4-氧代-2-戊烯酸和肝臟病癥的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一般涉及具有健康益處的組合物。特別而言，本發(fā)明涉及治療或預防肝臟病癥。本發(fā)明的主題是用于治療或預防肝臟病癥的包含4-氧代-2-戊烯酸的組合物。本發(fā)明的另一主題是用于治療或預防與肝臟中的II期酶活性不足有關(guān)的病癥、包含4-氧代-2-戊烯酸的組合物。
CNCM I-3865
2007.11.15

CNCM I-3914
2008.02.05
【專利說明】4-氧代-2-戊烯酸和肝臟病癥
[0001] 描沭
[0002] 本發(fā)明一般涉及具有健康益處的組合物。特別而言，本發(fā)明涉及治療或預防肝臟 病癥。本發(fā)明的主題是用于治療或預防肝臟病癥的包含4-氧代-2-戊烯酸的組合物。本 發(fā)明的另一主題是用于治療或預防與肝臟中的II相酶活性不足有關(guān)的病癥的包含4-氧 代-2-戊烯酸的組合物。
[0003] 肝臟是體內(nèi)的最大器官。其充當體內(nèi)化學工廠，執(zhí)行很多生命機能-從調(diào)控化 學物質(zhì)在體內(nèi)的水平到生產(chǎn)制備血凝塊的物質(zhì)。由于其在如此多的體內(nèi)過程中的關(guān)鍵作 用，與肝臟功能相關(guān)的病癥是不健康的主要原因。根據(jù)British Liver Trust,肝臟疾病 是在英格蘭和威爾士中排在心臟、癌癥、中風和呼吸疾病后的第五大"殺手"（http://WWW. britishlivertrust.org.uk，于2011年11月1日檢索）。由于人們可在70%肝臟損傷下 存活，所以存在來自肝臟疾病的患病率的巨大負擔和來自肝相關(guān)的不健康的巨大的經(jīng)濟和 人成本。
[0004] 肝臟是負責異源性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化和隨后的解毒的主要器官。異源性物質(zhì)是存在 于體內(nèi)但通常不被產(chǎn)生或不預期存在于其中的化學物質(zhì)。術(shù)語異源性物質(zhì)還是指以高于平 常濃度存在的物質(zhì)。為了在尿液中排泄親脂性異源性物質(zhì)，它們必須被制成水溶性的。親 脂性化合物至水溶性化合物的生物轉(zhuǎn)化通常在體內(nèi)以兩個階段發(fā)生：官能化，然后綴合。官 能化使用氧以形成反應性位點并且被稱為I期解毒。綴合導致將水溶性基團添加至反應性 位點并且被稱為II期解毒。存在許多催化II期解毒的酶，例如血紅素氧合酶1、NAD(P)H 脫氫酶醌1、谷胱甘肽還原酶、谷氨酸半胱氨酸連接酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和UDP-葡萄醛酸 基轉(zhuǎn)移酶。因為肝臟的解毒中的主要作用，故肝臟中這些II期酶的活性特別重要。
[0005] 用于治療肝臟病癥的現(xiàn)有治療性干預是非常有限的。當病因可被鑒定時，那么去 除該病因在預防和/或治療中起重要作用。例如，當該病癥歸因于過度酒精消耗或肥胖時， 那么戒酒或適當?shù)纳罘绞胶惋嬍匙兓侵匾?。同樣應建議人們采取預防措施以避免被 病毒性肝炎感染。
[0006] 氧化應激和炎癥在肝臟疾病的發(fā)病機理中起關(guān)鍵作用，故已提出靶向這些疾病的 化合物用于治療或預防肝臟病癥。例如，已顯示奧替普拉（4-甲基-5-(2-吡嗪基）-3_二硫 雜環(huán)戊二烯硫酮（dithiolethione))使小鼠肝臟免遭a-萘基異硫氰酸酯（ANIT)-誘導的 膽汁郁積以及降低大鼠中黃曲毒素-誘導的肝癌發(fā)生。合成三萜系化合物2-氰基-3, 12-二 氧代齊墩果-1，9-二烯-28-酸（CDDO)可與相應的甲基（CDDO-Me)和咪唑（CDDO-Im)酯 (C. D. Klaassen 等人，Toxicology and Applied Pharmacology, 244, 57-65 (2010)) -起產(chǎn) 生保肝作用。然而，這些化合物還可以產(chǎn)生不希望的作用；例如，奧替普拉的臨床試驗已顯 不顯著副作用（Y. Zhang 等人，Molecular Cancer Therapeutics 3, 885-893 (2004))。因此 具有可用于治療或預防肝臟病癥且沒有現(xiàn)有技術(shù)中所述那些組合物的缺點的另外組合物 將是可取的。特別而言，發(fā)現(xiàn)其活性成分從天然來源獲得的有效組合物是高度可取的。
[0007] 因此，本發(fā)明的目的是改良技術(shù)狀態(tài)，特別而言是提供可用于治療或預防肝臟病 癥的替代組合物。發(fā)明人驚訝地看到，可由獨立權(quán)利要求的主題實現(xiàn)本發(fā)明的目的。從屬 權(quán)利要求進一步開發(fā)本發(fā)明的理念。
[0008] 因此，本發(fā)明提供用于治療或預防肝臟病癥的包含4-氧代-2-戊烯酸的組合物。
[0009] 本發(fā)明還提供4-氧代-2-戊烯酸在制備用于治療或預防肝臟病癥的組合物中的 用途。
[0010] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)的"治療"是指減少、抑制、減輕或改善。
[0011] 4-氧代-2-戊烯酸具有CAS號4743-82-2和下列式
[0012] CH A^coom W3' 'GOOH
[0013] 發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)4-氧代-2-戊烯酸激活Nrf2。Nrf2(核因子（紅細胞源性 2)_樣2)是細胞中抗氧化劑響應的主要調(diào)控因子。Nrf2在肝臟中的顯著性是公認的，因 為無Nrf2的小鼠的肝臟比野生型小鼠更易受各種氧化/親電子應激-誘導的病理學影響 (C.D. Klaassen 等人，Toxicology and Applied Pharmacology, 244, 57-65 (2010))。轉(zhuǎn)錄 因子Nrf2在細胞的細胞溶質(zhì)中發(fā)現(xiàn)并且結(jié)合于抑制劑Keapl。當結(jié)合于Keapl時，Nrf2還 被蛋白酶體快速降解，因此其基底濃度低。在氧化應激發(fā)生時，從Keapl釋放Nrf2。Nrf2 濃度增加并且其易位到細胞核中。其刺激編碼解毒酶的基因和抗氧化劑蛋白的表達，從而 增加對氧化應激和親電子劑的抗性。
[0014] 反應性氧種類和氧化應激在發(fā)展肝病中起重要的作用（Y.-P. Wang等人，World Chinese Journal of Digestology, 18, 1907-1911(2010))。已知肝臟中 Nrf2 的 激活治療或預防肝臟病癥。例如，Aleksunes (L. M. Aleksunes等人，Toxicologic Pathology, 35, 459-473 (2007))和Klaassen (C. D. Klaassen等人，Toxicology and Applied Pharmacology, 244, 57-65(2010))的現(xiàn)有綜述已將Nrf2激活與病癥的治療相關(guān)聯(lián)。包括膽 汁郁積性肝臟疾病、炎癥性肝損傷、撲熱息痛肝臟毒性、黃曲毒素-誘導的癌、化學物質(zhì)-誘 導的癌發(fā)生、乙醇-介導的肝臟毒性、肝纖維化、肝細胞細胞凋亡和重金屬毒性，以及預防 高脂肪飲食-誘導的體重、脂肪質(zhì)量和肝脂質(zhì)蓄積的增加。
[0015] Nrf2的激活可通過藥理學方法來實現(xiàn)。例如奧替普拉、⑶DO、CDDO-Me和 Q)D〇-Im(上文論述的）導致經(jīng)由Nrf2激活的保肝作用（C. D. Klaassen等人，Toxicology and Applied Pharmacology, 244, 57-65(2010))〇
[0016] 已描述存在于食物中的Nrf2激活化合物。這些化合物包括姜黃素（姜黃的 一種主要組分）（US2009/0042980);于葡萄中發(fā)現(xiàn)的白藜蘆醇（Chen CY等人，Biochem Biophys Res Commun 2005 年 6 月 17 日；331 (4) :993-1000);于花椰菜中發(fā)現(xiàn)的萊服 硫燒（F. Elbarbry 等人，Journal of Medical Plants Research, 5, 473-484，（2011)); 于蘋果中發(fā)現(xiàn)的槲皮素（Tanigawa S等人，F(xiàn)ree Radic Biol Med 2007年6月I日； 42(11):1690-703)和于大豆和咖啡中發(fā)現(xiàn)的染料木黃酮；于羽衣甘藍（kale)中發(fā) 現(xiàn)的山柰酚（kaempferol);于草莓和覆盆子（raspberry)中發(fā)現(xiàn)的縣花酸（elIagic acid);以及綠茶中發(fā)現(xiàn)的表兒茶素類黃酮（B.H.J.Juurlink, Canadian Journal of Pharmacology, 79, 266-282(2001))。如同激活Nrf2,已均報道它們誘導II期酶。然而， Nrf2激活化合物以低水平存在于這些食物中，故將需要大量天然來源物質(zhì)提取顯著量的 Nrf2激活化合物。姜黃素、白藜蘆醇、萊服硫烷和槲皮素的非常低的水溶解度影響其生物利 用度。因此，仍需要鑒定激活Nrf2的其它化合物，特別而言可從天然來源以顯著量獲得的 化合物和具有良好的水溶解度的化合物。
[0017] 已知Nrf2介導II期酶的誘導。因此，發(fā)明人調(diào)查了 4-氧代-2-戊烯酸是否刺激 編碼II期酶的基因在肝臟中的表達。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)4-氧代-2-戊烯酸激活在肝臟細胞（肝 細胞）中下列II期酶的基因表達：血紅素氧合酶UNAD⑵H脫氫酶醌1、谷胱甘肽還原酶、 谷氨酸半胱氨酸連接酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和UDP-葡萄醛酸基轉(zhuǎn)移酶。
[0018] 肝臟中II期酶的活性不足已與如環(huán)境敏感性、藥物不耐受性、肝臟的病理學解 毒、慢性疲勞綜合征和纖維肌痛的病癥相關(guān)。包含4-氧代-2-戊烯酸的組合物提供治療這 些病癥的方法。
[0019] 已顯示核轉(zhuǎn)錄因子K B(NF-K B)的抑制預防急性和慢性肝損傷 (P. Muriel, Journal of Applied Toxicology, 29, 91 - 100 (2009))。NF-K B 是慢性免疫 響應和炎癥性疾病中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（P.J.Barnes等人，The NewEngland Journal of Medicine，336, 1066-1078 (1997))。NF-K B被多種刺激物激活，包括細胞因子、蛋白激 酶C活化劑、病毒、免疫刺激物和尤其是反應性氧種類（F. Luft, Current Hypertension R印orts, 3, 61-67(2001))。NF-k B由Rel蛋白的同二聚體和異二聚體組成。NF-k B的主 要反式激活形式由P65和p50異二聚體組成。NF-kB的激活涉及通過特異性I K B激酶使抑 制性蛋白I K B磷酸化和隨后蛋白質(zhì)降解。游離NF-k B傳入細胞核，在那里它結(jié)合于在炎 癥中涉及的許多基因的啟動子區(qū)中的KB位點。
[0020] 已鑒定NF- K B抑制劑，如糖皮質(zhì)激素（Adcock等人，American Journal Physiology-Cell Physiology, 268, C331-C338 (1995)),但是當全身給予時糖皮質(zhì)激素具 有內(nèi)分泌和代謝副作用。也已報道肝素抑制NF-K B (W0200119376)，但是其具有潛在副作 用，導致肝素誘導的血小板減少。
[0021] 發(fā)明人調(diào)查了 4-氧代-2-戊烯酸是否抑制NF- K B激活。使用暴露于促炎癥性應 激（LPS和rhTNF- a )的人結(jié)腸細胞和人單核細胞/巨噬細胞，他們發(fā)現(xiàn)4-氧代-2-戊烯 酸抑制NF-K B激活。
[0022] 發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)4-氧代-2-戊烯酸可由天然來源獲得，例如獲自一些經(jīng)過熱 處理的細菌株。例如，當在90°C加熱6小時時短雙岐桿菌CNCMI-3865和短雙岐桿菌ATCC 15700?的細菌制品均產(chǎn)生4-氧代-2-戊烯酸。發(fā)現(xiàn)在離心并過濾經(jīng)過熱處理的細菌制品 后，4-氧代-2-戊烯酸存在于可溶性部分中。
[0023] 短雙岐桿菌 CNCM 1-3865 于 2007 年 11 月 15 日保藏于 COLLECTION NATI0NALE DE CULTURES DE MICR00RGANISMES(CNCM),INSTITUT PASTEUR,25rue du Docteur Roux, F-75724PARIS Cedex 15,France。
[0024] 短雙岐桿菌ATCC 15700?可商業(yè)獲得，例如以ATCC 15700的商標獲自美國典型培 養(yǎng)物保藏中心（American type Culture Collection) (ATCC) ,Manassas, Virginia, USA。
[0025] 因此，本發(fā)明部分涉及用于治療或預防肝臟病癥的包含4-氧代-2-戊烯酸的組合 物，其中組合物不用作藥劑。藥劑是在藥房中制備或分發(fā)且在醫(yī)學治療中使用的藥物或藥 品（〈URL :www. thefreedictionary. com/pharmaceutical/>[于 2012 年 07 月 17 檢索])。 本發(fā)明可以是用于治療或預防肝臟病癥的包含4-氧代-2-戊烯酸的食品組合物。肝臟病癥 可選自下組：肝炎；肝纖維化；膽汁郁積性肝臟疾?。谎装Y性肝損傷；生物異源物質(zhì)毒性，包 括藥物-誘導的肝臟毒性和乙醇-介導的肝臟毒性；肝性腦病；脂肪肝臟疾病；缺血再灌注 肝損傷；肝衰竭；1型遺傳性酪氨酸血癥；肝細胞癌，包括由肝炎、黃曲毒素和化學毒素誘導 的那些；環(huán)境敏感性、藥物不耐受性、慢性疲勞綜合征和纖維肌痛，歸因于過量負載毒素進 入I期和低效II期途徑；肝臟的病理學解毒及其組合。這些病癥均具有氧化應激組分并且 可通過肝臟中的Nrf2激活（常常與NF-K B抑制組合）來治療。例如，包含4-氧代-2-戊 烯酸的組合物可用于治療或預防可通過肝臟中Nrf2激活治療的病癥。
[0026] 肝炎是肝臟的炎癥。一組被稱為肝炎病毒的病毒引起全世界大多數(shù)情況的肝炎， 但是其還可以歸因于毒素、其它感染和自身免疫性疾病。
[0027] 肝纖維化是指堅韌的纖維癜痕組織在肝臟中的蓄積并且是對肝臟的炎癥或直接 毒性損害的一個結(jié)果。
[0028] 膽汁郁積是一種其中膽汁不能從肝臟流向十二指腸的疾患。其可作為很多藥物的 副作用獲得。已顯示Nrf2活化劑可用于治療膽汁郁積性肝臟疾病，這不僅通過降低由膽酸 積聚引起的氧化應激，而且通過調(diào)節(jié)Bsep (膽汁鹽流出泵）蛋白來動員和分泌毒性膽酸。
[0029] 肝細胞死亡可觸發(fā)炎癥性響應。這種炎癥性響應的關(guān)鍵是促進反應性氧種類 (ROS)形成。炎癥是固有免疫響應于微生物感染和組織創(chuàng)傷的關(guān)鍵部分。然而，過度炎癥性 響應可導致炎癥性肝損傷。
[0030] 許多化合物可證實對肝有毒性并且導致肝臟病癥。此類肝臟毒素的實例包括脂多 糖；藥物如撲熱息痛（對乙酰氨基酚）合成代謝類固醇、一些抗生素和糖皮質(zhì)激素；乙醇； 溴苯；四氯化碳；硫代乙酰胺；呋塞米；鬼筆環(huán)肽；砷；五氯苯酚（PCB);吡唑；馬來酸二乙 酯；百草枯（paraquat);秋水仙堿；和過量的所謂的"重金屬"如鐵、錳、鋁、汞、鎘、鈹和砷。
[0031] 肝性腦病是通常由肝移除的毒性物質(zhì)在血流中蓄積造成的意識模糊、改變意識水 平或昏迷的發(fā)生。
[0032] 脂肪肝臟疾病是其中甘油三酯脂肪的大液泡經(jīng)由脂肪變性的過程于肝細胞中蓄 積（肝臟脂質(zhì)蓄積）的疾患。盡管具有多種原因，但是脂肪肝可被認為是在世界范圍內(nèi)在 過度飲酒的人和肥胖的人（具有或沒有胰島素抗性的作用）中發(fā)生的單一疾病。脂肪的蓄 積還可以伴有肝的進展性炎癥。取決于酒精的貢獻，脂肪肝可被稱為酒精或非酒精脂肪肝 臟疾?。ɑ蚓凭蚍蔷凭咀冃裕?。
[0033] 再灌注損傷是在缺血或缺氧的時期后在血液供給返回組織時造成的組織損傷。缺 血再灌注肝損傷在許多臨床環(huán)境中發(fā)生，包括肝手術(shù)、移植、和隨后流體復蘇的出血性休 克，導致顯著性患病率和死亡率。其特征在于伴有內(nèi)源性抗氧化劑耗竭的顯著性氧化應激。 [0034] 肝細胞癌（也稱為惡性肝細胞瘤）是最常見類型的肝癌。大多數(shù)情況的肝細胞癌 繼發(fā)于病毒感染或肝硬化。肝細胞癌可以通過暴露于黃曲毒素而造成，黃曲毒素是遍及經(jīng) 濟發(fā)展中國家的人類食物供給的普遍存在的污染物。黃曲毒素暴露使肝癌在被肝炎乙型病 毒慢性感染的人中的風險成倍數(shù)增加。肝細胞癌還可以被化學毒素如除草劑、氯乙烯和砷 所誘導。盡管化學癌發(fā)生是多因子的時，但是氧化應激是用于細胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵組分。
[0035] 肝衰竭是肝不能執(zhí)行其正常合成和代謝功能作為正常生理學的部分。
[0036] 1型酪氨酸血癥，也稱為肝腎酪氨酸血癥，由缺少延胡索酰乙酰乙酸水解酶而造 成。
[0037] 肝臟的病理性解毒是指一種其中I期和II解毒途徑未處于平衡且I期相對于II 期增加的疾患。環(huán)境敏感性、藥物不耐受性、慢性疲勞綜合征和纖維肌痛可歸因于過量負載 的毒素進入I期且II期途徑低效。環(huán)境敏感性或多發(fā)性化學敏感性是由于人們不能耐受 環(huán)境化學物質(zhì)或一類生物異源化學物質(zhì)而造成的慢性復發(fā)疾病。慢性疲勞綜合征是一種或 一組明顯使人衰弱的醫(yī)學病癥，通常由持續(xù)疲勞伴有其它具體癥狀至少6個月而定義的病 癥，并非歸因于持續(xù)勞累，并非通過休息來顯著緩解，也不是由其它醫(yī)學疾患引起。該病癥 還可以被稱為肌痛性腦脊髓炎（myalgic encephalomyelitis)、病毒后疲勞綜合征或慢性 疲勞免疫機能紊亂綜合征。纖維肌痛是特征在于慢性廣泛疼痛和觸誘發(fā)痛（一種對壓力強 烈且痛苦的響應）的醫(yī)學病癥。提供用于治療或預防上文所述所有肝臟病癥的組合物是有 利的。
[0038] 本發(fā)明提供用于治療或預防與肝臟中II期酶活性不足相關(guān)的病癥、包含4-氧 代-2-戊烯酸的組合物。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的" II期酶活性不足"包括活性不足以實現(xiàn)或 保持II期解毒途徑的正常健康的運行；活性不足以正確地平衡或補償I期解毒途徑的被干 擾水平；和/或活性不足以通過處理異源性物質(zhì)、包括藥物、前藥和毒素來控制、減少或預 防慢性疾病。
[0039] II期酶可選自下組：血紅素氧合酶UNAD(P)H脫氫酶醌1、谷胱甘肽還原酶、谷氨 酸半胱氨酸連接酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、UDP-葡萄醛酸基轉(zhuǎn)移酶及其組合。能夠治療或預 防與這些II期酶的活性不足相關(guān)的病癥是有利的。
[0040] 血紅素（heme)氧合酶或血紅素（haem)氧合酶是催化血紅素降解的酶。這產(chǎn)生膽 綠素、鐵和一氧化碳。有三種已知血紅素氧合酶同工型。血紅素氧合酶I (H0-1)是響應于如 氧化應激、低氧、重金屬和細胞因子的應激的可誘導同工型。NAD(P)H脫氫酶醌I(Nqol)是 胞質(zhì)黃素蛋白。其催化內(nèi)源性和生物異源化學物質(zhì)的兩個電子還原性代謝和解毒以及通過 清除超氧化物來防御胞內(nèi)氧化應激。谷胱甘肽還原酶（Gsr)是還原谷胱甘肽二硫化物為谷 胱甘肽的酶，其是重要的細胞抗氧化劑。谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL)是谷胱甘肽生物合 成途徑的第一酶。GCL執(zhí)行在谷胱甘肽合成中的限速步驟。GCL是由兩種蛋白質(zhì)組成的異 二聚體酶：具有所有催化性質(zhì)的谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞單位（Gclc)，和增加Gclc的 催化效率的谷氨酸半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)劑亞單位（Gclm)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Gst)家族 的酶由很多胞質(zhì)、線粒體和微粒體蛋白質(zhì)組成。Gst酶催化化學物質(zhì)和親電子種類與谷胱甘 肽的綴合。這些綴合物隨后被降解為巰基尿酸鹽（mercapturates)并從體內(nèi)排泄。UDP-葡 萄醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UGT)催化生物異源和內(nèi)源性化學物質(zhì)與葡糖醛酸（II期解毒途徑的主要 部分）的綴合。
[0041] 有利的是，可以向肝臟中I期酶的活性增加和/或肝臟中II期酶活性減少的對象 施用本發(fā)明的組合物。I期酶和II期酶的活性應通常處于平衡，其中I期酶產(chǎn)生II期酶綴 合并去除的反應性中間體。I期酶的活性增加且II期酶的活性沒有相應增加、或II期酶的 活性減少將破壞這個平衡并且產(chǎn)生較高水平的反應性中間體，后者可對DNA、RNA和蛋白質(zhì) 產(chǎn)生損傷。I期酶活性增加可例如由來自香煙煙霧的多環(huán)烴和來自在高溫炙烤的肉的芳基 胺引起。這些誘導CyplAl和CyplA2酶，導致I期活性大幅增加且II期酶未受或受極少誘 導。抑制II期酶的常用機制是耗竭必要的輔因子。在人類中，硫酸化尤其易受由于受損的 輔因子狀態(tài)造成的抑制。硫酸儲備必須通過飲食攝入含硫氨基酸或無機硫酸鹽來保持。I 期和II期酶活性之間的失衡可通過施用激活I(lǐng)I期酶途徑的組合物來彌補。
[0042] 肝臟中的毒性負載增加可通過簡單壓制該系統(tǒng)并競爭解毒酶活性而導致解毒抑 制。如果I期和II解毒途徑變得過度負載，則毒素將在體內(nèi)累積。這些毒素中的很多種是 脂溶性的并且變得摻入體內(nèi)的脂肪部分，它們可在體內(nèi)存在數(shù)年。腦和內(nèi)分泌腺是脂肪器 官并且是脂溶性毒素蓄積的常見位點。這可產(chǎn)生腦功能障礙的癥狀和激素失調(diào)。因此，有 利的是，本發(fā)明還提供向需要肝解毒的對象施用的包含4-氧代-2-戊烯酸的組合物。
[0043] 過重或肥胖是熟知的病癥，目前在我們社會中是個很大的負擔。"過重"對于成年 人被定義為具有體重指數(shù)（BMI)介于25至30之間。"體重指數(shù)"計算為重量（以kg計） 除以身高（以米計）的比率的平方。
[0044] "肥胖癥"是一種其中在貯存于動物、特別是人和其它哺乳動物脂肪組織中的天然 能量儲備增加至與某些健康狀況或增加的死亡率相關(guān)的點的疾患。"肥胖"對于成年人被定 義為具有大于30的BMI。
[0045] 脂肪肝臟疾病作為與人口中的肥胖癥和2型糖尿病的發(fā)病率增加相關(guān)的慢性肝 臟疾病的最重要病因出現(xiàn)。非脂肪組織具有有限的供三酰甘油儲存的容量，并且在營養(yǎng) 過度的情況下，過量脂質(zhì)蓄積，確定高水平的飽和脂肪酸，其可觸發(fā)細胞功能障礙和/或 細胞死亡，即為一種稱為脂毒性的響應。該現(xiàn)象涉及反應性氧種類水平的升高。尤其，這 種氧化還原失衡的特征在于谷胱甘肽顯著耗竭（LA. Videl等人，Trends in Molecular Medicine，12, 555-558(2006))。谷胱甘肽的形成通過激活I(lǐng)I期酶來促成，并且已知Nrf2 活化劑減少高脂肪飲食-誘導的肝臟脂質(zhì)蓄積增加（S. Shin等人，European Journal of Pharmacology 620, 138-144(2009))。因此，有利的是，本發(fā)明還提供向過重和/或患有2 型糖尿病的對象施用的包含4-氧代-2-戊烯酸的組合物。
[0046] 在本發(fā)明中，4-氧代-2-戊烯酸是可獲得的，例如獲自天然來源。很多人關(guān)心在工 業(yè)上由化工原料合成的材料的安全性，尤其在將攝入這些材料的情況下，并且優(yōu)選獲自天 然來源的材料。
[0047] 令人驚訝的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，一些菌株提供4-氧代-2-戊烯酸的天然來源。特別 而言，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)4-氧代-2-戊烯酸可獲自短雙岐桿菌CNCMI-3865或短雙岐桿菌ATCC 15700?(短雙岐桿菌的模式株）。將細菌用作4-氧代-2-戊烯酸的來源是尤其有利的， 因為例如通過使用生物反應器可以生產(chǎn)大量4-氧代-2-戊烯酸。因此，在本發(fā)明中4-氧 代-2-戊烯酸可以獲得，例如獲自短雙岐桿菌CNCM 1-3865或短雙岐桿菌ATCC 15700?。
[0048] 該細菌可以在商業(yè)生產(chǎn)過程中在約60_180°C、優(yōu)選在約80_160°C、例如在約 110-150°C進行熱處理。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在這些溫度的熱處理在可接受的時間內(nèi)提供令人滿意 的4-氧代-2-戊烯酸收率。不希望受理論束縛，應理解，熱處理的溫度越高4-氧代-2-戊 烯酸形成速率增加，而且使其降解速率增加。因此，這些溫度在4-氧代-2-戊烯酸的形成 速率與其降解之間給出良好平衡。
[0049] 包含4-氧代-2-戊烯酸的典型組合物可以包含至少lmg/kg組合物的量的4-氧 代-2-戊烯酸。一般而言，如果組合物包含至少10mg/kg組合物、例如在50mg至50g/kg組 合物之間的量的4-氧代-2-戊烯酸，則是優(yōu)選的。
[0050] 待施用的最佳量的4-氧代-2-戊烯酸可以由熟練技術(shù)人員容易地確定。
[0051] 在治療性應用中，以足以至少部分治愈或阻止病癥和/或其并發(fā)癥的癥狀的量施 用組合物。足以完成此的量被定義為"治療性有效劑量"。對于此目的有效的量將取決于本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多因素，如病癥的嚴重性以及患者的重量和一般狀況。在預防性應 用中，向易受特定病癥影響或另外處于特定病癥風險的患者施用足以至少部分減少發(fā)展病 癥的風險的量的根據(jù)本發(fā)明的組合物。此類量被定義為"預防性有效劑量"。而且，精確量 取決于許多患者特異性因素如患者的健康狀況和重量。
[0052] 在本發(fā)明的框架中，4-氧代-2-戊烯酸可以以治療性有效劑量和/或以預防性有 效劑量施用。本發(fā)明的組合物可以以對應于2iig至20mg 4-氧代-2-戊烯酸/kg體重、優(yōu) 選20 ii g至2mg 4-氧代-2-戊烯酸/kg體重、例如40 ii g至Img 4-氧代-2-戊烯酸/kg 體重的日劑量施用。
[0053] 肝臟病癥可影響動物和人，例如肝炎是動物中的常見肝臟疾病。貓中最常見肝臟 病癥之一是貓肝臟脂質(zhì)沉積癥，也稱為貓脂肪肝綜合征。小玩具狗也可易受肝臟脂質(zhì)沉積 癥影響。脂肪肝臟疾病還常見于例如奶牛和小雞的家畜中。以與人類似的方法，存在很多 可損害動物肝臟的毒素，包括藥物如撲熱息痛、阿司匹林、合成代謝類固醇、化學療法藥物、 一些抗生素、糖皮質(zhì)激素、麻醉劑、寄生蟲防治藥物和保泰松。物種之間存在代謝機制的差 異，導致對一些肝臟病癥的特定易感性。例如，因為貓缺少II期酶葡萄醛酸基轉(zhuǎn)移酶，所以 它們綴合化合物如嗎啡和苯酚的能力受到影響。狗對糖皮質(zhì)激素藥物特別敏感并且將在多 劑療法后在肝臟中形成典型的病變。
[0054] 因此，提供向人、寵物或家畜施用的組合物是有利的。在伴侶動物的情況下，此類 治療改良動物的整體生活質(zhì)量，改良主人滿意度并且改良主人與伴侶動物之間的聯(lián)系。本 發(fā)明的實施方案提供向人、寵物或家畜施用的組合物。
[0055] 組合物的性質(zhì)并不特別受限。其可以是用于口服或腸道施用的組合物。組合物可 以是例如選自下組：食品組合物、食品添加劑、營養(yǎng)品（nutraceutical)、飲料、營養(yǎng)配方、 管飼配方、在乳或水中重構(gòu)的粉狀組合物、和寵物食品組合物。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明的食品組合物具有不同特征，例如：乳、酸奶、奶酪、發(fā)酵乳、乳基發(fā)酵 產(chǎn)品、冰淇淋、基于谷物的產(chǎn)品或發(fā)酵的基于谷物的產(chǎn)品、乳基粉末、冷凍的或耐貯藏的飲 料、糖果、動物飼料，特別對于家畜。
[0057] 食品組合物還可以進一步包含蛋白源、碳水化合物源、脂質(zhì)源、礦物源和/或維生 素源。蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、礦物和/或維生素的存在可具有數(shù)種優(yōu)勢。這些化合物 通常促成最終產(chǎn)品的味道和口感。它們還為身體提供當其受肝臟病癥影響時可急需的營養(yǎng) 物。它們還允許將本發(fā)明的組合物配制成完整營養(yǎng)配方，以使無需另外的營養(yǎng)。
[0058] 溶于水中的化合物具有以多種方式、包括作為溶液口服來方便施用的優(yōu)勢。包 含4-氧代-2-戊烯酸的組合物可以是水基的，例如組合物可以包含溶解于水中的4-氧 代-2-戊烯酸。
[0059] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解，他們可自由地組合本文公開的本發(fā)明的所有特征。特別 而言，可以組合對于本發(fā)明的不同實施方案所述的特征。本發(fā)明的另外的優(yōu)勢和特征根據(jù) 下列附圖和非限制性實例是明顯的。
[0060] 圖1示出短雙岐桿菌ATCC 15700?的粗制品（0D 50,在90°C加熱6小時）的標準 化熒光素酶活性。結(jié)果在y-軸上被表示成技術(shù)上一式三份的平均土SD。X-軸值為樣品的 最終稀釋度。
[0061] 圖2示出短雙岐桿菌CNCM 1-3865的粗制品（0D 50,在90°C加熱6小時）的標準 化熒光素酶活性。結(jié)果在y-軸上被表示成技術(shù)上一式三份的平均土SD。x-軸值為樣品的 最終稀釋度。
[0062] 圖3示出用0至200 ii M的劑量范圍的4-氧代-2-戊烯酸溫育的AREc32細胞的 Nrf2誘導倍數(shù)（棒）和細胞活力百分比（線）。Nrf2倍數(shù)誘導為在4-氧代-2-戊烯酸存 在下AREc32細胞的熒光素酶活性（RLU)與未暴露細胞的基底熒光素酶活性之間的比率。通 過ATP定量測量的細胞活力表示為對照（未治療）細胞的相對百分比。結(jié)果被表示為技術(shù) 上一式三份的平均土SD并且代表四個獨立實驗。
[0063] 圖4示出用2. 5至50% v/v的劑量范圍的短雙岐桿菌CNCM 1-3865的"純制品" 溫育的AREc32細胞的Nrf2誘導倍數(shù)（棒）和細胞活力百分比（線）。其它細節(jié)如圖3所 /Jn 〇
[0064] 圖5示出與一定劑量范圍的4-氧代-2-戊烯酸溫育24h的肝細胞中II期酶的基 因的mRNA表達譜。結(jié)果代表以技術(shù)上一式兩份執(zhí)行的兩個實驗并且表示為平均土SD。
[0065] 圖6示出通過用LPS刺激的HT-29克隆34細胞的上清液中測量SEAP(實心棒） 和IL-8(條紋棒）的產(chǎn)生而估算的NF-k B活性。細胞活力用線示出。將細胞暴露于一定 劑量范圍的4-氧代-2-戊烯酸。結(jié)果被表示為兩個以技術(shù)上一式三份執(zhí)行的獨立實驗的 平均土 SD。
[0066] 圖7示出在一定劑量范圍的4-氧代-2-戊烯酸存在下LPS刺激24h的（0. 5 ii g/ ml)THP-I藍細胞的NF-k B活性（棒）和細胞活力（線）。結(jié)果被表示為兩個以技術(shù)上一 式三份執(zhí)行的獨立實驗的平均土 SD。
[0067] 圖8示出溶解于水中的4-氧代-2-戊烯酸標準品的典型色譜圖。較高的SRM與 m/z 113 -69的躍遷反應相關(guān)聯(lián)，而較低的SRM對應于m/zll3 -41的躍遷反應。保留時 間以分鐘（X-軸）表示。信號強度（y-軸）以Cps表示。
[0068] 圖9示出使用HPLC-ESI-MS/MS、在90°C (以圓形〇表示）、120°C (以三角形A表 示）和140°C (以正方形□表示）加熱2、15、30和60分鐘的短雙岐桿菌CNCM 1-3865 (0D 40)的粗制品中的4-氧代-2-戊烯酸定量。
[0069] 實施例1 :通討4-氣代-2-戊烯酸和細菌部分的Nrf2激活
[0070] Nrf2報告某閔測定：
[0071] 使用Nrf2報告基因測定測量Nrf2的激活。該測定基于來自CRX生物科學 (Dundee，Scotland)的AREc32細胞系，一種在ARE控制下含有熒光素酶基因構(gòu)建體的穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染MCF7(乳腺癌）的細胞系。熒光素酶是消化熒光素并且產(chǎn)生熒光的酶?？寡趸肿尤?叔丁基氫醌（TBHQ)經(jīng)由結(jié)合于ARE的Nrf2激活而誘導熒光素酶轉(zhuǎn)錄。熒光素酶活性使用 熒光素酶試劑盒形式Promega(Madison，WI)來確定。熒光素酶活性與Nrf2激活成比例。
[0072] 通討細菌部分的Nrf2激活：
[0073] 使用三種細菌株來調(diào)查通過微生物的Nrf2激活：短雙岐桿菌CNCM 1-3865 (NCC2950)、短雙岐桿菌 CNCM 1-3914 (NCC466)和短雙岐桿菌ATCC 15700? (NCC2791)。短雙岐桿菌 CNCM 1-3914 于 2008 年2 月 5 日保藏于 COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES(CNCM), INSTITUT PASTEUR, 25rue du Docteur Roux，F(xiàn)_75724PARIS Cedex 15,France。
[0074] 對于各株，將10ml含有0. 05%半胱氨酸的MRS瓊脂用20 ill甘油儲液接種并在 37°C在厭氧條件中溫育過夜以形成預培養(yǎng)物。然后通過用預培養(yǎng)物接種IOml含有0. 05% 半胱氨酸的MRS制備另外的培養(yǎng)物（最終OD_調(diào)節(jié)為0. 1)。將培養(yǎng)物在37°C在厭氧條件 中溫育16小時以形成P2培養(yǎng)物。將200ml含有0. 05%半胱氨酸的MRS用P2培養(yǎng)物接種 (最終OD_調(diào)節(jié)為0. 1)且將瓶在37°C在厭氧條件中溫育16小時。
[0075] 測量0D_，將培養(yǎng)物以3300g離心IOmin且將細菌沉淀物用冷IXPBS (磷酸鹽緩沖 液鹽水）洗滌兩次且用IX PBS標準化至OD 50。
[0076] 對于各細菌株，用兩種方法獲得細菌部分；"粗制品"和"純制品"。
[0077] 如下獲得細菌"粗制品"。將5ml OD 50細菌制品在90°C于加熱塊（來自 Techne, Staffordshire, United Kingdom 的 Dri-Block DB-3 加熱塊）中加熱 6 小時。將經(jīng) 過加熱的細菌制品在+4°C以3300g離心lOmin，將上清液使用0. 22 ii m注射器濾器過濾且 在+4 °C C藏直至進一步分析。
[0078] 如下獲得細菌"純制品"。將5ml OD 50細菌制品在+4°C以3300g離心IOmin且 將細菌沉淀物用5ml水重懸浮。在冷藏室中使用迷你珠敲打（MBB)裝置破壞細菌細胞（6 個循環(huán)，以最大速度各90秒，每個循環(huán)之間停頓IOmin)。將經(jīng)破壞的細胞在+4°C以3300g 離心lh，將沉淀物用5ml IXPBS重懸浮并且于加熱塊中在90°C加熱6小時。將經(jīng)過加熱的 制品在+4°C以3300g離心lOmin。將上清液使用0. 22 ii m注射器濾器過濾并在+4°C儲存直 至進一步分析。
[0079] 通過使用斑點法鋪板來確定"0D 50懸液"的活菌計數(shù)，并使用具有下列設置的鹵 素水分分析儀（Metler-Toledo, Greifensee, Switzerland)確定干重：干燥溫度為160°C且 激活步階干燥。
[0080] 為了確定Nrf2激活，將樣品在AREC32細胞（于96孔板中接種）中使用10個獨 立稀釋（1/2、1/4、1/6、1/10、1/15、1/20、1/25、1/30、1/40 和 1/50)測試且于 5% CO2/空氣 孵育箱中在37°C溫育24小時。使用熒光素酶和來自Promega的Cell Titer-Glo試劑盒確 定熒光素酶活性和細胞活力（ATP測量）。
[0081] 對于每次運行，用所有板中僅細胞的熒光素酶活性的平均值將所有孔的以相對光 單位（RLU)測量的熒光素酶活性標準化。在測試的所有樣品中，發(fā)現(xiàn)標準化程序不影響數(shù) 據(jù)，這種觀察允許不同運行中測量的樣品的比較。
[0082] 對于每個樣品，如下計算Nrf2激活：
[0083] l)Nrf2倍數(shù)誘導：
【權(quán)利要求】
1. 用于治療或預防肝臟病癥的包含4-氧代-2-戊烯酸的組合物，其中所述組合物不用 作藥劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1使用的組合物，其中所述肝臟病癥選自下組：肝炎；肝纖維化；膽 汁郁積性肝臟疾病；炎癥性肝損傷；生物異源物質(zhì)毒性，包括藥物-誘導的肝臟毒性和乙 醇-介導的肝臟毒性；肝性腦??；脂肪肝臟疾病；缺血再灌注肝損傷；肝衰竭；1型遺傳性酪 氨酸血癥；肝細胞癌，包括由肝炎、黃曲毒素和化學毒素誘導的那些；環(huán)境敏感性、藥物不 耐受性、慢性疲勞綜合征和纖維肌痛，歸因于過量負載的毒素進入I期且Π 期途徑低效；肝 臟的病理性解毒及其組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1使用的組合物，其中所述病癥與肝臟中的II期酶活性不足有關(guān)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1使用的組合物，其中所述II期酶選自下組：血紅素氧合酶1、NAD (P) Η脫氫酶醌1、谷胱甘肽還原酶、谷氨酸半胱氨酸連接酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、UDP-葡萄醛 酸基轉(zhuǎn)移酶及其組合。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中一項使用的組合物，其向肝臟中的I期酶的活性增加和/或肝 臟中的Π 期酶的活性減少的對象施用。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中一項使用的組合物，其向需要肝臟解毒的對象施用。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中一項使用的組合物，其向過重和/或患有2型糖尿病的對象施 用。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中一項使用的組合物，其中4-氧代-2-戊烯酸獲自天然來源。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中一項使用的組合物，其中4-氧代-2-戊烯酸可獲自短雙岐桿菌 CNCM 1-3865 或短雙岐桿菌 ATCC 15700。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9使用的組合物，其中所述短雙岐桿菌CNCM 1-3865或短雙岐桿菌 ATCC 15700在約60-180°C、優(yōu)選在約80-160°C進行熱處理。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中一項使用的組合物，其包含至少lmg/kg組合物、優(yōu)選至少 10mg/kg組合物、例如50mg至50g/kg組合物的量的4-氧代-2-戊烯酸。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中一項使用的組合物，其以對應于2 μ g至20mg4-氧代-2-戊 烯酸/kg體重、優(yōu)選20 μ g至2mg 4-氧代-2-戊烯酸/kg體重、例如40 μ g至lmg 4-氧 代-2-戊烯酸/kg體重的日劑量施用。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中一項使用的組合物，其口服或腸內(nèi)施用。
14. 根據(jù)前述權(quán)利要求中一項使用的組合物，其向人、寵物或家畜施用。
15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中一項使用的組合物，其中所述組合物選自下組：食品組合物、 食品添加劑、營養(yǎng)品、飲料、營養(yǎng)配方、管飼配方、在乳或水中重構(gòu)的粉狀組合物、和寵物食 品組合物。
【文檔編號】A61K35/00GK104244938SQ201380018462
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月30日
【發(fā)明者】維拉 F·J·阿爾塞, B·布爾其, T·比特勒, S·杜布克斯, F·法塔, P·A·蓋伊, N·帕日, S·A·D·萊茲 申請人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司