā)明提供了一種 TENC1表達或活性的抑制劑的篩選方法。該方法包括與測試物質(zhì)在一起培養(yǎng)或單獨培養(yǎng)表 達TENC1 (包含磷酸酶的張力蛋白樣C1結(jié)構(gòu)域）的細(xì)胞，并測量細(xì)胞中TENC1的表達或活 性程度。
[0009] 然而，本發(fā)明的范圍并不局限于上述目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從下面的詳情中 清楚地知曉其它未提到的目的。
[0010] 技術(shù)方案
[〇〇11] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種用于預(yù)防或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的藥物 組合物，其包含作為活性成分的TENC1 (包含磷酸酶的張力蛋白樣C1結(jié)構(gòu)域）表達或活性 的抑制劑。
[0012] 該表達抑制劑可以是siRNA的si6或si7。
[0013] 該活性抑制劑可以是烏酸。
[0014] TENC1可以包括SEQ ID NO. 1的氨基酸序列。
[0015] TENC1可以是PTPase (蛋白酪氨酸磷酸酶）活性。
[〇〇16] TENC1可以使用IRS-1 (胰島素受體底物-1)作為底物。
[〇〇17] 糖尿病的并發(fā)癥可能選自下列組成的組，包括肌肉萎縮、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿 病性白內(nèi)障、糖尿病腎病、糖尿病性神經(jīng)病變、心臟病、癌癥、骨質(zhì)疏松癥、腎臟疾病、性功能 障礙、皮膚疾病、高血壓、動脈硬化、中風(fēng)或動脈粥樣硬化。
[0018] 該組合物可以抑制IRS-1的降解性和/或TENC1的脫磷酸。
[〇〇19] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種用于治療或預(yù)防糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的 抑制劑的篩選方法，該抑制劑能抑制TENC1的表達或活性，該方法包括：
[0020] 與測試物質(zhì)在一起培養(yǎng)或單獨培養(yǎng)表達TENC1 (包含磷酸酶的張力蛋白樣C1結(jié)構(gòu) 域）的細(xì)胞；以及
[0021] 測量細(xì)胞中TENC1的表達或活性的程度。
[0022] 測試物質(zhì)可以選自下列組成的組，包括化學(xué)物質(zhì)、微生物培養(yǎng)液或提取物、核酸、 抗體、適體和天然提取物。
[0023] 可以通過RT-PCR(實時聚合酶鏈反應(yīng)）或蛋白質(zhì)印跡法，測量TENC1表達的程度。
[0024] 在TENC1的活性程度測量中，可以測量TENC1的PTPase活性，或者TENC1和IRS-1 的結(jié)合程度。
[0025] 有益效果
[0026] 本發(fā)明已證實，TENC1的PTPase活性抑制IRS-1的磷酸化，或直接降解IRS-1，使 得葡萄糖的吸收減少并且引起肌肉萎縮，從而提出了一種治療糖尿病的新靶標(biāo)。因此，根據(jù) 本發(fā)明，提供了一種用于預(yù)防或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥制藥物組合物，其包含作為活 性成分的TENC1表達或活性的抑制劑，該抑制劑抑制由TENC1引起的IRS-1脫磷酸和降解， 并且能夠有效預(yù)防由于IRS-1減少引起的葡萄糖吸收減少和肌肉萎縮。因此，可以預(yù)期的 是該組合物將廣泛應(yīng)用于預(yù)防和/或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥。同樣的，當(dāng)使用根據(jù)本 發(fā)明的TENC1表達或活性的抑制劑進行的篩選方法時，激活I(lǐng)RS-1的機理和有效預(yù)防和/ 或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的藥品開發(fā)是可以預(yù)期的。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1示出了通過測量在db/db小鼠中TENC1表達的增加所獲得結(jié)果。
[0028] 圖2示出了通過測定TENC1對Akt和ERK1/2的磷酸化的抑制能力所獲得的結(jié)果。
[0029] 圖3示出了通過測量TENC1對胰島素受體和IRS-1的磷酸化的抑制能力所獲得的 結(jié)果。
[0030] 圖4示出了通過測量TENC1和IRS-ι的結(jié)合所獲得的結(jié)果。
[0031] 圖5示出了通過測量IRS-1和TENC1的PTPase結(jié)構(gòu)域的結(jié)合所獲得的結(jié)果。
[0032] 圖6示出了通過測量TENC1的PTPase酶活性所獲得的結(jié)果。
[0033] 圖7示出了通過在TENC1表達時，測量在肌肉中與IRS-1相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)磷酸化 所獲得的結(jié)果。
[0034] 圖8示出了通過在TENC1表達時，測量IRS-1的mRNA的量所獲得的結(jié)果。
[0035] 圖9示出了通過在TENC1表達時，測量IRS-1的絲氨酸磷酸化所獲得的結(jié)果。
[0036] 圖10示出了通過測量TENC1的PTPase活性對IRS-1降解的影響所獲得的結(jié)果。
[0037] 圖11示出了通過測量依賴TENC1酶活性而引起體外肌肉萎縮的能力所獲得的結(jié) 果。
[0038] 圖12示出了通過測量TENC1減少MYH的能力所獲得的結(jié)果。
[0039] 圖13示出了通過測量TENC1對FoxO蛋白質(zhì)磷酸化的影響所獲得的結(jié)果。
[〇〇4〇] 圖14示出了通過測量依賴TENC1酶活性而引起體外肌肉萎縮的能力所獲得的結(jié) 果。
[0041] 圖15示出了通過TENC1表達的抑制作用會導(dǎo)致肌肉肥大，IRS-1降解的抑制作用 對肌肉萎縮的抑制。
[0042] 圖16說明的是結(jié)果，其證實TENC1的活性抑制可以抑制IRS-1脫磷酸和降解。 【具體實施方式】
[0043] 本發(fā)明人研究了靶蛋白質(zhì)，其通過調(diào)節(jié)IRS-1 (胰島素受體底物-1)的功能性降解 可以有效地用于治療糖尿病，從而完成了本發(fā)明。
[0044] 因為蛋白質(zhì)如PTP1B(蛋白酪氨酸磷酸酶1B)，最近作為在胰島素受體中治療糖尿 病的靶標(biāo)受到廣泛關(guān)注，據(jù)證實它對葡萄糖的吸收有作用，但它對通常由糖尿病引起的肌 肉量減少沒有作用。因此，為了篩選治療藥物的靶標(biāo)，該治療藥物可以治療糖尿病和伴隨糖 尿病的肌肉萎縮，本發(fā)明人分析了一種蛋白質(zhì)，其在糖尿病誘導(dǎo)小鼠的肌肉中的表達比正 常小鼠中更多，因此，篩選出了 TENC1蛋白質(zhì)（SEQ ID N0. 1)。
[0045] 本發(fā)明的一個實施例證實，TENC1抑制IRS-1磷酸化，同時，通過降解IRS-1抑制 IRS的功能（參見圖4-圖10)。另一個實施例證實TENC1抑制IRS-1的功能，從而造成肌 肉萎縮（參見圖11-13)。本發(fā)明的還一個實施例證實，通過抑制TENC1表達來抑制IRS-1 次級信號增加和抑制糖尿病引起的肌肉萎縮（參見圖15)。
[0046] 本發(fā)明的還一個實施例證實，可以通過抑制TENC1活性來抑制IRS-1的脫磷酸化 和IRS-1的降解（參見圖16)。
[0047] 基于上述結(jié)果，據(jù)證實TENC1可以用作治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的靶蛋白， TENC1表達或活性的抑制劑可以用作治療或預(yù)防糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的有效物質(zhì)。因此， 本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，其包含作為活性 成分的TENC1 (張力蛋白像包含磷酸酶的C1結(jié)構(gòu)域）表達或活性的抑制劑。糖尿病并發(fā)癥 的例子包括肌肉萎縮、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病性白內(nèi)障、糖尿病腎病、糖尿病性神經(jīng)病 變、心臟病、癌癥、骨質(zhì)疏松癥、腎臟疾病、性功能障礙、皮膚疾病、高血壓、動脈硬化、中風(fēng)、 動脈粥樣硬化等，但并發(fā)癥并不局限于此，只要它是由糖尿病引起的就是糖尿病并發(fā)癥。
[0048] 同樣地，本發(fā)明提供了一種篩選TENC1表達或活性的抑制劑的方法，該抑制劑可 用于預(yù)防或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥。該方法包括，與測試物質(zhì)在一起培養(yǎng)或單獨培養(yǎng) 表達TENC1 (包含磷酸酶的張力蛋白樣C1結(jié)構(gòu)域）的細(xì)胞，并測量細(xì)胞中TENC1的表達或 活性的程度。測量TENC1表達程度的方法包括RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡法等等，但不限于此，只 要它可以測量mRNA或蛋白質(zhì)的量。同時，測量TENC1活性度的方法是測量TENC1的PTPase 活性或TENC1與IRS-1的結(jié)合程度。然而，該方法并不局限于此。測試物質(zhì)可能選自下列 組成的組，包括化學(xué)物質(zhì)、微生物培養(yǎng)液或提取物、核酸、抗體、適體和天然提取物，但物質(zhì) 并不局限于此。
[〇〇49] 本發(fā)明的藥物組合物可以包括藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體可以包 括生理鹽水、聚乙二醇、乙醇、植物油、肉豆蘧酸異丙酯等等，但載體不限于此。
[0050] 本發(fā)明的另一個方面，提供了一種通過對"受試者"施用藥學(xué)上有效劑量的藥物 組合物來治療糖尿病的方法，該藥物組合物包含作為活性成分的TENC1表達或活性的抑制 齊U。在本發(fā)明中"受試者"這一術(shù)語是指需要治療疾病的目標(biāo)，更具體地說，哺乳動物如人 類或非人類的猩猩、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛。同樣，在本發(fā)明中，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯 而易見的是，藥學(xué)上有效劑量的范圍是可以根據(jù)患者體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、給 藥時間、給藥方法、排泄率、疾病的嚴(yán)重程度等進行不同的調(diào)整。
[0051] 本發(fā)明的藥物組合物的優(yōu)選劑量取決于患者的病情、體重、疾病的程度、藥物劑 型、給藥途徑和持續(xù)時間而變化，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇。然而，一天的施用劑 量，優(yōu)選0. 001?l〇〇mg/體重（kg)，更優(yōu)選0. 01?30mg/體重（kg)?？梢悦刻旖o藥一 次也可以分成幾次給藥。本發(fā)明的TENC1表達或活性的抑制劑可以占總組合物總重量的 0· 0001 ?10wt%，優(yōu)選 0· 001 ?lwt%。
[0052] 本發(fā)明的藥物組合物可以通過不同的途徑施用給哺乳動物如鼠，小鼠，牲畜和人 類。施用方法可以是例如，通過口腔、直腸、或靜脈、肌肉內(nèi)、皮下、子宮內(nèi)硬膜下或腦室注 射，給藥方法不限于此。
[0053] 在下文中，將描述本發(fā)明進一步的實施例，以便于理解本發(fā)明。然而，下面提供的 例子僅便于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的范圍并不局限于以下實施例。
[0054] 實施例
[0055] 實施例1、與糖尿病相關(guān)的蛋白質(zhì)的篩選
[0056] 已經(jīng)知曉的是，具有SH2(Src同源區(qū)2)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在從受體中傳遞信號中是 很重要的。因此，為了篩選與糖尿病有關(guān)的新的蛋白質(zhì)，發(fā)明人在10周齡的雄性db/db小 鼠的肌肉中，通過定量實時PCR篩選蛋白質(zhì)，該小鼠的瘦素受體已經(jīng)被去除以誘導(dǎo)肥胖癥 和糖尿病，該蛋白質(zhì)具有SH2結(jié)構(gòu)域，并且比正常小鼠中表達更多。為了進行PCR，使用了 TENC1的正向引物5'-CTCAGTGGAGTTTGTTTTCTCCTC-3'（SEQIDN0·2)，TENC1的反向引物5 ' -GCTGATTGAAGTTTTCATAGGAGTC-3'（SEQ ID NO. 3)，p85a 正向引物 5' -GGCGATTACACTCTTAC ACTAAGGA-3'（SEQIDN0·4)，p85a反向引物5'-GAGTTGAAGGTTAATGGATCAGAGA-3'（SEQID NO. 5)。結(jié)果如圖1所示。
[0057] 如圖1所示，它證實了 db/db小鼠的骨骼肌中TENC1的mRNA顯著增加超過三倍 (參見圖1)，并且TENC1的蛋白質(zhì)的量也增加了（參見圖1B)。眾所周知，2型糖尿病導(dǎo)致 肌肉減少癥?；谏鲜鼋Y(jié)果，證實TENC1與2型糖尿病相關(guān)的病理癥狀表達相關(guān)。
[0058] 實施例2、確定TENC1對胰島素機理的影響
[0059] 在大多數(shù)2型糖尿病患者中，胰島素降低血糖水平的功能降低，從而細(xì)胞不能有 效處理葡萄糖。為了確定TENC1對胰島素機理的影響，在低表達TENC1的HEK293細(xì)胞系中 過量表達TENC1，然后通過蛋白質(zhì)印跡法確定與胰島素機理相關(guān)的蛋白質(zhì)磷酸化。結(jié)果如圖 2所示。
[0060] 如圖2所示，證實了 TENC1抑制了胰島素刺激的Akt (蛋白激酶B) T308和 ERK1/2 (細(xì)胞外信號激酶）的磷酸化。
[0061] 因為Akt和ERK1/2的磷酸化是由于胰島素受體和IRS-1 (胰島素受體底物-1)的 酪氨酸磷酸化導(dǎo)致的，使用如上所述相同的方法，可以證實TENC1是否抑制了胰島素受體 和IRS-1磷酸化。結(jié)果如圖3所示。
[0062] 如圖3A所示，證實了 TENC1可以抑制約50% IRS-1的磷酸化，但對胰島素受體 磷酸化沒有影響。此外，為了確定TENC1抑制磷酸化的能力是否是由蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶 (PTPase)的活性所引起的，制備了 TENC1CS變體，其中氨基酸位置231上的半胱氨酸被絲氨 酸替代。TENC1CS變體是突變體，比常規(guī)TENC1更可靠地結(jié)合到底物，但是沒有催化作用。 使用TENC1CS變體，使用如上所述同樣的方法測定IRS-1的磷酸化。結(jié)果如圖3B所示。
[0063] 如圖3B所示，證實了當(dāng)使用TENC1CS時，IRS-1的磷酸化又恢復(fù)了?；谏鲜鼋Y(jié) 果，證實了 TENC1抑制IRS-1的磷酸化，抑制Akt和ERK1/2的磷酸化，從而抑制胰島素作用 機理。
[0064] 實施例3、確定TENC1對IRS-1磷酸化的抑制機理
[0065] 為了確認(rèn)TENC1抑制IRS-1磷酸化的機理，使用IRS-1進行免疫沉淀反應(yīng)。在對 照實驗中，使用磷酸酪氨酸的類似物釩酸鹽，與PTPase結(jié)構(gòu)域結(jié)合以抑制PTPase的活性。 結(jié)果如圖4和圖5所示。
[0066] 如圖4所示，確認(rèn)了 TENC1CS變體比TENC1WT (野生型）更可靠地結(jié)合到IRS-1。此 夕卜，如圖5所示，證實了當(dāng)不用釩酸鹽時，TENC1WT結(jié)合到IRS-1，但使用釩酸鹽時，與IRS-1 的結(jié)合減少?；谏鲜鼋Y(jié)果，證實IRS-1與釩酸鹽競爭結(jié)合到TENC1的PTPase結(jié)構(gòu)域。因 此，證實了 IRS-1作為TENC1的底物直接結(jié)合到PTPase結(jié)構(gòu)域中。
[0067] 此外，為了測量TENC1的PTPase活性，首先，F(xiàn)lag免疫沉淀反應(yīng)/Flag肽洗脫系統(tǒng) 將TENC1從HEK293細(xì)胞系中分離出來。然后，使用具有磷酸酪氨酸的肽，隨著時間的推移， 測量分離的TENC1的PTPase活性。使用孔雀石綠測定法分析PTPase的活性。使用PTEN (磷 酸酶和張力蛋白同系物）或使用TENC1 CS變體作為對照組。結(jié)果如圖6所示。
[0068] 如圖6A和圖6B所示，證實了 TENC1與PTEN的PTPase活性相似，在TENC1CS變體 中沒有PTPase活性?；谏鲜鼋Y(jié)果，證實了通過TENC1結(jié)合到IRS-1中通過PTPase活性 抑制磷酸化。此外，上述結(jié)果意味著TENC1抑制IRS-1磷酸化以影響糖尿病的發(fā)病。
[0069] 實施例4、確定TENC1的IRS-1降解機理
[〇〇7〇] 為了了解TENC1的生理功能，使用腺病毒，在L6肌管（肌細(xì)胞）中過表達TENC1， L6肌管在IRS-1中起重要作用。使用與實施例1相同的方法，進行定量PCR，證實，在肌管 中TENClmRNA增加8-10倍。然后，使用與實施例2相同的方法，測定與IRS-1相關(guān)的蛋白 質(zhì)的磷酸化。結(jié)果如圖7所示。
[0071] 如圖7所示，證實了在TENC1過量表達的細(xì)胞中，通過IRS-1調(diào)節(jié)Akt、S6K1和 ERK1/2的磷酸化受到抑制（參見圖7A和7B)。然而，它證實IRS-1蛋白質(zhì)的數(shù)量也減少 (參見圖7C)。
[0072] 為了確定IRS-1數(shù)量的降低是否是由于抑制的基因表達，使用IRS-1的正向引物 (SEQ ID N0. 6)和反向引物（SEQ ID N0. 7)通過定量PCR來定量IRS-1的mRNA。結(jié)果如圖 8所示。
[0073] 如圖8所示，證實了 IRS-1的mRNA的量沒有降低。基于上述結(jié)果，證實，發(fā)生IRS-1 蛋白質(zhì)的量減少，不是因為在轉(zhuǎn)錄階段的基因表達，而是由于轉(zhuǎn)錄階段之后的基因表達。
[0074] 因此，為了確定IRS-1減少的原因，通過蛋白質(zhì)印跡法確定TENC1是否影響泛素蛋 白酶體途徑或IRS-1的絲氨酸磷酸化。為了確定TENC1是否影響蛋白質(zhì)降解機理，使用了 MG132,其是一種蛋白質(zhì)降解酶（蛋白酶）的抑制劑。結(jié)果如圖9所示。
[0075] 如圖9所示，證實，在不處理胰島素時（圖9A)和處理胰島素時（圖9 B)，處理 MG132時的IRS-1的減少數(shù)量都恢復(fù)了，并且在通過處理MG132而恢復(fù)IRS-1的量的細(xì)胞 中，IRS-1的絲氨酸磷酸化沒有區(qū)別，但IRS-1磷酸化受到了抑制?；谏鲜鼋Y(jié)果，證實， TENC1是通過降解IRS-1或抑制其磷酸化以影響IRS-1的機理。
[0076] 為了確定TENC1的PTPase活性是否影響IRS-1的降解，釩酸鹽處理，通過蛋白質(zhì) 印跡法確定IRS-1的降解是否被抑制。結(jié)果如圖10所示。
[0077] 如圖10所示中，證實了當(dāng)釩酸鹽處理時，IRS-1降解被抑制?？梢灾獣缘氖?，TENC1 的活性直接參與IRS-1降解。
[0078] 實施例5、確定TENC1和肌肉萎縮的相互關(guān)系
[0079] 在糖皮質(zhì)激素引起的肌肉萎縮和鏈脲霉素（STZ)引起的急性糖尿病肌肉萎縮中 觀察到，由于IRS-1蛋白質(zhì)數(shù)量的減少，IRS-2蛋白質(zhì)數(shù)量的增加并且PI3K/Akt/mT0RCl信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)的減少。因此，為了確定TENC1是否會引起肌管萎縮，進行了如下實驗，使用腺病毒 在肌管中表達綠色熒光蛋白（GFP)，TENC1 WT或者TENC1 CS過量表達，用熒光測量肌管的 直徑。結(jié)果如圖11所示。
[0080] 如圖11所示，證實，在TENC1過量表達的細(xì)胞，相比TENC1 CS過量表達的細(xì)胞，其 尺寸下降了約40%。上面的結(jié)果意味著TENC1與糖尿病引起的肌肉萎縮有關(guān)。
[0081] 已知的是，泛素蛋白酶體途徑在肌肉萎縮中降解了肌纖維蛋白如肌球蛋白重鏈 (MYH)，其是骨骼肌的主要組成部分。因此，進行了一個實驗來確定TENC1是否影響泛素蛋 白酶體途徑以減少MYH。結(jié)果如圖12所示。
[0082] 如圖12所示，通過蛋白質(zhì)印跡法根據(jù)PTPase的活性，證實TENC1降解MYH?；?上述結(jié)果，證實，TENC1降解IRS-1以抑制Akt/S6K1機制，從而可能造成肌肉萎縮。
[0083] 哺乳動物細(xì)胞包括三種類型的FoxO(叉頭框轉(zhuǎn)錄因子0)蛋白質(zhì)：Fox01、Fox03、 Fox04。其中，F(xiàn)oxOl和Fox03磷酸化對糖皮質(zhì)激素引起的肌肉萎縮至關(guān)重要。特別是激活 的Fox03刺激基因表達，在肌肉萎縮中發(fā)揮重要作用，S卩，各種萎縮基因，造成肌肉萎縮。因 此，通過蛋白質(zhì)印跡法確定TENC1是否影響FoxOl和Fox03磷酸化。結(jié)果如圖13所示。
[0084] 如圖13所示，在TENC1過量表達的肌管（參見圖13A)中，F(xiàn)ox01/3a磷酸化下降。 在TENC1 CS過量表達的肌管（參見圖13B)中，F(xiàn)oxOl蛋白的量減少，并且Fox01/3a磷酸 化的量相對增加。此外，由FoxO蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的MuRFl (肌肉RING指蛋白1)在肌管中表達 增加，該肌管中TENC1過量表達（參見圖13C)?；谏鲜鼋Y(jié)果，證實TENC1降解IRS-1以激 活FoxO蛋白質(zhì)，這樣可能會引起肌管萎縮。
[0085] 實施例6、確定TENC1引起的肌肉萎縮
[0086] 為了確定TENC1是否導(dǎo)致體內(nèi)肌肉萎縮，通過電穿孔，YFP(黃色熒光蛋白）結(jié)合 的TENC1，注入到小鼠的脛骨前肌中。然后，使用YFP測量肌纖維的尺寸變化。結(jié)果如圖14 所示。
[0087] 如圖14A、14B和14C所示，證實了注射TENC1的肌肉橫截面積（CSA)在12天后下 降了約25 (%。然而，這證實TENClCS不會造成肌肉萎縮?；谏鲜鼋Y(jié)果，證實由于PTPaSe 活性，TENC1可能導(dǎo)致體內(nèi)肌肉萎縮。
[0088] 實施例7、確定抑制TENC1表達的效果
[0089] 為了確定TENC1可以用作治療糖尿病的靶標(biāo)，使用了 si6和si7,其是特異性結(jié)合 到TENC1的siRNA。證實，當(dāng)TENC1的量減少時，糖皮質(zhì)激素引起的IRS-1降解被恢復(fù)，來 預(yù)防肌管的肌肉萎縮。使用DeliverX Plus siRNA轉(zhuǎn)染（Panomics)，siRNA被引入L6肌管 中。結(jié)果如圖15所示。
[0090] 如圖15所示，證實，當(dāng)SiRNA用于抑制TENC1的表達時，糖皮質(zhì)激素引起的MYH減 少被有效抑制（參見圖15C)。然而，可以知曉的是，si7強烈抑制TENC1的表達，通過IRS-1 底物蛋白質(zhì)（sub-proteins)活化導(dǎo)致肌肉肥大（參見圖15A和15B)。此外，證實，MuRFl 刺激和由糖皮質(zhì)激素引起的IRS-1降解（參見圖15D)被恢復(fù)（參見圖15B)，并且肌肉萎縮 得到抑制（參見圖15F)。
[0091] 實施例8、確定抑制TENC1活性的效果
[0092] 據(jù)報道，烏酸抑制肌肉萎縮并導(dǎo)致肌肉肥大。然而，其靶標(biāo)或者作用機理尚未明確 確定。
[0093] 因此，發(fā)明人通過以下實驗確定烏酸是否能夠靶向TENC1調(diào)節(jié)活性。
[0094] 特別是，使用與實施例3相同的方法分離的TENC1蛋白質(zhì)，與20μπι烏酸一起培 養(yǎng)，然后通過孔雀石綠測量PTPase活性的變化（在這種情況下，使用釩酸鹽作為對照組）。 結(jié)果證實TENCl的PTPase活性被抑制60%或更多（參見圖16A)。
[0095] 此外，使用如實施例2相同的方法，當(dāng)TENC1和IRS-1過量表達的細(xì)胞（HEK293 細(xì)胞系）與測試物質(zhì)一起培養(yǎng)時，IRS-1的酪氨酸磷酸化增加，從而證實，由TENC1引起的 IRS-1脫磷酸在細(xì)胞水平上被抑制（參見圖16B)。
[0096] 此外，將烏酸添加到TENC1過量表達的肌管（肌細(xì)胞）中，然后通過蛋白質(zhì)印跡法 測量IRS-1蛋白質(zhì)的降解程度。因此，當(dāng)烏酸的濃度增加時，IRS-1恢復(fù)到與對照組（細(xì)胞 中的TENC1沒有過量表達）相似的水平。因此，證實，通過烏酸可以抑制由TENC1的活性引 起的IRS-1降解（參見圖16C)。
[0097] 基于上述結(jié)果，TENC1的活性抑制劑例如烏酸，抑制由TENC1的活性引起的IRS-1 脫磷酸和IRS-1的降解。因此，證實，可以有效地預(yù)防由IRS-1減少造成的葡萄糖的吸收降 低、肌肉萎縮等。因此，可以知曉的是，TENC1的活性抑制劑可以有效地用于治療或預(yù)防糖 尿病。
[〇〇98] 本發(fā)明的上面描述僅僅是示例，可以理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以不背離本發(fā) 明的范圍而且不改變基本特征而進行變型。因此，上述實施例僅僅作為描述性意義而不是 為了限制本發(fā)明。
[0099] 工業(yè)適用性
[〇1〇〇] 本發(fā)明的TENC1表達或活性的抑制劑，抑制由TENC1導(dǎo)致的IRS-1的脫磷酸和降 解，并且能夠防止IRS-1降低引起的葡萄糖吸收減少和肌肉萎縮，因此其可被開發(fā)為一種 預(yù)防和/或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的藥物。此外，本發(fā)明提出的篩選方法提供了 TENC1 作為一種新的靶標(biāo)化合物來克服已有的治療藥物的限制。因此，本發(fā)明能夠有用地用來開 發(fā)一種藥物，其具有預(yù)防和/或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的新機理。
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【權(quán)利要求】
1. 一種用于預(yù)防或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，包括： 作為活性成分的TENC1 (包含磷酸酶的張力蛋白樣C1結(jié)構(gòu)域）表達或活性抑制劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物， 其特征在于，表達抑制劑是si6,其包括SEQ ID NO. 8的序列，或者是si7,其包括SEQ ID NO. 9的序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物， 其特征在于，所述活性抑制劑包括烏酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物， 其特征在于，所述TENC1包括SEQ ID NO. 1的氨基酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物， 其特征在于，所述TENC1包括PTPase (蛋白酪氨酸磷酸酶）活性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物， 其特征在于，所述TENC1使用IRS-1 (胰島素受體底物-1)作為底物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物， 其特征在于，所述糖尿病并發(fā)癥選自由肌肉萎縮、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病性白內(nèi) 障、糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變、心臟病、癌癥、骨質(zhì)疏松癥、腎臟疾病、性功能障礙、皮膚 疾病、高血壓、動脈硬化、中風(fēng)和動脈粥樣硬化所組成的組。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物， 其特征在于，所述藥物組合物抑制通過TENC1的IRS-1降解。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物， 其特征在于，所述藥物組合物抑制通過TENC1的IRS-1脫磷酸。
10. -種TENC1表達或活性抑制劑的篩選方法，所述抑制劑治療或預(yù)防糖尿病或糖尿 病并發(fā)癥，該方法包括： 與測試物質(zhì)在一起培養(yǎng)或單獨培養(yǎng)表達TENC1 (包含磷酸酶的張力蛋白樣C1結(jié)構(gòu)域） 的細(xì)胞；以及 測量TENC1在細(xì)胞中的表達或活性程度。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法， 其特征在于，所述測試物質(zhì)選自由化學(xué)物質(zhì)、微生物培養(yǎng)液或提取物、核酸、抗體、適體 和天然提取物所組成的組。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法， 其特征在于，通過RT-PCR或蛋白質(zhì)印跡法測量TENC1的表達程度。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法， 其特征在于，在測量TENC1活度的過程中，測量TENC1的PTPase活性或TENC1和IRS-1 的結(jié)合度。
【文檔編號】A61P3/10GK104066437SQ201380006963
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月30日
【發(fā)明者】柳成浩, 高雅羅, 李美男, 鄭熙潤, 梁用烈, 徐判吉 申請人:浦項工科大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團