含有生物分子探針的锝-99m三羰基標(biāo)記的甘氨酸單體或低聚體的制備及其作為成像復(fù)合 ...的制作方法
【專利摘要】本申請公開了一種與用于目的生物分子的成像探針有關(guān)的锝-99m-標(biāo)記的甘氨酸低聚體。使用自動化肽合成儀可以容易地以單一過程合成甘氨酸低聚體。锝-99m三羰基標(biāo)記的甘氨酸低聚體可用作用于γ或SPECT成像裝置的放射性示蹤劑。锝-99m三羰基標(biāo)記的甘氨酸低聚體可被加載到各種肽生物分子上，例如RGD肽、抑生長素、神經(jīng)降壓肽等，并且示出快速的腎臟清除率而不會被過量地保留在體內(nèi)。
【專利說明】含有生物分子探針的锝-99M三羰基標(biāo)記的甘氨酸單體或 低聚體的制備及其作為成像復(fù)合物-組合物的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種使用自動化肽合成以單一過程制備锝_99m三羰基標(biāo)記的甘氨酸 單體或低聚體的方法，及含有锝_99m三羰基標(biāo)記的甘氨酸單體或低聚體的成像造影組合 物。

【背景技術(shù)】
[0002] 在理想的腫瘤調(diào)節(jié)是現(xiàn)代醫(yī)藥主要目標(biāo)之一的時代，使用與靶分子特異性反應(yīng)的 放射性示蹤劑，能夠在分子水平非侵入性地觀測腫瘤狀態(tài)的閃爍檢測和治療技術(shù)占有非常 重要的位置，因為其允許用于腫瘤的早期診斷和治療。例如，[ 18f]-fdg已被廣泛用作腫瘤 診斷中用于正電子成像術(shù)（PET)的放射性藥物，其提供血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移的信息。然而， 它的缺點是不能夠診斷腦腫瘤及區(qū)分腫瘤和炎癥。
[0003] 整聯(lián)蛋白是異質(zhì)二聚體跨膜糖蛋白，其由19個α-亞基和8個β-亞基組成， 且在腫瘤誘導(dǎo)的血管生成、腫瘤浸潤和腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。其中，α νβ 3,也稱為 玻連蛋白受體，作為潛在放射性示蹤劑的靶標(biāo)用于提供腫瘤進(jìn)展和惡性腫瘤的信息。這 種整聯(lián)蛋白在增殖性內(nèi)皮細(xì)胞和實體瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，然而在靜態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)。 Arg-Gly-Asp(RGD)肽是已經(jīng)示出的與整聯(lián)蛋白受體特異性結(jié)合的主要結(jié)合部分。這種三肽 RGD(精氨酰甘氨酰天冬氨酸）序列參與細(xì)胞膜的各種細(xì)胞間相互作用，因此其被廣泛研究 用于診斷和治療各種腫瘤與疾病。環(huán)肽結(jié)構(gòu)，具有高親合力的cRGD (環(huán)狀A(yù)rg-Gly-Asp)， 已被研發(fā)作為α νβ 3整聯(lián)蛋白的拮抗劑，這是基于事實上用各種放射性同位素標(biāo)記的RGD 和cRGD肽衍生物已用作整聯(lián)蛋白-靶向的放射性示蹤劑，放射性示蹤劑用于癌癥誘導(dǎo)的 血管生成的分子成像研究中。對于cRGD衍生物作為診斷性放射性藥物的潛在用途，各種 Y -發(fā)射同位素包括锝-99m、碘-123、銦-111、鎵-67/68和銅-64已用于SPECT或PET成 像。單糖可與放射性示蹤劑結(jié)合以誘導(dǎo)從肝臟的快速釋放，從而改善基于RGD的放射性示 蹤劑的藥代動力學(xué)行為。此外，兩個或四個cRGD分子可結(jié)合一個放射性示蹤劑以提高與 整聯(lián)蛋白的親合力（參考：Haubner, R.，Wester, H-J.，Weber, W. A.，Mang, C.，Ziegler, S. I. , Goodman, S. L. , Senekowitsch-Schmidtke, R. , Kessler, H. , Schwaiger, M. , Cance r Res. , 2001, 61:1781-1785 ； Jeong, J. M. , Hong, Μ. K. , Chang, Y. S. , Lee, Y. S. , Kim, Y. J. ，Cheon，G. J.，Lee，D. S.，Chung，J. K.，Lee，M. C.，J. Nucl. Med.，2008, 49 : 830-836 ;C hen, W. , Park, R. , Tohme, M. , Shahinian, A. H. , Bading, J. R. , Conti, P. S. Bioconjugate Chem. , 2004, 15: 41-49 ；Liu, S. , Hsieh, W. Y. , Kim, Y. S. , Mohammel, S. I. , Bioconjugate Chem.，2005，16:1580-1588 ;Haubner，R.，Wester，H_J.，Reuning，U.，Senekowitsch -Schmidtke，R.，Diefenbach，B.，Kessler，H.，Stocklin G.,Schwaiger, M. , J. Nucl. Med.，1999, 40:1061-1071 ; Janssen，M.，Oyen，W. J. G.，Dijkgraaf，I.，Massuger，L. F. A. G. , Frielink, C. , Edwards, D. S. , Rajopadyhe, M. , Boonstra, H. , Corsten, F. Η. M.，Boerman，0· C.，Cancer Res.，2002, 62:6146-6151 ;Wu，Y.，Zhang，X.，Xiong，Z.，Cheng ,Z. , Fisher, D. R. , Liu, S. , Gambhir, S. S. , Chen, X. , J. Nucl. Med. , 2005, 46:1707-1718.) 〇
[0004] 由于生物活性分子介導(dǎo)體內(nèi)的生理或病理作用，生物活性分子的體內(nèi)行為的診斷 在理解生理和病理現(xiàn)象及診斷和治療相關(guān)疾病中起重要作用。隨著分子成像技術(shù)的進(jìn)步， 可使用高度靈敏的放射性同位素觀察各種生物活性分子的體內(nèi)行為，然后這些分子可臨床 應(yīng)用。例如，[ 18F]-FDG(2-氟-2-脫氧-D-葡萄糖）廣泛應(yīng)用于葡萄糖體內(nèi)代謝速率的定量 及腫瘤診斷。由于正電子-發(fā)射放射性同位素，如F-18和C-11，半衰期短（分別為110分 鐘和20分鐘），其適合于早期時間點的縱向PET成像。雖然F-18和C-11特別適用于PET， 但锝-99m是單光子發(fā)射計算機(jī)斷層顯像（SPECT)中使用最廣泛的放射性核素，這是由于其 最佳核特性（半衰期=6h，140keVY光子）及其可從制造商那以低成本方便地獲得。這使 锝-99m對用于研發(fā)腫瘤成像的放射性示蹤劑具有吸引力。
[0005] 在傳統(tǒng)技術(shù)中使用锝-99m發(fā)射的γ射線，生物活性化合物的肽序列通常與螯合 劑綴合。在肽合成后，螯合劑在末端氨基酸殘基或特異性氨基酸序列與肽化學(xué)地綴合。除 了這兩個步驟，還可能需要其他步驟如純化，其導(dǎo)致合成產(chǎn)量的降低。
[0006] 當(dāng)用于成像的放射性配體不是從身體分泌的，那么在體內(nèi)產(chǎn)生非特異性信號，其 導(dǎo)致信噪比的降低，并因此降低檢測靈敏度。此外，體內(nèi)保留的放射性配體增加了將身體過 度暴露于輻射的風(fēng)險。因此，已進(jìn)行努力克服這些問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問題
[0008] 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的
【發(fā)明者】為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所遇到的問題，進(jìn)行了深入徹 底的關(guān)于成像造影劑的研究，所述造影劑能夠容易地與锝_99m三羰基前體綴合并顯示腎 清除率，其獲得了以下發(fā)現(xiàn)，即甘氨酸，無論是單體或低聚體形式，都能夠容易地與锝_99m 三羰基前體結(jié)合，且得到的锝_99m三羰基甘氨酸復(fù)合物起雙功能螯合劑的作用并迅速地 從血液中清除。
[0009] 因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種制備锝-99m三羰基標(biāo)記的甘氨酸單體或 低聚體的方法，并提供一種包含所述锝_99m三羰基標(biāo)記的甘氨酸單體或低聚體的成像造 影組合物。
[0010] 然而，本發(fā)明中將實現(xiàn)的目標(biāo)不限于上述目的，本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)勢將 通過以下詳細(xì)描述更清楚地理解。
[0011] 技術(shù)方案
[0012] 為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了一種包含锝-99m-標(biāo)記的甘氨酸單體或低聚體 的成像造影組合物。
[0013] 此外，本發(fā)明提供了一種制備锝-99m-標(biāo)記的甘氨酸單體或低聚體锝-99m的方 法，包括：合成锝_99m三羰基前體，并用锝-99m三羰基前體標(biāo)記甘氨酸單體或低聚體。
[0014] 有益效果
[0015] 锝_99m三羰基標(biāo)記的甘氨酸低聚體可應(yīng)用于各種肽基生物分子，如R⑶肽、生長 抑素、神經(jīng)降壓肽等，并顯示快速的腎清除率而不會在體內(nèi)過量保留。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1示出了锝_99m(A)、锝-99m三羰基前體⑶、锝-99m三羰基甘氨酸（C)、 锝-99m三羰基甘氨酸三聚體（D)和锝-99m三羰基甘氨酸五聚體（E)的HPLC圖譜；
[0017] 圖2示出了 ICR小鼠的SPECT圖像，其中分布有锝-99m三羰基前體（A)、锝-99m 三羰基甘氨酸（B)、锝-99m三羰基甘氨酸三聚體（C)、锝-99m三羰基甘氨酸五聚體（D)。
[0018] 圖3示出了锝-99m三羰基前體（A)、锝-99m三羰基AGRGDS (B :R⑶肽）、锝-99m 三羰基GGGAGRGDS(C :含有甘氨酸三聚體的R⑶肽）、锝-99m三羰基RRPIL(D :神經(jīng)降壓肽 (8-13)肽），及锝-99m三羰基神經(jīng)降壓肽（8-13) (E :含有甘氨酸三聚體的R⑶肽）的HPLC 圖譜。
[0019] 最佳模式
[0020] 本發(fā)明涉及甘氨酸單體或低聚體的用途，其可使用自動化肽合成儀在單一過程中 合成，且考慮到成本和時間其可有效地應(yīng)用于放射性示蹤劑。更具體地，本發(fā)明提出了一種 用于成像造影的含有锝-99m-標(biāo)記的甘氨酸單體或低聚體的成像造影組合物。
[0021] 此外，本發(fā)明提出了一種锝-99m-標(biāo)記的甘氨酸單體或低聚體的制備方法，包括：
[0022] a)合成锝-99m三羰基前體；和
[0023] b)用锝-99m三羰基前體標(biāo)記甘氨酸單體或低聚體。
[0024] 在以下實施例部分將詳細(xì)解釋，本
【發(fā)明者】用锝_99m三羰基前體標(biāo)記甘氨酸單體、 三聚體（Gly (3))和/或五聚體（Gly (5))以獲得锝-標(biāo)記的三羰基甘氨酸（實施例1)，其 通過辛醇-水分配系數(shù)法（實施例3)確定為親水性，并經(jīng)斷層掃描確定其通過腎臟由體內(nèi) 快速釋放（實施例4)。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明，可通過自動化肽合成將甘氨酸添加到已知靶標(biāo)肽。更詳細(xì)地，使用本 發(fā)明的實施方案中的以下方法進(jìn)行肽合成，但不限于此。使用ASP48S(P印tron Inc.)通過 Fmoc 固相膚合成（SPPS)合成膚，并使用 Vydac Everest C18 柱（250_ X 22mm, ΙΟμπι)通 過反相HPLC純化。用含有0.1% (ν/ν)三氟乙酸的水-乙腈線性梯度（10-75% (ν/ν)的 乙腈）進(jìn)行洗脫。使用LC/MS(Agilent ΗΡ1100系列）確定純化肽的分子量。
[0026] Fmoc SPPS旨在從C-末端一個接一個地連接氨基酸。使用了 NH2_Ser (叔丁 基）-2_氯-二苯甲基樹脂，或NH2-Leu_2-氯-二苯甲基樹脂，其中膚的C-末端的第一個 氨基酸與樹脂相連接。肽合成中使用的所有氨基酸都是被Fmoc (芴基甲氧基羰基）N-保護(hù) 的，而殘基由Trt、叔丁氧羰基（Boc)、叔丁基（t-Bu)、Pbf等保護(hù)，其全部在酸中去除。例 如，可以使用 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(0tBu)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、 Fmoc-Pr〇-〇H、 Fmoc-Met-OH、 Fmoc_His(Trt)-〇H、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Gly-〇H、 Fmoc-Lys (Boc) -〇H、Fmoc-Ser (tBu) -〇H、Fmoc-Thr (tBu) -〇H 和 Fmoc-Tyr (tBu) -〇H。作為偶 聯(lián)劑，使用HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基）-1，1，3,3-四甲基銨六氟磷酸酯）/H0Bt(N-羥 基苯并三唑）/NMM(4-甲基嗎啉）。使用含20%哌啶的DMF完成Fmoc基團(tuán)的去除。用 95 :3:2了?4(三氟乙酸）：115(三異丙基硅烷）：!120的混合物進(jìn)行蛋白質(zhì)從樹脂的最后清除 和永久保護(hù)基團(tuán)的去除。觀察到以這種方式添加甘氨酸三聚體的RGD或神經(jīng)降壓肽（8-13) 肽序列與锝-標(biāo)記的前體以更高效率綴合，相比較于RGD或神經(jīng)降壓肽（8-13)肽本身（實 施例2)。
[0027] 因此，本發(fā)明的锝_99m三羰基標(biāo)記的甘氨酸單體或低聚體可進(jìn)一步結(jié)合到靶標(biāo) 肽上。
[0028] 如本文所使用的，術(shù)語"靶標(biāo)肽"是指生物活性肽，其易于結(jié)合到細(xì)胞的特定位點。 靶標(biāo)肽的例子包括但不限于RGD肽（精氨酰甘氨酰天冬氨酸）、神經(jīng)降壓肽、抑生長素、血 管緊張肽、促黃體激素釋放激素（LHRH)、胰島素、催產(chǎn)素、神經(jīng)激肽-1 (NK-1)、血管活性腸 肽（VIP)、物質(zhì)P (SP)、神經(jīng)肽Y(NPY)、內(nèi)皮素A、內(nèi)皮素B、緩激肽、白細(xì)胞介素-1、表皮生長 因子（EGF)、縮膽囊肽（CCK)、甘丙肽、促黑素細(xì)胞激素（MSH)、蘭樂肽、奧曲肽和精氨酸升壓 素，優(yōu)選RGD肽（精氨酰甘氨酰天冬氨酸）或神經(jīng)降壓肽。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的成像造影組合物可不經(jīng)腸道施用，例如，通過推注、靜脈注射或動脈 內(nèi)注射。為了對肺部成像，可使用噴霧劑或氣霧劑施用造影組合物?？刹捎每诜蚪?jīng)直腸途 徑施用造影組合物。然而，本發(fā)明并不限于這些途徑。只要是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，任何施 用方法都可用于本發(fā)明。在這方面，成像造影組合物的腸胃外劑型必須是無微生物、生物不 可接受的物質(zhì)，且無順磁性、超順磁性、鐵磁性（ferromagnetic)或鐵磁（ferromagnetic) 雜質(zhì)。本發(fā)明的組合物可與通常用于非口服溶液、賦形劑和MR造影劑的防腐劑、抗菌劑、緩 沖液和抗氧化劑結(jié)合使用。此外，所述組合物可保護(hù)其他添加劑，如果其不妨礙最終產(chǎn)品的 生產(chǎn)、儲存和使用。
[0030] 本發(fā)明成像造影組合物的有效量取決于各種因素，包括患者的狀態(tài)和年齡、疾病 嚴(yán)重程度、造影劑的制劑形式、施用途徑、施用時間，其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。 通常，施用的造影劑數(shù)量為1至1. 〇〇〇mg/kg重量的劑量,優(yōu)選為3至300mg/kg重量的劑量。

【具體實施方式】
[0031] 將通過以下實施例獲得對本發(fā)明更好的理解，以下列出的實施例僅用于說明目 的，而不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
[0032] 制備實施例1
[0033] 锝-99m-標(biāo)記的甘氨酸的制備
[0034] 從以下材料中制備根據(jù)本發(fā)明的锝-99m-標(biāo)記的甘氨酸單體或低聚體。
[0035] ①材料：由Daehan Gas (韓國，首爾）提供一氧化碳，并在使用之前使用氧氣捕獲 器（trap)純化。使用Unitech Tc_99m產(chǎn)生器（Samyoung Unitech·有限公司，韓國）在 0.9%的氯化鈉中制備以過锝酸鹽形式存在的锝-99m。甘氨酸，Gly-Gly-Gly (甘氨酸三聚 體）和Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (甘氨酸五聚體）購買于Sigma化學(xué)公司（美國，圣路易斯）。
[0036] ②動物試驗：雌性無菌ICR小鼠（7周齡）購買于Orient公司（韓國，首爾）并且 在實驗使用之前馴化一周。將小鼠保持在相對濕度為50±5%，溫度23±2°C，12小時光暗 循環(huán)的環(huán)境中，允許小鼠自由獲得食物和水，并在使用之前馴化至少一周。所有的動物實驗 均在由韓國原子能研究所的研究所動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)后進(jìn)行。
[0037] 實施例1
[0038] 锝-99m三羰基甘氨酸復(fù)合物的制備
[0039] 將锝_99m三羰基前體施加到甘氨酸單體和低聚體以獲得锝-99m三羰基甘氨酸。
[0040] 〈1-1>锝-99m三羰基前體的合成
[0041] 通過向市售產(chǎn)生器的5ml的瓶子中添加lml的99mTc04_(10mCi)制備 [ 99mTc (CO) 3 (H20) 3]+，該 5ml 的瓶子中含有硼燒碳酸鉀（potassium boranocarbonates) (5. 9mg)、十水四硼酸鈉（2. 85mg)、脫水酒石酸鈉（8. 5mg)和碳酸鈉（7. 15mg)，并且溶液在 氮氣條件下在沸水中加熱30分鐘。使用反相高效液相色譜法檢測锝-99m三羰基前體的標(biāo) 記率和穩(wěn)定性。
[0042] 至于 HPLC，使用 Agilent 1200 系列（Agilent Technologies, Waldbronn,德國）， 其配備有真空脫氣裝置、二元泵、溫度控制自動進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外可見光檢測器和放射 性年代測定儀。在Nucleosil C18柱（5微米，3. 0x250mm，Supelco有限公司，美國賓夕法尼 亞州）上，用甲醇（溶劑B)和0· 05M的TEAP (溶劑A)洗脫，在室溫下進(jìn)行HPLC。用三氯乙 酸將移動相的pH值調(diào)整為2.3。在HPLC中，在第0-5分鐘，用100%A進(jìn)行洗脫；在第5? 8分鐘，使用75% A/25% B?100% A/0% B的線性梯度洗脫；在第8?11分鐘，使用66% A/34% B?75% A/25% B的線性梯度洗脫；在第11?22分鐘，使用0% A/100% B?66% A/34% B的線性梯度洗脫；在第22?25分鐘，使用100% B洗脫。洗脫溶劑以10 μ 1等份 以0. 6ml/min的流速加載。
[0043] 如圖1所示，[99mTc(C0)3(H20) 3]+以高產(chǎn)率（>95% )制備，而不需要額外的純化步 驟。
[0044] 〈1_2>用锝-99m三羰基前體標(biāo)記
[0045] 將锝-99m三羰基前體施加到甘氨酸單體或甘氨酸低聚體。在這方面，將在實施例 1-1中合成的lml的锝-99m三羰基前體加入到反應(yīng)器中的50 μ 1的甘氨酸單體、甘氨酸三 聚體或甘氨酸五聚體（在鹽水中l(wèi)〇mg/ml)，然后在75°C加熱30分鐘。使用放射-HPLC測 定標(biāo)記率。
[0046] 測量結(jié)果如圖1所示。由圖1的色譜可以看出，所有的甘氨酸單體、甘氨酸三聚體 或甘氨酸五聚體都以80%或更高的標(biāo)記率標(biāo)記有锝-99m三羰基。HPLC時，在10. 3分鐘檢 測到锝-99m三羰基-甘氨酸的單峰值，而锝-99m三羰基核在第4分鐘被洗脫。因此，甘氨 酸和甘氨酸低聚體以高標(biāo)記率被標(biāo)記有锝_99m三羰基前體。
[0047] 實施例2
[0048] 甘氨酸三聚體锝_99m三羰基標(biāo)記的R⑶和神經(jīng)降壓肽（8-13)的效果
[0049] 將甘氨酸三聚體施加到靶標(biāo)肽的末端序列，檢測標(biāo)記有锝_99m三羰基前體的效 果。為此，使用以下自動化肽合成方法合成原型肽（AGRGDS和RRPHL)和添加甘氨酸三聚 體的肽（GGGAGRGDS 和 GGGRRPHL)。
[0050] 〈2-DAGRGDS 的合成
[0051 ] 使用以下自動化肽合成方法合成AGRGDS :
[0052] 1)連接步驟：加入保護(hù)的氨基酸（8當(dāng)量（eqs·))和含連接劑HBTU(8當(dāng)量）/ H0Bt(8當(dāng)量）/NMM(16當(dāng)量）的DMF至NH 2-Ser (叔丁基）-2-氯-三苯甲基樹脂中，并與其 在室溫下反應(yīng)2小時，接著用DMF、甲醇和DMF按順序洗滌。
[0053] 2) Fmoc去保護(hù)步驟：連接步驟完成后，將含20 %哌啶的DMF加入樹脂中，并與樹脂 在室溫下反應(yīng)5分鐘。該過程重復(fù)兩次，之后用DMF、甲醇和DMF按順序洗滌。
[0054] 3)重復(fù)進(jìn)行步驟1)和2)，最后合成肽架（NH2-A-G_R (Pbf) -G-D (叔丁基）-S (叔丁 基）-2-氯-三苯甲基樹脂），接著使用95:3:2的TFA: TIS:H20的混合物從樹脂中分離肽。
[0055] 4)向反應(yīng)混合物中加入冷卻的乙醚，并且離心以沉淀所述肽。通過HPLC純化后， 使用MS檢測肽的質(zhì)量，并凍干。
[0056] <2_2>GGGAGRGDS 的合成
[0057] 使用以下自動化肽合成方法合成GGGAGRGDS :
[0058] 1)連接步驟：加入保護(hù)的氨基酸（8當(dāng)量）和含連接劑HBTU(8當(dāng)量）/H0Bt(8當(dāng) 量）/NMM(16當(dāng)量）的DMF至NH2-Ser (叔丁基）-2-氯-三苯甲基樹脂中，并與其在室溫下 反應(yīng)2小時，接著用DMF、甲醇和DMF按順序洗滌。
[0059] 2) Fmoc去保護(hù)步驟：連接步驟完成后，將含20 %哌啶的DMF加入樹脂中，并與樹脂 在室溫下反應(yīng)5分鐘。該過程重復(fù)兩次，之后用DMF、甲醇和DMF按順序洗滌。
[0060] 3)重復(fù)進(jìn)行步驟1)和2)，最后合成肽架（NH2-G-G-G-A-G-R (Pbf) -G-D (叔丁 基）-s (叔丁基）-2-氯-三苯甲基樹脂），接著使用95:3:2的TFA: TIS: H20的混合物從樹 脂中分離肽。
[0061] 4)向反應(yīng)混合物中加入冷卻的乙醚，并且離心以沉淀所述肽。通過HPLC純化后， 使用MS檢測肽的質(zhì)量，并凍干。
[0062] <2-3>RRPHL 的合成
[0063] 使用以下自動化肽合成方法合成RRPYIL。
[0064] 1)連接步驟：加入保護(hù)的氨基酸（8當(dāng)量）和含連接劑HBTU(8當(dāng)量）/H0Bt(8當(dāng) 量）/NMM(16當(dāng)量）的DMF至NH 2-Leu-2-氯-三苯甲基樹脂中，并與其在室溫下反應(yīng)2小 時，接著用DMF、甲醇和DMF按順序洗滌。
[0065] 2) Fmoc去保護(hù)步驟：連接步驟完成后，將含20 %哌啶的DMF加入樹脂中，并與樹脂 在室溫下反應(yīng)5分鐘。該過程重復(fù)兩次，之后用DMF、甲醇和DMF按順序洗滌。
[0066] 3)重復(fù)進(jìn)行步驟1)和2)，最后合成肽架（NH2_R (Pbf) -R (Pbf) -P-Y (叔丁 基）-I-L-2-氯-三苯甲基樹脂），接著使用95:3:2的TFA: TIS: H20的混合物從樹脂中分離 肽。
[0067] 4)向反應(yīng)混合物中加入冷卻的乙醚，并且離心以沉淀所述肽。通過HPLC純化后， 使用MS檢測肽的質(zhì)量，并凍干。
[0068] <2-4>GGGRRPHL 的合成
[0069] 使用以下自動化肽合成方法合成GGGRRPHL。
[0070] 1)連接步驟：加入保護(hù)的氨基酸（8當(dāng)量）和含連接劑HBTU(8當(dāng)量）/H0Bt(8當(dāng) 量）/NMM(16當(dāng)量）的DMF至NH 2-Leu-2-氯-三苯甲基樹脂中，并與其在室溫下反應(yīng)2小 時，接著用DMF、甲醇和DMF按順序洗滌。
[0071] 2) Fmoc去保護(hù)步驟：連接步驟完成后，將含20 %哌啶的DMF加入樹脂中，并與樹脂 在室溫下反應(yīng)5分鐘。該過程重復(fù)兩次，之后用DMF、甲醇和DMF按順序洗滌。
[0072] 3)重復(fù)進(jìn)行步驟 1)和 2)，最后合成肽架（NH2-G-G-G-R(Pbf)-R(Pbf)-P_Y (叔丁 基）-I-L-2-氯-三苯甲基樹脂），接著使用95:3:2的TFA: TIS: H20的混合物從樹脂中分離 肽。
[0073] 4)向反應(yīng)混合物中加入冷卻的乙醚，并且離心以沉淀所述肽。通過HPLC純化后， 使用MS檢測肽的質(zhì)量，并凍干。
[0074] 〈2_5>用锝-99m三羰基標(biāo)記合成肽及其分析
[0075] 在實施例2-1至2-4中合成的肽用锝-99m三羰基標(biāo)記并且以與實施例1中相同 的方式進(jìn)行分析。
[0076] 結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，觀察到與原型肽AGRGDS和RRPHL本身相 t匕，加入甘氨酸三聚體的肽GGGAGRGDS和GGGRRPHL以高標(biāo)記率標(biāo)記有锝-99m三羰基。
[0077] 這些數(shù)據(jù)表明不同的生物活性化合物，當(dāng)加入了甘氨酸三聚體時，可以容易地被 锝-99m三羰基所標(biāo)記。
[0078] 實施例3
[0079] 锝_99m三羰基甘氨酸辛醇-水分配系數(shù)
[0080] 為了預(yù)測锝-99m三羰基甘氨酸復(fù)合物的體內(nèi)殘留和降解率，如下所述一式三份 測定辛醇-水分配系數(shù)。向500 μ 1的氮氣凈化的0. 05M PBS (磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7. 4)和 500 μ 1的正辛醇的混合物中加入10 μ 1锝-99m三羰基甘氨酸、甘氨酸三聚體或甘氨酸五聚 體，接著渦旋3分鐘。在SORVALL FRESCO離心機(jī)（Asheville,美國北卡羅來納州）中，以 3, OOOxg離心5分鐘，以獲得兩個不同的相。從每個PBS層和辛醇層抽取20 μ 1，然后其使 用井式碘化鈉（ΤΙ)閃爍探測器測量放射性。根據(jù)以下等式計算分配系數(shù)。
[0081] 〈等式〉
[0082] Log p = log (辛醇（cpm)/ 水（cpm))
[0083] 在表1中給出了锝_99m三羰基-甘氨酸單體和低聚體的辛醇-水分配系數(shù)。觀 察到它們具有的正辛醇/緩沖液的分配系數(shù)為約-〇. 5至-16。
[0084]【表1】
[0085]

【權(quán)利要求】
1. 一種锝-99m-標(biāo)記的單體或低聚體的制備方法，包括： a) 合成锝_99m三羰基前體；和 b) 用所述锝_99m三羰基前體標(biāo)記甘氨酸單體或低聚體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述甘氨酸低聚體是甘氨酸三聚體或甘氨酸五聚 體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述甘氨酸單體或低聚體進(jìn)一步綴合到靶標(biāo)肽 中。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述靶標(biāo)肽選自由RGD肽(精氨酰甘氨酰天冬 氨酸)、神經(jīng)降壓肽、抑生長素、血管緊張肽、促黃體激素釋放激素、胰島素、催產(chǎn)素、神經(jīng)激 肽-1、血管活性腸肽、物質(zhì)P、神經(jīng)肽Y、內(nèi)皮素 A、內(nèi)皮素 B、緩激肽、白細(xì)胞介素-1、表皮生 長因子、縮膽囊肽、甘丙肽、促黑素細(xì)胞激素、蘭樂肽、奧曲肽和精氨酸升壓素組成的組中。
【文檔編號】A61K49/08GK104254344SQ201380022372
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月14日
【發(fā)明者】張范洙, 樸相炫, 李柱相, 盧鍾國 申請人:韓國原子力研究院