體外制備人工牙齒原基的方法和由其獲得的人工牙齒原基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明是針對(duì)一種體外制備一種人工牙齒原基的方法，包括以下步驟：a)提供多個(gè)分離的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞；以及b)在多種非貼壁條件下培養(yǎng)這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞以形成代表一種人工牙齒原基的一個(gè)細(xì)胞聚集體；連同培養(yǎng)至由其衍生的一種人工牙齒原基。
【專利說明】體外制備人工牙齒原基的方法和由其獲得的人工牙齒原基

【背景技術(shù)】
[0001] 牙科護(hù)理是維持健康義齒的最佳方式。然而，即使在最佳牙科護(hù)理下，也可發(fā)生牙 齒的損害、破壞或缺失。所述牙齒的損害、破壞或缺失可能為例如疾病相關(guān)的、激素相關(guān)的、 療法相關(guān)的或意外事件的后果?，F(xiàn)今，在此類情況下使用牙科植入體，這些牙科植入體通常 由包含金屬（例如鈦）、陶瓷和/或復(fù)合物的材料形成。這些植入技術(shù)是高度復(fù)雜的且由醫(yī) 學(xué)和化妝品觀點(diǎn)，已經(jīng)達(dá)到高水平。然而，這些牙齒替換療法需要一個(gè)重要的外科手術(shù)，且 最終，需要辛苦的隨訪護(hù)理。另外，這些合成植入體無法滿足對(duì)于牙齒的所有需求，如例如 由將牙齒固定于額骨內(nèi)的天然牙周韌帶"吸收"。
[0002] 因此，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的一個(gè)目的是提供允許生產(chǎn)或誘導(dǎo)在功能和形態(tài)方面等 于對(duì)應(yīng)的天然存在組織和器官的組織或器官的手段。一種方法是提供可體外和/或體內(nèi)用 于牙齒再生的人工組織或器官。所述人工組織包含已經(jīng)通過生物技術(shù)手段生產(chǎn)的組織。
[0003] 除了提供能夠體內(nèi)形成在功能和形態(tài)方面充分等于天然存在牙齒的牙齒的組織 的問題以外，另一目標(biāo)是提供無需胚胎干細(xì)胞即可制造且利用源于待治療的患者的細(xì)胞的 組織。
[0004] 在眾多方法中，已經(jīng)針對(duì)用于這種目的的組織進(jìn)行首次嘗試且取得進(jìn)展。此 類方法的實(shí)例描述于EP1 905 459AUEP2 130 909A1、US2007/0231275AUUS 2011/0212414以及WO2005/051436A2中。然而，在大多數(shù)的這些方法中，使用胚胎細(xì)胞，這 些細(xì)胞在非生理學(xué)貼壁培養(yǎng)（adherentculture)條件下進(jìn)行培養(yǎng)且需要合成支架或載體 的存在。
[0005] 因此，本發(fā)明的一種選擇是提供克服現(xiàn)有技術(shù)的一種或多種問題的手段。具體來 說，本發(fā)明的一種選擇是提供體外制備人工牙齒原基的改良的方法，該方法可用非胚胎原 代細(xì)胞來執(zhí)行。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及一種體外制備人工牙齒原基的方法，包括以下步驟：
[0007]a)提供分離的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞；和
[0008]b)在非貼壁條件下培養(yǎng)這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞以形成代表人工牙齒原基的細(xì)胞聚 集體。
[0009] 已驚訝地發(fā)現(xiàn)，分離的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞能夠形成代表人工牙齒原基的三維細(xì)胞聚 集體，而不影響胚胎上皮細(xì)胞。這種效應(yīng)是通過在非貼壁條件下培養(yǎng)間充質(zhì)牙髓細(xì)胞來達(dá) 成的?？赡苷故?，在所述非貼壁培養(yǎng)條件下，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞自由地彼此安排且凝結(jié)成 細(xì)胞聚集體，該聚集體展現(xiàn)牙胚結(jié)構(gòu)的特異性標(biāo)志物的表達(dá)且因此表示牙齒原基。
[0010] 在下文中，更詳細(xì)地提供本發(fā)明的不同方面。除非清楚地作相反陳述，否則如此定 義的各方面可以與任何一個(gè)或多個(gè)其他方面組合。具體來說，被指示為優(yōu)選或有利的任何 特征均可以與被指示為本發(fā)明的一部分或被指示為優(yōu)選或有利的任何一個(gè)或多個(gè)其他特 征組合。 toon] 本發(fā)明的方法是針對(duì)體外人工牙齒原基的制備。人工牙齒原基為已經(jīng)重新且體外 制備且組裝的牙齒原基。
[0012] 出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"牙齒原基"是指展現(xiàn)牙齒組織或功能性牙胚所特有的至 少一種功能的一種或超過一種細(xì)胞類型的功能性細(xì)胞聚集體。優(yōu)選地，本發(fā)明的牙齒原基 展現(xiàn)牙齒組織或功能性牙胚或牙齒的大多數(shù)或基本上所有的器官或組織功能。具體來說， 本發(fā)明的牙齒原基可以表現(xiàn)得像功能性誘導(dǎo)性牙胚一樣且能夠體外和/或體內(nèi)誘導(dǎo)牙齒 器官發(fā)育或完整牙齒的發(fā)育。本發(fā)明的牙齒原基的特征可以在于與牙齒組織的發(fā)育或分化 有關(guān)的標(biāo)志基因或蛋白質(zhì)的增強(qiáng)的表達(dá)。優(yōu)選地，本發(fā)明的牙齒原基的特征可以在于與即 將經(jīng)受非貼壁培養(yǎng)條件之前的分離的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞相比，BMP4、HGF、PAX9、MSX1、I型膠 原蛋白、DSPP和/或原牙質(zhì)（predentin)的增強(qiáng)的表達(dá)。此外，在聚集體中可能出現(xiàn)基底 膜（basementmembrane)形成，特征主要在于IV型膠原蛋白表達(dá)。聚集體形成和培養(yǎng)條件 可能導(dǎo)致所得組織的礦化（mineralization)。
[0013] 本發(fā)明的人工牙齒原基是通過本發(fā)明的一種方法形成的。該人工牙齒原基可以展 現(xiàn)具有實(shí)質(zhì)上球形形狀且具有〇. 3mm到2mm的平均直徑，優(yōu)選地具有0. 5mm到I. 5mm的平 均直徑的細(xì)胞聚集體。該人工牙齒原基可以包含一個(gè)包含由間充質(zhì)牙髓細(xì)胞形成的一個(gè)內(nèi) 核和由上皮細(xì)胞形成的一個(gè)外層的細(xì)胞聚集體，而這些上皮細(xì)胞可以在稍后時(shí)刻在共培養(yǎng) 時(shí)凹入該內(nèi)核中。上皮來源的細(xì)胞的凹入可能導(dǎo)致這些細(xì)胞的成釉細(xì)胞分化。這種分化的 特征可以在于外觀形態(tài)（柱狀安排）以及在于成釉細(xì)胞標(biāo)志基因或蛋白質(zhì)（例如BMP7、SHH 和/或釉基質(zhì)（amelogenin))的增強(qiáng)的表達(dá)。本發(fā)明的人工牙齒原基不含任何人工生物或 非生物支架或載體，該支架或載體不是源于所述人工牙齒原基的生產(chǎn)中所用的細(xì)胞。本發(fā) 明的人工牙齒原基優(yōu)選地由通過本發(fā)明的一種方法形成的細(xì)胞聚集體組成，其中該方法已 經(jīng)被執(zhí)行而無需使用任何人工生物或非生物支架或載體，該支架或載體不是源于所述方法 中所用的細(xì)胞。
[0014] 在本發(fā)明的該方法中，使用分離的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞。術(shù)語"分離的"意思指這些間 充質(zhì)牙髓細(xì)胞是已經(jīng)從一個(gè)天然來源或其后代分離的細(xì)胞，該后代例如已經(jīng)通過細(xì)胞增殖 而得到。所用的這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞優(yōu)選地從一個(gè)供體牙齒或組織的牙髓組織得到。優(yōu)選 地，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞是尚未轉(zhuǎn)化或永生化的原代細(xì)胞。這些細(xì)胞的特征可以在于對(duì)于 ⑶90、⑶73、⑶44、⑶29和HLAI呈陽性以及對(duì)于⑶34和⑶45呈陰性。它們在2維培養(yǎng)中 展現(xiàn)紡錘形狀的形態(tài)且粘附到塑料。具體來說，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞可以包含或組成為成 體間充質(zhì)牙髓細(xì)胞。所述成體間充質(zhì)牙髓細(xì)胞是從一個(gè)供體牙齒或組織的非胚胎牙髓組織 得到。這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞可從已經(jīng)分化成包含牙髓組織的任何供體牙齒或組織的牙髓組 織得到。優(yōu)選地，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞是從一顆牙齒的牙髓組織，更優(yōu)選地從一個(gè)供體的第 三磨牙得到。用于本發(fā)明的該方法中的這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞優(yōu)選地是人類牙髓細(xì)胞。人類 間充質(zhì)牙髓細(xì)胞是從人類來源的牙髓組織得到。
[0015] 在本發(fā)明的該方法中，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞可在分離后的任何階段在非貼壁條件 下經(jīng)受培養(yǎng)。然而，如果這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞在貼壁2維單層條件下已經(jīng)經(jīng)歷至少一些培 養(yǎng)，那么細(xì)胞聚集體的形成進(jìn)一步得到增強(qiáng)。優(yōu)選地，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞在非貼壁條件下 經(jīng)受培養(yǎng)之前已經(jīng)在2維單層培養(yǎng)中培養(yǎng)了至少1個(gè)傳代。細(xì)胞聚集體形成的高效率在廣 譜的傳代中得以維持。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如果這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞已經(jīng)在2維單層培養(yǎng)中培 養(yǎng)了至少1個(gè)傳代且不超過15個(gè)傳代，那么獲得最佳結(jié)果。優(yōu)選地，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞 在分離后在2維單層中培養(yǎng)了至少2個(gè)傳代且不超過8個(gè)傳代之后經(jīng)受非貼壁培養(yǎng)。
[0016]在本發(fā)明的該方法中，在提供分離的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞之后，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞 經(jīng)受非貼壁培養(yǎng)條件以形成細(xì)胞聚集體。
[0017]如果這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞在某一濃度下經(jīng)受非貼壁培養(yǎng)條件，那么細(xì)胞聚集體的 形成為尤其有效的。如果該濃度過低，那么細(xì)胞僅很少地彼此接觸且凝結(jié)為細(xì)胞聚集體不 太有效。另一方面，如果間充質(zhì)牙髓細(xì)胞的該濃度過高，那么細(xì)胞不太靈活或可動(dòng)且因此， 細(xì)胞聚集體的形成不太有效。優(yōu)選地，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞在每ml5XIO4到5XIO7個(gè)的濃 度下經(jīng)受非貼壁培養(yǎng)條件。如果這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞在每mlIXIO5到IXIO7個(gè)，優(yōu)選地每 ml5XIO5到5XIO6個(gè)且最優(yōu)選地每ml9XIO5到I.IXIO6個(gè)的濃度下經(jīng)受非貼壁培養(yǎng)條件， 那么獲得甚至更佳結(jié)果。
[0018]在本發(fā)明的該方法中，這些分離的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞在非貼壁培養(yǎng)條件下進(jìn)行培 養(yǎng)。這意思指間充質(zhì)牙髓細(xì)胞在其中這些細(xì)胞不會(huì)采用一種扁平、展開形狀的條件下進(jìn)行 培養(yǎng)，指示對(duì)于培養(yǎng)表面的強(qiáng)烈附著和貼壁。優(yōu)選地，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞在播種后立即保 持圓形且即使有的話，也僅與培養(yǎng)表面微弱地締合。用于非貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的適當(dāng)手段為本 領(lǐng)域中眾所周知的。非貼壁培養(yǎng)條件可以包含在具有不支撐這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞的貼壁的 一個(gè)培養(yǎng)表面的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞。例如，可使用具有展現(xiàn)超低細(xì)胞附 著的培養(yǎng)表面的培養(yǎng)容器。出于這個(gè)目的，可以使用具有一個(gè)中性或帶正電荷的培養(yǎng)表面 的培養(yǎng)容器。優(yōu)選地，該培養(yǎng)表面可以由一層進(jìn)一步降低這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞和該培養(yǎng)表 面的相互作用的一種材料涂布。該培養(yǎng)表面可以由一種親水性水凝膠覆蓋。
[0019]看起來，在非貼壁培養(yǎng)條件下，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞相當(dāng)快速地締合且凝結(jié)成細(xì) 胞聚集體。在已經(jīng)24小時(shí)的非貼壁細(xì)胞培養(yǎng)之后，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞聚集成一個(gè)大的復(fù) 合物。然而，為了制備代表著具有改進(jìn)的發(fā)育、分化和/或功能的人工牙齒原基的細(xì)胞聚集 體，有利的是進(jìn)行非貼壁培養(yǎng)，持續(xù)超過24小時(shí)的一段時(shí)間。在本發(fā)明的該方法中，這些間 充質(zhì)牙髓細(xì)胞可以在非貼壁條件下培養(yǎng)至少48小時(shí)，優(yōu)選地至少72小時(shí)，更優(yōu)選地至少2 周，甚至更優(yōu)選地至少4周，最優(yōu)選地至少8周。因此，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞可以在非貼壁 條件下培養(yǎng)48小時(shí)到10周，優(yōu)選地1周到9周，更優(yōu)選地4周到8周。
[0020] 在本發(fā)明的該方法中，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞優(yōu)選地在非貼壁條件下培養(yǎng)，至少直 到形成展現(xiàn)具有〇. 3mm到2mm的平均直徑，更優(yōu)選地具有0. 5mm到I. 5mm的平均直徑的一 種圓形形狀的細(xì)胞聚集體。
[0021] 通過本發(fā)明的該方法產(chǎn)生的人工牙齒原基的適用性取決于它誘導(dǎo)或提供分化的 牙齒組織的能力。因此，優(yōu)選的是在非貼壁條件下培養(yǎng)這些分離的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞，直到所 得的細(xì)胞聚集體開始展現(xiàn)部分地或完全地分化的牙齒組織的特性和/或功能。分化的進(jìn)展 可通過對(duì)應(yīng)的標(biāo)志基因、蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)的相對(duì)表達(dá)來監(jiān)測。優(yōu)選地，這些分離的間充質(zhì)牙髓 細(xì)胞是在非貼壁條件下培養(yǎng)，至少直到所形成的細(xì)胞聚集體展現(xiàn)與即將經(jīng)受非貼壁培養(yǎng)條 件之前的分離的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞相比，BMP4、HGF、PAX9、MSXl、I型膠原蛋白、DSPP和/或原 牙質(zhì)的上調(diào)的表達(dá)。優(yōu)選地，所形成的聚集體展現(xiàn)牙齒發(fā)育的所謂的帽狀期（capstage)的 關(guān)于形態(tài)和基因表達(dá)的特征?；虻南鄬?duì)表達(dá)可容易地通過眾所周知的方法，如例如定量 或半定量RT-PCR、轉(zhuǎn)錄體定序（RNA-seq)或RNA印跡法（Northernblotting)來測定。蛋 白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)也可通過眾所周知的方法，如例如蛋白質(zhì)印跡法（Westernblotting)、懸 浮點(diǎn)陣技術(shù)（SuspensionArrayTechnology)和ELISA技術(shù)來測定。蛋白質(zhì)的差異表達(dá)的 定位可通過原位雜交和/或免疫組織化學(xué)來測定。
[0022] 大多數(shù)的現(xiàn)有技術(shù)的方法所遇到的缺點(diǎn)之一是在這些方法中，需要人工生物或非 生物支架或載體的存在，細(xì)胞在其上或其內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)以形成牙齒原基或牙胚。如果一個(gè)生 物或非生物支架或載體是從外部添加或提供且不是通過在細(xì)胞聚集體形成期間本發(fā)明的 該方法中所用的細(xì)胞形成，那么所述支架或載體被視為人工的。在本發(fā)明的該方法中，此類 人工生物或非生物支架或載體的使用或存在是不需要的。本發(fā)明的該方法生成根據(jù)本發(fā)明 的人工牙齒原基，而不使用任何所述人工生物或非生物支架或載體，該支架或載體不是源 于所述人工牙齒原基的生產(chǎn)中所用的細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，執(zhí)行本發(fā)明的該方法， 使得在細(xì)胞聚集體的形成中不使用人工生物或非生物支架。
[0023] 本發(fā)明的該方法是尤其有利的，因?yàn)楸景l(fā)明的人工牙齒原基可從單一細(xì)胞類型開 始，也就是說從分離的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞開始來生產(chǎn)。然而，如果該方法進(jìn)一步包括共培養(yǎng) 預(yù)凝結(jié)的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞與上皮細(xì)胞的步驟，那么即使更復(fù)雜的人工牙齒原基的產(chǎn)生也可 實(shí)現(xiàn)。該共培養(yǎng)優(yōu)選地在非貼壁培養(yǎng)條件下執(zhí)行?？雌饋碛绕溆欣氖窃诜琴N壁條件下培 養(yǎng)這些分離的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞持續(xù)至少48小時(shí)以形成預(yù)聚集的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞，接著添 加上皮細(xì)胞，以及在非貼壁條件下共培養(yǎng)預(yù)聚集的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞和上皮細(xì)胞的混合物。 可以執(zhí)行共培養(yǎng)，持續(xù)以上關(guān)于分離的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞的非貼壁培養(yǎng)所定義和提出的時(shí)間 段。
[0024]優(yōu)選地，本發(fā)明的該方法中所用的上皮細(xì)胞是原代上皮細(xì)胞，尤其優(yōu)選的人類原 代上皮細(xì)胞。這些原代上皮細(xì)胞可以從成體或非胚胎組織，如例如皮膚組織或齒齦組織獲 得。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，這些上皮細(xì)胞是角化細(xì)胞，例如人類角化細(xì)胞，更優(yōu)選地是從 非胚胎組織，如例如皮膚或齒齦獲得的原代角化細(xì)胞。尤其優(yōu)選的是從齒齦，例如從非胚胎 齒齦獲得的人類角化細(xì)胞。
[0025] 在具有該共培養(yǎng)步驟的本發(fā)明的該方法中，添加這些上皮細(xì)胞用于共培養(yǎng)，使得 最初用于形成預(yù)聚集的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞的數(shù)目等于或高于上皮細(xì)胞的 數(shù)目。優(yōu)選地，上皮細(xì)胞以關(guān)于間充質(zhì)牙髓細(xì)胞的初始細(xì)胞數(shù)目為1:1到1:10的相對(duì)量， 優(yōu)選地以1:2到1:8的相對(duì)量，更優(yōu)選地以1:3到1:5的相對(duì)量添加用于共培養(yǎng)。
[0026] 具有該共培養(yǎng)步驟的本發(fā)明的該方法生成本發(fā)明的人工牙齒原基，其中形成該牙 齒原基的早期細(xì)胞聚集體包含由聚集的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞形成的一個(gè)核和由這些上皮細(xì)胞 形成的一個(gè)外層。該長期培養(yǎng)的聚集體可以展現(xiàn)這些上皮細(xì)胞凹入間充質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)核中。
[0027] 在本發(fā)明的該方法中，這些間充質(zhì)牙髓細(xì)胞在貼壁或非貼壁條件下與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基 一起培養(yǎng)。在非貼壁條件下誘導(dǎo)適當(dāng)細(xì)胞聚集并不必需專門的培養(yǎng)基。熟練人員充分了解 適合的培養(yǎng)基。典型地，標(biāo)準(zhǔn)DMEM是與某一含量的胎牛血清（FCS) -起使用，優(yōu)選地FCS 以5 %到15%的濃度，更優(yōu)選地以10%FCS的濃度存在。如果在非貼壁條件下共培養(yǎng)預(yù)聚 集的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞和上皮細(xì)胞，那么培養(yǎng)基可以包含某一量的通常用于在貼壁條件下培 養(yǎng)這些上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基。
[0028] 本發(fā)明還針對(duì)一種移植物，其包含或組成為本發(fā)明的人工牙齒原基或由其獲得的 組織或結(jié)構(gòu)。
[0029] 在本發(fā)明的另一方面中，提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的人工牙齒原基、由 其獲得的組織或結(jié)構(gòu)或本發(fā)明的移植物以及至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0030] 本發(fā)明的人工牙齒原基、本發(fā)明的移植物或本發(fā)明的藥物組合物可以用于治療牙 齒損害和/或破壞或牙齒缺失。
[0031] 由于本發(fā)明的該方法與從非胚胎來源獲得的分離的間充質(zhì)牙髓細(xì)胞合作，該方法 允許由從一個(gè)特定供體或患者獲得的細(xì)胞開始來生產(chǎn)人工牙齒原基。因此，有可能提供已 經(jīng)從待用本發(fā)明的該人工牙齒原基、藥物組合物或移植物治療的人的細(xì)胞獲得的人工牙齒 原基。因此，看來有可能提供主要地、實(shí)質(zhì)上或完全地從一個(gè)移植物的接受者本身的細(xì)胞獲 得的移植物，使得排斥反應(yīng)將降低到最低或?qū)⑼耆淮嬖凇?br> [0032] 本發(fā)明的該人工牙齒原基可以用于牙齒組織或整個(gè)牙齒的體外產(chǎn)生。
[0033] 本發(fā)明的人工牙齒原基、本發(fā)明的移植物或本發(fā)明的藥物組合物可以用作可體外 和體內(nèi)使用的一種研究工具。
[0034] 本發(fā)明的人工牙齒原基、本發(fā)明的移植物或本發(fā)明的藥物組合物可以用于體外或 體內(nèi)篩選多種物質(zhì)的一種方法中，這些物質(zhì)調(diào)節(jié)牙齒組織的特性。
[0035] 本發(fā)明另外提出一種體外篩選多種物質(zhì)的方法，這些物質(zhì)調(diào)節(jié)牙齒組織的特性， 該方法包括以下步驟：
[0036]-提供本發(fā)明的人工牙齒原基或通過本發(fā)明的一種方法制備的細(xì)胞聚集體或由其 得到的組織的一個(gè)樣品；
[0037]-將對(duì)應(yīng)的樣品分成多個(gè)部分；
[0038] -將至少一個(gè)部分與待篩選的一種物質(zhì)一起孵育；以及
[0039] -將關(guān)于該被處理的部分所測量的參數(shù)與未與該待篩選的物質(zhì)一起孵育的另一部 分相比較。
[0040] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，在將該部分與待篩選的一種物質(zhì)一起孵育之前，該部分 經(jīng)受一種自含式循環(huán)系統(tǒng)。
[0041] 簡單地說，本發(fā)明方法使得有可能鑒別和分析多種物質(zhì)，這些物質(zhì)經(jīng)由本發(fā)明的 人工牙齒原基對(duì)牙齒或牙齒組織施加影響。該樣品應(yīng)理解為包含某一數(shù)目的根據(jù)本發(fā)明的 產(chǎn)品受試者，將其分成多個(gè)部分。提供至少兩個(gè)子集；一個(gè)用于篩選，而另一個(gè)用作陰性對(duì) 照。優(yōu)選地，篩選部分的數(shù)目超過對(duì)照部分的數(shù)目。通常，多個(gè)部分經(jīng)受高通過量篩選。在 本發(fā)明方法中待篩選的物質(zhì)不受任何限制。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，這些物質(zhì)選自下組， 即核酸（包括RNAi)、核糖酶、適體、抗體、肽、碳水化合物、聚合物、具有在50與I.OOODa之 間的分子量的小分子、以及蛋白質(zhì)，優(yōu)選地抗體、細(xì)胞因子以及脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（Iipocalin)。 這些物質(zhì)經(jīng)常可在庫中獲得。優(yōu)選的是孵育在該樣品的一個(gè)不同部分內(nèi)的一種單一化合 物。然而，也有可能通過孵育在一個(gè)部分內(nèi)的至少兩種物質(zhì)來研究多種物質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)。受 試者的另一子集在這些物質(zhì)不存在下同時(shí)地進(jìn)行孵育。該孵育過程取決于不同參數(shù)，例如 細(xì)胞類型和檢測敏感性，它們的優(yōu)化遵循本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的常規(guī)程序。在本發(fā) 明的含義中有效物質(zhì)的鑒別優(yōu)選地間接地執(zhí)行，例如通過測定發(fā)生改變的表達(dá)模式和/或 細(xì)胞活力。該測定可以在一個(gè)規(guī)定的時(shí)刻執(zhí)行且與在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度和陰性對(duì)照有 關(guān)。適合的測試為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知或可容易地按常規(guī)來設(shè)計(jì)。
[0042] 由于本發(fā)明的人工牙齒原基可被視為一個(gè)器官或者一個(gè)器官或其部分的一個(gè)前 體，可能尤其有利的是使用一種測試系統(tǒng)，其中該人工牙齒原基可在模擬天然灌注的條件 下被制備和/或培養(yǎng)一段延長的時(shí)間?？磥碛绕溥m合在基于具有申請(qǐng)?zhí)朎P10 008 244的 歐洲專利申請(qǐng)中或具有
【發(fā)明者】羅蘭·勞斯特爾, 烏韋·馬爾克斯, 詹尼弗·賓德, 馬克·羅索夫斯基 申請(qǐng)人:羅蘭·勞斯特爾, 烏韋·馬爾克斯, 詹尼弗·賓德, 馬克·羅索夫斯基