基質(zhì)干細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】基質(zhì)干細(xì)胞被預(yù)期地從人骨髓中分離,然后擴(kuò)大成克隆群,并培養(yǎng)和使用,分離基于細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá),其中細(xì)胞表面標(biāo)記物結(jié)合抗體,以及其中所述抗體與小鼠基質(zhì)干細(xì)胞或大鼠基質(zhì)干細(xì)胞上找到的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng),可選地還與選自小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞的至少一種其它哺乳動物品種細(xì)胞上找到的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng)。有用的基質(zhì)干細(xì)胞群對SDC2呈陽性。
【專利說明】基質(zhì)干細(xì)胞
[0001] 引言
[0002] 本發(fā)明涉及分離干細(xì)胞的方法,涉及由分離的細(xì)胞獲得的干細(xì)胞群和涉及那些細(xì) 胞群、由那些細(xì)胞群獲得的細(xì)胞和組織的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 在20世紀(jì)60-70年代,化iedenstein及其同事證明了成骨潛能-由骨髓炬M) 細(xì)胞的異位移植所掲示-與BM-單核細(xì)胞(MNCs)的次要亞群相關(guān)(在化iedenstein, 1990中綜述)。該些MNCs與造血MNC的區(qū)別在于它們快速附著到塑料組織培養(yǎng)容器上, W及它們的后代在培養(yǎng)時具有成纖維細(xì)胞樣外觀,暗示著來源于BM的基質(zhì)區(qū)室(stromal compartment)。在建立BM基質(zhì)源的同時,RriedensteiruOwen及其同事提供了第二個突 破,其表明將BM細(xì)胞息液W克隆密度接種會導(dǎo)致單個細(xì)胞產(chǎn)生分離集落(colony-化rming unit fibroblastic, C即-F(《成纖維細(xì)胞的集落形成單位,CFU-F》KRriedenstein等人, 1970])。
[0004] 化iedenstein和Owen后來將該種CFU-F形成細(xì)胞稱為基質(zhì)干細(xì)胞(SSC) (Owen和 化iedenstein,1988),此處提到的SSC基于該原始細(xì)胞定義。
[000引 BM衍生的SSC可在塑料粘附的(PA)、成纖維細(xì)胞的MNC的混合群體中被識別出, 所述MNC生成骨、脂肪或軟骨W及分泌有效的免疫調(diào)節(jié)和血管生成蛋白。臨床前研究表明, PA-SSC介導(dǎo)體內(nèi)有效的免疫調(diào)節(jié)和血管形成應(yīng)答。目前,臨床試驗(yàn)在40種不同的退行性、 自身免疫性和缺血性疾病中測試PA-SSC。
[0006] 在人骨髓中,每80, 000個MNC中大約有1個BM單核細(xì)胞(MNC)是形成SSC的 C即-F。到目前為止,從BM中分離該些SSC所使用的最簡單和頻繁的方法取決于之前提 到的對組織培養(yǎng)塑料制品的附著,據(jù)此,將MNC培養(yǎng)10-14天,在此期間,C即-F將W認(rèn)可 的1:80000的頻率附著和形成集落。在10-14天,通過膜蛋白酶消化收獲該些CFU-F,并W 3-8000CFU-F/cm 2的密度再接種于富血清培養(yǎng)基中。然后,在體外繁殖該些CFU-F,直至獲 得足夠的細(xì)胞數(shù)量W能夠進(jìn)行生物化學(xué)和細(xì)胞學(xué)評估。該種方法被廣泛使用,但是對于臨 床用途,被認(rèn)為是不足W定義或純化SSC的,因?yàn)閮H有1:80, 000接種的BMMNC是SSC,并且 該些方法不符合相關(guān)產(chǎn)品獲得臨床批準(zhǔn)所需要的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范。
[0007] 因此,現(xiàn)有技術(shù)已基于附著到塑料表面的初始能力來鑒別干細(xì)胞群。經(jīng)過該一初 始的篩選,從表面的單獨(dú)集落形成單位獲得作為克隆群體的細(xì)胞群。盡管該術(shù)語可能不準(zhǔn) 確,但該些在文獻(xiàn)中也已被標(biāo)記為"間充質(zhì)干細(xì)胞",因?yàn)榉情g充質(zhì)干細(xì)胞可包括在分離的 細(xì)胞內(nèi)。在已知的分離方法中,該些已知的細(xì)胞群衍生自對堿性磯酸酶(AL巧和CD271呈 陽性的干細(xì)胞。但是,在臨床方面,該細(xì)胞基本上未被鑒別。
[0008] 從該些已知的分離細(xì)胞制備(例如從單個分離細(xì)胞經(jīng)克隆擴(kuò)大)細(xì)胞群,并用于 移植。但是,結(jié)果是變化的,移植的細(xì)胞群在批次與批次之間有時表現(xiàn)得相當(dāng)不同,具有不 可預(yù)測的因素。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)的細(xì)胞群往往形成骨和脂肪及軟骨,但經(jīng)過有限的控制,在需要骨或軟 骨時,經(jīng)常形成脂肪。相反,例如,在優(yōu)選獲得形成脂肪的細(xì)胞時,卻僅僅不可靠地獲得該些 產(chǎn)生脂肪的細(xì)胞。
[0010] 一個重要的問題是,起始細(xì)胞群基本上是未被確定的,因?yàn)榛诟街芰系姆蛛x 不是對細(xì)胞類型的充分技術(shù)確定。例如,即使W提到的標(biāo)記物(ALP和CD271)用于選定時, 細(xì)胞或后代中那些標(biāo)記物的表達(dá)在培養(yǎng)時也會快速消失,留下效果上未確定的群體。細(xì)胞 的有用性質(zhì)還會隨著時間而減少或消失一未確定的細(xì)胞群的另一個問題。
[0011] 發(fā)明目的
[0012] 本發(fā)明的一個總目的是提供分離基質(zhì)干細(xì)胞和細(xì)胞群及由其獲得的組織的方法, 該方法至少是現(xiàn)有技術(shù)的一種替代;本發(fā)明特定實(shí)施方式的一個目的是提供改進(jìn)的方法, 例如通過增強(qiáng)所獲細(xì)胞的確定,或提供改進(jìn)的細(xì)胞或組織,例如通過增強(qiáng)其性質(zhì)的可靠性, 使它們更適合臨床應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0013] 本發(fā)明基于基質(zhì)干細(xì)胞特別是人基質(zhì)干細(xì)胞的預(yù)期分離,基于在多種哺乳動物中 表達(dá)的標(biāo)記物或抗原的表達(dá)。在本發(fā)明的方法和細(xì)胞群中,細(xì)胞基于特定的跨物種標(biāo)記物 的表達(dá)來進(jìn)行分選,該被稱為預(yù)期分離,然后培養(yǎng)獲得的細(xì)胞,留至細(xì)胞鑒別,即可克隆擴(kuò) 增的成纖維細(xì)胞的集落形成單位(CFU-Fs)D克隆擴(kuò)增后獲得的細(xì)胞群接著計(jì)劃用于治療、 移植和其它用途。
[0014] 因此,本發(fā)明提供了一種基于標(biāo)記物的表達(dá)來分離基質(zhì)干細(xì)胞的方法,包括從混 合的哺乳動物細(xì)胞群中分離一細(xì)胞的方法,其中,
[0015] 標(biāo)記物與抗體結(jié)合,W及其中,
[0016] 所述抗體與至少一種其它哺乳動物品種的細(xì)胞中找到的標(biāo)記物交叉反應(yīng),所述其 它哺乳動物品種的細(xì)胞選自人、小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。
[0017] 本發(fā)明提供了一種基于標(biāo)記物的表達(dá)來分離基質(zhì)干細(xì)胞的方法,包括從混合的哺 乳動物細(xì)胞群中分離細(xì)胞,其中,所述標(biāo)記物由哺乳動物細(xì)胞表達(dá),W及其中,相應(yīng)的標(biāo)記 物也在至少一種其它哺乳動物品種的細(xì)胞上表達(dá),所述至少一種其它哺乳動物品種的細(xì)胞 選自人、小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。
[0018] 優(yōu)選地,該標(biāo)記物在人基質(zhì)干細(xì)胞和小鼠基質(zhì)干細(xì)胞上找到,或在人基質(zhì)干細(xì)胞 和大鼠基質(zhì)干細(xì)胞上找到,或在所有H者上找到。在實(shí)施方式中,該標(biāo)記物為SDC2。
[0019] 更具體地,本發(fā)明提供了一種分離人基質(zhì)干細(xì)胞的方法,包括從人骨髓中分離細(xì) 胞,該細(xì)胞對CD45呈陰性,對另一細(xì)胞表面標(biāo)記物呈陽性,其中所述另一細(xì)胞表面標(biāo)記物 與抗體結(jié)合,W及其中所述抗體與至少一種其它哺乳動物品種細(xì)胞上找到的細(xì)胞表面標(biāo)記 物交叉反應(yīng),所述其它哺乳動物品種細(xì)胞選自小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。更具體地,本 發(fā)明提供了一種分離人基質(zhì)干細(xì)胞的方法,包括從人骨髓中分離細(xì)胞,該細(xì)胞對FAP a呈 陽性,對另一細(xì)胞表面標(biāo)記物呈陽性,其中所述另一細(xì)胞表面標(biāo)記物與抗體結(jié)合,W及其中 所述抗體與至少一種其它哺乳動物品種細(xì)胞上找到的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng),所述其它 哺乳動物品種細(xì)胞選自小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。
[0020] 優(yōu)選地,該另一標(biāo)記物在人基質(zhì)干細(xì)胞和小鼠基質(zhì)干細(xì)胞上找到,或在人基質(zhì)干 細(xì)胞和大鼠基質(zhì)干細(xì)胞上找到,或在所有H者上找到。在實(shí)施方式中,該另一標(biāo)記物為NG2, 或特別是SDC2。
[0021] 本發(fā)明還提供了獲得細(xì)胞群的方法,包括:根據(jù)本發(fā)明分離細(xì)胞,W及從那些分離 出的細(xì)胞獲得細(xì)胞群;本發(fā)明還提供了獲得克隆細(xì)胞群的方法,包括根據(jù)本發(fā)明分離單個 細(xì)胞,W及從單個細(xì)胞獲得克隆細(xì)胞群。
[0022] 本發(fā)明還提供由此獲得的細(xì)胞一因此,基質(zhì)細(xì)胞群,優(yōu)選基質(zhì)干細(xì)胞群,其關(guān)于 標(biāo)記物得到富集。富集可W是30%或W上、35%或W上,或40%或W上的細(xì)胞對于標(biāo)記物 呈陽性。在實(shí)施方式中,該標(biāo)記物是NG2,特別是SDC2。
[0023] 本發(fā)明特定的細(xì)胞群通過W下獲得;-
[0024] 提供人基質(zhì)干細(xì)胞;
[0025] 從所述人基質(zhì)干細(xì)胞獲得克隆細(xì)胞群,W及
[0026] 可選地,在培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)和/或擴(kuò)大和/或傳代細(xì)胞;
[0027] 其中,人基質(zhì)干細(xì)胞分離自骨髓,對CD45的表達(dá)呈陰性,對另一細(xì)胞表面標(biāo)記物 呈陽性,其中所述另一細(xì)胞表面標(biāo)記物與抗體結(jié)合,W及其中所述抗體與至少一種其它哺 乳動物品種細(xì)胞上找到的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng),所述其它哺乳動物品種細(xì)胞選自小 鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。
[0028] 本發(fā)明另一特定的細(xì)胞群通過W下獲得;-
[0029] 提供人基質(zhì)干細(xì)胞;
[0030] 從所述人基質(zhì)干細(xì)胞獲得克隆細(xì)胞群,W及
[0031] 可選地,對培養(yǎng)中的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)和/或擴(kuò)增和/或傳代;
[0032] 其中,人基質(zhì)干細(xì)胞分離自骨髓,對FAP a的表達(dá)呈陽性,對另一細(xì)胞表面標(biāo)記 物呈陽性,其中所述另一細(xì)胞表面標(biāo)記物與抗體結(jié)合,W及其中所述抗體與至少一種其它 哺乳動物品種細(xì)胞上找到的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng),所述其它哺乳動物品種細(xì)胞選自小 鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。
[0033] 本發(fā)明提供來自細(xì)胞的產(chǎn)品,例如骨、軟骨肌膊和其它基質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品,如在例如 試驗(yàn)中使用的細(xì)胞。
[0034] 本發(fā)明能夠基于特定標(biāo)記物的表達(dá)來鑒別所需基質(zhì)干細(xì)胞,提供預(yù)期純化和確定 的細(xì)胞和由其獲得的細(xì)胞群。
[00巧]發(fā)明細(xì)節(jié)
[0036] 因此,本發(fā)明提供了一種基于細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)來分離基質(zhì)干細(xì)胞的方法, 包括從混合的哺乳動物細(xì)胞群中分離細(xì)胞,其中,
[0037] 所述細(xì)胞表面標(biāo)記物與抗體結(jié)合,W及其中,
[0038] 所述抗體與至少一種其它哺乳動物品種細(xì)胞中找到的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng), 所述其它哺乳動物品種細(xì)胞選自人、小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。
[0039] 抗體可識別人細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記物并與至少一種其它哺乳動物品種細(xì)胞上 的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng),所述其它哺乳動物品種細(xì)胞選自小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì) 胞。使用時,該些方法適用于分離人、小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞,特別是人細(xì)胞。
[0040] 抗體可識別馬細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記物并與至少一種其它哺乳動物品種細(xì)胞上 的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng),所述其它哺乳動物品種細(xì)胞選自人、小鼠、大鼠、兔子和豬細(xì) 胞。使用時,該些方法適用于分離人、小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞,特別是馬細(xì)胞。
[0041] 類似地,本發(fā)明提供了一種基于細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)來分離基質(zhì)干細(xì)胞的方 法,包括從混合的哺乳動物細(xì)胞群中分離細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞表面標(biāo)記物由哺乳動物細(xì)胞 表達(dá),W及其中,相應(yīng)的細(xì)胞表面標(biāo)記物也在至少一種其它哺乳動物品種的細(xì)胞上表達(dá),所 述至少一種其它哺乳動物品種的細(xì)胞選自人、小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。
[0042] 該標(biāo)記物可表達(dá)在人細(xì)胞上,相應(yīng)的標(biāo)記物可在至少一種其它哺乳動物細(xì)胞上表 達(dá),所述其它哺乳動物細(xì)胞選自小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞,用于分離例如人細(xì)胞。抗體 可表達(dá)在馬細(xì)胞上,相應(yīng)的標(biāo)記物在至少一種其它哺乳動物細(xì)胞上表達(dá),所述其它哺乳動 物細(xì)胞選自人、小鼠、大鼠、兔子和豬細(xì)胞,用于分離例如馬細(xì)胞。如果抗體可基于與人細(xì)胞 上的標(biāo)記物結(jié)合來對人細(xì)胞進(jìn)行分選,并且相同的抗體可用W對另一哺乳動物品種細(xì)胞進(jìn) 行分選,該標(biāo)記物為相應(yīng)的標(biāo)記物。
[0043] 因此,本發(fā)明預(yù)期的基質(zhì)干細(xì)胞分離使用跨物種找到的標(biāo)記物,是指不同哺乳動 物品種中的標(biāo)記物與共同的抗體結(jié)合。在下面描述的特定實(shí)施方式中,人SDC2的抗體結(jié)合 到并可用W分離人基質(zhì)干細(xì)胞,還結(jié)合到并可用W分離小鼠、大鼠、馬和兔子中的基質(zhì)干細(xì) 胞。
[0044] 抗體可與至少H種哺乳動物品種、至少四種或至少五種品種的細(xì)胞上的標(biāo)記物結(jié) 合或交叉反應(yīng)。
[0045] 獨(dú)立地,本發(fā)明提供了一種獲得或衍生基質(zhì)干細(xì)胞群的方法,包括預(yù)期分離細(xì)胞, 其基于在人細(xì)胞和小鼠、大鼠、兔子、馬和豬中至少一種其它細(xì)胞中類似地表達(dá)的標(biāo)記物的 表達(dá),用于分離例如人基質(zhì)干細(xì)胞。
[0046] 在本發(fā)明的實(shí)施方式中,基質(zhì)干細(xì)胞根據(jù)標(biāo)記物的表達(dá)而分離,所述標(biāo)記物在至 少人和小鼠基質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá),在至少人和大鼠基質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)或在至少人、小鼠和大 鼠基質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)。因此,例如,SDC2的抗體可用W分離人、小鼠、兔子、馬和大鼠中的相 應(yīng)的基質(zhì)干細(xì)胞群。其它已知的NG2和FAP a抗體(細(xì)節(jié)在下面給出)可用W分離人、小 鼠和大鼠中的相應(yīng)基質(zhì)干細(xì)胞群。來自兩種或所有H種品種的相應(yīng)的基質(zhì)干細(xì)胞群及其衍 生物,因此可平行獲得,或用于比對,或在研究另一品種的基質(zhì)干細(xì)胞之前進(jìn)行一個品種的 基質(zhì)細(xì)胞分析。
[0047] 用于分離干細(xì)胞的起始細(xì)胞的不同來源是合適的。一種來源,混合的哺乳動物細(xì) 胞群,可W是骨髓、脂肪組織、骨骼肌、子宮內(nèi)膜、胎盤、廝帶、廝帶血和華頓氏膠質(zhì)。可W使 用人、小鼠、大鼠、兔子、馬和豬細(xì)胞的來源,在特定實(shí)施例中使用了人細(xì)胞。實(shí)施例中使用 的一種來源是骨髓,特別優(yōu)選的來源是人骨髓。另一來源是獲自人多能細(xì)胞的細(xì)胞,例如 SSC。在一個實(shí)施例中,使用了來自hES細(xì)胞的人SSC。
[0048] 在使用本發(fā)明時,可僅基于第一標(biāo)記物例如SDC2表達(dá)進(jìn)行初步分選。該種方法通 常也分離出不需要的細(xì)胞,意思是非基質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞,并可能是例如B細(xì)胞或T細(xì)胞。但 是,通過進(jìn)一步分離CFU,該些不需要的細(xì)胞可丟失,因?yàn)樗鼈儾恍纬杉洌虼?,該種水平 的分選可能是可接受的,因?yàn)閮H僅是所需的能夠形成CFU的基質(zhì)細(xì)胞將會產(chǎn)生集落群。
[0049] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中,細(xì)胞基于兩種獨(dú)立的標(biāo)記物的表達(dá)而分離。細(xì)胞的 組合選擇可W是對陽性/陽性細(xì)胞的選擇,該是指,如果細(xì)胞對于第一標(biāo)記物的表達(dá)呈陽 性并且對于第二標(biāo)記物的表達(dá)呈陽性,那么細(xì)胞被選出。選擇也可W是陽性/陰性、陰性/ 陽性或是陰性/陰性。
[0050] 本發(fā)明的組合方法,通常結(jié)合本文其它地方描述的任何方法的一種或多種或所有 特征,因此包括基于不同于第一細(xì)胞表面標(biāo)記物的另一細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)而分離細(xì) 胞。該可被稱為第二標(biāo)記物,盡管系統(tǒng)命名法僅表明標(biāo)記物相互之間的不同,沒有表明根據(jù) 那種標(biāo)記物選擇或分離的時機(jī)方面時間的不同?;跇?biāo)記物的選擇可W是W任一順序依次 進(jìn)行的,盡管通常在單次分選或分離中進(jìn)行(該可W是同時的),因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)能夠做到該 一點(diǎn)。
[0051] 一種合適的第二標(biāo)記物是CD45。合適地,選擇CD45陰性的細(xì)胞。另一合適的標(biāo)記 物是FAPa ;合適地,選擇FAP a陽性細(xì)胞。合適的第一細(xì)胞表面標(biāo)記物包括SDC2和NG2。
[0052] 在本發(fā)明的另一應(yīng)用中,初步分選基于CD45的表達(dá)進(jìn)行,選擇呈陰性的部分。一 種獨(dú)立的分選是基于第一標(biāo)記物例如SDC2的表達(dá)進(jìn)行的??蒞獲取陽性部分,或可W獲取 陰性部分。實(shí)踐中,分選通常同時進(jìn)行。細(xì)胞存活力在依次分選中會急劇減少。
[0053] 在本發(fā)明的一特定方法中,選擇對于第一標(biāo)記物呈陽性的細(xì)胞;該些方法適合用 于分離成骨細(xì)胞和血管形成細(xì)胞。
[0054] 在本發(fā)明的另一特定方法中,選擇對第一標(biāo)記物呈陰性的細(xì)胞;該些方法適合用 于分離成脂細(xì)胞。
[0055] 分離人基質(zhì)干細(xì)胞的一種特定方法包括從人骨髓中分離細(xì)胞,所述人骨髓對第 一標(biāo)記物呈陽性,并對CD45呈陰性,其中所述第一標(biāo)記物與抗體結(jié)合,W及其中所述抗體 與在至少一種其它哺乳動物品種細(xì)胞上找到的標(biāo)記物交叉反應(yīng),所述其它哺乳動物品種細(xì) 胞選自小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。第一標(biāo)記物優(yōu)選SDC2,分離米用一抗體,該抗體結(jié) 合SDC2,并與所有人、小鼠、大鼠、馬、兔子上的相應(yīng)標(biāo)記物交叉反應(yīng)。該第一標(biāo)記物可W是 NG2,分離采用一抗體,該抗體結(jié)合人NG2,并與一種或多種的小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞 上的相應(yīng)于NG2的標(biāo)記物交叉反應(yīng)。
[0056] 組合標(biāo)記物分選還可包括根據(jù)H種不同標(biāo)記物分選,例如基于第二標(biāo)記物分選, 然后基于兩種或W上第一標(biāo)記物分選。通過NG2的分選可用于細(xì)分SDC2+V6群。
[0057] 本發(fā)明具體分離的基質(zhì)干細(xì)胞是;-
[0058] (i) CD45 - ve, SDC^ve
[0059] (ii)CD45-ve, SDC2 - ve
[0060] (iii) CD45 - ve, SDC化ve, NG化ve
[0061] (iv) CD45 - ve, SDC化ve, NG2_ve
[0062] (V) FAP a +ve, SDC2+VG
[0063] (v;L) FAP a +ve, SDC2 - ve
[0064] (vii) FAP a +ve, SDC2+ve, NG化ve
[0065] (viii)FAP a +ve, SDC2+ve, NG2-ve
[0066] 從分離出的細(xì)胞可獲得細(xì)胞培養(yǎng)物和細(xì)胞群。該可通過克隆擴(kuò)增分離的細(xì)胞(例 如至少開始時CD45陰性和SDC2陽性的細(xì)胞,或CD45陰性和SDC2陰性的細(xì)胞),然后繼續(xù) 增長或培養(yǎng)獲得的細(xì)胞來得到。注意,通過該種繼續(xù)的增長和培養(yǎng)W及傳代獲得的細(xì)胞開 始時傾向于表現(xiàn)出與原始分離的細(xì)胞或多細(xì)胞相同的標(biāo)記物譜。隨時間推移,表達(dá)模式可 改變。但是,所得細(xì)胞群的性質(zhì)與初始分離的標(biāo)準(zhǔn)(例如,至少開始時CD45陰性和SDC2陽 性的細(xì)胞,或CD45陰性和SDC2陰性的細(xì)胞)相關(guān)。
[0067] 通過測量用來分離的標(biāo)記物或抗原的表達(dá),通常可從已分離的細(xì)胞獲得一致性高 的細(xì)胞培養(yǎng)物和群體。因此,本發(fā)明還提供了高水平表達(dá)第一細(xì)胞表面標(biāo)記物的哺乳動物 基質(zhì)細(xì)胞群。表達(dá)第一標(biāo)記物的細(xì)胞的%可W是50%或W上、60%或W上、70%或W上、 75%或W上、80%或W上、或者90%或W上。在下面詳細(xì)描述的本發(fā)明一個【具體實(shí)施方式】 中,初始細(xì)胞群W95%或W上的水平表達(dá)第一標(biāo)記物。提到細(xì)胞是陽性的,是指在細(xì)胞表面 處或在細(xì)胞表面上測量,例如使用該標(biāo)記物的帶標(biāo)簽抗體可檢測到。
[006引還可由W上獲得細(xì)胞群,例如通過培養(yǎng)和/或傳代,該樣做的時候,保持表達(dá)第一 標(biāo)記物的細(xì)胞的比例可能降低,但是,仍然比非基于該標(biāo)記物選擇出的群體要高。因此,本 發(fā)明還提供了表達(dá)高水平的第一細(xì)胞標(biāo)記物的另一哺乳動物細(xì)胞群。表達(dá)第一標(biāo)記物的細(xì) 胞的%可W是30%或W上、40%或W上、50%或W上或者在上面提到的該些水平上。本發(fā)明 的細(xì)胞群具有特定的純度并且是確定的。細(xì)胞可基于標(biāo)記物的表達(dá)鑒別/選擇出來,如果 獲得足夠純度的細(xì)胞群的話,即時使用不需要培養(yǎng)W確定。
[0069] 在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中,標(biāo)記物為NG2,特別是SDC2。
[0070] 因此提供了哺乳動物基質(zhì)干細(xì)胞群,其中75%或W上的細(xì)胞對細(xì)胞表面標(biāo)記物呈 陽性,W及其中相應(yīng)的細(xì)胞表面標(biāo)記物也表達(dá)在選自人、小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞中的 至少一種其它哺乳動物品種細(xì)胞上。該標(biāo)記物合適地表達(dá)在人細(xì)胞上,而相應(yīng)的標(biāo)記物表 達(dá)在小鼠細(xì)胞上,可選地還表達(dá)在選自大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞的至少一種其它哺乳動物細(xì) 胞上。該標(biāo)記物合適地表達(dá)在人細(xì)胞上,而相應(yīng)的標(biāo)記物表達(dá)在大鼠細(xì)胞上,可選地還表達(dá) 在選自小鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞的至少一種其它哺乳動物細(xì)胞上。在另一示例性基質(zhì)干細(xì) 胞群中,75%或W上的細(xì)胞是SDC2陽性的,并且該些細(xì)胞是成骨細(xì)胞。此外,細(xì)胞的特征 還可額外地在于第二標(biāo)記物的表達(dá)水平。表達(dá)第二標(biāo)記物的細(xì)胞的%可^是50%或W上、 60%或W上、70%或W上、75%或W上、80%或W上、或者90%或W上。在下面詳細(xì)描述的本 發(fā)明一個【具體實(shí)施方式】中,初始細(xì)胞群中95%或W上的細(xì)胞對第二標(biāo)記物呈陽性。細(xì)胞可 獨(dú)立地對第二標(biāo)記物呈陰性。不表達(dá)第二標(biāo)記物的細(xì)胞的%可^是50%或W上、60%或W 上、70%或W上、75%或W上、80%或W上,或者90%或W上。在下面詳細(xì)描述的本發(fā)明一個
【具體實(shí)施方式】中,初始細(xì)胞群中95%或W上的細(xì)胞對第二標(biāo)記物呈陰性。在一個示例性的 成骨和血管形成基質(zhì)干細(xì)胞群中,75%或W上的細(xì)胞是SDC2陽性的,75%或W上的細(xì)胞是 CD45陰性的。
[0071] 本發(fā)明還提供了表達(dá)低水平的第一標(biāo)記物的細(xì)胞群。不表達(dá)第一標(biāo)記物的細(xì)胞 的%可W是50%或W上、60%或W上、70%或W上、75%或W上、80%或W上,或者90%或 W上。在下面詳細(xì)描述的本發(fā)明一個【具體實(shí)施方式】中,初始細(xì)胞群W 5%或W下的水平表達(dá) 第一標(biāo)記物,或被視為對第一標(biāo)記物呈陰性。在一個示例性基質(zhì)干細(xì)胞群中,75%或W上的 細(xì)胞是SDC2陰性的,并且該些細(xì)胞是血管形成細(xì)胞。此外,細(xì)胞的特征還可額外地在于第 二標(biāo)記物的表達(dá)水平。表達(dá)第二標(biāo)記物的細(xì)胞的%可W是50%或W上、60%或W上、70% 或W上、75%或W上、80%或W上、或者90%或W上。細(xì)胞可獨(dú)立地對第二標(biāo)記物呈陰性。 不表達(dá)第二標(biāo)記物的細(xì)胞的%可W是50%或W上、60%或W上、70%或W上、75%或W上、 80%或W上,或者90%或W上。在下面詳細(xì)描述的本發(fā)明一個【具體實(shí)施方式】中,初始細(xì)胞群 中95%或W上的細(xì)胞對第二標(biāo)記物呈陰性。在一個示例性的成骨基質(zhì)干細(xì)胞群中,75%或 W上的細(xì)胞是SDC2陰性的,75%或W上的細(xì)胞是CD45陰性的。
[0072] 因此,本發(fā)明還提供了獲得細(xì)胞群的方法,包括;根據(jù)描述的方法分離細(xì)胞,W及 從那些分離出的細(xì)胞獲得細(xì)胞群;本發(fā)明進(jìn)一步提供了獲得克隆細(xì)胞群的方法,包括根據(jù) 描述的方法分離單個細(xì)胞,W及從單個細(xì)胞獲得克隆細(xì)胞群。一般而言,培養(yǎng)包括獲得初始 細(xì)胞群,然后使培養(yǎng)中的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步生長和/或擴(kuò)增和/或傳代。SDC2是下面描述的 特定實(shí)施例中的特征標(biāo)記物。
[0073] 已獲得下面具體實(shí)施例中描述的細(xì)胞群并發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出有用的性質(zhì)。因此,本發(fā)明 還提供了可根據(jù)描述和要求保護(hù)的方法獲得的細(xì)胞群。細(xì)胞群優(yōu)選人、馬、兔子、小鼠和/ 或大鼠細(xì)胞。
[0074] -個【具體實(shí)施方式】的細(xì)胞群可通過W下獲得;-[00巧]提供人基質(zhì)干細(xì)胞;
[0076] 從所述人基質(zhì)干細(xì)胞獲得克隆細(xì)胞群,W及
[0077] 可選地,使培養(yǎng)中的細(xì)胞進(jìn)一步生長和/或擴(kuò)增和/或傳代;
[0078] 其中,人基質(zhì)干細(xì)胞分離自骨髓,對CD45的表達(dá)呈陰性,對另一細(xì)胞表面標(biāo)記物 的表達(dá)呈陽性,其中所述另一細(xì)胞表面標(biāo)記物與抗體結(jié)合,W及其中所述抗體與至少一種 其它哺乳動物品種細(xì)胞上找到的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng),所述其它哺乳動物品種細(xì)胞選 自小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。
[0079] 本發(fā)明提供了組織,其通過描述的方法獲得細(xì)胞,W及由其獲得組織。選自骨、軟 骨和肌膊的組織可WW該種方式獲得。也可W獲得用于重建手術(shù)的脂肪組織或組織。
[0080] 本發(fā)明的另一用途在于為使用經(jīng)分離的細(xì)胞及其后代進(jìn)行的試驗(yàn)提供細(xì)胞。因 此,一種實(shí)施試驗(yàn)的方法包括;根據(jù)描述的方法獲得細(xì)胞,W及在試驗(yàn)中使用那些細(xì)胞。
[0081] 如所提到的,現(xiàn)有技術(shù)細(xì)胞群往往形成骨和脂肪及軟骨,經(jīng)過有限的控制,從而有 時在需要骨或軟骨時形成脂肪。可制備本發(fā)明往往不形成脂肪的細(xì)胞群。該是一個優(yōu)勢。 可制備本發(fā)明的獨(dú)立細(xì)胞群,其確實(shí)傾向于形成脂肪。因此,基于特定的細(xì)胞標(biāo)記物選擇標(biāo) 準(zhǔn),可向使用者提供增強(qiáng)的控制和可預(yù)測性的細(xì)胞性質(zhì)。
[0082] 本發(fā)明特定細(xì)胞群的優(yōu)點(diǎn)可用另一種方式表達(dá),即對CD45陰性、SDC2陽性的細(xì) 胞,它們往往有較高的頻率是成骨、骨生成和軟骨產(chǎn)生細(xì)胞群。現(xiàn)有技術(shù)獲得骨和軟骨的混 合結(jié)果和低再現(xiàn)性的難點(diǎn)可因此得到解決?,F(xiàn)在可獲得的具體細(xì)胞群可具有其它優(yōu)點(diǎn);例 女口,SDC2陽性群表現(xiàn)出更能促血管生成,包括鄰接細(xì)胞形成血管。該在治療疾病中是有利 的,所述疾病將獲益于改進(jìn)的血管,例如缺血性疾病。
[0083] 此外,SDC2陽性群在特定的本發(fā)明方法中通過參考在細(xì)胞和后代中持續(xù)的標(biāo)記 物,獲自比現(xiàn)有技術(shù)更高度確定的起始細(xì)胞。該本身就是一個優(yōu)勢。細(xì)胞群是一個可接受 的確定的群體。
[0084] 本發(fā)明的另一個潛在優(yōu)點(diǎn)是,用于初始細(xì)胞群預(yù)期分離的標(biāo)記物也可用于其它品 種細(xì)胞群的預(yù)期分離。因此,在一個【具體實(shí)施方式】中,SDC2在所有人、小鼠、大鼠、馬、兔子 上是共用的。因此,可W分離例如小鼠細(xì)胞中的相應(yīng)細(xì)胞群,然后從小鼠細(xì)胞上的工作推斷 到在人細(xì)胞上的工作??墒褂眯∈笾忻鞔_的群體來獲得數(shù)據(jù),然后所述數(shù)據(jù)可在另一品種 相應(yīng)的明確群體,特別是人細(xì)胞中進(jìn)一步獲取?,F(xiàn)有技術(shù)間充質(zhì)干細(xì)胞群(即采用已知的 預(yù)期分離獲得的那些)的一個問題是,用于分離如小鼠細(xì)胞的標(biāo)記物不具有相應(yīng)的在人細(xì) 胞中表達(dá)的形式。本發(fā)明可因此提供具有跨物種(例如小鼠和人,或小鼠和馬等)平行群 體的確定細(xì)胞群。該有助于臨床前和臨床工作,因?yàn)樽畛踉谝环N品種細(xì)胞上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)所 獲得的知識可轉(zhuǎn)移到在其它品種中相應(yīng)確定的細(xì)胞群上的后期工作。
[0085] 本發(fā)明的細(xì)胞和組織,W及包含細(xì)胞和組織的組合物,可用于治療各種哺乳動物 的狀況和疾病,包括特別是可用獲自現(xiàn)有SSC產(chǎn)品的細(xì)胞和產(chǎn)品治療的那些。該細(xì)胞和 組織可與樹突狀細(xì)胞相互作用,并驅(qū)動IFN-目分泌,因此可用做腫瘤抑制劑。一般的癌 癥可用本發(fā)明治療,特別包括肝癌、宮頸癌、膜腺癌、前列腺癌、纖維肉瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤 (me化11油Iastoma)和星形細(xì)胞瘤??芍委煼渭膊。毙苑螕p傷(ALI);急性呼吸窘迫 綜合癥(ARD巧;慢性阻塞性肺病(COPD);特發(fā)性肺纖維化(IPF)。該細(xì)胞和組織可用W治 療敗血癥和敗血癥引起的多器官衰竭、骨髓移植炬MT)或造血干細(xì)胞化SC)排斥;實(shí)體器官 移植(SOT)排斥(包括肝、腎、皮膚、角膜、也臟、肺);急性毒素誘導(dǎo)的肝衰竭;自身免疫性 肝炎;原發(fā)性膽汁性肝硬化任BC)和原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC);骨壞死;退行性椎間盤病 變;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;糖尿病患者中的骨關(guān)節(jié)炎和骨延遲愈合;自身免疫性腎炎,包括韋格納 氏肉芽腫(WG);燒傷、嚴(yán)重灼傷;肌肉萎縮狀況和萎縮性綜合癥包括肌肉減少癥;惡病質(zhì)和 其它肌肉萎縮狀況,包括肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne和Becker);充血性也臟衰竭、急性也肌 梗塞和中風(fēng);1型糖尿病;2型糖尿?。惶悄虿⌒砸暰W(wǎng)膜病和其它視網(wǎng)膜病變;糖尿病性腎 病和其它腎??;糖尿病性神經(jīng)病和其它神經(jīng)病;不愈合糖尿病性潰瘍;糖尿病性也肌病和 其它肌??;動脈粥樣硬化;外周動脈疾病和嚴(yán)重肢體缺血;葡萄膜炎;(濕或干)急性黃斑 變性(AMD);視網(wǎng)膜和角膜損傷;自身免疫性狀況例如自身免疫性胃炎(AIG);移植物抗宿 主病佑V皿);多發(fā)性硬化和脫髓銷疾?。患谞钕偌膊?;炎癥性腸病包括克羅恩病、潰瘍性結(jié) 腸炎和化瘦(fistulising)克羅恩??;硬皮病;狼瘡(SLE);格雷夫斯氏??;和自身免疫性淋 己增生性疾?。ˋLP巧。
[0086] 該細(xì)胞和組織還可用W治療具體的各種馬的狀況,包括蹄葉炎、肌膊損傷和運(yùn)動 引起的肺出血巧IPH)-也稱為"出血"或"出血發(fā)作化Ieeding attack)"。
[0087] 本發(fā)明還提供了用于治療動物,特別是哺乳動物例如人或馬的疾病或狀況的藥物 組合物。該藥物組合物合適地包含有效量的本發(fā)明的細(xì)胞或組織W治療動物中的疾病或狀 況。因此,細(xì)胞可W與可接受的藥物載體一起給藥。例如,在藥學(xué)上可接受的液體介質(zhì)中息 液細(xì)胞來注射細(xì)胞。液體介質(zhì)的實(shí)例是鹽水、磯酸鹽緩沖液,可選地還包含額外的材料例如 二甲基亞諷(DMSO)和人血清白蛋白。該細(xì)胞和組織通常可WW多種形式給藥,所述形式為 已知的用于現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞和類似產(chǎn)品和由其獲得的組織的形式。它們可系統(tǒng)地給藥, 例如通過靜脈滴注或直接注射。組合物可包含基質(zhì)或支架,或細(xì)胞或組織,可通過注射到已 原位包含基質(zhì)或支架的位點(diǎn)來給藥。因此,該細(xì)胞或組織可與透明質(zhì)酸、膠原或其它細(xì)胞 外基質(zhì)聯(lián)合給藥。比照本發(fā)明細(xì)胞和組織,在現(xiàn)有技術(shù)例如W02001080865、EP2545928和 W01999061587中可發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步的配制和給藥實(shí)施例。本發(fā)明提供了一種治療動物的方法, 包括給予動物本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的細(xì)胞或組織提供用于治療動物疾病或奈亂。方法 和用途的實(shí)施方式包括如本文描述的本發(fā)明通常的實(shí)施方式。
[0088] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于識別的標(biāo)記物獲得合適的抗體用于進(jìn)行分選和分 離。人 NG2/MCSP 抗體可獲自 R&D 系統(tǒng)公司(614McKinley Place 肥,Minneapolis, MN 55413, USA),作為單克隆小鼠IgGl克隆#7. 1,目錄編號;MAB25851。NG2佑-20)抗體獲自: Santa Cruz Biotechnology, Inc. (2145Delaware Avenue, Santa Cruz, California, 5060, U SA),ref: SC-30923,與小鼠、大鼠、人、馬、犬、牛和豬反應(yīng);也可獲得封閉膚SC-30923P。人成 纖維細(xì)胞活化蛋白a/FAP抗體,目錄編號;AF3715,獲自R&DSystems,Inc.。FAPa(Y-16) 抗體獲自Santa化UZ Biotechnology, Inc.,與至少人、大鼠和小鼠反應(yīng),且還與馬、犬、牛、 豬和禽反應(yīng)??钩衫w維細(xì)胞活化蛋白,Ct抗體,油28243,獲自Abcam(330Cambridge Science Park, Cambridge, CBAOFL, UK),與至少小鼠、大鼠和人反應(yīng)。Syndecan 2 抗體,orbl3481,其 與至少人、小鼠和大鼠反應(yīng),獲自 Biorb5ft Ltd. (12化mbroke Avenue, Denny Industrial C entre, Waterbeach, Cambridge, CB259QR, UK)。特定實(shí)施例中使用的SDC2抗體,目錄編號: 歴829651((:1〇116 305507)獲自1?&0 573161113,111(3,與人、小鼠、大鼠、馬、兔子和豬反應(yīng)。
[0089] SDC2也稱為成纖維聚糖(Fibroglycan),現(xiàn)在是CD362,原始的生物化學(xué)特征在于 作為肺中表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白之一,包含主要硫酸己醜肝素化巧粘多糖(GAG)。SDC2是該 種脊椎動物單跨膜家族的四個成員之一。此處提到的"S2 "和"SDC2"是指SDC2。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0090] 現(xiàn)在參考所附附圖在具體的實(shí)施方式中描述本發(fā)明,其中:
[0091] 圖1顯示人基質(zhì)干細(xì)胞而非人肺成纖維細(xì)胞的抗SDC2抗體進(jìn)行的標(biāo)記。綠線 表示抗SDC2-APC的細(xì)胞染色。紅線表示用合適的對照抗體(大鼠IgG2B異型對照-APC ; R&D#IC013A ;Clone - 141945)進(jìn)行標(biāo)記。藍(lán)線表示用抗-PDGFRa-APC抗體進(jìn)行的陽性對照 標(biāo)記(R&D Systems#FAB1264A ;Clone-PRa292);
[009引圖2顯示了用CD27lb心h7DC45i"人骨髓單核細(xì)胞的SDC2-APC進(jìn)行的標(biāo)記。數(shù)據(jù) 顯示了用上面提到的SDC2-APCXD271-陽和CD45-門TC(均來自BD)染色的3. 5X107BMMNC 的英光激活細(xì)胞分選(FAC巧圖。CD45-FITC染色能夠?qū)MMNC分成3個群,(A)CD45-ve-藍(lán) 色炬)CD4510W-澄色,和(C)CD45hi曲-綠色。在炬)中,罕見TP SDC+ve/CD27化ri曲t/ CD4510W細(xì)胞是藍(lán)色的;
[009引 圖3顯示了 SDC+/CD27lb心hYDC45i"分選的骨髓單核細(xì)胞中C即-F的增強(qiáng)富集。 數(shù)據(jù)顯示了用上面提到的SDC2-APCXD271-陽和CD45-門TC(均來自抓)染色的107BMMNC 的英光激活細(xì)胞分選(FACS)圖。
[0094] 圖4顯示了 96孔板中沒有克隆形成的孔的百分比,作為SDC+/CD27lWshYDC45-單 核細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞的函數(shù);
[0095] 圖5顯示了克隆的群體倍增數(shù)目;
[0096] 圖6顯示了 SDC化基質(zhì)干細(xì)胞在2%和19%氧壓下的體外GAG沉積。顯示了獲自 微團(tuán)顆粒的SDC2+SSC代表性番紅-0染色的組織切片;
[0097] 圖7顯示了 SDC化和SDC2-(分別標(biāo)記為S化和S2-)基質(zhì)干細(xì)胞的體外脂肪沉 積;
[0098] 圖8顯示了 SDC化和SDC2-基質(zhì)干細(xì)胞響應(yīng)體外成骨細(xì)胞刺激的巧沉積;
[0099] 圖9顯示了 SDC化和SDC2-基質(zhì)干細(xì)胞響應(yīng)體外軟骨形成刺激的GAG沉積;
[0100] 圖10顯示了 SDC化和SDC2-基質(zhì)干細(xì)胞響應(yīng)體外血管形成刺激的相關(guān)HUVEC索 形成(relative HUVEC cord formation);
[0101] 圖11顯示了罕見CD45-/SDC+人骨髓單核細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物CD271、 CD146 和 NG2 ;
[0102] 圖12顯示了分離自兔骨髓的基質(zhì)干細(xì)胞的SDC2表達(dá);
[0103] 圖13顯示了獲自馬骨髓的基質(zhì)干細(xì)胞中的SDC2在細(xì)胞覆蓋(upon confluence) 時的不斷增加水平,W及獲自豬骨髓的基質(zhì)干細(xì)胞在低氧壓中表達(dá)SDC2 ;
[0104] 圖14顯示了獲自H種兔骨髓的基質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞覆蓋時的SDC2的不斷增加水 平;
[0105] 圖15顯示了對SDC2和Seal共染色的CD45單核細(xì)胞的FACS分離;W及
[0106] 圖16顯示了 SDC+/Scal選擇的小鼠單核細(xì)胞中CFU-F的增強(qiáng)富集。
【具體實(shí)施方式】
[0107] 我們使用人SDC2的大鼠IgG2B單克隆抗體,其與別藻藍(lán)蛋白(APC)英光染料 (R&DSystems number FAB2965A ;clone 30551巧結(jié)合,W指不相對于對照人胎兒肺成纖維 細(xì)胞系MRC5, SDC2蛋白的表達(dá)在人SSC的細(xì)胞表面上是否強(qiáng)化了。在SSC生長培養(yǎng)基中 (aMEM/10% PAA FSC ;NUNC T175瓶)培養(yǎng)的MRC5肺成纖維細(xì)胞不表達(dá)SDC2 (圖1)。作為 對照,我們顯示了 MRC5成纖維細(xì)胞確實(shí)表達(dá)了 PDGFRa標(biāo)記物(CDHOa-APC)。該些數(shù)據(jù)表 明,與對照肺成纖維細(xì)胞相比,SDC2蛋白的表達(dá)在人SSC的表面上富集(圖1)。
[0108] 當(dāng)前,現(xiàn)有技術(shù)基于抗體純化來自BM的SSC由使用抗CD271 (LNGFR)和抗CD45抗 體的組合構(gòu)成,該被University of Leeds (利茲大學(xué))報(bào)道值rs. McGonagle和Jones)。 該種CD4510W/CD27化ri曲t細(xì)胞的分離已被證明能夠捕獲所有CFU-F(SSC)。
[0109] 但是,CD271 "bri曲t"細(xì)胞的定義難W在實(shí)驗(yàn)室之間標(biāo)準(zhǔn)化。為研究該種抗 SDC2抗體是否與CD451ow/CD27化ri曲t BMMNC共染色,Dr Ruth Morrell從高威大學(xué)醫(yī)院 (Galway化iversity Hospital) (GUH)的臨床研究機(jī)構(gòu)(CRF)處的捐獻(xiàn)者CRFG#0007中抽 吸出30ml人BM。
[0110] BMMNC巧XlO8)通過Ficoll離也法分離、在PBS中清洗、重息于MACS緩沖液中并用 人尸081〇。1^(]\111161171,碰)封閉。8匪肥(4義10 7)用抗50〔2-4口(:巧&0)、抗〔0271斗6炬0)、抗 CD45-門TC 炬D)和 Sytox/DAPI 存活染料染色。細(xì)胞在 NUI Galway 的 Becton Dickinson AriaII上通過FACS進(jìn)行分析。
[01U] 圖2表明了來自SDC2/CD271/CD45H重染色的流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)的代表性的直方圖 /散點(diǎn)圖。圖2B表明了表達(dá)低/中水平CD45標(biāo)記物的BMMNC(澄色)。與其它報(bào)道一致, 我們發(fā)現(xiàn),在CD4510W群體(圖2B)中找到CD271陽性的細(xì)胞,并且在該些實(shí)驗(yàn)中,我們注 意到,抗SDC2-APC抗體標(biāo)記了 CD4510W/CD271陽性的細(xì)胞。特別是,抗SDC2-APC抗體標(biāo)記 了 CD451ow/CD27化ri曲t BMMNCs。SDC2+/CD451ow/CD271+H重陽性(T巧群體在 BMMNCs 內(nèi)罕見,頻率范圍為1:16, 000-1:23, 000。
[0112] 圖3顯示,與天然預(yù)分選的BMMNC相比,SDC化/CD271+/CD45-MNC部分包含多3000 倍的CFU-F/SSC。相反,CD271+群體的SDC2陰性部分沒有保留大量的CFU-F/SSC。
[0113] 進(jìn)行單細(xì)胞FACS分選實(shí)驗(yàn)W列出SDC2+/CD271+群體內(nèi)克隆形成細(xì)胞的數(shù)量。單 一 SDC2+/CD271+/CD45-MNC在96孔板中W 1、3和20個細(xì)胞/孔進(jìn)行分選。有限稀釋分析 掲示,1個細(xì)胞/孔,每塊96孔板形成16-17個克?。▓D4)。所有16個克隆都是增殖性的, 并能夠經(jīng)歷15-20次群體倍增(圖5)。值得注意的是,選擇出的SDC化克隆能夠?qū)w外微 團(tuán)培養(yǎng)作出反應(yīng),經(jīng)歷顯著的軟骨形成。當(dāng)在低(2%)氧壓下培養(yǎng)時,所有五種克隆表現(xiàn)出 增強(qiáng)的粘多糖(GAG)沉積(圖6)。
[0114] 當(dāng)與預(yù)分選的(親本)SSC相比時,F(xiàn)ACS分選并培養(yǎng)擴(kuò)增的SDC2+SSC對體外刺激 作出反應(yīng),表現(xiàn)出顯著的脂肪沉積減弱,所述體外刺激是用強(qiáng)效的成脂培養(yǎng)基進(jìn)行14天的 分化方案(圖7),如用油紅0染色、提取和量化所見。相反,與SDC2-SSC和預(yù)分選SSC相 比,用成骨培養(yǎng)基進(jìn)行14天的誘導(dǎo),分別通過巧提取和茜素紅S染色測定,SDC2+SSC引起 的巧沉積增強(qiáng),基質(zhì)礦化增強(qiáng)(圖8)。值得注意的是,當(dāng)接受軟骨細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)時,沒有觀 察到H種SSC群之間有差異(圖9)。
[0115] 人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)可在接種到富營養(yǎng)基質(zhì)膠上2化內(nèi)形成血管索狀小管。 SDC2+SSC W 1:1的比率與HUVEC在基質(zhì)膠上的共培養(yǎng)在2化,穩(wěn)定的血管小管數(shù)目增加3 倍(圖10)。
[0116] 最后,人SDC2+/CD45-MNC還表達(dá)關(guān)鍵基質(zhì)標(biāo)記物,包括CD146、NG2(CSPG4)和 CD27U 圖 11)。
[0117] 圖12代表獲自山羊的BM和脂肪MNC和兔子的BM組織的SSC的流式細(xì)胞儀直方 圖。雖然SDC2標(biāo)記物似乎不可在山羊SSC上檢測到,但是,在兔子SSC上可檢測到顯著水 平的SDC2蛋白(圖12)。
[0118] 在對細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)作出反應(yīng)的培養(yǎng)的馬SSC中,增強(qiáng)檢測到SDC2蛋白增強(qiáng)了(圖 13)。當(dāng)在低氧壓中培養(yǎng)時,SDC2蛋白也可在豬SSC的亞群中檢測到(圖13)。
[0119] SDC2標(biāo)記物表達(dá)在大鼠SSC表面(圖14)。如在馬SSC中所見,SDC2蛋白在大鼠 SSC表面增加,作為對細(xì)胞覆蓋作出的反應(yīng)。該種模式可W在獲自大鼠的H種通常使用的實(shí) 驗(yàn)室品種(即,Dark Agouti、Sprague Dawley和Lewis)的骨髓的SSC中見到(圖14)。 陽120] 連施例
[0121] 連施例1. 1-骨髓袖吸物的分離
[012引人骨髓樣品按照患者的同意書獲自健康志愿者(n = 3)的后骼晴。病人按照抓 Tissue Directive (《歐洲組織指令》)2006/17/EC的要求對HIV I和II、舶P A/C、皿sAg、 抗皿核、梅毒和CMV進(jìn)行病毒學(xué)檢測。在BSC中,樣品匯集并分成7. 5ml的等份,進(jìn)行密度 梯度貿(mào)心。 陽12引 連施例1. 2-通巧密麼梯麼離也巧icoll)分離巧擴(kuò)譜人SSC [0124] 在生物安全柜中,用無菌技術(shù)將7. 5ml的Ficoll移入50ml離也管中。為除去血 塊,通過100微米級細(xì)胞篩炬D Falcon)過濾30ml的BM到50ml的離也管中。經(jīng)過濾的 骨髓按1/1稀釋在D-PBS中,然后在包含F(xiàn)icoll的4支管之間均分,緩慢地將BM移到W 35° -45°角度放置的管側(cè),W保證BM緩慢釋放,不干擾Ficoll或產(chǎn)生泡沫。然后,將管 在900g下離也22分鐘,離也制動設(shè)為零W形成分級樣品。離也后,管內(nèi)容物形成H層;血 漿頂層,一薄層-淡黃色外層-包含MNCiFicoll的清澈層和包含血紅細(xì)胞組分-紅細(xì)胞和 粒細(xì)胞的底層。小也地將淡黃色外層抽吸出,不要干擾周圍的細(xì)胞。然后將該些細(xì)胞轉(zhuǎn)移 到另一 50血離也管,并重息于45ml的D-PBS。然后讓該些管在350g離也lOmin。吸取上 清液并將團(tuán)(pellet)重息于5mL完全培養(yǎng)基中。然后讓該些在350g離也lOmin。吸取上 清液并將團(tuán)匯集在5mL D-PBS中。 陽1巧]連施例1. 3-CFU-F平板接種
[0126] 通過直接接種或Ficoll分離單核細(xì)胞后,從兩組細(xì)胞中分離出9X106個細(xì)胞,并 W 3X106MNC/板的接種密度接種在IOcm碟中,做H個重復(fù)。在上面列出的培養(yǎng)細(xì)胞的同 時,清洗和飼喂該些細(xì)胞。 陽127] 連施例1. 4-結(jié)晶紫CFU-F染朽
[0128] 在12-14天,將細(xì)胞固定并染色用于CFU-F分析。從平板中吸取培養(yǎng)基,并將平板 在D-PBS中清洗H次,W除去余下的培養(yǎng)基。將膽存于-2(TC的SmL 95%甲醇移到細(xì)胞上 IOmin并輕輕地轉(zhuǎn)動,固定細(xì)胞。從平板中吸取甲醇,用D-PBS清洗細(xì)胞一次。然后將8ml 的結(jié)晶紫(0.5%結(jié)晶紫,99. 5%甲醇)加到平板中,輕輕轉(zhuǎn)動平板。將平板放置10-15min。 吸取過量的結(jié)晶紫,用D-PBS清洗H次W除去殘余的過量染料。然后倒轉(zhuǎn)平板,放置干燥過 夜。然后將干燥平板用平板掃描儀成像。然后計(jì)算集落,在倒置顯微鏡(Olympus CKx41) 下通過肉眼檢查來表征。包含多于50+集群的集落,視為CFU。 陽12引 連施例2-單核細(xì)胸巧某質(zhì)干細(xì)胸的杭體分析
[0130] 表1顯示了用W表示實(shí)施例1產(chǎn)生的單核細(xì)胞和基質(zhì)干細(xì)胞的抗體的細(xì)節(jié)。
[0131] 表 1 ;
[0132]
【權(quán)利要求】
1. 哺乳動物基質(zhì)干細(xì)胞群,其中30%或以上的細(xì)胞對SDC2呈陽性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群,其中所述細(xì)胞為小鼠、大鼠或人細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)胞群,其中所述細(xì)胞為人細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群,其中所述細(xì)胞為馬細(xì)胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群,其中40%或以上的細(xì)胞對SDC2呈陽性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群,其中50%或以上的細(xì)胞對SDC2呈陽性。
7. 獲自前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群的組織。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的組織,選自骨、軟骨和肌腱。
9. 一種分離基質(zhì)干細(xì)胞的方法,包括從混合的哺乳動物細(xì)胞群中基于細(xì)胞表面標(biāo)記物 分離細(xì)胞,其中細(xì)胞表面標(biāo)記物與抗體結(jié)合,以及其中所述抗體與至少一種其它哺乳動物 品種細(xì)胞上找到的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng),所述其它哺乳動物品種細(xì)胞選自人、小鼠、大 鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其中抗體識別人細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記物,并與小鼠 細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng),可選地,與至少一種其它哺乳動物細(xì)胞上的細(xì)胞表面 標(biāo)記物交叉反應(yīng),所述其它哺乳動物細(xì)胞選自大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法,其中抗體識別人細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記物,并與 大鼠細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng),可選地,與至少一種其它哺乳動物細(xì)胞上的細(xì)胞 表面標(biāo)記物交叉反應(yīng),所述其它哺乳動物細(xì)胞選自小鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其中抗體識別馬細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記物,并與至少 一種其它哺乳動物細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng),所述其它哺乳動物細(xì)胞選自人、小 鼠、大鼠、兔子和豬細(xì)胞。
13. -種分離基質(zhì)干細(xì)胞的方法,包括從混合的哺乳動物細(xì)胞群中基于細(xì)胞表面標(biāo)記 物的表達(dá)分離細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞表面標(biāo)記物由哺乳動物細(xì)胞表達(dá),以及其中,相應(yīng)的細(xì) 胞表面標(biāo)記物也表達(dá)在至少一種其它哺乳動物品種的細(xì)胞上,所述至少一種其它哺乳動物 品種的細(xì)胞選自人、小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法,其中所述標(biāo)記物表達(dá)在人細(xì)胞上,相應(yīng)的標(biāo)記物表 達(dá)在小鼠細(xì)胞上,可選地還表達(dá)在選自大鼠、馬、兔子和豬的至少一種其它哺乳動物的細(xì)胞 上。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法,其中所述標(biāo)記物表達(dá)在人細(xì)胞上,相應(yīng)的標(biāo)記 物表達(dá)在大鼠細(xì)胞上,可選地還表達(dá)在選自小鼠、馬、兔子和豬至少一種其它哺乳動物的細(xì) 胞上。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法,其中所述標(biāo)記物表達(dá)在馬細(xì)胞上,相應(yīng)的標(biāo)記物表 達(dá)在選自人、小鼠、大鼠、兔子和豬細(xì)胞的至少一種其它哺乳動物細(xì)胞上。
17. 根據(jù)權(quán)利要求9-11和13-15中任一項(xiàng)所述的方法,用于分離人細(xì)胞。
18. 根據(jù)權(quán)利要求9、12、13和16中任一項(xiàng)的方法,用于分離馬細(xì)胞。
19. 根據(jù)權(quán)利要求9-18中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述標(biāo)記物或相應(yīng)標(biāo)記物表達(dá)在至 少二種哺乳動物品種的細(xì)胞上。
20. 根據(jù)權(quán)利要求9-19中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述標(biāo)記物是SDC2。
21. 根據(jù)權(quán)利要求9-20中任一項(xiàng)所述的方法,其中混合的哺乳動物細(xì)胞群是來源選自 骨髓、脂肪性組織、骨骼肌、子宮內(nèi)膜、胎盤、臍帶血、臍帶、華頓氏膠質(zhì)以及衍生自多能細(xì)胞 的細(xì)胞。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法,其中所述來源是骨髓或衍生自多能細(xì)胞的細(xì)胞。
23. 根據(jù)權(quán)利要求9-22中任一項(xiàng)所述的方法,包括基于另一種細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá) 分離細(xì)胞,所述另一種細(xì)胞表面標(biāo)記物不同于第一可選的CD45或FAP α。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法,包括分離CD45陰性或FAP α陽性的細(xì)胞。
25. 根據(jù)權(quán)利要求9-24中任一項(xiàng)所述的方法,其中細(xì)胞表面標(biāo)記物,或適用第一細(xì)胞 表面標(biāo)記物的地方,選自SDC2和NG2。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法,包括分離對SDC2呈陽性的細(xì)胞,或?qū)DC2和NG2都 呈陽性的細(xì)胞。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法,用于分離成骨和血管形成細(xì)胞。
28. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法,包括分離對SDC2呈陰性的細(xì)胞。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法,用于分離脂肪形成細(xì)胞。
30. -種分離人基質(zhì)干細(xì)胞的方法,包括從人骨髓中分離細(xì)胞,所述細(xì)胞是(i)對CD45 呈陰性或?qū)APa呈陽性,以及(ii)對另一種細(xì)胞表面標(biāo)記物呈陽性,其中所述另一種細(xì) 胞表面標(biāo)記物結(jié)合抗體,以及所述抗體與小鼠或大鼠基質(zhì)干細(xì)胞上找到的細(xì)胞表面標(biāo)記物 交叉反應(yīng),以及可選地還與至少一種其它哺乳動物品種上的細(xì)胞表面標(biāo)記物交叉反應(yīng),所 述其它哺乳動物品種細(xì)胞選自小鼠、大鼠、馬、兔子和豬細(xì)胞。
31. -種獲得細(xì)胞群的方法,包括根據(jù)權(quán)利要求9-30中任一項(xiàng)所述方法分離細(xì)胞;以 及從那些分離的細(xì)胞獲得群體。
32. -種獲得克隆細(xì)胞群的方法,包括根據(jù)權(quán)利要求9-30中任一項(xiàng)所述方法分離單個 細(xì)胞;以及從單個細(xì)胞獲得克隆細(xì)胞群。
33. -種獲得細(xì)胞群的方法,包括根據(jù)權(quán)利要求31或32或35-38中任一項(xiàng)獲得初始細(xì) 胞群,然后在培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)和/或擴(kuò)增和/或傳代細(xì)胞。
34. 根據(jù)權(quán)利要求31-33任一項(xiàng)的方法可獲得的細(xì)胞群。
35. 細(xì)胞群,通過以下獲得:- 提供人基質(zhì)干細(xì)胞; 從所述人基質(zhì)干細(xì)胞獲得克隆細(xì)胞群,以及 可選地,在培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)和/或擴(kuò)增和/或傳代細(xì)胞; 其中人基質(zhì)干細(xì)胞(i)是分離自骨髓,(ii)是對CD45的表達(dá)呈陰性或?qū)APa的表 達(dá)呈陽性,以及(iii)是對另一種細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)呈陽性,其中,所述另一種細(xì)胞表 面標(biāo)記物結(jié)合抗體,以及其中所述抗體與小鼠或大鼠基質(zhì)干細(xì)胞上找到的細(xì)胞表面標(biāo)記物 交叉反應(yīng),可選地還與選自小鼠、大鼠、馬、兔子和豬的至少一種其它哺乳動物品種上的細(xì) 胞標(biāo)記物交叉反應(yīng)。
36. 哺乳動物基質(zhì)干細(xì)胞群,其中75%或以上的細(xì)胞對細(xì)胞表面標(biāo)記物呈陽性,以及 其中相應(yīng)的細(xì)胞表面標(biāo)記物也表達(dá)在選自人、小鼠、大鼠、馬、兔子和豬至少一種其它哺乳 動物品種的細(xì)胞上。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的細(xì)胞群,其中所述標(biāo)記物表達(dá)在人細(xì)胞上,相應(yīng)的標(biāo)記物 表達(dá)在小鼠細(xì)胞上,可選地還表達(dá)在選自大鼠、馬、兔子和豬至少一種其它哺乳動物的細(xì)胞 上。
38. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的細(xì)胞群,其中所述標(biāo)記物表達(dá)在人細(xì)胞上,相應(yīng)的標(biāo)記物 表達(dá)在大鼠細(xì)胞上,可選地還表達(dá)在選自小鼠、馬、兔子和豬至少一種其它哺乳動物的細(xì)胞 上。
39. 基質(zhì)干細(xì)胞群,其中75%或以上的細(xì)胞是SDC2陽性的。
40. 基質(zhì)干細(xì)胞群,其中75%或以上的細(xì)胞是SDC2陰性的。
41. 根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的基質(zhì)干細(xì)胞群,其中75%或以上的細(xì)胞是CD45陰性 的或FAPa陽性的。
42. 根據(jù)權(quán)利要求36-41中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群,可根據(jù)權(quán)利要求9-33中任一項(xiàng)的方 法獲得。
43. 獲得組織的方法,包括根據(jù)權(quán)利要求9-33中任一項(xiàng)的方法獲得細(xì)胞,以及由其獲 得組織。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法,用于獲得選自骨、軟骨和肌腱的組織。
45. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法,用于獲得重建手術(shù)的脂肪組織或組織。
46. 獲自權(quán)利要求34-42中任一項(xiàng)的細(xì)胞群的骨、軟骨或肌腱。
47. 獲自權(quán)利要求34-42中任一項(xiàng)的細(xì)胞群的用于重建手術(shù)的脂肪組織或組織。
48. 進(jìn)行試驗(yàn)的方法,包括根據(jù)權(quán)利要求9-33中任一項(xiàng)的方法獲得細(xì)胞,以及在試驗(yàn) 中使用那些細(xì)胞。
49. 一種試驗(yàn),包括使用權(quán)利要求34-42中任一項(xiàng)的細(xì)胞。
50. 用于治療動物疾病或紊亂的藥物組合物,包括根據(jù)權(quán)利要求1-6、7-8、34-42和 46-47中任一項(xiàng)的細(xì)胞或組織。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的組合物,進(jìn)一步包括藥物可接受載體。
52. 根據(jù)權(quán)利要求50或51所述的組合物,包括鹽水或磷酸緩沖鹽水,以及可選地還包 括二甲亞砜、人血清白蛋白、透明質(zhì)酸和膠原中的一種或多種。
53. 治療動物的方法,包括給予動物根據(jù)權(quán)利要求50-52中任一項(xiàng)的組合物。
54. 根據(jù)權(quán)利要求1-6、7-8、34-42和46-47中任一項(xiàng)的細(xì)胞或組織,用于治療動物疾病 或紊亂。
55. 基本如前所述的人基質(zhì)細(xì)胞群。
【文檔編號】A61K35/28GK104302763SQ201380019351
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年2月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月10日
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