用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的介孔二氧化硅組合物的制作方法
【專利摘要】一種組合物包括介孔二氧化硅棒，所述介孔二氧化硅棒包括免疫細(xì)胞募集化合物和免疫細(xì)胞活化化合物，以及任選的包括抗原，例如腫瘤抗原溶解產(chǎn)物。該組合物用于引發(fā)對(duì)疫苗抗原的免疫反應(yīng)。
【專利說明】用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的介孔二氧化硅組合物
[0001] 政府支持
[0002] 本申請(qǐng)具有政府支持，由國家健康研究院授權(quán)的第R01DE019917號(hào)權(quán)利支持。政 府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及生物相容性可注射性組合物。

【背景技術(shù)】
[0004] 需要體外操作的疫苗，例如大多數(shù)基于細(xì)胞的治療，會(huì)導(dǎo)致不理想的淋巴結(jié)定位 以及有限的效力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明為現(xiàn)有方法中相關(guān)的一些問題和缺陷提供了一種解決方案。因此，本發(fā)明 的特點(diǎn)在于一種組合物，所述組合物包括介孔二氧化硅（MPS)棒，所述介孔二氧化硅（MPS) 棒包括一種免疫細(xì)胞募集化合物和一種免疫細(xì)胞活化化合物。所述棒包括直徑在2-50納 米之間的孔，例如，直徑在5-25納米之間的孔或者直徑在5-10納米之間的孔。在優(yōu)選的實(shí) 施方案中，所述棒包括直徑大約為8納米的孔。微棒的長度在5微米到500微米之間。在 一個(gè)實(shí)施例中，所述棒的長度為5-25微米，例如，10-20微米。在其他實(shí)施例中，所述棒的長 度為50微米-250微米。使用介孔二氧化硅（MPS)微顆粒組合物可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的穩(wěn)固的募 集，所述介孔二氧化硅（MPS)微顆粒組合物的特點(diǎn)在于具有較高的寬高比，例如，所述棒的 長度為80微米到120微米。
[0006] 示例性的免疫細(xì)胞募集化合物包括粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-菌落刺激因子（GM-CSF)。 其他募集化合物的實(shí)施例包括趨化因子，例如，選自由趨化因子（C-C基序）配位體 21(CCL-21，基因銀行編目號(hào)：（aa)CAG29322. 1(01 :47496599)，（na)EF064765. 1(01 : 117606581)，通過引證在此并入本文），趨化因子（C-C基序）配位體19 (CCL-19,基因銀行 編目號(hào)：（aa)CAG33149. 1(01 :48145853), (na)NM_006274. 2(01 :22165424)，通過引證在 此并入本文），以及FMS-樣酪氨酸激酶3配位體（Flt3)配位體；基因銀行編目號(hào)：（aa) AAI44040 (01 :219519004)，（na)NM_004119 (01 :01 :121114303)通過引證在此并入本文） 所組成的組中。
[0007] 免疫細(xì)胞活化化合物包括Toll樣受體激動(dòng)劑。這種激動(dòng)劑包括病原相關(guān)分子 模型（PAMP)，例如，一種感染-模擬組合物，例如，細(xì)菌衍生的免疫調(diào)節(jié)劑（也叫做危險(xiǎn)信 號(hào)）。Toll樣受體（TLR)激動(dòng)劑包括核酸或者脂類組合物（例如，單磷酸脂A(MPLA))。在 一個(gè)實(shí)施例中，Toll樣受體（TLR)激動(dòng)劑包括TLR9激動(dòng)劑，例如，一種胞嘧啶-鳥嘌呤低聚 核苷酸（CpG-ODN)、一種聚（氮丙啶）（PEI)-濃縮的低聚核苷酸（ODN)(例如，聚（氮丙啶） (PEI)-胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN))、或者雙鏈脫氧核糖核酸（DNA)。例如，所述 裝置包括5微克、10微克、25微克、50微克、100微克、250微克或者500微克的胞嘧啶-鳥 嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN)。在另一個(gè)實(shí)施例中，Toll樣受體（TLR)激動(dòng)劑包括TLR3激動(dòng) 齊U，例如，聚肌苷-聚胞苷酸（聚I :C)、一種聚（氮丙啶）（PEI)-聚（I :〇、聚腺尿苷酸（聚 (A :U))、聚（氮丙啶）（PEI)-聚（A :U)、或者雙鏈核糖核酸（RNA)。
[0008] 脂多糖（LPS)同樣可以用于實(shí)現(xiàn)此目的。
[0009] 為了產(chǎn)生免疫反應(yīng),所述組合物包括此免疫反應(yīng)所需要的抗原。例如,所述組合物 包括腫瘤抗原。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原包括一種腫瘤細(xì)胞溶解產(chǎn)物（例如，從被治 療的主體中收集的腫瘤活組織切片樣品中提取的）。所述主體優(yōu)選是人類患者，但是所述組 合物/系統(tǒng)還可以用于獸醫(yī)用途，例如，用于治療功能性動(dòng)物，比如狗、貓以及性能動(dòng)物，例 如,馬和家畜，比方說家牛、公牛、羊、山羊,等。
[0010] 抗原遞呈細(xì)胞，比如樹突狀細(xì)胞（DC)，通過介孔二氧化硅（MPS)裝置，那就是說， 細(xì)胞不是永久居住在裝置中。向裝置中募集免疫細(xì)胞，并且使其短時(shí)間內(nèi)居住在裝置中，當(dāng) 他們遇到抗原時(shí)被活化。然后免疫細(xì)胞（比如樹突狀細(xì)胞（DC))定位向淋巴結(jié)。他們聚集 在淋巴結(jié)處，例如，一種引流淋巴結(jié)，而不是在介孔二氧化硅（MPS)裝置中。在淋巴結(jié)處聚 集的細(xì)胞進(jìn)一步增加了對(duì)疫苗抗原的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更有力的針對(duì)該抗原的細(xì)胞反應(yīng)和體 液反應(yīng)。
[0011] 因此，一種誘導(dǎo)對(duì)疫苗產(chǎn)生全身性抗原特異性免疫反應(yīng)的方法包括對(duì)主體施用如 上所述的介孔二氧化硅（MPS)組合物。所述組合物被裝入注射器并注入受試者的身體中。 例如，少量（例如，50-500微升，例如，150微升）進(jìn)行皮下注射。一般地，在施用后第2天， 使用細(xì)胞滲透所述裝置（介孔二氧化硅（MPS)組合物），并在施用后第5-7天，引流淋巴結(jié) 中充滿從裝置中遷移出來的細(xì)胞和遷移到淋巴結(jié)組織中的細(xì)胞，這些細(xì)胞在此聚集并進(jìn)一 步的傳播抗原-特異性反應(yīng)。因此，所述組合物可以有效用于誘導(dǎo)免疫細(xì)胞向淋巴結(jié)的定 位。在接種疫苗治療劑之后，不比去除所述介孔二氧化硅（MPS)組合物。這些組合物可以 在施用位點(diǎn)處保存，并在此降解。例如，通過巨噬細(xì)胞隨著時(shí)間來消耗介孔二氧化硅（MPS) 顆粒，并直至從身體內(nèi)清除。
[0012] 制備疫苗的方法包括，提供一種介孔二氧化硅棒懸浮液，將所述棒與疫苗抗原、免 疫細(xì)胞募集化合物和免疫細(xì)胞活化化合物相接觸。所述疫苗抗原一種腫瘤細(xì)胞溶解產(chǎn)物， 所述募集化合物包括粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)，并且所述活化化合物包 括胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN)。有時(shí)候，在將所述棒與一個(gè)或一個(gè)以上下列化 合物相接觸之前用羥基乙酸或者乳酸修飾所述棒：疫苗抗原、募集化合物或者活化化合物。 選擇性的，所述介孔二氧化硅（MPS)組合物/裝置是使用介孔二氧化硅（MPS)棒、一種免疫 細(xì)胞募集化合物和一種免疫細(xì)胞活化化合物（選擇性地，與羥基乙酸或者乳酸修飾）來制 備的，被儲(chǔ)存和/或運(yùn)往應(yīng)用位點(diǎn)，因此，在施用前，向棒懸浮液中加入病人特異性腫瘤抗 原制劑或者溶解產(chǎn)物，例如，在對(duì)病人施用前1、2、6、12、24或者48小時(shí)之前加入。
[0013] 所述裝入介孔二氧化硅（MPS)組合物中的化合物是被加工或者純化的。例如、多 聚核苷酸、多肽或者其他試劑，可以被純化和/或分離。具體地說，如這里所使用的，"分離 的"或者"純化的"核苷酸分子、多聚核苷酸、多肽或者蛋白質(zhì)是指在通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí) 基本上不含有其他細(xì)胞物質(zhì)或者培養(yǎng)基的物質(zhì)，或者是指通過化學(xué)合成的化學(xué)前體物或者 其他化學(xué)試劑。純化后的化合物按重量計(jì)算（干重）占所關(guān)心化合物的至少60%。優(yōu)選的， 所述制劑按重量計(jì)算占所關(guān)心化合物的至少75%，更優(yōu)選的占至少90 %，并且最優(yōu)選的占 至少99 %。例如，純化后的化合物按重量計(jì)算占理想化合物的至少90 %，91 %，92 %，93 %， 94%，95%，98%，99%，或者100%(重量/重量）?？梢酝ㄟ^任何適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)方法來測(cè)量 純度，例如，通過柱形色譜法、薄層色層分析法、或者高效液相色譜（HPLC)進(jìn)行分析。純化 后的或者分離的多聚核苷酸（核糖核酸（RNA)或者脫氧核糖核酸（DNA))不含有那些在其 天然存在形式中存在的側(cè)鏈基因或者序列。純化的也用于定義一種滅菌程度，這種滅菌程 度可以安全的對(duì)人類主體給藥，例如，不具有傳染性或者毒劑。就腫瘤抗原而言，所述抗原 可以被純化或者處理成一種腫瘤細(xì)胞溶解產(chǎn)物。
[0014] 同樣，"基本上純的"是指從其天然伴隨的成分中分離出來的核苷酸或者多肽。通 常，當(dāng)核苷酸和多肽按重量計(jì)算不含有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少 95%、或者甚至至少99%的蛋白質(zhì)和其天然伴隨存在的有機(jī)分子時(shí)，這種核苷酸和多肽是 基本上純的。
[0015] 小分子是質(zhì)量小于2000道爾頓的化合物。優(yōu)選的，所述小分子的分子質(zhì)量小于 1000道爾頓，更優(yōu)選的，小于600道爾頓，例如，所述化合物的分子質(zhì)量小于500道爾頓、400 道爾頓、300道爾頓、200道爾頓或者100道爾頓。
[0016] 過渡術(shù)語"包括（comprising) " 與"包含（including) "、"含有（containing) " 或 者"具有...的特征"是同義詞，都屬于包括性的或者開放式定義，不排除其他未列出的成 分或者方法步驟。相反，術(shù)語"由。。。組成"不包括任何在權(quán)利要求中沒有特別指出的成分、 步驟或者組分。術(shù)語"基本上由...組成"將權(quán)利要求的范圍限制在指定的材料或者步驟， "以及那些本質(zhì)上不影響要求保護(hù)的發(fā)明的本質(zhì)和新穎特性的材料或者步驟"。
[0017] 從下面關(guān)于本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案的表述中，以及從權(quán)利要求書中，本發(fā)明的其 他特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)將變得顯而易見。除非另有定義，這里使用的所有科技用語與本發(fā)明所屬領(lǐng) 域普通技術(shù)人員通常的理解具有相同的含義。雖然與這里描述的方法和材料相似的任何方 法和材料都可以被用于實(shí)施或者檢測(cè)本發(fā)明，但是下面描述的是適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?。這里 應(yīng)用的所有公開的外國專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^引證全部并入本文。Genbank和NCBI指明 的登記號(hào)碼也通過引證在此全部并入本文。這里引用的其他出版的參考文獻(xiàn)、文件、原稿和 科學(xué)文獻(xiàn)通過引證在此全部并入本文。如果出現(xiàn)矛盾，以本發(fā)明說明書包括定義為準(zhǔn)。此 夕卜，這里所述的材料、方法和實(shí)施例只起到說明作用，并不作為限制。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是介孔二氧化硅（MPS)棒的電鏡照片。這些棒的隨機(jī)堆疊和自組裝可產(chǎn)生能 夠進(jìn)行細(xì)胞過濾的3D空間。
[0019] 圖2是一種棒狀圖，顯示了具有不同長度的介孔二氧化硅（MPS)棒的表面標(biāo)記物 表達(dá)作用。將1〇〇微克具有不同長度的介孔二氧化硅（MPS)棒與骨髓衍生的樹突狀細(xì)胞 一起培養(yǎng)18小時(shí)。作為發(fā)炎作用的標(biāo)記物，通過用細(xì)胞表面受體CDllc (樹突狀細(xì)胞標(biāo)記 物）、MHCII (抗原呈遞標(biāo)記物）和CD86 (共刺激受體）染色來確定被活化的細(xì)胞的百分比。 隨著長度的增加，所述棒的炎癥性質(zhì)也增加。由于理想的腳手架顯示炎癥性質(zhì)（與PLG腳 手架參照相似），在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中使用長度為30微米到100微米或120微米之間的棒。
[0020] 圖3是一系列圖，顯示了介孔二氧化硅（MPS)棒在小鼠中的作用。圖3A是一種圖， 顯示了在用5毫克羅丹明標(biāo)記的介孔二氧化硅（MPS)棒對(duì)C57bl/6j小鼠進(jìn)行皮下注射5天 后切除的腳手架注射位點(diǎn)。皮下小囊顯示所述棒被定位并且自組裝產(chǎn)生3D微環(huán)境。圖3B 是切除的腳手架位點(diǎn)的電鏡照片，顯示了過濾進(jìn)入腳手架位點(diǎn)的細(xì)胞。圖3C顯示了從介孔 二氧化硅（MPS)腳手架上分離的細(xì)胞的活/死成像，說明活細(xì)胞被募集。
[0021] 圖4A是線狀圖，顯示了粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-菌落刺激因子（GM-CSF)從介孔二氧化 硅（MPS)棒中的釋放。1微克粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-菌落刺激因子（GM-CSF)被裝載入介孔二氧 化硅（MPS)棒中，與0. IBS A/PBS -起培養(yǎng)。定時(shí)收集上清液，然后使用ELISA(R&D公司） 測(cè)定粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-菌落刺激因子（GM-CSF)。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-菌落刺激因子（GM-CSF) 從介孔二氧化硅（MPS)棒中連續(xù)釋放。圖4B是棒狀圖，顯示了在體外骨髓衍生的樹突狀 細(xì)胞（BMDC)中與介孔二氧化硅（MPS)共培養(yǎng)的表面標(biāo)記物表達(dá)。100微克的未修飾的、氨 基_、硫醇_、氯_、和膦酸修飾的介孔二氧化硅（MPS)棒與IO 6/毫升骨髓衍生的樹突狀細(xì)胞 (BMDC) -起培養(yǎng)18小時(shí)。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，確定MHC II類和共刺激性分子CD86的表 達(dá)。介孔二氧化硅（MPS)刺激骨髓衍生的樹突狀細(xì)胞（BMDC)中MHCII和⑶86的增加的表 達(dá)作用表示介孔二氧化硅（MPS)棒是炎癥性的，并且這一性質(zhì)可以被表面修飾的介孔二氧 化硅（MPS)棒所調(diào)節(jié)。
[0022] 圖5A是棒狀圖，顯示了通過裝載粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)的 介孔二氧化硅（MPS)棒募集的樹突狀細(xì)胞。皮下注射5毫克/小鼠裝載有或者不裝載有1 微克/小鼠粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)的介孔二氧化硅（MPS)棒。從腳 手架位點(diǎn)捕獲細(xì)胞并進(jìn)行CDl Ic受體（樹突狀細(xì)胞（DC)標(biāo)記物）染色。裝載有粒性白細(xì) 胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)的介孔二氧化硅（MPS)腳手架能夠比空白介孔二氧化 硅（MPS)腳手架募集更多的樹突狀細(xì)胞（DC)。圖5b是一種棒狀圖，描述了樹突狀細(xì)胞（DC) 的表面標(biāo)記物表達(dá)。裝載粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)和胞嘧啶-鳥嘌呤 低聚核苷酸（CpG-ODN)的介孔二氧化硅（MPS)腳手架比不裝載胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)的腳手架活化更多的樹突狀細(xì)胞（DC)。
[0023] 圖6A-B是棒狀圖，顯示了腳手架位點(diǎn)處的（圖6A)B220+細(xì)胞百分比，或者（圖 6B)B220+細(xì)胞總數(shù)。皮下注射5毫克/小鼠裝載有或者不裝載有1微克/小鼠粒性白細(xì)胞 巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)UOO微克胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN)和130 微克卵清蛋白的介孔二氧化硅（MPS)棒。從腳手架位點(diǎn)定時(shí)捕獲細(xì)胞并進(jìn)行B220受體（B 細(xì)胞標(biāo)記物）染色。在第3天，裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)、胞嘧 啶-鳥嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN)和卵清蛋白的介孔二氧化硅（MPS)腳手架能夠募集更多 的B細(xì)胞。
[0024] 圖7A-C是流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖（圖7A)和棒狀圖（圖7B-C)，描述了樹突狀細(xì)胞 (DC)表面上存在MHC-I-SIINFEKL(SEQ ID N0:1)標(biāo)記物。裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集 落刺激因子（GM-CSF)、胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN)和模型抗原卵清蛋白的介 孔二氧化硅（MPS)腳手架能夠誘導(dǎo)抗原特異性樹突狀細(xì)胞（DC)擴(kuò)散，定位到引流淋巴結(jié) (dLN)。用樹突狀標(biāo)記物⑶I Ic和標(biāo)記物標(biāo)記物MHC-I-SIINFEKL對(duì)dLN細(xì)胞進(jìn)行染色顯 示，在MHC-I復(fù)合物中，一部分卵清蛋白（肽序列SIINFEKL)存在于細(xì)胞表面上。
[0025] 圖8A-B是棒狀圖，顯示由于介孔二氧化硅（MPS)腳手架形成的次級(jí)淋巴小 結(jié)。在裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)、胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅（MPS)腳手架能夠誘導(dǎo)次級(jí)淋巴小結(jié)，定 位活化的抗原初始化B細(xì)胞。用B220 (B細(xì)胞標(biāo)記物）和GL7次級(jí)淋巴小結(jié)標(biāo)記物）對(duì)dLN 進(jìn)行染色，研究次級(jí)淋巴小結(jié)的形成，所述次級(jí)淋巴小結(jié)中存在特有的B細(xì)胞，這種特有的 B細(xì)胞被活化并且包括在身體過成熟和同型體轉(zhuǎn)換過程中。
[0026] 圖9A-B是一種棒狀圖，描述了裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)、胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅 (MPS)腳手架能夠誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTLs)的擴(kuò)散，所述CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞可 以特異性識(shí)別模型抗原。用CD8 (殺傷T細(xì)胞標(biāo)記物）和MHCI-四聚體-SIINFEKL抗體對(duì) 脾細(xì)胞染色，顯示T細(xì)胞是否能夠識(shí)別MHCI復(fù)合物上呈遞的特異性抗原。
[0027] 圖10A-C是直方圖，顯示了裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)、 胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅（MPS)腳手架 能夠誘導(dǎo)抗原特異性CD8+CTLS在dLN和脾中的克隆擴(kuò)散。從OT-I小鼠中注射的脾細(xì)胞被 追蹤染料CFSE染色，追蹤染料CFSE的熒光性隨著細(xì)胞每次分裂減半。完全裝載的疫苗組 中脾和dLN中CFSE染色的脾細(xì)胞的熒光下降顯示ova-特異性CTL增殖。
[0028] 圖IlA-C是直方圖，顯示了裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)、 胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅（MPS)腳手架 能夠誘導(dǎo)抗原特異性CD4+THS在dLN和脾中的克隆擴(kuò)散。從OT-II小鼠中注射的脾細(xì)胞被 追蹤染料CFSE染色，追蹤染料CFSE的熒光性隨著細(xì)胞每次分裂減半。完全裝載的疫苗組 中和只裝載抗原的介孔二氧化硅（MPS)組的脾和dLN中CFSE染色的脾細(xì)胞的熒光下降顯 示ova-特異性CD4+TH細(xì)胞增殖。
[0029] 圖12A-B是直方圖，顯示了抗原滴定度被定義為抗體-血清溶液被稀釋并仍然保 持可檢測(cè)的抗體數(shù)量的程度。所述抗卵清蛋白血清抗體被滴定。裝載有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì) 胞集落刺激因子（GM-CSF)、胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN)和卵清蛋白的介孔二氧 化硅（MPS)腳手架能夠引發(fā)有力的和長時(shí)間的THl和TH2抗體反應(yīng)。單獨(dú)裝載有卵清蛋白 的介孔二氧化硅（MPS)可以引發(fā)有效的TH2反應(yīng)，顯示了介孔二氧化硅（MPS)材料本身的 輔助潛力。
[0030] 圖13A-B是線性圖，顯示了粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)以一種控 制并持續(xù)的方式從介孔二氧化硅（MPS)微粒中釋放。A)1微克粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺 激因子（GM-CSF)被裝載入5毫克介孔二氧化硅（MPS)棒中并在0. 1BSA/PBS中培養(yǎng)。定時(shí) 收集上清液并使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（R&D公司）測(cè)定粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)。雖然劑量較小，但是粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)連續(xù)地從介孔 二氧化硅（MPS)棒中釋放。B)1微克粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)被裝載 入5毫克的含有OVA和CpG的介孔二氧化硅（MPS)中。然后皮下注射入C57BL/6J小鼠中。 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，收獲包圍注射的顆粒腳手架的組織并分析粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因 子（GM-CSF)水平。粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)的水平維持一周。
[0031] 圖14A-B是照片，和圖14C是棒狀圖。具有更高寬高比的介孔二氧化硅（MPS)微 粒能夠募集更多的細(xì)胞。圖14A顯示了長度或者在10微米和20微米之間、或者在80微米 和120微米的介孔二氧化硅（MPS)微粒的掃描電鏡圖像。較長的棒使組合物具有更大面積 或者更大的棒間空間。圖14B顯示了從小鼠中捕獲的介孔二氧化硅（MPS)組合物。將5微 克介孔二氧化硅（MPS)微粒皮下注射入小鼠中，在注射后第7天收獲腳手架位點(diǎn)。圖14C 是一種棒狀圖，列舉了從腳手架中分離的細(xì)胞。具有更高寬高比的介孔二氧化硅（MPS)微 粒能夠募集更多的細(xì)胞。
[0032] 圖15A-B是條形圖。作為對(duì)粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)的反應(yīng)， 樹突狀細(xì)胞（DC)被介孔二氧化硅（MPS)微粒募集。將粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF) (0納克、500納克、1000納克、3000納克）裝載入介孔二氧化硅（MPS)微粒中，并 將其皮下注射入小鼠中。在注射后第7天，收獲腳手架并用流式細(xì)胞儀分析。圖15A顯示， 隨著粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)劑量的增加，募集的CDllc+CDllb+樹突 狀細(xì)胞（DC)增加。圖15B顯示，隨著粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)劑量的 增加，募集的成熟CDllc+MHCII+樹突狀細(xì)胞（DC)同樣增加。
[0033] 圖16是一種棒狀圖，顯示了粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)能夠增 加募集的樹突狀細(xì)胞（DC)向著引流淋巴結(jié)的流通。將裝載有Alexa 647標(biāo)記的卵清蛋白 (OVA)、或者Alexa 647標(biāo)記的OVA和1微克粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF) 的介孔二氧化硅（MPS)微粒皮下注射入小鼠體內(nèi)。在注射后第7天，收獲引流管淋巴結(jié) (dLN)并用流式細(xì)胞儀分析。在加入了抗原（OVA)的情況下，流向腳手架并吸收OVA的 Alexa647+⑶IlC+樹突狀細(xì)胞（DC)有適度增加。然而，粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)的加入使從腳手架流向dLN的樹突狀細(xì)胞顯著增加。
[0034] 圖17A-C是散點(diǎn)圖，圖17D是棒狀圖。胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN)從 介孔二氧化硅（MPS)微粒腳手架中的局部運(yùn)輸能夠增加活化的樹突狀細(xì)胞的循環(huán)。介孔二 氧化硅（MPS)微粒裝載有1微克粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)、300微克OVA 和100微克胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN)。然后將其皮下注射入小鼠中。在注射 后7天收獲dLNs并分析。用CDllc和CD86染色淋巴結(jié)細(xì)胞。胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)能夠從介孔二氧化硅（MPS)腳手架中局部釋放，因此它的加入能夠進(jìn)一步增加 dLN中活化的、成熟樹突狀細(xì)胞（DC)的百分比和數(shù)目。
[0035] 圖18A-C是照片，圖18D是棒狀圖。蛋白質(zhì)以控制且持續(xù)的方式從介孔二氧化硅 (MPS)微粒腳手架中釋放。將Alexa 647標(biāo)記的卵清蛋白（或者處于緩沖溶液中，或者裝載 在介孔二氧化硅（MPS)微粒上）皮下注射到老鼠側(cè)面。使用IVIS測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì) 熒光。如果在緩沖溶液中注射，所述蛋白質(zhì)在小于1天的時(shí)間里從注射部位擴(kuò)散。但是，如 果裝載在介孔二氧化硅（MPS)微粒上，所述蛋白質(zhì)以一種持續(xù)的方式從局部腳手架位點(diǎn)釋 放，例如，超過一周的時(shí)間（2、3、4、5、7或者更多天）。
[0036] 圖19A-B是線性圖，顯示了抗體滴定度?？贵w滴定度被定義為抗體-血清溶液被稀 釋但始終包含可檢測(cè)數(shù)量抗體的程度。使用30微克OVA、10微克胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷 酸（CpG-ODN)和1微克粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)，或著以可溶形式、或者 裝載在5毫克介孔二氧化硅（MPS)微粒中，對(duì)小鼠接種。滴定抗卵白蛋白血清抗體。裝載 有粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)、胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN)和 ova的介孔二氧化硅（MPS)可以引發(fā)有力的、長時(shí)間的THl和TH2抗體反應(yīng)，分別如IgG2a 和IgGl抗體的高滴定度所示。更令人難忘的是，這些反應(yīng)在單次注射接種超過200天后仍 然明顯。該反應(yīng)可以與使用氫氧化鋁傳遞的OVA相比，這是美國唯一獲批的助劑。雖然介 孔二氧化硅（MPS)疫苗能夠誘導(dǎo)THl和TH2抗體反應(yīng)，由于其能夠裝載小的細(xì)胞因子、蛋白 質(zhì)和DNA，通過硫酸鋁誘導(dǎo)的反應(yīng)是完全TH2偏移的。介孔二氧化硅（MPS)疫苗用途非常廣 泛，并且容易精確的轉(zhuǎn)變和控制，誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。
[0037] 圖20 A-D是一種散點(diǎn)圖，顯示了使用介孔二氧化硅（MPS)疫苗接種能夠誘導(dǎo)T卵 泡輔助細(xì)胞的擴(kuò)增。用CFSE染色OT-II脾細(xì)胞并適應(yīng)性傳遞進(jìn)入Thy 1. 1+受體小鼠中。 然后用介孔二氧化硅（MPS)和溶菌酶、介孔二氧化硅（MPS)和0VA，和包括粒性白細(xì)胞巨噬 細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)和CpG的全形式疫苗接種受體小鼠。在疫苗接種三天后，收獲 dLN并分析適應(yīng)性傳遞的細(xì)胞。這里顯示，接種介孔二氧化硅（MPS)和ova的小鼠，接種全 形式疫苗的小鼠能夠產(chǎn)生強(qiáng)壯的卵泡T輔助細(xì)胞群，這是直接負(fù)責(zé)"輔助" B細(xì)胞分化并成 熟為完全功能性抗原特異性抗體分泌的漿細(xì)胞。
[0038] 圖21A-D是一種線狀圖，顯示了使用介孔二氧化硅（MPS)疫苗接種能夠誘導(dǎo)⑶4+T 輔助細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。用CFSE染色OT-II脾細(xì)胞并適應(yīng)性傳遞進(jìn)入Thy 1. 1+受體小鼠中。 然后用介孔二氧化硅（MPS)和溶菌酶、介孔二氧化硅（MPS)和0VA，和包括粒性白細(xì)胞巨噬 細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)和CpG的全形式疫苗接種受體小鼠。在疫苗接種三天后，收獲 dLN并分析適應(yīng)性傳遞的細(xì)胞。據(jù)這里所顯示，介孔二氧化硅（MPS)和0VA，以及全型疫苗 都能夠誘導(dǎo)CD4+T輔助細(xì)胞有效的顆粒擴(kuò)增，顯示全身性抗原特異性反應(yīng)。
[0039] 圖22A-B是一種線性圖，顯示了介孔二氧化硅（MPS)微粒羥基乙酸和乳酸修飾作 用幫助生物活性粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)的釋放。~1微克的粒性白 細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)被裝載入5毫克的羥基乙酸或者乳酸修飾的介孔二 氧化硅（MPS)棒中，并在0.1BSA/PBS中培養(yǎng)。周期性收集上清液并使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè) 定（R&D公司）粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)。與從未修飾的介孔二氧化硅 (MPS)微粒中釋放的粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)相比，羥基乙酸和乳酸修 飾作用能夠使生物活性粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)的累積釋放增加超過 20倍。
[0040] 圖23A-D是散點(diǎn)圖，顯示了羥基乙酸修飾的介孔二氧化硅（MPS)能夠增加募集的 樹突狀細(xì)胞（DC)和成熟樹突狀細(xì)胞（DC)的百分比。在37度下，5毫克未修飾的或者羥 基乙酸修飾的介孔二氧化硅（MPS)微粒裝載有1微克粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)I小時(shí)，然后皮下注射入小鼠中。在第7天收獲腳手架并分析。這里證實(shí)，修飾的 介孔二氧化硅（MPS)幾乎使募集的⑶Ilc+⑶Ilb+樹突狀細(xì)胞（DC)的百分比加倍，并且， ⑶Ilc+⑶86+成熟樹突狀細(xì)胞（DC)百分比顯著增加。這些結(jié)果顯示，介孔二氧化硅（MPS) 微粒良好的表面修飾能力允許進(jìn)行進(jìn)一步募集細(xì)胞的表型操作，從而誘導(dǎo)更有效的免疫反 應(yīng)。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 可注射的介孔二氧化硅（MPS)-基的微棒在體內(nèi)隨機(jī)自組裝形成3D腳手架。設(shè)計(jì) 該系統(tǒng)從而使該系統(tǒng)釋放細(xì)胞因子，募集并短時(shí)間內(nèi)收容免疫細(xì)胞，用抗原呈遞他們并用 危險(xiǎn)信號(hào)活化他們。在募集并短時(shí)間收容所述細(xì)胞或者結(jié)構(gòu)中含有所述細(xì)胞之后，這些免 疫細(xì)胞從裝置結(jié)構(gòu)中遷移出來并定位到淋巴結(jié)中。因此，所述組合物是一種細(xì)胞在其中來 回交流/循環(huán)的組合物，他們的免疫活化狀態(tài)通過裝置運(yùn)輸?shù)慕Y(jié)果而改變/調(diào)節(jié)。
[0042] 在淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)抗原特異性樹突狀細(xì)胞群落的顯著擴(kuò)增以及次級(jí)淋巴小結(jié)的形 成，這是通過使用本發(fā)明的裝置，在淋巴結(jié)中引入卵泡T輔助細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。在脾中，抗原 識(shí)別性⑶8+CTL群落也被發(fā)現(xiàn)顯著增加了。該系統(tǒng)同樣誘導(dǎo)抗原特異性⑶4和⑶8 T細(xì) 胞的克隆擴(kuò)增。除了細(xì)胞免疫反應(yīng)顯著擴(kuò)增之外，還檢測(cè)到產(chǎn)生大量耐受性抗體和平衡性 TH1/TH2 反應(yīng)。
[0043] 用于調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞流通和重新編碼的可注射性介孔二氧化硅微棒-基腳手架系 統(tǒng)的基本元素包括：
[0044] ?介孔二氧化硅（MPS)微棒的寬高比（10納米橫截面積除以100微米長度）防止 其被吸收，并因此允許局部形成三維結(jié)構(gòu)。
[0045] ? 8納米孔徑，允許吸附那些能夠通過控制的并且連續(xù)的方式擴(kuò)散而傳遞的小分 子。
[0046] ?高表面面積與體積比，允許控制各種細(xì)胞因子、危險(xiǎn)信號(hào)和抗原的裝載。
[0047] ?介孔二氧化硅（MPS)微棒的炎癥性質(zhì)能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞募集，并且不需要其他 炎癥性細(xì)胞因子。
[0048] ?介孔二氧化娃（MPS)棒表面化學(xué)修飾能力的多功能性，可以調(diào)節(jié)所述棒的性質(zhì) 以及蛋白質(zhì)與棒的結(jié)合方式。
[0049] ?粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)的控制釋放可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞流 向腳手架位點(diǎn)。
[0050] ?胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸（CpG-ODN)的控制釋放能夠活化募集的樹突狀細(xì)胞。
[0051] ?募集免疫細(xì)胞在腳手架位點(diǎn)可以吸收錨定蛋白質(zhì)抗原。
[0052] 據(jù)發(fā)現(xiàn)，孔徑為大約5-10納米，例如8納米時(shí)，對(duì)于小分子以及蛋白質(zhì)的裝載效率 達(dá)到最佳，例如，粒性白細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)(其分子直徑為大約3納米）。
[0053] 將懸浮在緩沖液中的微棒進(jìn)行皮下注射，所述棒隨機(jī)堆疊成一種三維結(jié)構(gòu)，所述 棒的末端相互之間形成物理接觸，并且在此接觸之間形成一種微空隙。
[0054] MPS
[0055] 通過將四乙基原硅酸酯與一種由膠束棒制成的模板發(fā)生反應(yīng)來合成介孔二氧化 硅納米顆粒。所得結(jié)果是一系列納米尺寸的球或者棒，其中充滿規(guī)則排列的小孔。通過溶 劑洗滌調(diào)節(jié)合適的PH值，并因此除去模板。在另一個(gè)技術(shù)中，所述介孔顆?？梢允褂煤唵?的溶膠_凝膠法或者噴霧干燥法合成。四乙基原硅酸酯還可以與其他的聚合物單體（作為 模板）一起使用。其他方法包括美國專利
【發(fā)明者】金在允, W·A·李, D·J·穆尼 申請(qǐng)人:哈佛學(xué)院董事會(huì)