肽及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于治療和/或預(yù)防與T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性疾病相關(guān)的病癥的方法，所述方法通過向患者施用抑制T細(xì)胞遷移的包含N’-SVTEQGAELSNEER-C’(SEQ?ID?NO:1)的肽或其類似物。本發(fā)明還提供用于治療和/或預(yù)防所述病癥的方法的肽或其類似物。
【專利說明】肽及其用途
[0001]本發(fā)明涉及對T細(xì)胞(包括自身反應(yīng)性T細(xì)胞)的遷移具有抑制作用的分泌自B細(xì)胞的肽的用途。這可應(yīng)用于治療和/或預(yù)防與這樣的T細(xì)胞相關(guān)的病癥，最顯著地是I型糖尿病。
[0002]引言
[0003]胰島反應(yīng)性T細(xì)胞在β細(xì)胞破壞中起核心作用并因此在I型糖尿病(TlD)的發(fā)病機(jī)制中起核心作用。明顯地，在TlD胰腺中T細(xì)胞包含大部分的胰島滲入物，并且靶向T細(xì)胞的免疫抑制性藥物保持β細(xì)胞功能。理解胰島反應(yīng)性T細(xì)胞從血液募集，越過發(fā)炎的內(nèi)皮，并進(jìn)入胰島中的機(jī)制在TlD中沒有被很好地檢查。
[0004]這是特別相關(guān)的，因為健康的人也可以具有不表現(xiàn)為有害的循環(huán)胰島反應(yīng)性T細(xì)胞。因此，我們認(rèn)為在TlD中，禁止反應(yīng)性T細(xì)胞運(yùn)輸?shù)揭认僦械膬?nèi)源性機(jī)制失效，并且如果這樣的調(diào)控途徑可以再建立，則會有可能排除自身反應(yīng)性T細(xì)胞并保持β細(xì)胞功能。來源于脂肪細(xì)胞的細(xì)胞因子脂連蛋白在調(diào)控T細(xì)胞遷移中起作用，但是情景比當(dāng)在TlD中脂連蛋白的循環(huán)水平似乎不波動時更復(fù)雜。
[0005]驚人地，我們已發(fā)現(xiàn)某種肽可以抑制T細(xì)胞遷移。盡管這種肽是已知的，但是我們證實的是，脂連蛋白通過誘導(dǎo)從B淋巴細(xì)胞釋放的介體而實現(xiàn)其對T細(xì)胞遷移的作用。這種介體(一種肽)看起來是T細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的抑制劑。
[0006]發(fā)明概述
[0007]所述肽具有序列N’ -SVTEQGAELSNEER-C’或是其抑制T淋巴細(xì)胞遷移的類似物。
[0008]因此，在第一個方面，本發(fā)明提供一種用于治療和/或預(yù)防與T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性疾病相關(guān)的病癥的方法，所述方法通過向有需要的患者施用包含N’-SVTEQGAELSNEER-C’的肽。所述肽還可以是其抑制T淋巴細(xì)胞遷移的類似物或變體。
[0009]所述病癥任選地選自由以下各項組成的組:T細(xì)胞自身反應(yīng)性，T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性疾病和自身免疫疾病。備選地，所述病癥可以是T細(xì)胞自身反應(yīng)性或T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性疾病或自身免疫疾病。
[0010]應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語T細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在本文中可以互換。T細(xì)胞的遷移任選地是夸內(nèi)皮的。內(nèi)皮任選地是分隔胰島細(xì)胞與血液供給的胰腺微血管系統(tǒng)的內(nèi)皮。
[0011]所述肽任選地是分離的肽。所述肽可以是合成的(即化學(xué)合成的，例如以與小分子藥物相同的方式)或它可以重組地生產(chǎn)，例如在單獨(dú)的細(xì)胞系統(tǒng)(細(xì)胞培養(yǎng)物)或動物中。
[0012]我們已發(fā)現(xiàn)是有用的肽的氨基酸序列為SVTEQGAELSNEER(SEQ ID NO:1)。這個序列可以包含在更大的肽或蛋白質(zhì)、或嵌合或融合蛋白內(nèi)。備選地，所述肽可以僅由SEQID NO:1構(gòu)成。所有這些都落入如本文所用的肽的定義中。根據(jù)SEQ ID NO:1的肽表示14.3.3 ζ / δ (14.3.3.ζ δ)蛋白的氨基酸28-41，其又是YWHAZ基因的245個氨基酸的產(chǎn)物。
[0013]還優(yōu)選的是，可以使用所述肽的類似物或變體。這方面特別優(yōu)選的是基于保守氨基酸置換的類似物(或變體)。優(yōu)選的肽為14個氨基酸長，盡管所述肽也可以少達(dá)13、12、11或10個氨基酸或多達(dá)15、16、1718、19或20個氨基酸。當(dāng)插入或去除氨基酸時，這些優(yōu)選插入到所述肽的N和/或C末端或從其N和/或C末端去除。保護(hù)所述肽免于體內(nèi)降解或清除的化學(xué)結(jié)構(gòu)的其他修飾也是優(yōu)選的變體，例如但不限于，利用本領(lǐng)域已知的接頭或間隔物的PEG化(PEGylat1n)。最優(yōu)選地，相比于SVTEQGAELSNEER，任何類似物應(yīng)保留或改進(jìn)所期望的功能，即抑制T細(xì)胞遷移。這可以通過對互有關(guān)系的受體(cognate receptor)的親和性的變化或改變所述肽在體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征的變化。應(yīng)當(dāng)理解，現(xiàn)在在現(xiàn)有技術(shù)中是改變肽化學(xué)來增加肽在體內(nèi)的藥理‘特征’，并且這些變化不僅是基于氨基酸置換。
[0014]本文將提及肽，但應(yīng)理解，除非另有說明，這也涵蓋其任何類似物。
[0015]肽的作用可以作為其互有關(guān)系的受體的激動劑。
[0016]T細(xì)胞遷移的抑制可以是例如從血液中將所述細(xì)胞募集至胰腺。
[0017]任選地，T細(xì)胞是自身反應(yīng)性T細(xì)胞。這些可以優(yōu)選地靶向胰腺，尤其是胰腺的胰島細(xì)胞。T細(xì)胞可以是⑶4+或⑶8+。
[0018]在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述肽用于抑制(即減少)自身反應(yīng)性T細(xì)胞募集至胰腺的胰島。
[0019]應(yīng)當(dāng)理解，所述肽作用于其施用的個體。同樣，任何T細(xì)胞的自身反應(yīng)性是針對來自該個體的自身(即胰腺的胰島細(xì)胞)的反應(yīng)性。所述個體是哺乳動物，任選地，嚙齒動物如大鼠或小鼠，或靈長類動物，特別是猿和人。
[0020]當(dāng)肽的存在用于抑制T細(xì)胞的遷移時，增加個體被暴露的肽的量將用于進(jìn)一步抑制所述遷移。任選地，遷移的抑制水平使得遷移減少至少50% (依據(jù)被募集的T細(xì)胞的數(shù)量)，但最優(yōu)選地這種減少為至少60 %，更優(yōu)選地至少70 %，更優(yōu)選地至少80 %，更優(yōu)選地至少90 %，更優(yōu)選地至少95 %，更優(yōu)選地至少99 %并且最優(yōu)選地減少至可忽略水平。當(dāng)然，理想地，沒有T細(xì)胞將遷移，但這可能不現(xiàn)實，并且事實上，所需的一切在于，靶組織(例如胰島細(xì)胞)的正常功能被很大程度上保持和/或回轉(zhuǎn)(或至少盡可能接近正常水平或期望減輕要治療的病癥)。
[0021]本發(fā)明的肽因此最可用于治療大量病癥。這些包括其中T細(xì)胞在與T細(xì)胞自身反應(yīng)性相關(guān)的病理學(xué)或病癥中起作用的那些疾病。這些可以包括T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性疾病和自身免疫疾病。糖尿病(I型)是特別優(yōu)選的。還預(yù)期青少年型糖尿病(juvenile onsetdiabetes),類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)和克羅恩氏病(Crohn’s disease),動脈粥樣硬化(atherosclerosis),銀屑病(psoriasis),炎性和纖維化肝病(包括脂肪性肝炎(steatohepatitis)和肝硬化(cirrhosis))以及葡萄膜炎(uveitis)。因此所述肽優(yōu)選發(fā)揮作用以治療任何上述疾病，但最優(yōu)選地是I型糖尿病(TlD)。所述肽可以被視為用于挽救或保持剩余的胰腺功能。這可以是由于自身反應(yīng)性T細(xì)胞攻擊所致而發(fā)生的喪失功能。所述肽可以被視為用于改善糖尿病結(jié)果，即減少TlD的癥狀。所述肽還可以被視為用于改善與胰腺功能喪失相關(guān)的其他病狀，其包括與胰腺功能喪失相關(guān)、(又)與TlD相關(guān)的腎(例如腎?。惶悄虿∧I病)，神經(jīng)(例如外周神經(jīng)病)和心血管并發(fā)癥(例如由于加速的動脈粥樣硬化所致的糖尿病視網(wǎng)膜病和心腦疾病)。因此，所述肽可以最有用于治療和/或預(yù)防上述病癥，特別是TlD及其共發(fā)病(如所述的)。
[0022]本發(fā)明還提供編碼所述肽的多核苷酸序列，其也可用于治療和/或預(yù)防任何上述病癥。所述多核苷酸可以是DNA，RNA或DNA/RNA雜交物(DNA/RNA hybrid)。這種多核苷酸編碼所述肽或其類似物。盡管存在相當(dāng)大量的可能組合，但是我們提供編碼SVTEQGAELSNEER (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的多核苷酸的至少兩個實例。它們是:
[0023]5， -AGU GUU ACU GAA CAA GGU GCU GAG UUA UCU AAU GAG GAG AGA-3，
[0024](SEQ ID NO:2);或
[0025]5， -AGC ⑶C ACC GAG CAG GGC GCC GAA UUG UCC AAC GAA GAG AGG-3’
[0026](SEQ ID NO:3)。
[0027]以上序列僅是實例，并且以RNA形式給出，但是本發(fā)明還提供其DNA形式(其中T替代U)和DNA/RNA雜交形式，以及RNA，DNA和RNA/DNA雜交形式的互補(bǔ)序列(該互補(bǔ)序列為RNA，DNA或DNA/RNA)。優(yōu)選具有至少80 %序列同源性的變體，該變體編碼例如與SEQID NO:1至少50%同樣有效的肽。還優(yōu)選具有至少功能85%序列同源性，至少90%序列同源性，至少95%序列同源性，至少99%序列同源性的變體(舍入成最接近的整數(shù))。這例如可以通過程序如BLAST確定。
[0028]還提供質(zhì)粒(即構(gòu)建體)，所述質(zhì)粒包含編碼所述肽(或其類似物或變體)的多核苷酸。該多核苷酸優(yōu)選可操作地連接于合適啟動子。該啟動子可以是例如胰腺-特異性啟動子。
[0029]編碼所述肽的多核苷酸可以通過施用含有所述多核苷酸或與其結(jié)合的合適載體進(jìn)行遞送。實例包括所謂的基因槍(gene gun)，其中所述多核苷酸可以附著于被發(fā)射通過皮膚的金粒子。備選地，并且更優(yōu)選地，多核苷酸(例如包含其的質(zhì)粒)可以封裝在病毒載體或衣殼內(nèi)。優(yōu)選的實例包括腺病毒載體。優(yōu)選祀向胰腺的那些。
[0030]肽的施用可以通過肽本身的遞送，例如以藥用制劑的形式，或通過編碼所述肽的多核苷酸的遞送和表達(dá)，例如以上述形式。這些例如可以通過注射被遞送至血液。這可以是肌肉內(nèi)或皮下地。這些也可以經(jīng)由粘膜如口腔粘膜、鼻粘膜或直腸粘膜遞送。這些也可以以噴霧或片劑的形式或者以栓劑的形式遞送。這些也可以經(jīng)口攝入到胃中，盡管在肽的情況下，這可能需要提供前藥形式的肽以減輕或?qū)笹I消化的作用。
[0031]盡管一方面可用，但應(yīng)當(dāng)理解，不必需是這樣的情況，即所述肽或編碼其的多核苷酸是或需要是靶向在或至胰腺(至少對于TlD)。任選地，因此，對于肽遞送，增加的血漿中的系統(tǒng)呈現(xiàn)是所需的一切。不需要特定地遞送至胰腺。然而，在備選的實施方案中，可以使用特定地遞送至胰腺，因為這可以增加效力。這同樣適用于多核苷酸。
[0032]直接靶向至胰腺被考慮，作為靶向的基因療法的一部分，包括編碼所述肽的多核苷酸。
[0033]還提供了一種藥用組合物或制劑，其包含本文中所述的肽、多核苷酸、質(zhì)?；虿《据d體。任選地，所述藥用組合物包含所述肽并且適用于注射或攝入。
[0034]如上解釋的，預(yù)期治療和/或預(yù)防上述病癥，特別是與T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性疾病相關(guān)的病癥，包括T細(xì)胞自身反應(yīng)性，T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性疾病和自身免疫疾病的方法。糖尿病(I型)是特別優(yōu)選的。還預(yù)期青少年型糖尿病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和克羅恩氏病，動脈粥樣硬化，銀屑病，炎性和纖維化肝臟疾病(包括脂肪性肝炎和肝硬化)和葡萄膜炎，以及任何上述病狀。所述方法可以包括以本文中描述的任何方式向有此需要的患者施用治療量的所述肽或多核苷酸。
[0035]因此，提供一種方法，所述方法治療和/或預(yù)防T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性疾病相關(guān)的病癥，包括T細(xì)胞自身反應(yīng)性，T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性疾病和自身免疫疾病。特別地，所述病癥是糖尿病(I型)。然而，所述病癥也可以選自由以下各項組成的組:青少年型糖尿??；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；克羅恩氏??；動脈粥樣硬化；銀屑病；炎性和纖維化肝臟疾病(包括脂肪性肝炎和肝硬化)；和葡萄膜炎；或所述病癥可以選自由以下各項組成的組:腎?。惶悄虿∧I??；外周神經(jīng)??；糖尿病視網(wǎng)膜??；和心腦疾病。
[0036]所述方法可以是用于治療所述病癥或者是治療所述病癥的方法。備選地，所述方法可以是用于預(yù)防所述病癥或者可以是預(yù)防所述病癥的方法。備選地，所述方法可以是它們的任意組合。
[0037]還提供用于治療和/或預(yù)防本文所述的病癥的肽和/或編碼其的多核苷酸。本文中方法的提及包括這樣的用途。
[0038]附圖簡述
[0039]現(xiàn)在將參考附圖描述本發(fā)明，其中:
[0040]圖1:脂連蛋白抑制外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移；
[0041 ] 圖2:用化合物C抑制AMPK恢復(fù)PBL的遷移；
[0042]圖3:來自TlD患者的PBL釋放自脂連蛋白對跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用；
[0043]圖4:脂連蛋白受體在PBL上的表達(dá)在患有TlD的患者中減少；
[0044]圖5:脂連蛋白受體在TlD或健康對照受試者中的表達(dá)與通過脂連蛋白的淋巴細(xì)胞遷移的抑制相關(guān)聯(lián)；
[0045]圖6:脂連蛋白受體在不同血細(xì)胞亞類上的表達(dá)；
[0046]圖7:B細(xì)胞介導(dǎo)T細(xì)胞遷移的脂連蛋白誘導(dǎo)的抑制；
[0047]圖8:B細(xì)胞通過分泌肽調(diào)節(jié)PBL變移(transmigrat1n)；
[0048]圖9顯示分泌的肽的序列和14.3.3蛋白質(zhì)的不同同種型；
[0049]圖10:來自B細(xì)胞上清的MS/MS母離子m/z 774.88和合成形式的所述肽的比較；
[0050]圖11:在體外所述肽抑制穿過內(nèi)皮細(xì)胞的T細(xì)胞遷移；和
[0051]圖12:在有或沒有所述肽下在野生型或B細(xì)胞敲除小鼠的發(fā)炎的腹膜中的T細(xì)胞的絕對數(shù)量。
[0052]圖13:脂連蛋白(Aq)對外周血淋巴細(xì)胞的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用。
[0053](A)在靜態(tài)粘附測定中進(jìn)行的EC50為?40nM的劑量響應(yīng)。
[0054](B)在基于流動的測定(模擬血液流動)中的15 μ g/ml Aq對淋巴細(xì)胞遷移的作用。
[0055](C)抑制途徑對于分離自不同組織(HUVEC =臍帶；HSAVEC =隱靜脈；HSEC =肝竇內(nèi)皮細(xì)胞；HDMEC =真皮微血管內(nèi)皮)的內(nèi)皮細(xì)胞是有效的。
[0056]⑶AMP-激酶抑制劑對脂連蛋白的作用的影響。AMPK是脂連蛋白_受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)連接物。
[0057]圖14:脂連蛋白介導(dǎo)的T細(xì)胞運(yùn)輸?shù)囊种菩枰狟細(xì)胞。
[0058]15 μ g/ml的Aq顯著減少穿過內(nèi)皮細(xì)胞的淋巴細(xì)胞遷移。從外周血淋巴細(xì)胞制劑除去B細(xì)胞完全抑制這種響應(yīng)。這可以使用來自Aq刺激的B細(xì)胞的上清重建，也可以有效抑制淋巴細(xì)胞遷移，但當(dāng)上清是在布雷菲德菌素-A (Brefeldin-A)( 一種B細(xì)胞分泌的抑制齊U)存在下制備時這種作用喪失。這些數(shù)據(jù)證實，需要釋放自B細(xì)胞的可溶性介體。
[0059]圖15:釋放自B細(xì)胞的14氨基酸肽調(diào)控T細(xì)胞運(yùn)輸
[0060]圖16:PEPITEM抑制T細(xì)胞變移
[0061]A)合成的肽在抑制淋巴細(xì)胞的變移方面高度有效，而對照肽，包括打亂的(scrambled)形式(天然肽序列的隨機(jī)重組)在抑制淋巴細(xì)胞遷移方面無效。
[0062]B)所述肽具有的EC50為?20pM。由于它有效地抑制穿過內(nèi)皮細(xì)胞的淋巴細(xì)胞遷移，所以我們將所述試劑稱為跨內(nèi)皮遷移的肽抑制劑；“PEPITEM”。
[0063]圖17:PEPITEM抑制T細(xì)胞遷移并且促進(jìn)抗炎調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的募集
[0064]PEPITEM以與脂連蛋白相同模式抑制穿過EC的T細(xì)胞遷移㈧；它在抑制記憶性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的遷移方面有效，但它對嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞(包括⑶16-和⑶16+亞類)沒有作用。天然淋巴細(xì)胞沒有在這種分析進(jìn)行評估，因為它們不粘附至內(nèi)皮細(xì)胞單層(B)。令人關(guān)注地，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T-regs)(其具有抗炎功能)的遷移的效率通過PEPITEM增加(C)。
[0065]圖18:PEPITEM不直接調(diào)節(jié)T細(xì)胞遷移。
[0066]同樣，PEPITEM作用的最明顯模式是通過直接調(diào)節(jié)T細(xì)胞的遷移功能。然而，事實并非如此。當(dāng)PBL用PEPITEM處理并且所述試劑在內(nèi)皮上測定之前被洗掉時，淋巴細(xì)胞遷移的效率不受影響。然而，用PEPITEM預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致對淋巴細(xì)胞運(yùn)輸?shù)囊种?。因此，PEPITEM通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放抑制T細(xì)胞運(yùn)輸?shù)脑噭┒\(yùn)行。
[0067]圖19:通過內(nèi)皮細(xì)胞的鞘氨醇-1-磷酸(SlP)合成的誘導(dǎo)抑制T細(xì)胞遷移。
[0068]由于PEPITEM不直接抑制淋巴細(xì)胞遷移，所以我們測試了這樣的假設(shè)，即其他組織中的淋巴細(xì)胞運(yùn)輸?shù)囊阎{(diào)節(jié)劑鞘氨醇-1-磷酸(SlP)是此途徑中的最終步驟。
[0069]A) SlP-受體拮抗劑(W146)從脂連蛋白的抑制作用釋放淋巴細(xì)胞
[0070]B) SlP-受體拮抗劑(W146)從PEPITEM的抑制作用釋放淋巴細(xì)胞
[0071]C)加入外源性SlP劑量依賴性地抑制T細(xì)胞遷移
[0072]D)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)鞘氨醇激酶-1 (SPHKl)但不表達(dá)鞘氨醇激酶_2 (SPHK2)
[0073]E) SPHKl的抑制劑從PEPITEM的抑制作用釋放淋巴細(xì)胞
[0074]圖20:當(dāng)細(xì)胞被固定在ICAM上并且用IP1(CXCL1)活化時，SlP調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞整聯(lián)蛋白 LFA-1 (CDlla/CD18 ; a LP 2)的親和性
[0075](A) KMl27用于中間親和位點，和
[0076](B)抗體24用于用SlP處理的記憶性T細(xì)胞上的高親和性表位。
[0077]圖21:在有或沒有所述肽存在下在野生型或B細(xì)胞敲除小鼠的發(fā)炎的腹膜中的T細(xì)胞的絕對數(shù)量。
[0078]A T細(xì)胞募集到Jh-/-(B-細(xì)胞敲除動物)的腹膜中在基線處(即在用PBS攻擊后)大于野生型動物。在用酵母聚糖(zymosan)腹膜內(nèi)注射攻擊后，T細(xì)胞數(shù)量在野生型動物中增加。在B細(xì)胞敲除小鼠中T細(xì)胞數(shù)量顯著且明顯增加并且這在PEPITEM存在下顯著減少，但在打亂的肽存在下不是這樣。
[0079]B當(dāng)相比于野生型動物時，在用無傷寒沙門氏菌感染攻擊后，T細(xì)胞到B細(xì)胞敲除動物的肝中的募集增加。
[0080]圖22:脂連蛋白/PEPITEM途徑在患有I型糖尿病的患者中改變
[0081]在I型糖尿病患者中，相比于健康的老化的匹配的對照，脂連蛋白受體的表達(dá)顯著減少(A和B)。通過脂連蛋白的淋巴細(xì)胞運(yùn)輸?shù)囊种婆cB細(xì)胞上的脂連蛋白受體的表達(dá)水平顯著相關(guān)(C)，使得患者和健康的群體在相關(guān)性圖表上分成離散的簇。重要地，盡管患者淋巴細(xì)胞對通過脂連蛋白的刺激是頑固的(D)，但是對這些細(xì)胞，通過添加外源性PEPITEM,抑制途徑可以被重現(xiàn)。
[0082]發(fā)明詳述
[0083]W02007127935涉及組蛋白脫乙酰酶HDAC7。其著手鑒別脫磷酸化HDAC7的磷酸酶并且發(fā)現(xiàn)大量結(jié)合至HDAC7的蛋白質(zhì)，包括本文中描述為SEQ ID NO NO:1的肽。該文獻(xiàn)的重點在于肌球蛋白磷酸酶(MYPTl)的“靶亞基”也結(jié)合HDAC7，并且因此教導(dǎo)是針對經(jīng)由肌球蛋白磷酸酶的該亞基的HDAC7和肌球蛋白磷酸酶之間的相互作用。沒有提及我們的肽具有任何價值，也沒有提及它干擾HDAC7-肌球蛋白磷酸酶相互作用。US2002164668(A1)和US20030064411(A1)關(guān)于治療阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)披露了我們的肽以及包含其的藥物制劑/組合物。US20040053309(A1)也披露了我們的肽，但涉及鑒別與對毒性效應(yīng)物的腎臟響應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)同種型。然而，沒有任何現(xiàn)有技術(shù)公開我們的肽或其類似物的用途。
[0084]我們已關(guān)注于來源于脂肪細(xì)胞的細(xì)胞因子(脂連蛋白)調(diào)節(jié)人T細(xì)胞到發(fā)炎的內(nèi)皮的募集的能力。之前，脂連蛋白缺陷小鼠顯示在白細(xì)胞粘附至內(nèi)皮細(xì)胞方面具有兩倍增加，并且重要地，白細(xì)胞募集通過加入重組脂連蛋白正常化。在我們的體外研究中，我們使用靜態(tài)transwell測定，以及基于流動的粘附測定來跟蹤T細(xì)胞(其在外周血淋巴細(xì)胞[PBL]的粗分離物中)穿過TNF-α和IFN-Y刺激的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。脂連蛋白劑量依賴性地阻斷T細(xì)胞遷移(圖1)。
[0085]脂連蛋白對T細(xì)胞變移的作用由通過脂連蛋白受體(ARl和AR2)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)。AMP-活化的蛋白質(zhì)激酶(AMPK)是自ARl和AR2的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵中間體，并且當(dāng)PBL用AMPK抑制劑(化合物C)預(yù)處理30分鐘時，脂連蛋白對T細(xì)胞遷移的抑制的作用被消除，即T細(xì)胞遷移恢復(fù)到在沒有脂連蛋白下觀察到的水平(圖2)?；衔顲在沒有脂連蛋白下對遷移不具有任何作用。
[0086]重要地，我們發(fā)現(xiàn)脂連蛋白介導(dǎo)的T細(xì)胞遷移的抑制在患有TlD的患者中顯著受損，即在我們的體外遷移測定中脂連蛋白調(diào)節(jié)T細(xì)胞募集的能力在使用分離自TlD的PBL時喪失(圖3)。我們現(xiàn)在已證實，在TlD中的淋巴細(xì)胞上，ARl和AR2都被顯著下調(diào)(圖4)，并且在體外脂連蛋白介導(dǎo)的T細(xì)胞遷移的抑制的水平強(qiáng)烈地與TlD中這些受體的表達(dá)相關(guān)，達(dá)到這樣的程度，即當(dāng)在內(nèi)皮細(xì)胞變移測定中將受體密度相對于對脂連蛋白的敏感性進(jìn)行繪圖時患者和健康對照群體獨(dú)立地成簇(圖5)。
[0087]我們不認(rèn)為脂連蛋白代表在TlD中用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞募集的合適靶標(biāo)。其在循環(huán)中的濃度在TlD中沒有改變，表明不同于其生物利用度的脂連蛋白生物學(xué)的特征是功能的重要決定者。此外，脂連蛋白是在代謝穩(wěn)態(tài)中具有重要作用的多效試劑，這提高嚴(yán)重脫靶副作用的可能性。
[0088]相反，我們認(rèn)為靶向脂連蛋白(其調(diào)節(jié)T細(xì)胞遷移)下游的途徑將提供更大精確性的治療方式。因此，我們現(xiàn)在繼續(xù)明確地證實，脂連蛋白通過誘導(dǎo)新的介體來實現(xiàn)其對T細(xì)胞遷移的作用，該介體我們認(rèn)為是釋放自B淋巴細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移的肽抑制劑。重要地，B淋巴細(xì)胞表達(dá)脂連蛋白受體，所以可以以適當(dāng)方式響應(yīng)于通過此試劑的刺激(圖6)。
[0089]此外，如果B細(xì)胞從混合的淋巴細(xì)胞制劑(PBL)中去除，則通過脂連蛋白的T細(xì)胞遷移的抑制喪失，并且如果將分離的B細(xì)胞添加至T細(xì)胞的純化的制劑中，則重新獲得T細(xì)胞遷移的抑制(圖7a)。令人關(guān)注地，自然殺傷淋巴細(xì)胞(NK細(xì)胞)，其也表達(dá)高水平的脂連蛋白受體(圖6)，不能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞的遷移(圖7b)，表明T細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)排他地通過B淋巴細(xì)胞而不是PBL群的其他細(xì)胞組分介導(dǎo)。
[0090]B細(xì)胞通過分泌所述肽而介導(dǎo)其在這種系統(tǒng)中的作用。因此，通過脂連蛋白刺激的B細(xì)胞調(diào)節(jié)的上清可以有效地抑制T細(xì)胞遷移(圖8)。此外，當(dāng)布雷菲德菌素A(其是B細(xì)胞分泌途徑的抑制劑)用來抑制所述肽從B細(xì)胞釋放到該調(diào)節(jié)的介質(zhì)中時，調(diào)節(jié)的上清的作用喪失，參見(圖8)。
[0091]我們現(xiàn)在已經(jīng)確定地鑒別了響應(yīng)于脂連蛋白刺激的釋放自B細(xì)胞的分泌的肽。利用質(zhì)譜分析，脂連蛋白調(diào)節(jié)的B細(xì)胞上清，以及相關(guān)對照上清通過LC-MS/MS純化并分析。蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫的比較分析揭示了對脂連蛋白調(diào)節(jié)的B細(xì)胞上清獨(dú)特的單個候選肽，其描述于下表I中。
[0092]
~洗脫時間(min)評分修飾相關(guān)蛋白質(zhì)序列 774.88 13.263.1 NA14-3-3 ζ/δ SVTEQGAELSNEER
[0093]表1:通過B細(xì)胞上清的比較分析揭示的所述肽的候選肽
[0094]由于斷裂分析的統(tǒng)計學(xué)嚴(yán)格性，軟件能夠以高精度概率提供確定的序列并且鑒別14.3.3 ζ / δ (14.3.3.ζ δ )蛋白質(zhì)作為前體蛋白質(zhì)。事實上所述肽表示14.3.3 ζ δ蛋白質(zhì)的氨基酸28-41，14.3.3 ζ δ蛋白質(zhì)又是YWHAZ基因的245個氨基酸的產(chǎn)物。嚴(yán)格數(shù)據(jù)庫檢索證實，所述肽序列對此蛋白質(zhì)是獨(dú)特的，并且甚至不是14.3.3蛋白質(zhì)家族的其他六個成員都有的(圖9)。所述肽不是免疫調(diào)劑分子的任何已知家族的成員并且由于其化學(xué)所致而具有引人關(guān)注的治療潛力。
[0095]我們已經(jīng)能夠成功地合成所述肽。來源于B細(xì)胞的肽和合成形式的比較分析顯示在質(zhì)譜分析中的相同質(zhì)量:電荷比，顯示天然肽在從14.3.3.ζ/δ蛋白質(zhì)切除和從B細(xì)胞分泌之前沒有經(jīng)過翻譯后修飾(圖10)。
[0096]所述肽在體內(nèi)外都具有效力。使用合成的肽，我們構(gòu)建了在我們的T細(xì)胞遷移的體外測定中的劑量響應(yīng)曲線(圖U)。所述肽在此測定中具有的EC50為?20ρΜ。我們還將所述肽用于急性、酵母聚糖誘導(dǎo)的腹膜炎的體內(nèi)模型中(圖12)。在此模型中，我們第一次證實B淋巴細(xì)胞(所述肽的細(xì)胞來源)的敲除導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞募集到腹膜腔中的增加。我們隨后在將所述肽注入B細(xì)胞敲除小鼠的血液和腹膜腔中后進(jìn)行實驗。所述肽能夠顯著地減少在用酵母聚糖攻擊后T細(xì)胞到腹膜的募集(圖12)。
[0097]不受理論束縛，我們理解以下表示在炎癥期間PEPITEM調(diào)節(jié)穿過內(nèi)皮細(xì)胞的T細(xì)胞運(yùn)輸?shù)姆独?脂連蛋白，通過受體Adipo-Rl和Adipo-R2 (AR1/2)操作，刺激免疫調(diào)節(jié)性肽PEPITEM從B細(xì)胞釋放，其在發(fā)炎期間被募集至內(nèi)皮細(xì)胞表面。PEPITEM通過其相關(guān)受體刺激內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)鞘氨醇-1-磷酸(SlP)的形成和釋放。SlP又通過SlP-受體S1PR1/4刺激在發(fā)炎期間被募集至內(nèi)皮細(xì)胞表面的T細(xì)胞，其是一種抑制T細(xì)胞穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障并進(jìn)入發(fā)炎組織的運(yùn)輸?shù)哪芰Φ男盘枴?br> [0098]以下實施例提供對于體內(nèi)外研究中這種途徑的功能的實驗證據(jù)，證實與人的慢性自身免疫疾病相關(guān)的途徑功能的變化，并且描述同一性PEPITEM肽。
[0099]實施例1
[0100]脂連蛋白抑制外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移。內(nèi)皮細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在沒有脂連蛋白下用TNF-α /IFN-Y刺激24小時。分離PBL并用0.0001至15 μ g/ml的脂連蛋白處理一小時。
[0101]結(jié)果示于圖1，其中部分(a)顯示在靜態(tài)粘附測定中PBL變移通過脂連蛋白顯著且劑量依賴地減少；部分(b)顯示如通過線性回歸確定的，脂連蛋白具有的EC50為0.94 yg/ml ;并且部分(c)顯示在基于流動的粘附測定中脂連蛋白在抑制PBL遷移方面同樣有效。數(shù)據(jù)是至少三個獨(dú)立實驗的代表并且利用t-檢驗、單向ANOVA和Dunnett的多重比較事后檢驗(Dunnett，s multiple comparisons post-test)進(jìn)行分析。*p ^ 0.01,**p ^ 0.001,
***p ^ 0.0001。
[0102]用化合物C抑制AMPK恢復(fù)PBL的遷移。
[0103]內(nèi)皮細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)并用TNF- a /IFN- Y刺激24小時。將化合物C以10 μ g/ml加入至PBL達(dá)30分鐘，然后以15 μ g/ml添加脂連蛋白達(dá)I小時。脂連蛋白處理誘導(dǎo)變移減少，其在化合物C存在下恢復(fù)至正常、對照水平。結(jié)果示于圖2，其中數(shù)據(jù)是三個實驗的代表并且利用單向ANOVA和Dunnet的多重比較事后檢驗進(jìn)行分析。**p ( 0.001，
***p ^ ο.0001。
[0104]來自TlD患者的PBL釋放自脂連蛋白對跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用。
[0105]內(nèi)皮細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在沒有脂連蛋白下用TNF-a /IFN-Y刺激24小時。結(jié)果示于3。部分a)顯示脂連蛋白介導(dǎo)的PBL變移的抑制在TID中喪失；并且部分b)顯示抑制的百分比通過用在脂連蛋白處理的情況下的變移的百分比除以未處理的PBL的變移的百分比進(jìn)行計算。HC組η = 13并且TlD組η = 12。數(shù)據(jù)利用t_檢驗和單向ANOVA和Bonferonni的多重比較事后檢驗進(jìn)行分析。0.0001。
[0106]脂連蛋白受體在PBL上的表達(dá)在患有TlD的患者中減少。
[0107]確定每個健康或患病受試者的表達(dá)脂連蛋白受體ARl或AR2的PBL的頻率并且分別示于圖4a)和4b)。數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM并且當(dāng)數(shù)據(jù)沒有通過Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗時利用t-檢驗或Mann Whitney t_檢驗進(jìn)行分析。
[0108]在TlD或健康對照受試者中的脂連蛋白受體的表達(dá)與通過脂連蛋白的淋巴細(xì)胞遷移的抑制相關(guān)。
[0109]圖5a)顯示ARl的表達(dá)和淋巴細(xì)胞遷移的抑制之間的相關(guān)性，而圖5b)顯示AR2的表達(dá)和淋巴細(xì)胞遷移的抑制之間的相關(guān)性。使用線性回歸分析確定相關(guān)性。
[0110]脂連蛋白受體在不同白細(xì)胞亞類上的表達(dá)。
[0111]圖6a)和b)顯示ARl (圖6a)和AR2(圖6b)在不同細(xì)胞型上的表達(dá)。數(shù)據(jù)是平均值土SEM并且是七個健康對照的代表。數(shù)據(jù)利用單向ANOVA和Bonferonni多重比較事后檢驗進(jìn)行分析。***p ( 0.0001。
[0112]B細(xì)胞介導(dǎo)脂連蛋白誘導(dǎo)的T細(xì)胞遷移的抑制。
[0113]圖7a)顯示PBL的遷移在其缺少B細(xì)胞(Bs)時喪失并且在將B細(xì)胞加回到分離的T細(xì)胞中時重新獲得。圖7b)顯示自然殺傷細(xì)胞的遷移不受脂連蛋白的影響并且NK添加到T細(xì)胞中不調(diào)節(jié)T細(xì)胞的遷移。數(shù)據(jù)是平均值土SEM并且是至少三個獨(dú)立實驗的代表。數(shù)據(jù)利用單向ANOVA和Bonferonni多重比較事后檢驗進(jìn)行分析。^ 0.001,***p ^ 0.0001。
[0114]B細(xì)胞通過分泌肽調(diào)節(jié)PBL變移。
[0115]分離B細(xì)胞并在有或沒有15 μ g/ml脂連蛋白的情況下進(jìn)行溫育。在一小時后提取上清并加入到Bs-ve PBL中，其顯著恢復(fù)PBL變移的脂連蛋白抑制。對于一些實驗，B細(xì)胞用布雷菲德菌素A(B細(xì)胞分泌的一種抑制劑)處理。這些上清不能調(diào)節(jié)T細(xì)胞的遷移。這示于圖8，其中數(shù)據(jù)顯示為平均值土SEM并且是三個獨(dú)立實驗的代表，利用單向ANOVA和Bonferonni多重比較事后檢驗進(jìn)行分析。***p〈0.001, ns =非顯著的。
[0116]確定所述肽的序列并且其連同14.3.3蛋白質(zhì)的不同同種型示于圖9。也參見上表
1
[0117]來自B細(xì)胞上清的MS/MS母離子m/z 774.88和所述肽的合成形式的比較。
[0118]離子m/z 774.88是分析方案的斷裂產(chǎn)物并且通常僅用于使用MS/MS的鑒別，但可以是用于比較的重要參數(shù)。
[0119]來自B細(xì)胞上清的母離子m/z 774.88和所述肽的合成形式的質(zhì)譜特征分析的比較示于圖10，其揭示了相同了質(zhì)量:電荷比。這確認(rèn)了序列同一性并且顯示所述肽在分泌之前沒有經(jīng)過翻譯后修飾。
[0120]所述肽在體外抑制穿過內(nèi)皮細(xì)胞的T細(xì)胞遷移。
[0121]PBL用脂連蛋白(15 μ g/ml，作為陽性對照)或濃度為0.001至10ng/ml的所述肽處理，打亂的肽用作陰性對照(使用的10ng/ml)。還使用其他生物活性肽以證明所述肽的特異性(即10ng/ml的破傷風(fēng)類毒素肽(TTp)和10ng/ml的胰島素原(PI))。結(jié)果示于圖
11。圖1la)顯示PBL變移在所述肽存在下劑量依賴性地減少，但在打亂的肽、TTp或PI對照存在下非如此。圖1lb)顯示所述肽的EC50(18.6pM)使用非線性回歸分析進(jìn)行計算。數(shù)據(jù)是三個獨(dú)立實驗的代表并且利用單向ANOVA和Bonfeironi多重比較事后檢驗進(jìn)行分析。*p ^ 0.01, **p < 0.001, ***p < 0.0001。
[0122]在有或沒有所述肽的情況下在野生型或B細(xì)胞敲除小鼠的發(fā)炎的腹膜中的T細(xì)胞的絕對數(shù)量。
[0123]在有或沒有所述肽或打亂的肽的情況下，在注射酵母聚糖(或PBS作為對照)48小時后，從腹膜收集白細(xì)胞。通過⑶3的表達(dá)鑒別T細(xì)胞。所述肽或打亂的肽以300 μ g/小鼠的終濃度注射。結(jié)果示于圖12，其中每個組的數(shù)據(jù)是平均值并且利用單向ANOVA和Bonferroni多重比較事后檢驗進(jìn)行分析。*p < 0.01。
[0124]實施例2
[0125]此實施例顯示進(jìn)行的進(jìn)一步工作的結(jié)果并由此致意實施例1。
[0126]脂連蛋白(AQ)對外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用。
[0127]參考圖13。內(nèi)皮細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在沒有脂連蛋白的情況下用TNF- a /IFN- Y刺激24小時。分離PBL并用0.0OOl至15 μ g/ml的脂連蛋白處理一小時。部分(a)顯示在靜態(tài)粘附測定中PBL變移通過脂連蛋白顯著且劑量依賴地減少，以及如通過線性回歸確定的，脂連蛋白具有的EC50為?40nM;并且部分(b)顯示在基于流動的粘附測定中，脂連蛋白在抑制PBL遷移方面同樣有效；并且部分(c)顯示脂連蛋白對分離自不同組織如HUVEC (臍帶)，HSEC (肝竇內(nèi)皮細(xì)胞)和DMEC (真皮微血管內(nèi)皮)的內(nèi)皮細(xì)胞是有效的，但是對HSAVEC(隱靜脈)不是有效的。在部分(d)中，化合物C(AMP-激酶抑制劑)以10 μ g/ml添加到PBL中達(dá)30分鐘，然后添力口 15 μ g/ml的脂連蛋白達(dá)I小時。AMPK是脂連蛋白-受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)連接物。脂連蛋白處理誘導(dǎo)變移減少，其在化合物C存在下恢復(fù)至正常對照水平。這些數(shù)據(jù)表明，脂連蛋白具有強(qiáng)的通過作用于其在PBL上表達(dá)的受體而調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的變移的能力。數(shù)據(jù)是至少三個獨(dú)立實驗的池并且利用t-檢驗、單向ANOVA和Dunnett多重比較事后檢驗進(jìn)行分析。**p ^ 0.01, ***p ^ 0.0Ol0
[0128]T細(xì)胞不具有脂連蛋白受體。
[0129]之前實驗的最簡單的解釋是，T細(xì)胞處于Aq的直接控制下。然而，T細(xì)胞缺少適當(dāng)?shù)氖荏w。然而，其他白細(xì)胞確實具有Adipo-Rl/2并且單核細(xì)胞和B細(xì)胞都顯示高水平的表達(dá)。
[0130]脂連蛋白受體AdipoRl和AdipoR2 二者的表達(dá)使用兔抗-人脂連蛋白受體I和2抗體(Phoenix peptides)通過流式細(xì)胞術(shù)在PBMC上測量。脂連蛋白受體表達(dá)相對于PBMC亞群的pan標(biāo)記物(垂直軸)示于水平軸上。AdipoRl和AdipoR2在單核細(xì)胞(⑶14+)上和在B細(xì)胞(⑶19+)上高表達(dá)，但在T細(xì)胞(⑶3+)上以極低水平表達(dá)。這表明脂連蛋白不能直接控制T細(xì)胞遷移。
[0131]脂連蛋白介導(dǎo)的T細(xì)胞運(yùn)輸?shù)囊种菩枰狟細(xì)胞。
[0132]參考圖14。內(nèi)皮細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在沒有脂連蛋白的情況下用TNF- a /IFN- Y刺激24小時。在有或沒有脂連蛋白(lSyg/ml)的情況下，在使用小珠陽性選擇去除B細(xì)胞后和在利用使用小珠陰性選擇分離的B細(xì)胞重建后測量PBL變移。來自脂連蛋白處理的B細(xì)胞或用布雷菲德菌素A處理以阻斷蛋白質(zhì)分離的B細(xì)胞的上清加入到PBL 中。
[0133]從外周血淋巴細(xì)胞制劑去除B細(xì)胞完全抑制這種響應(yīng)。這可以利用來自脂連蛋白刺激的B細(xì)胞(其也可以有效地抑制淋巴細(xì)胞遷移)重建，但這種作用在上清在布雷菲德菌素-A (B細(xì)胞分泌的抑制劑)存在下制備時喪失。這些數(shù)據(jù)證實，需要釋放自B細(xì)胞的可溶性介體。
[0134]數(shù)據(jù)是至少三個獨(dú)立實驗的池并且利用單向ANOVA和Bonferroni多重比較事后檢驗進(jìn)行分析。*p ( 0.05, ***ρ 0.0Olo
[0135]釋放自B細(xì)胞的14個氨基酸的肽調(diào)節(jié)T細(xì)胞運(yùn)輸
[0136]參考圖15。B細(xì)胞使用陰性選擇分離并用脂連蛋白溫育一小時?；厥丈锨宀⒃贑18柱上純化以除去大尺寸蛋白質(zhì)并通過質(zhì)譜獲取。利用來自AQ刺激的B細(xì)胞的上清的質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組分析揭示具有序列SVTEQGAELSNEER的14個氨基酸的肽。將此與公開且預(yù)測的序列的計算機(jī)中的文庫比較，所述肽證實與單個人蛋白質(zhì)的精確序列同源性，并且表示
14.3.3 ζ / δ (14.3.3.ζ δ)蛋白質(zhì)的氨基酸 28-41，該 14.3.3 ζ / δ (14.3.3.ζ δ)蛋白質(zhì)又是YWHAZ基因的245個氨基酸的產(chǎn)物。所述肽不是任何已知的免疫調(diào)節(jié)肽家族的成員，也不與其相關(guān)，與其也不具有序列相似性。通過質(zhì)譜的合成肽的分析顯示與天然肽相同的質(zhì)量:電荷比(m/z = 774.88),證實來源于B細(xì)胞的產(chǎn)物在釋放之前沒有經(jīng)過任何形式的翻譯后修飾。這些數(shù)據(jù)表明所鑒別的14個氨基酸的肽是在脂連蛋白刺激下由B細(xì)胞釋放的介體。
[0137]PEPITEM抑制T細(xì)胞變移
[0138]參考圖16。內(nèi)皮細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在沒有脂連蛋白下用TNF-a/IFN-y刺激24小時。PBL用脂連蛋白(15 μ g/ml，作為陽性對照)或濃度為0.001至1ng/ml的所述肽處理，打亂的肽用作陰性對照(10ng/ml)。還使用其他生物活性肽以證實所述肽的特異性(即10ng/ml的破傷風(fēng)類毒素肽(TTp)和10ng/ml的胰島素原(PI))。部分(a)顯示PBL變移在所述肽存在下劑量依賴性地減少但在打亂的肽、TTp或PI對照存在下不會如此。部分(b)顯示所述肽的EC50(18.6pM)利用非線性回歸分析計算。數(shù)據(jù)表明PEPITEM能夠類似于脂連蛋白地抑制PBL變移。數(shù)據(jù)是至少三個獨(dú)立實驗的池(pool)并且利用單向ANOVA 和 Bonferroni 多重比較事后檢驗進(jìn)行分析。*p ^ 0.05,**p ^ 0.01,***p ^ 0.001。
[0139]PEPITEM抑制T細(xì)胞遷移并且促進(jìn)抗發(fā)炎調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的募集
[0140]參考圖17。內(nèi)皮細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在沒有脂連蛋白下用TNF-a/IFN-y刺激24小時。將PBL以及不同亞類和PEPITEM加入到不同內(nèi)皮細(xì)胞并測量變移。利用用于Treg，CD4+和CD8+記憶性以及天然T細(xì)胞的陰性選擇分離不同亞類。使用陽性選擇來分離不同的單核細(xì)胞亞類。
[0141]部分(a)顯示在不同內(nèi)皮細(xì)胞型上PEPITEM以與脂連蛋白相同的方式抑制穿過EC的T細(xì)胞遷移。部分(b)顯示PEPITEM在抑制記憶性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的變移方面是有效的，但其對嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞(包括CD16-和CD16+亞類)沒有作用。天然淋巴細(xì)胞在此分析中沒有評估，因為它們不粘附至內(nèi)皮細(xì)胞單層。部分(c)顯示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)(其具有抗炎功能)的遷移的效率由PEPITEM增加。這些數(shù)據(jù)表明PEPITEM能夠特異性地調(diào)節(jié)記憶性T細(xì)胞和Treg的變移。
[0142]數(shù)據(jù)是至少三個獨(dú)立實驗的池并且利用t-檢驗以及單向ANOVA和Bonferroni多重比較事后檢驗進(jìn)行分析。*p 5? 0.05,林P ^ 0.01, ***p ^ 0.0Olo
[0143]PEPITEM不直接調(diào)節(jié)T細(xì)胞遷移
[0144]參考圖18。內(nèi)皮細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在沒有脂連蛋白下用TNF-a/IFN-y刺激24小時。PEPITEM連同PBL加入到內(nèi)皮細(xì)胞上或內(nèi)皮細(xì)胞用PEPITEM預(yù)處理并且在洗滌后加入PBL或者PBL用PEPITEM預(yù)處理，洗滌并添加至內(nèi)皮細(xì)胞。
[0145]當(dāng)PBL用PEPITEM處理并且該試劑在內(nèi)皮上的測定之前被洗掉時，淋巴細(xì)胞遷移的效率不受影響。然而，用PEPITEM預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致淋巴細(xì)胞運(yùn)輸?shù)囊种?。這些數(shù)據(jù)表明PEPITEM通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放抑制T細(xì)胞運(yùn)輸?shù)脑噭┻M(jìn)行操作。
[0146]數(shù)據(jù)是三個獨(dú)立實驗的池并且利用配對t-檢驗進(jìn)行分析*p ( 0.05，林P < 0.01。
[0147]通過內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)鞘氨醇-1-磷酸(SlP)合成抑制T細(xì)胞遷移。
[0148]參考圖19。在有或沒有(部分a)脂連蛋白(15 μ g/ml)或(部分b) PEPITEM的情況下，在使用SlPR拮抗劑(Ι146，10μΜ)阻斷SlP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)后，測量穿過IFN-Y/TNF-α處理的HUVEC的PBL或沒有B細(xì)胞的PBL變移。沒有B細(xì)胞的PBL用不同濃度(O - 100 μ Μ)的SlP預(yù)處理并且測量穿過IFN- Y /TNF- α處理的HUVEC的變移(部分c)。SPHKl和SPHK2mRNA表達(dá)的水平通過來自B細(xì)胞和HUVEC的RNA的實時PCR確定(部分d，η = 2)。在PEPITEM(10ng/ml)存在下，測量穿過用SPHKl特異性抑制劑(5 μ M)預(yù)處理的IFN-y/TNF- α處理的HUVEC的PBL變移(部分e)。
[0149]數(shù)據(jù)顯示SlP受體對T細(xì)胞的拮抗作用導(dǎo)致脂連蛋白和PEPITEM對T細(xì)胞變移的抑制喪失(部分a、b)。部分(c)顯示將SlP加入至沒有B細(xì)胞的T細(xì)胞恢復(fù)變移的抑制；并且部分(d)顯示在HUVEC中的SlP激酶I和2 (SPHK1和2)的高表達(dá)；并且部分(e)顯示SPHKl的抑制從PEPITEM的抑制作用釋放淋巴細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明PEPITEM刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放S1P，其又抑制淋巴細(xì)胞變移。
[0150]數(shù)據(jù)是至少三個獨(dú)立實驗的池并且利用t-檢驗以及單向ANOVA和Bonferroni多重比較事后檢驗進(jìn)行分析。*p 5? 0.05,林P ^ 0.01, ***p ^ 0.0Olo
[0151]SlP調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞整聯(lián)蛋白LFA-1的親和性。
[0152]參考圖20。96孔板在4°C用50ug/ml的重組ICAM過夜包被。所述板在室溫使用PBS 4% BSA封閉一小時并且加入用IP-10 (10ng/ml)和/或SlP (1uM)處理的PBL達(dá)30分鐘。洗滌過量的未結(jié)合的PBL并且在4°C，使用KM127抗體(10ug/ml)標(biāo)記PBL的淋巴細(xì)胞整聯(lián)蛋白LFA-1 (⑶Ila/⑶18 ; α Li? 2)的中間親和性位點并且使用抗體24(10ug/ml)標(biāo)記高親和性位點。兩個親和性位點的表達(dá)使用平均熒光強(qiáng)度(MFI)在記憶性T細(xì)胞上測量。數(shù)據(jù)顯示在ip-?ο刺激后增加的中間和高親和性位點二者的表達(dá)在SlP存在下被下調(diào)。數(shù)據(jù)表明SlP通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞變移必需的整聯(lián)蛋白LFA-1的親和性而調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞變移。數(shù)據(jù)是兩個獨(dú)立實驗的池。
[0153]在有或沒有所述肽的情況下在野生型或B細(xì)胞敲除小鼠的發(fā)炎的腹膜中的T細(xì)胞的絕對數(shù)量。
[0154]參考圖21。在部分(a)中，野生型或B細(xì)胞敲除(Jh_/_)BALB/c小鼠被注射以10ug酵母聚糖。在有或沒有所述肽或打亂的肽的情況下，在注射酵母聚糖(或PBS作為對照)48小時后，從腹膜收集白細(xì)胞。T細(xì)胞通過CD3的表達(dá)鑒別。所述肽或打亂的肽以300 μ g/小鼠的終濃度注射。結(jié)果示于部分(a)，其中每個組的數(shù)據(jù)是平均值并且利用單向ANOVA和Bonferroni多重比較事后檢驗進(jìn)行分析。*p<0.01。在部分(b)中，野生型或B細(xì)胞敲除C56BL/6小鼠被注射以傷寒沙門氏菌(Salmonella typhirium)。在5天后，收集肝臟并且進(jìn)行對于T細(xì)胞的切片染色。部分(b)中的數(shù)據(jù)顯示在肝臟切片中每個感染位置的T細(xì)胞的數(shù)量。
[0155]數(shù)據(jù)顯示小鼠中缺乏B細(xì)胞導(dǎo)致在酵母聚糖誘導(dǎo)的炎癥和沙門氏菌感染后的腹膜中更高的T細(xì)胞募集。這通過PEPITEM(但不是打亂的對照)在酵母聚糖處理的B細(xì)胞敲除小鼠中減少。這些數(shù)據(jù)表明，通過在炎癥位點釋放PEPITEM，B細(xì)胞對于體內(nèi)發(fā)炎期間調(diào)節(jié)T細(xì)胞的募集是必需的。
[0156]脂連蛋白/PEPITEM途徑在患有I型糖尿病的患者中改變
[0157]參考圖22。通過流式細(xì)胞術(shù)確定每個健康或患病受試者的表達(dá)脂連蛋白受體ARl或AR2的PBL的頻率并分別示于部分(a)和(b)。數(shù)據(jù)表示為平均值土 SEM并且當(dāng)數(shù)據(jù)沒有通過Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗時利用t-檢驗或Mann Whitney t_檢驗進(jìn)行分析。內(nèi)皮細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在沒有脂連蛋白下用TNF-α/IFN-Y刺激24小時。PBL分離自健康對照和患有I型糖尿病的患者并用脂連蛋白15 μ g/ml處理一小時。部分(c)顯示AdipoR2的表達(dá)和淋巴細(xì)胞遷移的抑制之間的相關(guān)性，利用線性回歸分析確定相關(guān)性。部分(d)顯示來自新診斷患有I型糖尿病、用脂連蛋白或PEPITEM預(yù)處理的患者(η=5)的PBL的變移。數(shù)據(jù)利用t-檢驗進(jìn)行分析**p〈0.01。
[0158]結(jié)果示于部分(a和b)，兩種脂連蛋白受體(AdipoRl/2)在來自患有I型糖尿病的患者的PBL上的較低表達(dá)；并且部分(b)顯示AdipoR2的表達(dá)越低，脂連蛋白抑制淋巴細(xì)胞變移的能力越低；并且在部分(d)中，PEPITEM仍然能夠抑制淋巴細(xì)胞變移。
[0159]數(shù)據(jù)表明來自患有I型糖尿病的患者的淋巴細(xì)胞釋放自脂連蛋白的抑制作用，因為它們表達(dá)較低的脂連蛋白受體并且這可以通過外源加入PEPITEM而恢復(fù)。
【權(quán)利要求】
1.用于治療和/或預(yù)防與T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性疾病相關(guān)的病癥的方法，所述方法通過向患者施用抑制T細(xì)胞遷移的包含N’ -SVTEQGAELSNEER-C’ (SEQ ID NO:1)的肽或其類似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥選自由以下各項組成的組:T細(xì)胞自身反應(yīng)性、T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎性疾病和自身免疫疾病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述病癥是糖尿病(I型)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述病癥選自由以下各項組成的組:青少年型糖尿?。活愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；克羅恩氏?。粍用}粥樣硬化；銀屑??；包括脂肪性肝炎和肝硬化在內(nèi)的炎性和纖維化肝??；和葡萄膜炎。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述病癥選自由以下各項組成的組:腎??；糖尿病腎?。煌庵苌窠?jīng)??；糖尿病視網(wǎng)膜??；和心腦疾病。
6.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述T細(xì)胞的遷移是跨內(nèi)皮細(xì)胞的，越過分隔胰島細(xì)胞與血液供給的胰腺微血管系統(tǒng)的內(nèi)皮。
7.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述T細(xì)胞是自身反應(yīng)性T細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述肽用于抑制募集自身反應(yīng)性T細(xì)胞至胰腺的胰島。
9.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法，其中施用編碼所述肽或其類似物的多核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述多核苷酸選自由以下各項組成的組:SEQIDNO:2 ；SEQ ID NO:3 ;其DNA形式或DNA/RNA雜交形式；及其任意互補(bǔ)序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述多核苷酸可操作地連接至合適的啟動子，例如胰腺-特異性啟動子。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項的方法，其中施用包含所述多核苷酸的質(zhì)粒。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中施用包含所述質(zhì)粒的病毒載體。
14.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法，其中施用藥用組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-8中任一項所述的肽或其類似物、權(quán)利要求9-10所述的多核苷酸、權(quán)利要求12所述的質(zhì)?；驒?quán)利要求13所述的病毒載體。
15.權(quán)利要求1-8中任一項所述的肽或其類似物、權(quán)利要求9-10所述的多核苷酸、權(quán)利要求12所述的質(zhì)粒或權(quán)利要求13所述的病毒載體，其用于如權(quán)利要求1-8中任一項所述的治療和/或預(yù)防病癥的方法。
【文檔編號】A61K38/17GK104168910SQ201380013630
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月13日
【發(fā)明者】喬治·愛德華·雷格爾, 帕爾特·納倫德蘭, 海倫·麥格特里克, 馬里亞姆·希梅 申請人:伯明翰大學(xué)