生物材料的穩(wěn)定化組合物的制作方法
【專利摘要】生物活性材料的干燥的穩(wěn)定化組合物包括糖類和水解蛋白，并可形成為生物活性材料提供增強(qiáng)的穩(wěn)定性的片劑或其它形式。包含生物活性材料的組合物可由下述方法進(jìn)行制備，方法包括：(a)將生物活性材料與其它組分在水性溶劑中組合以形成粘性漿料；(b)將漿料在液氮中快速冷凍以形成固體冷凍顆粒、珠、滴或串；(c)在真空下將步驟(b)的產(chǎn)物除水來進(jìn)行初級(jí)干燥并將該產(chǎn)物保持在高于其凍結(jié)溫度的溫度下；和(d)在最大真空和20℃或更高的溫度下使步驟(c)的產(chǎn)物經(jīng)充分時(shí)間的二級(jí)干燥，以將水活度降低至低于0.3Aw。
【專利說明】生物材料的穩(wěn)定化組合物
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 此申請是于2012年3月29日提交的美國申請No. 13/378, 106的部分延續(xù)案，其 是于2011年1月28日提交的國際申請No.PCT/USll/22821的進(jìn)入國家階段的申請，其要 求于2010年1月28日提交的美國臨時(shí)申請No. 61/299, 315的優(yōu)先權(quán)。此申請還是于2011 年8月12日提交的美國申請No. 13/208, 459的部分延續(xù)案，其要求于2010年8月13日提 交的美國臨時(shí)申請No. 61/373, 711的優(yōu)先權(quán)。此申請進(jìn)一步要求于2012年3月23日提交 的美國臨時(shí)申請No.61/6l4, 994、于2012年5月3日提交的美國臨時(shí)申請N〇.61/642,094 和于2012年5月13日提交的美國臨時(shí)申請No. 61/646, 337的優(yōu)先權(quán)。所有上述申請的內(nèi) 容均出于所有目的通過引用并入本文。

【背景技術(shù)】
[0003] 在于高溫和高濕度長期儲(chǔ)存時(shí)，生物材料的結(jié)構(gòu)和功能的保存對于食品、營養(yǎng)品 和藥品工業(yè)是至關(guān)重要的。通常，敏感的生物材料如蛋白質(zhì)、酶、細(xì)胞、細(xì)菌和病毒必須長期 保存以供日后使用。雖然已嘗試了許多方法來穩(wěn)定存儲(chǔ)中的生物材料，但許多方法并不適 合于敏感的生物活性材料，如活的或減毒的細(xì)菌和病毒。例如，傳統(tǒng)的冷凍千燥兼有歸因于 冷凍和干燥的壓力。此方法的冷凍步驟可帶來不良影響，如蛋白質(zhì)和酶的變性和細(xì)胞的破 裂。
[0004] 需要一種穩(wěn)定化的組合物，其用于寬范圍的生物材料，并在升高的溫度和變動(dòng)程 度的濕度下（如在材料運(yùn)輸和保存過程中可能遇到的溫度和濕度），在延長的時(shí)間段內(nèi)提 供生物材料的優(yōu)異的穩(wěn)定性和保存，而在再水化后仍然保留有顯著量的活性。還需要可用 于壓片應(yīng)用而不過量損失生物材料的活性的穩(wěn)定化組合物，許多生物材料在壓片過程中對 遭遇到的高壓和高溫敏感。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種生物活性材料的干燥的穩(wěn)定化組合物，其包括 碳水化合物組分和蛋白質(zhì)組分，其中，以組合物的總重量計(jì)，碳水化合物組分包含約10%至 8〇%寡糖、約5%至3〇%二糖和約1%至10%多糖，蛋白質(zhì)組分包含約0.5%至40%水解的 動(dòng)物或植物蛋白。組合物可以與生物活性材料組合。
[0006]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種制備組合了生物活性材料的上述組合物的 方法，其包括：(a)在水性溶劑中將生物活性材料與至少一種碳水化合物組分和蛋白質(zhì)組 分組合，以形成一種粘性漿料；(b)在液氮中快速冷凍漿料，以形成固體冷凍顆粒、珠、滴或 串；(c)在真空下將步驟（b)的產(chǎn)物除水來進(jìn)行初級(jí)干燥并將該產(chǎn)物保持在高于其凍結(jié)溫 度的溫度下；和（d)在最大真空下且在 2〇t；或更高的溫度下使步驟（c)的產(chǎn)物經(jīng)充分時(shí)間 的二級(jí)干燥，以將水活度降低至低于〇. 3Aw。
[0007]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了通過擠壓包埋到干燥的玻璃質(zhì)（giassy)和無定 形組合物中的敏感生物活性材料制備的片劑、丸劑或顆粒，其中組合物包括一種或多種糖 和一種或多種水解的蛋白質(zhì)，其中，以組合物的總千重計(jì)，糖介于約10%至60%之間，水解 的蛋白質(zhì)介于約1 %至40%之間。
[0008] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種制備上述片劑、丸劑或顆粒的方法，包括擠壓 包埋在千燥的玻璃質(zhì)和無定形組合物中的敏感生物活性材料，其中干燥的玻璃質(zhì)和無定形 組合物由包括下述步驟的方法制備：( a)在水性溶劑中將生物活性材料與至少一種或多種 糖類和一種或多種水解的蛋白組合，以形成一種粘性漿料；(b)在液氮中快速冷凍漿料，以 形成固體冷凍顆粒、珠、滴或串；(C)在真空下將步驟（b)的產(chǎn)物除水來進(jìn)行初級(jí)干燥并將 該產(chǎn)物保持在高于其凍結(jié)溫度的溫度下；和（d)在最大真空下和 2〇°C或更高的溫度下使步 驟（c)的產(chǎn)物經(jīng)充分時(shí)間的二級(jí)干燥，以將水活度降低至低于〇? 3Aw。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1示出了可商業(yè)購買的益生菌和在本發(fā)明的干燥組合物中的益生菌的加速穩(wěn) 定性。
[0010] 圖2示出了在加速儲(chǔ)存條件（37°C和33% RH)下組合物中各種摩爾比的玻璃質(zhì)增 強(qiáng)劑和碳水化合物混合物對益生菌穩(wěn)定性（副干酪乳桿菌（Lparacasei))的影響。
[0011] 圖3示出了本發(fā)明的組合物對益生菌嗜酸乳桿菌（L. acidophilus)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性 的影響。在24°C和33% RH的加速儲(chǔ)存條件下測試干燥的益生菌的穩(wěn)定性537天。
[0012]圖4示出了各種玻璃質(zhì)增強(qiáng)劑化合物對益生菌嗜酸乳桿菌的儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響。 在24°C和43% RH的加速儲(chǔ)存條件下測試干燥的益生菌的穩(wěn)定性180天。
[0013]圖5示出了各種蛋白質(zhì)水解物/糖的比例對益生菌乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性（35°C和43% RH)的影響。
[00M]圖6不出了益生菌鼠李糖乳桿菌(1_]：11&11111〇8113)的最大穩(wěn)定性的口11優(yōu)化（在40。〇 和33% RH的加速儲(chǔ)存條件下8周）。
[0015] 圖7和圖8 :根據(jù)本發(fā)明方法的包含各種基質(zhì)和玻璃質(zhì)形成劑的冷凍固體珠形式 的不同干燥組合物的目測和顯微觀察結(jié)果。
[0016] 圖9 :干燥組合物中新鮮的、冷凍珠或干燥粉末培養(yǎng)物形式的鼠李糖乳桿菌培養(yǎng) 物形式對其初始CFU計(jì)數(shù)的影響。
[0017] 圖10 :包含鼠李糖乳桿菌的如在液氮或-8(TC低溫冰箱中的冷凍固體珠和在+4。〇 中的非冷g粘性漿料形式的組合物的凍結(jié)溫度對干燥組合物中細(xì)菌初始 CFU計(jì)數(shù)的影響。 結(jié)果僅顯示在干燥前沒有額外驅(qū)氣步驟的漿料的凍結(jié)溫度的影響。
[0018]圖11 :包含雙歧桿菌的如在液氮中的冷凍固體珠和在+4。(：中的非冷凍的粘性漿 料形式的組合物的凍結(jié)溫度對干燥組合物中細(xì)菌初始CFU計(jì)數(shù)的作用。結(jié)果僅顯示在干燥 前沒有額外驅(qū)氣步驟的漿料的凍結(jié)溫度的影響。 =19] ? I2 :真空下冷凍的固體珠的驅(qū)氣持續(xù)時(shí)間對干燥組合物中鼠李糖乳桿細(xì)初 CFU計(jì)數(shù)的影響。
[0020]圖13 :根據(jù)本發(fā)明的方法的組合物在冷凍千燥器中的干燥曲線。
[0021]圖14 :本發(fā)明的組合物和干燥方法中的鼠李糖乳桿菌的方法損失和干燥損失。 g〇22]圖15 :干燥的益生菌鼠李糖乳桿菌組合物在4(TC和33%相對濕度的儲(chǔ)存條件下
[0023]圖16 :常規(guī)冷凍干燥的嗜酸乳桿菌屬（L. acidophilus sp.)或經(jīng)本發(fā)明的組合物 和方法配制之后的嗜酸乳桿菌屬在40°C和43% RH時(shí)的貨架儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
[0024] 圖17 :常規(guī)冷凍干燥的鼠李糖乳桿菌屬（L. rhamnosus sp_)或經(jīng)本發(fā)明的組合物 和方法配制之后的鼠李糖乳桿菌屬在40。(：和43% RH以及3(TC和6〇% RH時(shí)的貨架儲(chǔ)存穩(wěn) 定性。
[0025]圖IS證明了在壓片機(jī)中的壓縮對于在本發(fā)明的組合物中穩(wěn)定化和保護(hù)的益生菌 鼠李糖乳桿菌在40°c和43% RH的活力和儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響。
[0026]圖19示出了與多種維生素和礦物質(zhì)的混合物一起壓片并儲(chǔ)存于4(TC和43% RH 對于在本發(fā)明的組合物中穩(wěn)定化和保護(hù)的益生菌鼠李糖乳桿菌的活力的影響。
[0027]圖20說明了在壓片機(jī)中的壓縮對游離形式的或在本發(fā)明的組合物中保護(hù)的蛋白 酶和脂肪酶的活性的影響。酶可單獨(dú)壓片或按等量混合后再壓片。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 定義
[0029]應(yīng)當(dāng)理解，在本文中使用的術(shù)語的目的僅僅是為了描述【具體實(shí)施方式】，并不旨在 限制。當(dāng)在本說明書和隨附的權(quán)利要求書中使用時(shí)，單數(shù)形式"一"、"一個(gè)"和"此"包括其 復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確指明不是如此。因此，例如，言及"蛋白質(zhì)"則包括單個(gè)蛋白質(zhì)或 兩種或兩種以上蛋白質(zhì)的組合；言及"酶"、"細(xì)菌"等則包括單個(gè)或幾種類型的混合物,等 等。
[0030] 在描述和主張本發(fā)明時(shí)，將根據(jù)下述定義來使用下列術(shù)語。
[0031] "生物活性成分"、"生物活性材料"和"生物材料"都是指允許生物活性的微生物或 成分。適用于本發(fā)明的生物活性材料包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、酶、激素、核酸、抗體、藥物、 疫苗、酵母、真菌、細(xì)菌（益生菌或其它）、土壤微生物、病毒和/或細(xì)胞懸浮液。
[0032] "生物組合物"是指處于允許生物活性成分或試劑的生物活性明確有效的形式下 的制備物。
[0033] "玻璃增強(qiáng)劑"、"玻璃增強(qiáng)化合物"和"玻璃形成劑"在本文中可互換使用，指能在 低于臨界溫度（玻璃轉(zhuǎn)化溫度（Tg))時(shí)具有形成無定形或玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)的能力的化合物。在 玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成中，生物物質(zhì)可以包埋于玻璃結(jié)構(gòu)中。適用于本發(fā)明的玻璃增強(qiáng)劑包括 但不限于有機(jī)酸的鹽，如乳酸、抗壞血酸、馬來酸、草酸、丙二酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、葡 糖酸、谷氨酸等的鹽。鹽可以包括陽離子磷酸鹽等，所述陽離子如鈉、鉀、鈣、鎂。其它有用 的玻璃增強(qiáng)劑包括蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)水解物、多肽和氨基酸。玻璃形成劑的組合也可考慮在單 一組合物中。用于獲得用于本發(fā)明目的的玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法通常是溶劑升華和/或蒸發(fā)技 術(shù)。理想情況下，屬于GRAS化合物的化合物優(yōu)選于那些不屬于GRAS的化合物。
[0034] "糖類"是指主要由碳、氫和氧組成的糖類?？捎玫奶穷惏ㄟ€原性和非還原性糖 類和糖醇類和二糖類。連接在一起的兩個(gè)單糖形成二糖。用于形成二糖的兩個(gè)單糖可以是 相同的或不同的?？稍诒景l(fā)明的組合物中使用的二糖的實(shí)例包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽 糖、異麥芽糖。也可使用硫酸化的二糖。
[0035] "碳水化合物"或"多羥基化合物"是指主要由碳、氫和氧組成的糖類。糖類通常由 以線性或非線性方式連接的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元的糖骨架組成，其中一些包含帶正電荷或負(fù)電荷 的化學(xué)基團(tuán)。重復(fù)單元的范圍可以是二至數(shù)百萬。有用的糖類包括還原性和非還原性糖類 和糖醇類、二糖類、寡糖類、水溶性多糖類及其衍生物。連接在一起的兩個(gè)單糖形成二糖。用 于形成二糖的兩個(gè)單糖可以是相同的或不同的。可在本發(fā)明的碳水化合物混合物中使用的 二糖的實(shí)例包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖、異麥芽糖。也可使用硫酸化的二糖。連接在一 起的少量單糖（通常為3至20個(gè)）形成寡糖。用于形成寡糖的單糖可以是相同或不同組分 的糖。適合使用的寡糖的實(shí)例包括菊粉、麥芽糖糊精、葡聚糖、低聚果糖（FOS)、低聚半乳糖 (GOS)、甘露寡糖（MOS)及其組合。連接在一起的大量單糖（通常多于20)形成多糖。用于 形成多糖的單糖可以是相同或不同組分的糖。適合使用的多糖的實(shí)例包括但不限于甲基纖 維素、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素和羥丙基甲基纖維素；可溶性淀粉或淀粉片段、黃原膠、 瓜爾膠、果膠、角叉菜膠、半乳甘露聚糖、結(jié)冷膠（包括這些化合物的任何衍生物）、鄰苯二 甲酸醋酸纖維素（CAP)、羧甲基纖維素、海藻酸鈉、海藻酸鹽、羥基丙基甲基纖維素（HPMC)、 阿拉伯樹膠、刺槐豆膠、脫乙酰殼多糖和脫乙酰殼多糖衍生物、膠原、聚乙醇酸、淀粉和修飾 的淀粉和環(huán)糊精。
[0036] "水解蛋白"是指蛋白質(zhì)經(jīng)部分或完全的酸解或酶解而產(chǎn)生的具有約IkDa至約 50kDa的分子量的水解蛋白。在一些實(shí)施方式中，在本文中所指的"深度水解蛋白"是至少 20%的蛋白底物被轉(zhuǎn)換成具有200至2000道爾頓的分子量的肽。水解蛋白具有與完整蛋 白大致相同的氨基酸組成，并且可獲得自任何數(shù)量的商業(yè)來源。低變應(yīng)原的水解蛋白可有 利地用于某些用于超敏感消費(fèi)者如嬰兒和老人的食品。
[0037] "穩(wěn)定的"制劑或組合物是其中的生物活性材料在儲(chǔ)存后基本上保留其物理穩(wěn)定 性、化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性的制劑或組合物。對于選定的時(shí)間長度而言，可以在選定的 溫度和濕度條件下測量穩(wěn)定性?？梢允褂泌厔莘治鰜砉浪泐A(yù)期的儲(chǔ)存期限，然后才將材料 實(shí)際儲(chǔ)存該時(shí)間長度。例如，對于活細(xì)菌而言，穩(wěn)定性被定義為在預(yù)定的溫度、濕度和時(shí)間 長度條件下失去Ilog的CFU/g干制劑所花費(fèi)的時(shí)間。
[0038] 對于細(xì)菌來說，"活力"是指在適合于細(xì)菌生長的營養(yǎng)介質(zhì)上形成菌落的能力（CFU 或菌落形成單位）。對于病毒來說，活力是指感染適合的宿主細(xì)胞并在適合的宿主細(xì)胞中繁 殖，導(dǎo)致在宿主細(xì)胞的菌苔（lawn)上形成噬斑的能力。
[0039] "環(huán)境"室溫或條件是在給定環(huán)境中任何給定時(shí)間的溫度或條件。通常，環(huán)境室溫 是22_25°C，環(huán)境大氣壓力和環(huán)境濕度是容易測量的，并且隨著一年中的時(shí)節(jié)、天氣和氣候 條件、海拔等而變。
[0040] 在干燥制劑組合物的情形中，"水活度"或"Aw"是指水的可利用率，并且表示系統(tǒng) 中水的能量狀態(tài)。它被定義為樣品上水的蒸汽壓除以純水在相同溫度下的蒸汽壓。純蒸餾 水的水活度正好為1，即Aw = 1. 0。
[0041] 在儲(chǔ)存穩(wěn)定性的情形中，"相對濕度"或"RH"是指在給定溫度下空氣中水蒸氣的 量。相對濕度通常低于使空氣飽和所需的濕度，并用飽和濕度的百分?jǐn)?shù)表示。
[0042] "干燥"及其變化形式是指脫水或無水，即實(shí)質(zhì)上缺乏液體的物理狀態(tài)。干燥包括 如噴霧干燥、流化床干燥、凍干和真空千燥。
[0043] "凍干"或冷凍干燥是指通過快速冷凍并在冷凍狀態(tài)下脫水（有時(shí)被稱為升華）來 制備干燥形式的組合物。凍干發(fā)生于導(dǎo)致糖結(jié)晶的溫度下。此過程可以在足以維持冷凍產(chǎn) 物的真空下（在一些實(shí)施方式中，低于約2000mT0RR)發(fā)生。
[0044|對于本文中描述的方法來說，"初級(jí)除水，，或"初級(jí)干燥"步驟或"液體千燥，，是 指從融化冷凍顆粒的時(shí)間到開始二級(jí)干燥的時(shí)間點(diǎn)之間所發(fā)生的脫水干燥。通常情況下， 大部分的初級(jí)干燥是通過大量蒸發(fā)來進(jìn)行的，同時(shí)將產(chǎn)物溫度維持在顯著低于熱源的溫度 下。該過程可以在足以維持融化的產(chǎn)物的真空下（在一些實(shí)施方式中，高于約 2000mTORR) 發(fā)生。
[0045]對于本文中描述的方法來說，"二級(jí)干燥，，是指在接近熱源溫度的制劑溫度下發(fā)生 的干燥步驟。此過程可以在足以降低制劑的水活度的真空下（在一些實(shí)施方式中，低于約 IOOOmTORR)發(fā)生。在典型的制劑干燥過程中，二級(jí)千燥步驟將制劑的水活度降低至 〇. 3或 更低的Aw。
[0046] 本發(fā)明包括在儲(chǔ)存中保存敏感的生物活性材料如肽、蛋白質(zhì)、激素、核酸、抗體、藥 物疫苗、酵母、細(xì)菌（益生菌或其它）、病毒和/或細(xì)胞懸浮液的組合物和干燥方法。
[0047] 本發(fā)明的組合物和干燥方法解決了提供包含敏感的生物活性材料如肽、蛋白質(zhì)、 激核酸、抗體、藥^疫苗、酵母、細(xì)菌、病毒和/或細(xì)胞懸浮液的且在干燥狀態(tài)下的壽命 顯著延長的成本效益高且在工業(yè)上可放大的干燥制劑的問題。本發(fā)明提供了包括由高可溶 性化合$勿的無定形玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)所包圍的生物材料的保存組合物和干燥方法。干燥方法包 括：在液體漿料中混合生物材料和組合物,在液氮中快速冷凍所述組合物漿料以形成滴、串 或珠，隨后通過在減壓法同時(shí)給組合物提供熱量下蒸發(fā)水份來干燥糖玻璃構(gòu)成中的生物活 性材料。
[0048]本發(fā)明基于下述令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即生物材料可以被保護(hù)在玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)中并同時(shí) 保持實(shí)質(zhì)上的活性。當(dāng)生物材料與根據(jù)本發(fā)明的組合混合物組合并干燥時(shí)，在延長的暴露 于苛刻的溫度和濕度條件下的時(shí)間內(nèi)也可達(dá)到優(yōu)越的穩(wěn)定性。本發(fā)明包括包含生物材料、 可溶性碳水化合物和玻璃增強(qiáng)羧酸鹽的混合物的組合物。本發(fā)明的組合物在其物理結(jié)構(gòu)和 功能方面與經(jīng)常用冷凍干燥過程簡單干燥的非粘性或濃縮的含糖組合物具有本質(zhì)上的區(qū) 另|J。例如，美國專利No. 6, 919, 172公開了一種用于肺部給藥的霧化粉末組合物，其包含各 種碳水化合物和檸檬酸鈉的混合物。然而，在此專利中所描述的組合物缺乏額外的蛋白質(zhì) 類化合物，此化合物在干燥具有高濃度糖的溶液的過程中對于增加穩(wěn)定性和形成所需的物 理結(jié)構(gòu)是至關(guān)重要的。在此專利中所描述的組合物還缺少粘性或凝膠結(jié)構(gòu)，其允許有效干 燥解凍或未凍的溶液形成增強(qiáng)玻璃結(jié)構(gòu)。相反，本發(fā)明的組合物和千燥過程克服了所有這 些問題，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了生物材料的優(yōu)越穩(wěn)定性?，F(xiàn)有技術(shù)還缺少額外的羧酸組分，此羧酸組分 與水解蛋白一起協(xié)同作用以保護(hù)和穩(wěn)定生物材料。
[0049]在現(xiàn)有技術(shù)中，通常通過在真空下發(fā)泡或沸騰溶液來促進(jìn)有效干燥，來獲得增 強(qiáng)的玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)。發(fā)泡步驟通常引起溶液的大量沸騰和噴發(fā)，這是干燥未凍溶液不可避 免的結(jié)果，因此，只能獲得在小瓶或容器中非常低的溶液負(fù)載容量（參見例如美國專利 No. 6，、534, 087，、其中最終發(fā)泡產(chǎn)物的厚度小于2麵)。本發(fā)明的組合物和干燥方法避免了制 劑的沸騰和發(fā)泡，從而使單位干燥面積的材料負(fù)載大大提高，因此，能夠容易地放大規(guī)模至 生產(chǎn)大量材料，而無需使用特別設(shè)計(jì)的容器和托盤或設(shè)備。
[0050]寬范圍的生物材料都可以使用本發(fā)明的組合物以形成根據(jù)本發(fā)明的水性保存介 質(zhì)。然后，此保存介質(zhì)可進(jìn)行本發(fā)明的千燥過程，以制備生物材料的穩(wěn)定干燥粉末。這些生 物材料包括但不限于：酶如胰腺酶、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、肌醇六磷酸酶 （phitase)、乳 酸脫氫酶；蛋白質(zhì)如胰島素；疫苗；病毒如腺病毒；包括原核細(xì)胞（包括細(xì)菌和真菌）和真 核細(xì)胞的細(xì)胞，其它生物材料，包括藥物、核酸、肽、激素、維生素、類胡蘿卜素、礦物質(zhì)、抗生 素、殺菌劑、殺真菌劑、除草劑、殺蟲劑、殺精子劑、抗體和脂質(zhì)囊泡。
[0051]已經(jīng)顯示，益生菌特別受益于本發(fā)明的組合物和干燥方法。根據(jù)本發(fā)明的組合物 和方法制備穩(wěn)定的千燥益生菌粉末，其包括將益生菌的新鮮的、冷凍的或干燥的培養(yǎng)物與 碳水化合物和玻璃增強(qiáng)化合物的混合物混合，在液氮中快速冷凍粘性制劑以形成冷凍的固 體滴、串或珠，并且通過最初施加充足的真空使制劑溫度高于凍結(jié)溫度來進(jìn)行干燥，并且供 給 2CTC和更尚的熱源以促進(jìn)初級(jí)除水。保持高于凍結(jié)點(diǎn)的制劑溫度可以通過調(diào)節(jié)真空和傳 導(dǎo)熱至制劑來實(shí)現(xiàn)。為了完成干燥過程并進(jìn)一步降低制劑的水活度至〇. 3或更低的^之 下，在最大真空中并在高達(dá)70°C的升高的溫度時(shí)施加二級(jí)干燥步驟。這樣的組合物可以在 40°C和33% RH的儲(chǔ)存條件中保持穩(wěn)定30天或更長，如圖15所示。
[0052]己經(jīng)顯示，在壓制片中的活微生物如益生菌特別受益于本發(fā)明的組合物和干燥方 法。根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法制備穩(wěn)定的干燥的生物粉末，其包括將單細(xì)胞有機(jī)體的新 鮮的、冷凍的或干燥的培養(yǎng)物與糖、水解的蛋白和抗氧化劑的混合物混合，并且其可能包括 額外量的多糖和寡糖和玻璃增強(qiáng)化合物，在液氮中快速冷凍粘性制劑以形成冷凍的固體 滴、串或珠，并且通過最初施加充足的真空使制劑溫度高于其凍結(jié)溫度來蒸發(fā)水份，并且供 給 2〇°C和更高的熱源以促進(jìn)初級(jí)除水。保持高于凍結(jié)點(diǎn)的制劑溫度可以通過調(diào)節(jié)真空和傳 導(dǎo)熱或輻射熱至制劑來實(shí)現(xiàn)。為了完成干燥過程并進(jìn)一步降低制劑的水活度至〇. 3或更低 的Aw之下，在最大真空中并在高達(dá)701;的升高的溫度時(shí)施加二級(jí)干燥步驟。
[0053] 本發(fā)明的組合物
[0054]在一些實(shí)施方式中，制劑包含二糖、寡糖和多糖類的碳水化合物混合物，生物活性 材料被包埋其中二合適的多糖的實(shí)例包括但不限于鄰苯二甲酸醋酸纖維素（CAp)、羧甲基 纖維素、果膠、海藻酸鈉、海藻酸鹽、羥基丙基甲基纖維素（J 1pmc)、甲基纖維素、角叉菜膠、結(jié) 冷膠（geljan gum)、瓜爾膠、阿拉伯樹膠、黃原膠、刺槐豆膠、脫乙酰殼多糖和脫乙酰殼多糖 衍生物、膠原、聚乙醇酸、淀粉和修飾的淀粉。合適的寡糖的實(shí)例包括但不限于環(huán)糊精、果聚 糖、菊粉、FOS、麥芽糖糊精、葡聚糖等及其組合。合適的二糖的實(shí)例包括但不限于乳糖、海藻 糖、蔗糖等。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，合適的示例性多糖是海藻酸鈉或結(jié)冷膠。在另一個(gè)實(shí) 施方式中，制劑包含按總干物質(zhì)重量百分比計(jì)〇?丨―2〇 %的海藻酸鈉。
[0055]在一些^施方式中，碳水化合物混合物包含按總干物質(zhì)重量百分比計(jì)〇.卜川％的 ￡糖、1-10%的寡糖和1〇-9〇%的二糖。在另一個(gè)實(shí)施方式中，碳水化合物混合物包含重 量比10 :0? 1-4 :0? 1-2的二糖、寡糖和多糖，或其中二糖/寡糖/多糖的重量比為從約1〇 ? 0? 2 :0. 1 至約 10 :2 :1。
[0056]胃在一些實(shí)施方式中，碳水化合物混合物中的二糖部分包括各種糖和糖醇。合適的 二糖是那些在凍結(jié)溫度（例如低于_201:)和在除水過程中不結(jié)晶和/或不損害或不去穩(wěn) S化制劑，生物活3材料_。_，生物活性材料可以在玻璃形成糖如鎌、乳糖或海 澡糖存在的h況下進(jìn)行干燥，以促進(jìn)在整個(gè)干燥過程中保留分子結(jié)構(gòu)并在干燥狀態(tài)下傳遞 結(jié)構(gòu)剛5至無定形基質(zhì)。合適的二糖會(huì)有效地替代在干燥過程中水合所損失的水，以防止 細(xì)胞膜fe傷和酶變性（參見綜述C rowe等人，1998)。組合物中二糖的其它功能可以包括保 護(hù)生物活性材料免于暴露于有害光、氧、氧化劑和水分。合適的二糖必須容易溶解在溶液 中。海藻糖是一種特別有吸引力的保護(hù)劑，因?yàn)槠涫前l(fā)現(xiàn)于在干旱期間保持休眠狀態(tài)的植 物和生物有機(jī)體（如細(xì)菌、真菌和無脊椎動(dòng)物如昆蟲和線蟲）中的非還原性二糖。在某些 情況下，為了延長時(shí)間段并減少成本，包括兩種或更多種不同的二糖如海藻糖和蔗糖的混 合物以抑制晶體形成并增強(qiáng)干燥的生物活性材料制劑在儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性是有益的。 [0057]在一些實(shí)施方式中，碳水化合物混合物中的寡糖部分包括菊粉、麥芽糖糊精、葡聚 糖、低聚果糖（FOS)、低聚半乳糖（GOS)、甘露寡糖（MOS)及其組合。寡糖緩解與單獨(dú)使用海 藻糖作為保護(hù)劑以用于各種保存的生物材料相關(guān)的多個(gè)問題。雖然在脫水和復(fù)水過程中非 常有效地保護(hù)了生物材料,單獨(dú)將海藻糖作為穩(wěn)定劑不能在延長的時(shí)間段中，尤其是在高 溫和/或潮濕環(huán)境中提供理想的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。本發(fā)明通過將寡糖如菊粉添加到碳水化合物 混合物中，使得這一問題得到解決。
[0058]碳水化合物混合物中的糖類的合適的示例性質(zhì)量比為10 :〇?卜10 :〇. 1-2的二糖/ 寡糖/多糖，在一些實(shí)施方式中，其中二糖/寡糖/多糖的重量比為從約10 :〇. 2 :0. 1至約 5 :10 :1。在一些實(shí)施方式中，碳水化合物混合物包含按總干物質(zhì)重量百分比計(jì)10-90%的 二糖、1-10%的寡糖和0. 1-10 %的多糖。在其它實(shí)施方式中，碳水化合物混合物包含按總干 物質(zhì)重量百分比計(jì)10-50 %的二糖、10-80 %的寡糖和0. 1-10 %的多糖。
[0059]在【具體實(shí)施方式】中，制劑包含寡糖的混合物。寡糖混合物能緩解與單獨(dú)使用單一 寡糖作為組合物中玻璃增強(qiáng)材料相關(guān)的多個(gè)問題。雖然非常有效地提高了玻璃轉(zhuǎn)化溫度， 寡糖傾向于迅速地結(jié)晶并沉淀，并從而破碎了玻璃質(zhì)無定形結(jié)構(gòu)，特別是在高溫和/或潮 濕的環(huán)境下。本發(fā)明通過添加寡糖的混合物而不是單一型的寡糖（在一些實(shí)施方式中，是 果聚糖和低DE糊精的混合物），使得這一問題得以解決。在一些實(shí)施方式中，碳水化合物混 合物包含按總千物質(zhì)重量百分比計(jì)5% -40%的果聚糖和5-40%的低DE糊精。
[0060] -種合適的組合物包含約0. 5%至約90%的碳水化合物組分和蛋白質(zhì)組分，碳水 化合物組分包括至少二糖、寡糖和多糖，蛋白質(zhì)組分包含約〇. 5%至約40%的水解的蛋白。 在一些實(shí)施方式中，組合物包含約30%至約70%的碳水化合物組分和約10%至約40%的 玻璃增強(qiáng)劑組分，如蛋白質(zhì)水解的蛋白和羧酸，其中碳水化合物組分包含約 10%至90%或 約40 %至80%的二糖；約1 %至約10%或約5%至10%的寡糖；和約〇. 1至約10%或約 5%至約10%的多糖。組合物進(jìn)一步包括被認(rèn)為是另一種玻璃增強(qiáng)劑組分的有機(jī)酸鹽并包 括按組合物總重量計(jì)介于約〇. 5%和20%之間的羧酸。
[0061]在另一個(gè)實(shí)施方式中，組合物包括按海藻酸鈉/寡糖重量比計(jì)1:1-1〇 (或1:1-5) 的海藻酸鈉和寡糖的混合物。
[0062] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，組合物與二價(jià)金屬離子交聯(lián)，以形成牢固的水凝 膠。在一些實(shí)施方式中，通過在含有二價(jià)金屬離子溶液的浴槽中霧化或擠出漿料，或通過直 接將二價(jià)金屬離子加入到漿料中并允許制劑硬化并形成水凝膠的方式形成交聯(lián)的水凝膠 制劑。然后將水凝膠制劑根據(jù)本發(fā)明的干燥方法進(jìn)行快速冷凍并干燥。
[0063]在其它實(shí)施方式中，組合物包含顯著量的玻璃增強(qiáng)化合物，此玻璃增強(qiáng)化合物包 括有機(jī)酸的鹽，如乳酸、抗壞血酸、馬來酸、草酸、丙二酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、葡糖酸、 谷等的鹽。鹽可以包括陽離子，如鈉、鉀、鈣、鎂等。實(shí)例包括檸檬酸鈉、乳酸鈉、馬來酸 鈉、葡糖酸鎂、抗壞血酸鈉等。優(yōu)選具有高玻璃轉(zhuǎn)化溫度（Tg)和高溶解度的鹽。示例性的有 機(jī)酸包括檸檬酸及其鹽（如檸檬酸鈉或檸檬酸鉀、脫水檸檬酸鈉）和抗壞血酸及其鹽（如 抗壞血酸鈉、抗壞血酸鉀、抗壞血酸鎂）。例如，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包括二 糖、寡糖和多糖的碳水化合物混合物和有機(jī)酸如檸檬酸和/或抗壞血酸的離子。
[0064] 組合物中使用的玻璃增強(qiáng)劑的量將依整個(gè)組合物和其預(yù)期的干燥存儲(chǔ)條件而變 化。通常，組合物中玻璃增強(qiáng)化合物的量按總千物質(zhì)重量計(jì)高于2%，且溶液或分散液的pH 保持弱堿性（pH為7-7. 5)。不被理論所束縛，據(jù)認(rèn)為，如本文所述的相對高含量的玻璃增強(qiáng) 化合物的功能不僅有助于所得到的干燥組合物的所期望的無定形和剛性玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)，還保 護(hù)生物活性材料免于暴露在有害的光、氧氣、氧化劑和水分中。合適的示例性組合物包括按 總干物質(zhì)重量計(jì)1-20%或約2-10% (總干物質(zhì)重量百分比）的玻璃增強(qiáng)化合物。
[0065] 其它合適的包含于組合物中以進(jìn)一步增加其穩(wěn)定性的玻璃增強(qiáng)劑包括蛋白質(zhì)、蛋 白質(zhì)水解物、多肽和氨基酸。這些包括明膠、白蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、酪蛋白 鹽、免疫球蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、棉籽蛋白或其它食品和乳制品或植物蛋白和/或其 水解產(chǎn)物，或任何其它的水解的蛋白。聚氨基酸的實(shí)例包括聚丙氨酸、聚精氨酸、聚甘氨酸、 聚谷氨酸等。有用的氨基酸包括賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸或組氨酸，以及疏水性氨基 酸（色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等）和甲胺如甜菜堿。
[0066] 在一些實(shí)施方式中，使用酪蛋白或豌豆蛋白或水解的酪蛋白或水解的豌豆蛋白。 在一些實(shí)施方式中，組合物混合物中的水解的蛋白部分包括部分水解的或深度水解的蛋 白、多肽和氨基酸。如本文所用，深度水解的蛋白是通過使用用于蛋白修飾（裂解）的蛋 白酶深度酶解而獲得的那些蛋白。在一些實(shí)施方式中，水解的動(dòng)物或植物蛋白如酪蛋白、 乳清、大豆蛋白或豌豆蛋白或深度水解的酪蛋白或豌豆蛋白。一些實(shí)施方式采用具有超過 80 %的分子量為約IkDa至約50kDa的短鏈肽的深度水解的蛋白，并且至少20%的蛋白底物 被轉(zhuǎn)變成分子量為200至2000道爾頓的肽。不被理論所束縛，據(jù)認(rèn)為，由如本文所述的糖 和深度水解的蛋白得到的混合物允許更快地千燥,并有助于所得到的干燥組合物的所期望 的無定形和剛性玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)。酶解蛋白可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備或者可 以自商業(yè)來源獲得。合適的示例性組合物包括按總干物質(zhì)重量百分比計(jì)5-40 %的深度水解 的蛋白。
[0067] 干燥組合物中的蛋白、水解的蛋白或深度水解的蛋白和氨基酸的合適的示例性總 量為千燥混合物總質(zhì)量的約1 %至約40%，或約5%至約40%，或約10%至約30%。
[0068] 應(yīng)注意的是，組合物中玻璃增強(qiáng)劑的合適量可能依賴于干燥組合物的所需特性。 例如，可以使用包含碳水化合物混合物和蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解物的組合物來增強(qiáng)儲(chǔ)存于溫 和溫度和相對濕度下（如25°C和25% RH)的生物材料的化學(xué)穩(wěn)定性。適當(dāng)量的玻璃增強(qiáng) 齊!J，尤其是二糖和寡糖之間的相對比例的確定，應(yīng)根據(jù)所要求的儲(chǔ)存條件來進(jìn)行。例如， 可以使用包含高比例的二糖/寡糖的組合物來增強(qiáng)儲(chǔ)存于溫和溫度和相對濕度如 25°C和 25% RH下的生物材料的化學(xué)穩(wěn)定性?？梢允褂冒捅壤亩?寡糖的組合物來增強(qiáng) 儲(chǔ)存于高溫和相對濕度下（如30°C和40% RH或更高）的生物材料的化學(xué)穩(wěn)定性。
[0069] 在一些實(shí)施方式中，可優(yōu)選抗壞血酸離子用作玻璃增強(qiáng)劑以獲得在暴露于較高溫 度和濕度時(shí)額外的穩(wěn)定化益處?；蛘?，在一些實(shí)施方式中，更優(yōu)選檸檬酸鹽和/或抗壞血酸 鹽離子與另一種玻璃增強(qiáng)劑如蛋白或蛋白水解物的組合。
[0070] 在一些實(shí)施方式中，制劑包含糖和水解的蛋白的混合物，其中生物活性材料被包 埋。合適的糖的實(shí)例包括但不限于二糖如乳糖、海藻糖、蔗糖及其混合物。合適的水解的蛋 白的實(shí)例包括但不限于深度水解的明膠、白蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、釀蛋白鹽、 免疫球蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、棉籽蛋白或任何其它乳制品、動(dòng)物或植物來源的深度水 解的蛋白及其混合物。干燥組合物中糖的合適的示例性總量為干燥混合物的總質(zhì)量的約 10%至約80%，或千燥質(zhì)量的約10%至約60%。
[0071] 在一個(gè)示例性的實(shí)施方式中，玻璃形成劑包括二糖和水解的蛋白的混合物。在具 體的實(shí)施方式中，合適的示例性玻璃形成劑是海藻糖和水解的蛋白的混合物。在一些實(shí)施 方式中，制劑包含按總千物質(zhì)重量百分比計(jì)10-90%的海藻糖和〇? 1_30%的水解的蛋白或 20-80%的海藻糖和〇? 1-20%的水解的蛋白或40-80%的海藻糖和〇?卜2〇%的水解的蛋 白。
[0072] 理想情況下，屬于通常認(rèn)為安全的化合物（GRAS)的化合物優(yōu)選于那些不屬 于GRAS的化合物。其它包括賦形劑鹽，如硫酸鎂、多元醇如三羥或更多的糖醇（如甘油 (glycerin)、赤蘚醇、甘油（gly Cer〇l)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇）、丙二醇、聚 乙二醇、普朗尼克（pluronics)、表面活性劑和其組合物。
[0073] 在一些實(shí)施方式中，生物材料包括活細(xì)菌（如益生菌）。合適的微生物的實(shí)例 包括但不限于酵母，如糖酵母屬（Saccharomyces)、德巴利氏酵母屬（Debaromyces)Jg 絲酵母屬（Candida)、畢赤氏酵母屬（Pichia)和球擬酵母屬（Torulopsis)，霉菌，如曲 霉屬（Aspergillus)、根霉屬（Rhizopus)、毛霉屬（Mucor)、青霉屬（Penicillium)和 球擬酵母屬（Torulopsis),以及細(xì)菌，如雙歧桿菌屬（Bifidobacterium)、梭狀芽胞釬菌 屬（Clostridium)、梭桿菌屬（Fusobacterium)、蜜蜂球菌屬（Melissococcus)、丙酸桿 菌屬（Propionibacterium)、鏈球菌屬（Streptococcus)、腸球菌屬（Enterococcus)、乳 球菌屬（Lactococcus)、庫克菌屬（Kocuriaw)、葡萄球菌屬（Staphylococcus)、消化鏈 球菌屬（Peptostrepococcus)、芽孢桿菌屬（Bacillus)、片球菌屬（Pediococcus)、微球 菌屬（Micrococcus)、明串珠菌屬（Leuconostoc)、魏斯氏菌屬（Weissella)、氣球菌屬 (Aerococcus)、酒球菌屬（Oenococcus)和乳桿菌屬（Lactobacillus)。合適的益生微生物 的具體實(shí)例以下面的種為代表，并包括那些種中的所有培養(yǎng)生物型：黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉（A. oryzae)、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans)、緩慢芽孢桿菌 (B. lentus)、地衣形芽孢桿菌（B. Iicheniformis)、腸膜芽孢桿菌（B.mesentericus)、短小 芽孢桿菌（B. pumilus)、枯草芽孢桿菌（B. subtilis)、納豆芽孢桿菌（B. natto)、嗜淀粉擬 桿菌（Bacteroides amylophilus)、多毛擬桿菌（Bac.capillosus)、瘤胃生擬桿菌（Bac. ruminocola)、豬擬桿菌（Bac.suis)、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis)、 動(dòng)物雙歧桿菌（B.animalis)、短雙歧桿菌（B.breve)、兩歧雙歧桿菌（B.bifidum)、嬰兒 雙歧桿囷（B.infantis)、乳雙歧桿囷（B. Iactis)、長雙歧桿菌（B. Iongum)、假長雙歧桿 菌（B.pseudolongum)、嗜熱雙歧桿菌（B.thermophilum)、Candida pintolepesii、丁酸 梭狀芽抱桿菌（Clostridium butyricum)、乳脂腸球菌（Enterococcus cremoris)、二丁 酮腸球菌（E.diacetylactis)、屎腸球菌（E.faecium)、中間腸球菌（E.intermedius)、 乳酸腸球菌（E. lactis)、E. muntdi、嗜熱腸球菌（E. thermophilus)、大腸埃希氏桿 菌（Escherichia coli)、脆壁克魯維氏酵母（Kluyveromyces fragiIis)、嗜酸乳桿 菌（Lactobacillus acidophilus)、消化乳桿菌（L. alimentarius)、食淀粉乳桿菌 (L. amylovorus)、卷曲乳桿菌（L. crispatus)、短小乳桿菌（L. brevis)、干酪乳桿菌 (L. case 4)、彎曲乳桿菌（L. curvatus)、纖維二糖乳桿菌（L. cellobiosus)、德氏乳桿 菌保加利亞亞種（L. delbrueckii ss. bulgaricus)、香腸乳桿菌（L.farciminis)、發(fā)酵 乳桿菌（Lfermentum)、加氏乳桿菌（L.gasseri)、瑞士乳桿菌（Lhelveticus)、乳酸乳 桿菌（L. Iactis)、植物乳桿菌（L. plantarum)、約氏乳桿菌（L. johnsonii)、羅伊氏乳 桿菌（L. reuteri)、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus)、清酒乳桿菌（L.sakei)、唾液乳桿菌 (L.salivarius)、腸系膜狀明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)、啤酒（有害）片 球菌（P.cereviseae(damnosus))、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici)、戊糖片 球菌（P.pentosaceus)、費(fèi)羅伊登氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii)、 薛曼納氏丙酸桿菌（Prop, shermanii)、啤酒糖酵母（Saccharomyces cereviseae)、 肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus)、木糖葡萄球菌（Staph, xylosus)、嬰兒鏈 球菌（Streptococcus in fantarius)、唾液鏈球菌嗜熱亞種（Strep, salivarius ss. thermophilus)、嗜熱鏈球菌（Strep. Thermophilus)和乳鏈球菌（Strep, lactis)。
[0074] 制備組合物的方法
[0075] -種合適的生物材料和組合物的混合方法是通過將總干燥組合物混合物添加到 包含生物材料的濃縮培養(yǎng)物或介質(zhì)溶液中。培養(yǎng)基中生物材料的重量質(zhì)量通常介于約5% 和30% w八之間或介于約10%和20% w八之間。培養(yǎng)基中所添加的組合物混合物的重量 質(zhì)量通常介于約10%和約60%之間或介于約20%和40%之間?；旌蠞{料中的最終固體含 量為約20 %至約60 %之間，更具體地約30 %至約50 %之間。在一些實(shí)施方式中，將溶液在 室溫下混合或稍微加熱以幫助將材料溶解在粘性溶液中（例如20°C至40°C)。在本發(fā)明的 變化形式中，調(diào)整制劑中碳水化合物混合物的總量，以獲得期望的制劑粘度和密度以允許 有效干燥，同時(shí)避免可能在干燥步驟中發(fā)生的橡膠狀形成或過度發(fā)泡。合適的示例性漿料 粘度是約1，OOOcP至約500, OOOcP，或約5, OOOcP至約300, OOOcP。最終漿料所需的粘度和 密度可以通過任何本領(lǐng)域已知的手段來實(shí)現(xiàn)，例如略微調(diào)整碳水化合物混合物中多糖的量 或通過脫氣或注入氣體如空氣、氮?dú)?、二氧化碳、氬等?br> [0076] 本發(fā)明的生物材料漿料通常被快速冷凍到-30°C到-180°C之間，或通過霧化、滴 落或注射到液氮浴在液氮中快速冷凍制劑。從液氮浴中收集顆粒、珠、串或滴并在冷凍干 燥器或真空干燥器中進(jìn)行干燥，或?qū)⑺鼈円岳鋬鲂问絻?chǔ)存于低溫冰箱中（-30°C和-80°C之 間）以備日后使用或干燥，如噴霧干燥。
[0077]通常，干燥過程中有用的技術(shù)包括噴霧干燥或在真空箱或離心蒸發(fā)器中于高于漿 料的凍結(jié)溫度（-20至5〇°C)的溫度下蒸發(fā)干燥未凍溶液，然后通過碾磨獲得期望的粒徑。 得到的粉末顆粒是玻璃質(zhì)的，大多數(shù)玻璃質(zhì)材料涂覆生物材料。用玻璃質(zhì)材料涂覆生物材 料的優(yōu)點(diǎn)是提高了產(chǎn)品的物理穩(wěn)定性并減少了顆粒內(nèi)的有害分子間反應(yīng)。在合適的示例性 實(shí)施方式中，冷凍顆粒被負(fù)載于托盤中并立即轉(zhuǎn)移至真空干燥室，其中干燥過程經(jīng)歷三個(gè) 主要的步驟，其包括：（1)在低于2000mT0RR的真空壓力下對冷凍顆粒進(jìn)行任選的短時(shí)間驅(qū) 氣和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化步驟，（ 2)在高于2OOOmTORR的真空下和高于漿料的凝固點(diǎn)的溫度下進(jìn)行 初級(jí)干燥步驟，和（3)在完全真空壓力和升高的溫度下對玻璃質(zhì)無定形材料進(jìn)行充分時(shí)間 的二級(jí)和最終干燥步驟，以將干燥的制劑的水活度降低至〇. 3Aw或更低。
[0078]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，將干燥的制劑用熔化的脂肪的混合物進(jìn)行制 粒，以獲得短暫暴露于極端溫度和濕度條件下的增強(qiáng)的保存。
[0079]干燥且穩(wěn)定的生物組合物可直接用作薄片或磨成粉并過篩至約10llni至約 IOOOum的平均粒徑。制劑可以以濃縮粉末、重新配制的液體（如飲料）直接給藥至動(dòng)物 (包括人類），或者其可以以薄片或粉末的形式混合到現(xiàn)有的食品或飼料或農(nóng)業(yè)制品中。 [00 80]在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的用于制備生物材料的穩(wěn)定冷凍的或干燥的粉末 的組合物包括碳水化合物混合物和玻璃增強(qiáng)劑。當(dāng)與生物活性材料混合時(shí)，這樣的材料在 液氮中形成了珠、串或滴，并能根據(jù)本發(fā)明的方法在無定形玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)中有效干燥，并提供 大量的用于儲(chǔ)存和給藥所述生物活性材料的穩(wěn)定的干燥組合物。（參見圖 7和圖8,其是干 燥后不同制劑的目測和顯微觀察結(jié)果以及水活度（Aw))。碳水化合物混合物在高溫和潮濕 (如 3〇°C和40% RH以上）的條件下為制劑提供了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和/或?yàn)樯锘钚圆牧咸峁?了物理和化學(xué)的保護(hù)益處并阻止或減少了重新配制或再水化時(shí)的負(fù)面作用。
[0081]碳水化合物混合物中的多糖部分可以為制劑提供增稠的粘度以及在真空下制劑 密度性質(zhì)的更好控制，并為本發(fā)明的干燥制劑組合物增加結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。（參見圖8-圖片4、 4b、4c，其是該具體制劑的玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)和干燥度）。合適的多糖（尤其對活有機(jī)體而言）是 水溶性膠，這是由于水溶性膠在溫和溫度下形成粘性凝膠的獨(dú)特性質(zhì)。還發(fā)現(xiàn)一定濃度的 膠可以通過為制劑提供適當(dāng)?shù)恼扯群兔芏炔⒃试S在初級(jí)除水步驟中以特定粘度有效干燥 制劑在真空條件下有效地穩(wěn)定制劑結(jié)構(gòu)。某些膠也可以通過與二價(jià)或多價(jià)陽離子交聯(lián)（如 海藻酸鹽、果膠、脫乙酰殼多糖）或者通過溫度或pH變化（如明膠、CMC、CAP、結(jié)冷膠）形成 水凝膠。水凝膠化的溶液可防止與未凍溶液真空干燥有關(guān)的問題。還發(fā)現(xiàn)一定濃度的膠能 有效地穩(wěn)定制劑并促進(jìn)無定形玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成并增強(qiáng)真空下的干燥曲線（參見圖 7一圖 片 3a、3b、3c、4 和圖 8-4c 和圖 13)。
[0082]值得注意地，通過觀察圖7的照片并結(jié)合下面表1中所列的結(jié)果，可以明顯看出樣 品3b、3c、4、5和6都被充分干燥，在無定形玻璃質(zhì)結(jié)構(gòu)中提供了一定孔隙度。
[0083]表 1
[0084] 各種干燥組合物的目測檢查

【權(quán)利要求】
1. 一種用于生物活性材料的干燥的穩(wěn)定化組合物，其包括碳水化合物組分和蛋白質(zhì)組 分，其中，按組合物的總重量計(jì)，碳水化合物組分包括介于約10%和80%之間的寡糖、介于 約5 %和30 %之間的二糖和介于約1 %和10 %之間的多糖，蛋白質(zhì)組分包括介于約0. 5 %和 40 %之間的水解的動(dòng)物或植物蛋白。
2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中水解的蛋白組分包含水解的酪蛋白、水解的乳清 蛋白、水解的豌豆蛋白、水解的大豆蛋白或其混合物。
3. 如權(quán)利要求2所述的組合物，其中水解的酪蛋白、水解的乳清蛋白、水解的豌豆蛋 白、水解的大豆蛋白是深度水解的蛋白。
4. 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中多糖包括鄰苯二甲酸醋酸纖維素 (CAP)、羧甲基纖維素、果膠、海藻酸鈉、海藻酸鹽、羥基丙基甲基纖維素（HPMC)、甲基纖維 素、角叉菜膠、結(jié)冷膠、瓜爾膠、阿拉伯樹膠、黃原膠、刺槐豆膠、脫乙酰殼多糖和脫乙酰殼多 糖衍生物、膠原、聚乙醇酸、淀粉、修飾的淀粉或其混合物。
5. 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中寡糖包括環(huán)糊精、菊粉、麥芽糖糊精、葡 聚糖、低聚果糖（FOS)、低聚半乳糖（GOS)、甘露寡糖（MOS)或其混合物。
6. 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中二糖包括海藻糖、蔗糖、乳糖或其混合 物。
7. 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中組合物進(jìn)一步包含羧酸組分，其中，按組 合物的總重量計(jì),羧酸組分包括介于約0. 5%和10%之間的羧酸。
8. 如權(quán)利要求7所述的組合物，其中羧酸組分包含乳酸、抗壞血酸、馬來酸、草酸、丙二 酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、葡糖酸、谷氨酸、其鹽或其混合物。
9. 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中組合物與生物活性材料組合。
10. 如權(quán)利要求9所述的組合物，其中生物活性材料包括活的、死的或減毒的細(xì)胞、微 生物、病毒、細(xì)菌、益生菌、植物細(xì)菌、土壤細(xì)菌、真菌、酵母、細(xì)胞培養(yǎng)物、蛋白質(zhì)、重組蛋白、 酶、肽、激素、疫苗、抗生素、藥物或其混合物。
11. 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中組合物以無定形玻璃質(zhì)形態(tài)干燥。
12. 如權(quán)利要求11所述的組合物，其中組合物通過選自空氣干燥、真空干燥、流化床干 燥和噴霧干燥的一種或多種方法進(jìn)行干燥。
13. -種用于制備權(quán)利要求9所述的組合物的方法，其包括：(a)將生物活性材料與至 少碳水化合物組分和蛋白質(zhì)組分在水性溶劑中組合以形成粘性漿料；(b)將漿料在液氮中 快速冷凍以形成固體冷凍顆粒、珠、滴或串；（c)在真空下將步驟（b)的產(chǎn)物除水來進(jìn)行初 級(jí)干燥并將該產(chǎn)物保持在高于其凍結(jié)溫度的溫度下；和（d)在最大真空和20°C或更高的溫 度下使步驟（c)的產(chǎn)物經(jīng)充分時(shí)間的二級(jí)干燥，以將其水活度降低至低于0.3Aw。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中在快速冷凍之前通過pH或溫度變化或通過將聚合 物鏈與金屬離子交聯(lián)將漿料固化成堅(jiān)固的水凝膠。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中漿料被塑形成所需的形狀。
16. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中在高于>2000mT0RR的真空壓力下進(jìn)行初級(jí)除水步 驟。
17. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中將干燥的材料切割、壓碎、碾磨或分別粉碎成自由 流動(dòng)的粉末。
18. -種通過權(quán)利要求17所述的方法制造的組合物，其中粒徑小于約1000 μ m。
19. 一種包括權(quán)利要求9所述的組合物的重建的液體、研磨的粉末、片劑、顆粒、膠囊、 食品或飼料或涂覆的種子產(chǎn)品。
20. -種包括權(quán)利要求9所述的組合物的營養(yǎng)食品、藥物、農(nóng)產(chǎn)品或疫苗產(chǎn)品。
21. -種包括權(quán)利要求9所述的組合物的棒、液體配方、膠體懸浮液、粉末、片劑、膠囊 和涂覆的種子形式的食品、食品添加劑、動(dòng)物飼料、動(dòng)物飼料添加劑、營養(yǎng)食品、藥物、農(nóng)產(chǎn) 品或疫苗產(chǎn)品。
22. -種通過權(quán)利要求13所述的方法制造的組合物。
23. -種通過壓制包埋在干燥的玻璃質(zhì)和無定形組合物中的敏感生物活性材料制造的 片劑、丸劑或顆粒，其中組合物包含一種或多種糖和一種或多種水解的蛋白，其中，按組合 物的總干重計(jì)，糖介于約10%和60%之間，水解蛋白介于約1%和40%之間。
24. 如權(quán)利要求23所述的片劑、丸劑或顆粒，其中生物活性材料包括活的、死的或減毒 的細(xì)胞、微生物、病毒、細(xì)菌、益生菌、植物和土壤細(xì)菌、真菌或酵母、細(xì)胞培養(yǎng)物、蛋白質(zhì)、重 組蛋白、酶、肽、激素、疫苗、抗生素、藥物或其混合物。
25. 如權(quán)利要求23或24所述的片劑、丸劑或顆粒，其中水解的蛋白包括深度水解的酪 蛋白、乳清蛋白、跳?蛋白、大?蛋白或其混合物。
26. 如權(quán)利要求23-25任一項(xiàng)所述的片劑、丸劑或顆粒，其中糖是選自海藻糖、蔗糖、乳 糖和其混合物的二糖。
27. 如權(quán)利要求23-26任一項(xiàng)所述的片劑、丸劑或顆粒，其中組合物中包括玻璃增強(qiáng)化 合物，其中，按組合物總干重計(jì)，玻璃增強(qiáng)化合物介于約1%和20%之間。
28. 如權(quán)利要求27所述的片劑、丸劑或顆粒，其中玻璃增強(qiáng)化合物包括甲酸、草酸、抗 壞血酸、磷酸或其組合的離子。
29. 如權(quán)利要求23-28任一項(xiàng)所述的片劑、丸劑或顆粒，其中組合物進(jìn)一步包括多糖或 寡糖或其混合物。
30. 如權(quán)利要求29所述的片劑、丸劑或顆粒，其中組合物包括選自乙酸鄰苯二甲酸纖 維素（CAP)、羧甲基纖維素、果膠、海藻酸鈉、海藻酸鹽、羥基丙基甲基纖維素（HPMC)、甲基 纖維素、角叉菜膠、結(jié)冷膠、瓜爾膠、阿拉伯樹膠、黃原膠、刺槐豆膠、脫乙酰殼多糖和脫乙酰 殼多糖衍生物、膠原、聚乙醇酸、淀粉、修飾的淀粉和其混合物的多糖，其中多糖介于組合物 總干重的約〇. 1和10%之間。
31. 如權(quán)利要求29或30所述的片劑、丸劑或顆粒，其中組合物包含選自環(huán)糊精、菊粉、 麥芽糖糊精、葡聚糖、低聚果糖（FOS)、低聚半乳糖（GOS)、甘露聚糖（MOS)和其混合物的寡 糖，其中寡糖介于組合物總干重的約〇. 5和20%之間。
32. 如權(quán)利要求23-31任一項(xiàng)所述的片劑、丸劑或顆粒，其中組合物以無定形玻璃質(zhì)形 態(tài)干燥。
33. 如權(quán)利要求32所述的片劑、丸劑或顆粒，其中組合物通過包括選自空氣干燥、真空 干燥、流化床干燥和噴霧干燥的一種或多種方法的方法進(jìn)行干燥。
34. -種制備權(quán)利要求23-33任一項(xiàng)所述的片劑、丸劑或顆粒的方法，其包括壓縮包 埋在干燥的玻璃質(zhì)和無定形組合物中的敏感生物活性材料，其中干燥的玻璃質(zhì)和無定形組 合物通過下述方法制造：(a)將生物活性材料與至少一種或多種糖和一種或多種水解的蛋 白在水性溶劑中組合，以形成粘性漿料；(b)將漿料在液氮中快速冷凍，以形成固體冷凍顆 粒、珠、滴或串；（C)在真空下將步驟（b)的產(chǎn)物除水來進(jìn)行初級(jí)干燥并將該產(chǎn)物保持在高 于其凍結(jié)溫度的溫度下；和（d)在最大真空和20°C或更高的溫度下使步驟（C)的產(chǎn)物經(jīng)充 分時(shí)間的二級(jí)干燥，以將其水活度降低至低于〇. 3Aw。
35. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中在快速冷凍之前，通過pH或溫度變化或通過將聚 合物鏈與金屬離子交聯(lián)將漿料固化成堅(jiān)固的水凝膠。
36. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中在2000mT0RR或更多的真空下進(jìn)行初級(jí)除水步驟。
37. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中將干燥的材料切割、壓碎、碾磨或分別粉碎成自由 流動(dòng)的粉末。
38. 如權(quán)利要求37所述的方法，其中粉末的粒徑小于約1000 μ m。
39. 如權(quán)利要求23-33任一項(xiàng)所述的片劑、丸劑或顆粒，其中生物活性材料在壓片設(shè)備 中壓實(shí)或壓制時(shí)是穩(wěn)定的。
40. -種包括權(quán)利要求23-33任一項(xiàng)所述的片劑、丸劑或顆粒的飲料、食品、動(dòng)物飼料、 營養(yǎng)食品、藥物、農(nóng)產(chǎn)品或疫苗產(chǎn)品。
41. 一種通過權(quán)利要求34所述的方法制造的片劑、丸劑或顆粒。
【文檔編號(hào)】A61K9/20GK104244985SQ201380015928
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月23日
【發(fā)明者】莫迪·哈萊爾, 瓊·唐, 特麗莎·賴斯, 金伯利·詹寧斯, 布萊恩·卡朋特, 羅杰·德魯斯, 伊麗莎白·拉迪斯 申請人:先進(jìn)生物營養(yǎng)公司