人淋巴系器官源性抑制性基質(zhì)細(xì)胞的分離和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于抑制免疫反應(yīng)的方法。所述方法涉及向需要此類治療的受試者投予有效抑制所述受試者的所述免疫反應(yīng)的量的分離淋巴系組織源性抑制性基質(zhì)細(xì)胞LSSC。本發(fā)明還涉及一種通過使用酶混合物與攪動的組合來消化淋巴系組織片段，然后收集LSSC，從而分離LSSC的方法。本發(fā)明還提供包含LSSC的醫(yī)藥制劑。
【專利說明】人淋巴系器官源性抑制性基質(zhì)細(xì)胞的分離和用途
[0001] 相關(guān)申請案
[0002] 本申請案依據(jù)35U. S. C. § 119(e)主張2012年3月21日申請的美國臨時申請案 號61/613, 697的權(quán)益，所述申請案的內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。
[0003] 聯(lián)邦贊助的研究
[0004] 本發(fā)明是根據(jù)NIH撥款DK074500、K01DK087770和AI045757在政府支持下作出。 因此，美國政府在本發(fā)明中享有某些權(quán)利。

【背景技術(shù)】
[0005] 免疫抑制藥物被用于抑制或防止免疫系統(tǒng)的活性，從而治療某些疾病。臨床上，其 被用于治療或預(yù)防多種病況，例如預(yù)防移植的器官和組織（例如骨髓、心臟、腎、肝等）的排 斥反應(yīng),及治療炎癥性疾病或自體免疫性疾病,例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮癬 和炎癥性腸病。當(dāng)前被批準(zhǔn)用于治療慢性炎癥性疾病的免疫抑制藥物需要常常投予，并且 帶有顯著副作用，包括腎毒性和發(fā)病的風(fēng)險。
[0006] 盡管已經(jīng)描述免疫抑制性基質(zhì)細(xì)胞類型（例如間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞），但其定義不明 確，并且在臨床試驗中無法滿足主要功效終點。此外，由于難以成功分離基質(zhì)細(xì)胞，故這些 細(xì)胞的分離仍是個問題。歸因于由不想要的免疫活性引起的病況的嚴(yán)重程度和跡象，例如 自體免疫性或炎癥性疾病，故特別需要開發(fā)出這些疾病的有效治療。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在一些方面，本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)：從淋巴結(jié)分離的基質(zhì)細(xì)胞可抑制免疫反應(yīng)。淋 巴結(jié)源性基質(zhì)細(xì)胞抑制免疫反應(yīng)的能力與其已知的吸引免疫細(xì)胞的能力相結(jié)合使得其成 為一種抑制受試者中的免疫反應(yīng)的有效工具。因此，本發(fā)明的一些方面涉及一種用于抑制 免疫反應(yīng)的方法，所述方法是通過向需要此類治療的受試者投予有效抑制所述受試者的所 述免疫反應(yīng)的量的分離淋巴系組織源性抑制性基質(zhì)細(xì)胞（LSSC)實現(xiàn)。在一些實施例中，投 予受試者的LSSC是離體擴增的細(xì)胞。在一些實施例中，投予所述受試者的LSSC實質(zhì)上不 含非LSSC。在一些實施例中，向所述受試者投予至少10萬個LSSC/kg。在一些實施例中， 向所述受試者投予至少100萬個LSSC/kg。
[0008] 所述LSSC可從以下組織中的任一種或組合獲得：淋巴結(jié)、脾、胸腺、扁桃腺、腺樣 增殖體及派爾集合淋巴結(jié)（Peyer's patch)。所述LSSC相對于所述受試者可以是自體的、 同種異體的或異種異體的。
[0009] 在一些實施例中，所述LSSC是在植入所述受試者中的二維或三維構(gòu)架之上或之 中。在一些實施例中，所述LSSC是通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)注射或通過 局部投予到病變、器官、器官囊、脂肪或淋巴結(jié)中來向所述受試者投予。
[0010] 需要治療的受試者是指患有例如自體免疫性或炎癥性疾病的受試者。自體免疫性 或炎癥性疾病的實例包括（但不限于）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮癬、炎癥性腸病、 移植物抗宿主疾病及敗血病。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種分離LSSC的方法。所述方法包含使用酶混合物 與攪動的組合來消化淋巴系組織片段，并且然后收集所述LSSC。
[0012] 所述淋巴系組織片段的消化可以一系列步驟進行，所述步驟包含：
[0013] (i)將所述淋巴系組織片段與酶混合物一起培育；
[0014] (ii)使用移液管攪動所述組織，隨后培育以使較大片段沉降；
[0015] (iii)取出上清液并重復(fù)步驟⑴和（ii)，直到所有片段都消化；并且
[0016] 其中通過匯集所有上清液部分，隨后離心以獲得細(xì)胞團粒來收集所述LSSC。
[0017] 在實施例中，使所述分離LSSC在包含補充有生長因子、血清、血小板溶解產(chǎn)物和 抗生素中的一或多種的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中生長。在實施例中，所述分離LSSC可 以按1-10, 000個細(xì)胞/平方厘米的密度生長。在實施例中，所述分離LSSC是在0. 1-21% 的氧分壓下生長。在一些實施例中，所述LSSC可生長直到所述LSSC實質(zhì)上不含非LSSC。 在一些實施例中，使LSSC生長直到基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加至少10%、20%、30%、40%、50%、 75 %、100 %、200 %或更多。在一些實施例中，通過去除造血細(xì)胞或其它非基質(zhì)細(xì)胞，或通過 使細(xì)胞群在有利于基質(zhì)細(xì)胞生長超過非基質(zhì)細(xì)胞生長的條件下生長，來使含有LSSC的群 體富集LSSC。所述條件描述于本文中。
[0018] 在一個實施例中，所述酶混合物包含培養(yǎng)基、分散酶、膠原酶和DNA酶I。所述LSSC 可來源于淋巴結(jié)、脾、胸腺、扁桃腺、腺樣增殖體和/或派爾集合淋巴結(jié)。在一些實施例中， 使用本文所述的方法分離LSSC可用于抑制受試者中的免疫反應(yīng)。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種包含分離淋巴系組織源性抑制性基質(zhì)細(xì)胞 (LSSC)的組合物。所述LSSC可使用上述方法分離。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種醫(yī)藥制劑，其包含分離淋巴系組織源性抑制性 基質(zhì)細(xì)胞（LSSC)的組合物?？赏ㄟ^使用化學(xué)方法、機械方法和電細(xì)胞分離方法中的一或多 種處理淋巴系組織片段，并且然后收集LSSC，來分離LSSC。
[0021] 在一些實施例中，所述分離LSSC是通過細(xì)胞培養(yǎng)擴增的。在一些實施例中，所述 分離LSSC是離體擴增的細(xì)胞。在一些實施例中，所述分離LSSC是通過使所收集的細(xì)胞生 長直到所述LSSC實質(zhì)上不含非LSSC來擴增的。
[0022] 在一些實施例中，所述分離LSSC共同表達⑶140a和TO-L2。在一些實施例中，所 述分離LSSC共同表達⑶140a和LTBR。在一些實施例中，所述分離LSSC共同表達⑶140a、 PD-L2和LTBR。在一些實施例中，所述分離LSSC表達至少一種選自由以下各項組成的群組 的其它淋巴系標(biāo)記物：PD_L1、Thy-1、MADCAM-I、MYHll、IL-7R或ITGA7。在一些實施例中， 所述分離LSSC表達至少一種選自由IL-6、CCL19、CCL21或VEGF組成的群組的因子。
[0023] 所述LSSC可從選自由以下組成的群組的物種分離：人類、非人類靈長類動物、犬 科動物、貓科動物、馬科動物、豬科動物、?？苿游锛皣X動物。所述LSSC可在體內(nèi)或體外 抑制T細(xì)胞增殖。
[0024] 本發(fā)明的實施例和方法可各自獨立地或組合實施。另外，本文中使用的措辭和術(shù) 語都是出于說明的目的，并且不應(yīng)視作限制。本文中使用的"包括"、"包含"或"具有"、"含 有"、"涉及"及其變化形式旨在涵蓋其后所列各項和其等效物以及其它各項。
[0025] 本發(fā)明的這些和其它方面，以及各種益處和效用參照【具體實施方式】將顯而易見。 應(yīng)了解，本發(fā)明的每個方面均可涵蓋各種實施例。
[0026] 本申請案中所標(biāo)識的所有文獻都以全文引用的方式并入本文中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1顯示了匯集的鼠類淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞消化和制備用于細(xì)胞分選的示意圖。1.將 酶混合物（含〇? 8mg/ml分散酶、0? 2mg/ml膠原酶P、0. lmg/ml DNA酶I的RPMI-1640)添加 到組織中，在37C水浴中培育。2.在10-20分鐘（參看方法）之后，使用Iml移液管攪動淋 巴結(jié)片段，然后培育直到片段沉降。3.取出含有釋放的細(xì)胞的上清液，對其進行離心并將 其在冰上儲存。4.重復(fù)步驟1-3,直到所有片段都完全消化（不超過60分鐘）。5.匯集所 有上清液部分，離心，過濾并計數(shù)。6.添加抗CD45微珠，在4°C下于轉(zhuǎn)輪上培育。7.使用 MACS或AutoMACS耗盡CD45+細(xì)胞，計數(shù)。8.用抗體對富集的CD45-基質(zhì)染色；在20psi下 使用IOOum吸頭分選達到高純度。
[0028] 圖2顯示了用于分離淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞亞群的低死亡率方法的驗證。圖2A顯示了使 用低死亡率酶消化方法制備的單細(xì)胞懸浮液的活力。n = 6,平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖2B顯示 了從個別小鼠的皮膚引流或腸系膜淋巴結(jié)新鮮分離的淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞亞群的典型流式細(xì) 胞分析圖。圖2C顯示了在鼠類淋巴結(jié)的冷凍切片上原位鑒別的淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞亞群。頂 圖：T細(xì)胞區(qū)FRC(腎小球足突細(xì)胞膜粘蛋白+CD3D和高內(nèi)皮小靜脈（腎小球足突細(xì)胞膜 粘蛋白_CD31+，呈立方形的形態(tài)）。HEV的兩個實例是使用箭頭指示。中間圖指示髓LEC(腎 小球足突細(xì)胞膜粘蛋白+CD31+)和大髓血管（腎小球足突細(xì)胞膜粘蛋白XD31+)。髓淋巴管 使用箭頭顯示。底圖：囊傳入LEC(Lyvel+MadCAM+)、MRC(囊下，LyvellfeidCAM +)和FDC(濾 泡，LyVel_，MadCAM+)。共定位覆蓋圖在合并圖像上以白色顯示。原始放大倍率：200x。圖 2D顯示了經(jīng)消化并染色用于流式細(xì)胞分析的人淋巴結(jié)（非腸系膜來源）。點圖代表了 n = 4個獨立實驗。
[0029] 圖3展現(xiàn)淋巴結(jié)在基質(zhì)細(xì)胞組成方面顯示位點特異性變化。對來自個別C57B1/6 小鼠的淋巴結(jié)進行消化并染色以用于流式細(xì)胞分析。圖3A顯示了淋巴結(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。圖3B 顯示了⑶45陰性淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞亞群的比例。圖3C顯示了淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞亞群的數(shù)量。 圖3D展現(xiàn)以占總FRC或LEC的比例顯示的MadCAM+細(xì)胞。圖3E顯示了 MadCAM+FRC或LEC 的總數(shù)量。圖3F顯示了從年齡相配的Rag^或WT(B6)小鼠分離的皮膚引流淋巴結(jié)的細(xì)胞 結(jié)構(gòu)。圖3G顯示了來自年齡相配的Rag^或WT小鼠的淋巴結(jié)基質(zhì)的數(shù)量。圖3G顯示了來 自年齡相配的Rag^或WT小鼠的淋巴結(jié)基質(zhì)的數(shù)量。圖3H顯示了在年齡相配的Rag-/-或 WT小鼠的SLN中MadCAM+FRC(MRC)或LEC的比例，或圖31顯示了其數(shù)量。這些圖代表n = 5只小鼠。圖3J顯示了在MRC或MadCAM+LEC中MadCAM染色的平均熒光強度（MFI)。WT = 野生型。*P〈〇. 05 ;**P〈0. 01 曼-惠特尼 U 測試（Mann-Whitney U Test)。n = 5-10 只小 鼠來自2-3個獨立實驗。
[0030] 圖4顯示了淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞富集和分選。在圖4A中，對來自6-10只C57B1/6小 鼠的皮膚引流淋巴結(jié)進行酶消化并使用autoMACS富集CD45^基質(zhì)細(xì)胞。對添加到柱中（輸 入）和從柱重新得到（輸出）的CD4T基質(zhì)的數(shù)量作圖。數(shù)據(jù)描繪了 n = 5個獨立實驗。在 圖4B中，計算了有關(guān)基質(zhì)的autoMACS富集的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)率百分比。圖4C顯示了 autoMACS 富集之前和之后基質(zhì)細(xì)胞的流式細(xì)胞分析圖。圖4顯示了主要淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞亞群的分選 策略和分選后純度。點圖針對CD451典化丙啶-基質(zhì)進行門控。
[0031] 圖5顯示在來自皮膚引流淋巴結(jié)的鼠類FRC中細(xì)胞因子的位點特異性轉(zhuǎn)錄上調(diào)。 圖5A顯示了比較從皮膚引流淋巴結(jié)（SLN)或腸系膜淋巴結(jié)（MLN)分選的FRC的微陣列分 析。點圖描繪了對于15, 486個所選探針，SLN相對于MLN的P值與倍數(shù)變化的關(guān)系。在SLN 中上調(diào)的探針以紅色顯示，而在MLN中上調(diào)的探針呈藍色；(P〈0. 05并且倍數(shù)變化>2 ;t測 試）。n = 4-5個獨立重復(fù)實驗。圖5B顯示在SLN中富集的編碼細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體 的基因（KEGG路徑mmu04060;P〈0. 015;利用本杰明校正（Benjamini correction)的經(jīng)修 改費希爾氏精確檢驗（modified Fisher's exact test))。顯示了與MLN相比較，在SLN中 平均表達量的倍數(shù)增加。
[0032] 圖6顯示了鼠類FRC的三維（3D)培養(yǎng)物模擬體內(nèi)功能。在圖6A中，對淋巴結(jié)進 行消化，并將單細(xì)胞懸浮液放入培養(yǎng)物中保持5天，然后進行胰蛋白酶處理并染色用于流 式細(xì)胞剖析。使用CD45鑒別基質(zhì)細(xì)胞（左圖），然后用CD31和腎小球足突細(xì)胞膜粘蛋白進 行染色（右圖，針對⑶45_基質(zhì)進行門控）。具體地說，⑶45是造血細(xì)胞的標(biāo)記物，并且不存 在于基質(zhì)細(xì)胞上。在圖6B中，針對FDC-Ml或相關(guān)同型對照對培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞染色。圖3C 顯示在使用高胰蛋白酶或低胰蛋白酶方案采集的培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞中的CD31染色情況。點 圖表示n = 3個獨立實驗。在圖6D中，采集培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞，然后使用autoMACS進行純化。 將FRC、LEC或混合的FRC和LEC接種于2D (塑料組織培養(yǎng)板）或3D (基質(zhì)膠和膠原蛋白凝 膠）中，并且再培養(yǎng)3天，隨后成像。原始放大倍率10x。圖像表示n = 2個獨立實驗。在 圖6E中，使用了 F-肌動蛋白和DAPI來對2D或3D中純化的FRC染色以突出網(wǎng)絡(luò)。圖像表 示n = 3個獨立實驗。（F)在含或不含PP2的96孔板中，將純化的FRC放入3D培養(yǎng)物中。 24-36小時之后，對凝膠收縮進行定量。圖像代表了 n = 3個獨立實驗。直方圖描繪了平 均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差，P〈〇. 05, t測試。在圖6G中，將純化的FRC放入3D中與純化的樹突狀細(xì) 胞（DC)或B細(xì)胞一起培養(yǎng)，然后每90秒連續(xù)獲取圖像。上圖顯示了來自所捕捉的圖像的 照片，原始放大倍率：20x。下圖顯示了圖像中的基質(zhì)細(xì)胞和相關(guān)遷移的白細(xì)胞的草圖。在 圖6H中，對人淋巴結(jié)進行消化，并將單細(xì)胞懸浮液放入培養(yǎng)物中保持7天，然后進行胰蛋白 酶處理并染色用于流式細(xì)胞剖析。
[0033] 圖7顯示，人淋巴系組織源性抑制細(xì)胞抑制活化的同種異體脾細(xì)胞的增殖。將未 分級分離的LSSC與從不相關(guān)供體新鮮分離的人脾細(xì)胞一起培養(yǎng)。脾細(xì)胞用CFSE(當(dāng)細(xì)胞 分裂時稀釋的一種熒光染料）標(biāo)記。使用PHA和IL-2活化脾細(xì)胞群內(nèi)的T細(xì)胞。柱狀圖 描繪了通過T細(xì)胞抗原受體的表達鑒別的T細(xì)胞。比率指示脾細(xì)胞與基質(zhì)的比例。
[0034] 圖8顯示，人LSSC抑制活化的異種異體T細(xì)胞增殖。將未分級分離的LSSC與新 鮮分離的小鼠脾細(xì)胞一起培養(yǎng)。脾細(xì)胞用當(dāng)細(xì)胞分裂時稀釋的CFSE標(biāo)記。然后使用抗CD3 抗體和抗CD28抗體活化T細(xì)胞。柱狀圖描繪了通過T細(xì)胞抗原受體的表達鑒別的T細(xì)胞。 比率指示脾細(xì)胞與基質(zhì)的比例。
[0035] 圖9顯示，LSSC經(jīng)由新穎機制抑制T細(xì)胞增殖。在圖9A中，將未分級分離的人 LSSC與來源于野生型或IFNy-/-小鼠的新鮮分離的脾細(xì)胞一起培養(yǎng)。脾細(xì)胞用當(dāng)細(xì)胞分 裂時稀釋的CFSE標(biāo)記。然后使用抗CD3抗體和抗CD28抗體活化T細(xì)胞。柱狀圖描繪了通 過T細(xì)胞抗原受體的表達鑒別的T細(xì)胞。比率指示脾細(xì)胞與基質(zhì)的比例。在圖9B中，將 PDPN+LSSC、H)PN_LSSC和未分級分離的LSSC與從不相關(guān)供體新鮮分離的純化的人血液源性 T細(xì)胞一起培養(yǎng)。T細(xì)胞用當(dāng)細(xì)胞分裂時稀釋的CFSE標(biāo)記。使用PHA和IL-2活化T細(xì)胞。 柱狀圖描繪了通過T細(xì)胞抗原受體的表達鑒別的T細(xì)胞。收集上清液并測試亞硝酸鹽（一 氧化氮的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物）的存在。
[0036] 圖10顯示，兩個主要的人淋巴系組織源性抑制細(xì)胞亞群各自抑制活化的同種異 體T細(xì)胞的增殖。在圖IOA中，基于糖蛋白_36(又稱為H)PN)的表達或缺乏來純化兩個 LSSC亞群。兩個亞群均為非內(nèi)皮細(xì)胞（⑶31陰性）并且非造血細(xì)胞（CD45陰性）的。在 圖IOB中，將H)PN+LSSC、H)PN_LSSC或未分級分離的LSSC與從不相關(guān)供體新鮮分離的純化 的人血液源性T細(xì)胞以1:5的比率（LSSC比T細(xì)胞）培養(yǎng)。T細(xì)胞用當(dāng)細(xì)胞分裂時稀釋的 CFSE標(biāo)記。使用PHA和IL-2活化T細(xì)胞。柱狀圖描繪了通過T細(xì)胞抗原受體的表達鑒別 的T細(xì)胞。比率指示脾細(xì)胞與基質(zhì)的比例。
[0037] 圖11顯示，人LSSC停止預(yù)先活化的同種異體T細(xì)胞的分裂。將H)PN+LSSC、 PDPN-LSSC或未分級分離的LSSC與從不相關(guān)供體新鮮分離的純化的人血液源性T細(xì)胞一起 培養(yǎng)。T細(xì)胞用當(dāng)細(xì)胞分裂時稀釋的CFSE標(biāo)記。使用PHA和IL-2活化T細(xì)胞，使其分裂2 天，并且然后將一些T細(xì)胞再接種到LSSC上并進行再刺激，或在無LSSC情況下進行再接種 和再刺激，或進行再接種而不進行再刺激。柱狀圖描繪了通過T細(xì)胞抗原受體的表達鑒別 的T細(xì)胞。比率指示LSSC與T細(xì)胞的比例。
[0038] 圖12顯示，人LSSC使患有嚴(yán)重移植物抗宿主疾病的小鼠的早期致死率顯著降低。 使受體小鼠接受同種異體骨髓移植（分劑量致死照射，隨后靜脈內(nèi)注射全骨髓）。在移植 時，通過共注射含有同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞的供體來源的脾細(xì)胞來誘發(fā)嚴(yán)重GVHD。在誘發(fā) GVHD之后的多個時間點，腹膜內(nèi)注射IX IO6個人LSSC，而對照小鼠接受生理鹽水（媒劑）。 監(jiān)測存活率。
[0039] 圖13顯示LSSC的轉(zhuǎn)錄特征。使用針對表面標(biāo)記物的流式細(xì)胞分析和針對分泌因 子的RT-PCR(圖13A)，以及使用昂飛人基因STL 0 (Affymetrix HuGene STL 0)基因陣列獲 得mRNA轉(zhuǎn)錄組（圖13B)來獲得人LSSC的轉(zhuǎn)錄特征。
[0040] 圖14顯示人LSSC的形態(tài)特征。在補充有胎牛血清的a -MEM中生長的培養(yǎng)的LSSC 顯示類成纖維細(xì)胞形態(tài)。其通常展現(xiàn)較長過程，板狀偽足、絲狀偽足、有褶皺的前導(dǎo)端及粘 著斑。原始放大倍率：l〇〇x。
[0041] 圖15顯示離體擴增的小鼠淋巴結(jié)基質(zhì)使急性敗血性休克的致死率降低。
[0042] 圖16顯示，在2種不同的小鼠模型中，鼠類FRC當(dāng)在治療時間點投予時防止敗血 病。在圖16A中，用LD100劑量的LPS處理3-6周齡的幼C57B16/J小鼠，LPS是一種多糖， 其形成細(xì)菌細(xì)胞壁的一部分并且引起強烈的全身免疫反應(yīng)。由于此模型中沒有活動性感 染，故此模型稱為"無菌敗血病"。小鼠接受LPS之后4小時，用含F(xiàn)RC的生理鹽水或作為 對照的生理鹽水對其進行處理。所述曲線圖描繪了存活率％隨時間的變化。在圖16B中， 如圖16A中所詳述，在極老小鼠（18-24個月大）中誘發(fā)無菌敗血病，隨后在4小時后投予 FRC或生理鹽水。監(jiān)測存活率。在圖16C中，給與幼小鼠盲腸結(jié)扎穿孔（CLP)敗血病，其涉 及用針穿刺腸兩次以使糞便物漏泄到腹膜腔中，引起嚴(yán)重感染，所述感染在24小時內(nèi)發(fā)展 成敗血病。此模型模擬了闌尾破裂、槍傷或其它腸外傷。在CLP之后4小時投予自體FRC。 在圖16D中，給與幼小鼠CLP敗血病并用抗生素處理。如所指示，在CLP之后4小時，小鼠 接受生理鹽水、同種異體FRC或同種異體MSC。MSC(間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞）用作基于細(xì)胞的負(fù) 對照物。MSC是一種抑制性基質(zhì)細(xì)胞類型，但若干作者已顯示，當(dāng)作為同種異體療法在治療 時間點（敗血病損害之后>60分鐘）投予時，其在敗血病中的作用極小或不存在（尼密斯 (Nemeth)等人，2010 ;梅（Mei)等人，2010)。我們的結(jié)果類似地顯示投予MSC并無總體存 活率益處，而同種異體FRC賦予顯著的存活率益處。在圖16E中，在CLP之后16小時對圖 16D中的小鼠進行評估。測量血漿中關(guān)鍵細(xì)胞因子的濃度，比較接受生理鹽水或同種異體 FRC的小鼠與未處理（無敗血病）小鼠。虛線表示可靠檢測的下限和上限。
[0043] 圖17顯示鼠類FRC防止結(jié)腸炎死亡率。通過將純化的天然T細(xì)胞注射到免疫缺 陷小鼠中來誘發(fā)結(jié)腸炎。小鼠針對未知抗原（隨著人類疾病而出現(xiàn)）而發(fā)展T細(xì)胞介導(dǎo)的 炎癥，引起顯著體重減輕、結(jié)腸肥大及死亡。這是人類慢性結(jié)腸炎或克羅恩氏病（Crohn's disease)的模型。在2周時，即在小鼠開始顯示疾病病征并且體重顯著減輕（治療時程） 后，投予同種異體FRC。從第2周到第6周，每周兩次注射FRC，并與生理鹽水處理的對照組 相比較。監(jiān)測存活率。
[0044] 圖18顯示人LSSC分泌可溶性細(xì)胞因子受體。在無刺激或不添加異源因子情況 下，在含BSA的DMEM中培養(yǎng)人LSSC。在接種之后23小時，按照制造商的說明書，使用盧米 尼克斯公司（Luminex Corporation)的MAGPIX系統(tǒng)檢測培養(yǎng)基中的可溶性細(xì)胞因子受體 蛋白?？扇苄约?xì)胞因子受體可在體內(nèi)結(jié)合游離細(xì)胞因子并且防止其受促炎性功能影響。
[0045] 圖19展現(xiàn)從淋巴結(jié)和扁桃腺分離的LSSC在表型上是類似的。通過流式細(xì)胞分析 針對標(biāo)識符的表面表達來評估來源于淋巴結(jié)或扁桃腺的人LSSC。所有細(xì)胞都是CD45陰性 并且⑶31陰性的。
[0046] 圖20顯示，從淋巴結(jié)（圖20A和圖20B)和扁桃腺（圖20C和圖20D)分離的LSSC 顯示相當(dāng)水平的經(jīng)由可溶性因子引起的T細(xì)胞抑制。用每當(dāng)細(xì)胞分裂時稀釋的CFSE對來 源于人血液的同種異體T細(xì)胞進行標(biāo)記。然后，在從淋巴結(jié)或扁桃腺分離的hLSSC存在或 不存在下，使用PHA和hIL-2使T細(xì)胞活化。hLSSC存在于細(xì)胞內(nèi)，或通過0. 4 ii m的曲斯威 爾膜（transwell membrane)從T細(xì)胞物理分離，所述膜允許可溶性因子通過但細(xì)胞不能通 過。顯示了在存在和不存在曲斯威爾情況下，當(dāng)以不同的hLSSC比T細(xì)胞比率培育時分裂 一次、兩次、三次或不分裂的T細(xì)胞％。由可溶性因子引起的抑制％計算如下：在存在曲斯 威爾情況下分裂的T細(xì)胞/在不存在曲斯威爾情況下分裂的T細(xì)胞X 100。

【具體實施方式】
[0047] 在一方面，本發(fā)明涉及分離的淋巴系組織源性抑制性基質(zhì)細(xì)胞（LSSC)。本文描述 了以商業(yè)上適用的方式分離并離體擴增LSSC的方法、包含LSSC的新穎組合物，及LSSC的 用途，特別是在抑制自體、同種異體和異種異體免疫反應(yīng)方面的治療應(yīng)用。
[0048] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，來自淋巴結(jié)的基質(zhì)細(xì)胞可抑制免疫系統(tǒng)的活性。此外，淋巴系組織 源性基質(zhì)細(xì)胞吸引免疫細(xì)胞，這不是其它免疫抑制性基質(zhì)細(xì)胞群的已知特征。淋巴系組織 源性基質(zhì)細(xì)胞吸引免疫細(xì)胞（例如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞）的能力結(jié)合其免疫抑制功能一 起使得其成為用于抑制受試者中的免疫反應(yīng)的意外地有效治療工具。LSSC可單獨或與其它 免疫抑制性藥物一起用于抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的 活性。
[0049] 淋巴結(jié)是位于體內(nèi)淋巴管相交處的重要次級淋巴器官，允許抗原呈遞細(xì)胞與天然 T細(xì)胞和B細(xì)胞之間的高效相互作用并促進免疫反應(yīng)的有效起始（沃諾克（Warnock)等 人，1998，米布斯（Mebius) ,2003，片貝（Katakai)等人，2004a,片貝等人，2004b,賽希特 (Sixt)等人，2005,貝杰諾夫（Bajenoff)等人，2006,喬恩特（Junt)等人，2008)。淋巴 結(jié)基質(zhì)細(xì)胞還在促進天然T細(xì)胞維持方面起到至關(guān)重要并且可論證地未得到正確評價的 作用（林克（Link)等人，2007)。
[0050] 可解離淋巴結(jié)并且使所得細(xì)胞在培養(yǎng)物中生長。"淋巴系組織源性抑制性基質(zhì)細(xì) 胞"是指存在于淋巴系組織中所有細(xì)胞類型，其粘附到組織培養(yǎng)皿上并且可維持一定長度 的時間。培養(yǎng)的細(xì)胞可以是異源群體并且可由駐留在淋巴結(jié)內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞構(gòu)成，例如成 纖維細(xì)胞性網(wǎng)狀細(xì)胞（FRC)、濾泡性樹突狀細(xì)胞（FDC)、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（LEC)、血液內(nèi)皮細(xì)胞 (BEC)及邊緣網(wǎng)狀細(xì)胞（MRC)。培養(yǎng)的細(xì)胞還可為同源群體，或FRC、FDC、LEC、BEC和/或 MRC的任何所選組合。在一些實施例中，使用本文所述的方法分離并離體擴增LSSC。所述 LSSC可來源于皮膚或腸系膜淋巴結(jié)、脾、胸腺、扁桃腺、腺樣增殖體和/或派爾集合淋巴結(jié)。 LSSC不含或耗盡造血LSSC。在一些實施例中，LSSC來源于選自由以下組成的群組的物種： 人類、非人類靈長類動物、犬科動物、貓科動物、馬科動物、豬科動物、牛科動物及嚙齒動物。
[0051] 截然不同的基質(zhì)亞型細(xì)胞賦予淋巴結(jié)的結(jié)構(gòu)并且維持每個小生境。T細(xì)胞區(qū)成纖 維細(xì)胞性網(wǎng)狀細(xì)胞（FRC)表達趨化因子CCL19和CCL21以吸引T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC)， 并且產(chǎn)生由膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)狀物供這些細(xì)胞在其上蠕動（安賽爾 (Ansel)等人，2000，盧瑟（Luther)等人，2000，片貝等人，2004b,貝杰諾夫等人，2006， 林克等人，2007,沃爾夫（Woolf)等人，2007)。與FRC類似但專用于B細(xì)胞吸引的濾泡性 樹突狀細(xì)胞（FDC)是一種專用于B細(xì)胞吸引和抗原呈遞的稀少的基質(zhì)細(xì)胞亞群。FDC僅在 B細(xì)胞濾泡中發(fā)現(xiàn)，其通過CXCL13分泌產(chǎn)生（賽斯特（Cyster)等人，2000)。淋巴結(jié)囊是 基本上由淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（LEC)構(gòu)造的一個擴大的淋巴管，這些LEC將間質(zhì)液帶到淋巴結(jié)并 將其排空到實質(zhì)中。其經(jīng)由副皮質(zhì)和皮質(zhì)過濾，最終到達骨髓中的傳出淋巴，傳出淋巴將淋 巴液再向上游輸送（米布斯，2003,維拉德-默克（Willard-Mack)，2006)。血液內(nèi)皮細(xì)胞 (BEC)構(gòu)造皮質(zhì)血管和毛細(xì)血管，包括專用于吸引血流中的天然T細(xì)胞的高內(nèi)皮小靜脈（米 布斯，2003,維拉德-默克，2006)。
[0052] 文獻中已報道若干其它基質(zhì)細(xì)胞亞群，但研究不多，并且其譜系和主要功能尚未 確定（（弗雷徹（Fletcher)等人，2011)。邊緣網(wǎng)狀細(xì)胞（MRC)是在囊下竇的皮質(zhì)面處生 長的產(chǎn)生CXCL13的基質(zhì)亞群（片貝等人，2008)。其起源未知，不過這些細(xì)胞顯示出與FRC 的相似性，包括腎小球足突細(xì)胞膜粘蛋白表達（片貝等人，2008)。在脾中，類似基質(zhì)細(xì)胞亞 群對于未成熟B細(xì)胞遷移到濾泡中很重要（安賽爾等人，2000)。假定MRC表示淋巴系組織 的組織者（LTo)細(xì)胞亞群的出生后等效物（片貝等人，2008)，其負(fù)責(zé)淋巴結(jié)組織器官發(fā)生 (寇勒（Coles)等人，2010)。事實上，已經(jīng)令人信服地顯示，出生后腎小球足突細(xì)胞膜粘蛋 白+脾基質(zhì)能夠通過與造血淋巴系組織誘導(dǎo)細(xì)胞相互作用而再生（斯坎德拉（Scandella) 等人，2008)。
[0053] LSSC是根據(jù)本發(fā)明使用以抑制免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明的方面涉及用于抑制免疫 反應(yīng)的方法，所述方法是通過向需要此類治療的受試者投予有效抑制所述受試者的所述免 疫反應(yīng)的量的分離淋巴系組織源性抑制性基質(zhì)細(xì)胞（LSSC)實現(xiàn)。
[0054] 如本文所使用，"分離的"是指將基質(zhì)細(xì)胞群與其它非基質(zhì)細(xì)胞群分開。分離可通 過分開細(xì)胞的任何程序?qū)崿F(xiàn)，例如生長條件、純化技術(shù)（例如使用磁珠）、細(xì)胞分選或其它 類似技術(shù)。在一些實施例中，使用本文所述的方法分離LSSC。
[0055] 如本文所使用，"抑制"意思指使免疫反應(yīng)的明顯表現(xiàn)的程度、或嚴(yán)重性、或范圍、 或持續(xù)時間降低，包括例如T細(xì)胞或B細(xì)胞活化的減少，以及體液和細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)的減 少。"抑制"可例如通過檢查在LSSC存在或不存在下T或B細(xì)胞分裂的存在或速率；檢查 在LSSC存在或不存在下免疫細(xì)胞對細(xì)胞因子的釋放；測量在LSSC存在或不存在下抗體的 產(chǎn)生；或測量在LSSC存在或不存在下CTL的功能來進行測量。同樣，免疫反應(yīng)的抑制可例 如通過測定炎癥或與所治療的疾病相關(guān)的其它癥狀的減少，通過癥狀進行測量。免疫反應(yīng) 的"抑制"不需要完全消除或防止免疫反應(yīng)的這些表現(xiàn)中的任一種，而是程度、或嚴(yán)重性、或 范圍、或持續(xù)時間的降低，這具有臨床或其它實踐意義。在一個實施例中，抑制是通過檢查 在LSSC存在或不存在下預(yù)先活化的同種異體T細(xì)胞的細(xì)胞分裂速率來測量。在一個實施 例中，抑制是通過檢查在LSSC存在或不存在下患有移植物抗宿主疾病的小鼠的致死率來 測量。在一個實施例中，抑制是通過檢查小鼠中急性敗血性休克的致死率來測量。
[0056] 在一些實施例中，需要此類治療的受試者患有自體免疫性或炎癥性疾病。
[0057] 術(shù)語'自體免疫性或炎癥性疾病'是指這樣一些疾病狀態(tài)和病況，其中患者的免疫 反應(yīng)是針對患者自身的成分，從而導(dǎo)致不合需要并且通常可怕的使人虛弱的病況。如本文 所使用，'自體免疫性或炎癥性疾病'打算另外包括自體免疫性病況、綜合癥等。自體免疫性 或炎癥性疾病的實例包括（但不限于）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮癬、炎癥性腸病、 移植物抗宿主疾病及敗血病。
[0058] 在一些實施例中，需要治療的受試者是被鑒別為患有上述病況中的一或多種的受 試者，即，所述受試者已被醫(yī)師（例如使用所屬領(lǐng)域中眾所周知的方法）診斷為患有上述疾 病或病況。在一些實施例中，需要治療的受試者是懷疑患有或發(fā)展上述疾病或病況的受試 者，例如呈現(xiàn)指示上述疾病或病況的一或多種癥狀（例如極度疲勞或關(guān)節(jié)疼痛）的受試者。 在一些實施例中，需要治療的受試者是具有發(fā)展自體免疫性或炎癥性疾病的一或多個風(fēng)險 因子的受試者。風(fēng)險因子包括（但不限于）性別、年齡、遺傳傾向性、先前的自體免疫性或 慢性炎癥性疾病事件及生活方式。術(shù)語"需要治療的受試者"另外包括曾經(jīng)患有上述疾病 或病況但其癥狀已改善的人。
[0059] 在一些實施例中，需要治療的受試者患有或懷疑患有自體免疫性或炎癥性疾病。 受試者可呈現(xiàn)例如異常的自體抗體滴度。
[0060] 受試者是一種動物，通常為哺乳動物。在一方面，受試者是狗、貓、馬、綿羊、山羊、 母?；驀X動物。在重要實施例中，受試者為人類。
[0061] LSSC是以有效量投予。有效量是足以提供醫(yī)學(xué)上需要的結(jié)果的劑量并且可由所屬 領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)方法確定。在一些實施例中，有效量是引起所治療的病況的任何改 善的量。在一些實施例中，有效量可取決于所治療的疾病或病況的類型和程度和/或一或 多種其它治療劑的使用。然而，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可例如基于體外和/或體內(nèi)測試和/或 其它化合物劑量知識確定所使用的治療劑的適當(dāng)劑量和范圍。
[0062] 當(dāng)投予受試者時，治療劑的有效量當(dāng)然將取決于所治療的特定疾??；疾病的嚴(yán)重 程度；個別患者參數(shù)，包括年齡、身體狀況、體格和體重、同時治療、治療頻率和投藥模式。這 些因素是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并且可僅通過常規(guī)實驗確定。在一些實施例中，使 用最大劑量，也就是說，根據(jù)合理醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。
[0063] 在自體免疫性或炎癥性疾病的治療中，有效量是使疾病進展減慢、停止疾病進展 或使疾病進展逆轉(zhuǎn)的量。有效量包括使與自體免疫性或炎癥性疾病相關(guān)的一或多種癥狀減 慢、減少、抑制、改善或逆轉(zhuǎn)所需的量。在一些實施例中，這些術(shù)語是指使一或多個關(guān)節(jié)的腫 脹減輕，或使與自體免疫性或炎癥性疾病相關(guān)的疼痛、疲勞和/或發(fā)燒減少。在一些實施例 中，這些術(shù)語是指使與自體免疫性或炎癥性疾病相關(guān)的循環(huán)自體抗體的水平降低。在一些 實施例中，這些術(shù)語是指人類PASI評分的降低。在一些實施例中，這些術(shù)語是指人類總體 評估評分的改善。
[0064] 在一些實施例中，基于每公斤受試者以一或多次劑量投藥將至少10萬個LSSC投 予受試者，持續(xù)一天或數(shù)天（當(dāng)然取決于投藥模式和以上論述的因素）。在一些實施例中， 基于每公斤受試者，將至少100萬個LSSC投予受試者。在一些實施例中，基于每公斤受試 者，將至少1000萬個LSSC投予受試者。治療劑的實際劑量水平可變化以獲得對于特定患 者、組合物和投藥模式有效實現(xiàn)所需的治療反應(yīng)的量。所選劑量水平取決于特定化合物的 活性、投藥途徑、所治療的組織和所治療的患者的先前病史。然而，以低于獲得所需治療成 果所需水平的水平的化合物劑量起始并且逐漸增加劑量直到實現(xiàn)所需作用是在所屬領(lǐng)域 的技能范圍內(nèi)。
[0065] 在一些實施例中，投予受試者的LSSC是離體擴增的細(xì)胞。LSSC是通過使細(xì)胞在 培養(yǎng)基中生長來離體擴增的?？墒狗蛛x的LSSC在例如包含補充有生長因子、血清、血小板 溶解產(chǎn)物和抗生素中的一或多種的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中生長。在一些實施例中，使 分離的LSSC例如在補充有胎牛血清和青霉素/鏈霉素的最低必需培養(yǎng)基（MEM) a培養(yǎng)基 中生長。在一些實施例中，投予受試者的LSSC實質(zhì)上不含非LSSC。在一些實施例中，LSSC 相對于所述受試者是自體的、同種異體的或異種異體的。
[0066] 包含LSSC的醫(yī)藥制劑是通過任何適合途徑投予受試者。舉例來說，可通過靜脈 內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)注射或通過局部投予到病變、器官、器官囊、脂肪或淋巴 結(jié)之上或之中來向受試者投予組合物。
[0067] 在一些實施例中，LSSC是在植入受試者中的二維或三維構(gòu)架之上或之中。植入物 或基質(zhì)包括聚合物基質(zhì)，例如基于纖維或水凝膠的裝置。植入物可為生物可降解或非生物 可降解的。纖維或水凝膠植入物可使用市售材料制造或構(gòu)造。植入物通常是由天然或合成 聚合物形成的。通過將細(xì)胞懸浮液施加到植入物來將LSSC接種到植入物上。這可通過將 植入物浸泡于細(xì)胞培養(yǎng)容器中或?qū)⒓?xì)胞注射或以其它方式直接施加到植入物來實現(xiàn)。使用 標(biāo)準(zhǔn)外科技術(shù)植入接種有細(xì)胞的植入物。所述植入物可在植入之前接種并在體外培養(yǎng)，接 種并立即植入，或植入然后接種細(xì)胞。在優(yōu)選實施例中，將細(xì)胞接種到植入物之上和之中并 在體外培養(yǎng)介于約十小時與兩周之間的時間。
[0068] 本發(fā)明的一些方面涉及一種分離淋巴系組織源性抑制性基質(zhì)細(xì)胞（LSSC)的方 法。所述方法包含使用酶混合物與攪動的組合來消化淋巴系組織片段，并且然后收集所述 LSSC。在一些實施例中，所述淋巴系組織片段的消化是以一系列步驟進行，所述步驟包含： a)將淋巴系組織片段與酶混合物一起培育；ai)使用移液管攪動組織，隨后培育以使較 大片段沉降；aii)取出上清液并重復(fù)步驟a)和ai)，直到所有片段都消化。然后通過匯 集所有上清液部分，隨后離心以獲得細(xì)胞團粒來收集LSSC。在一些實施例中，所述酶混合物 包含培養(yǎng)基、分散酶、膠原酶和DNA酶I。所述LSSC可來源于皮膚或腸系膜淋巴結(jié)、脾、胸 腺、扁桃腺、腺樣增殖體和/或派爾集合淋巴結(jié)。如上文所述，可使用分離的細(xì)胞來抑制免 疫反應(yīng)。
[0069] 可使分離的LSSC在包含補充有生長因子、血清、血小板溶解產(chǎn)物和抗生素中的一 或多種的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中生長。在一些實施例中，使LSSC在補充有胎牛血清和 青霉素/鏈霉素的最低必需培養(yǎng)基（MEM) a培養(yǎng)基中生長。在一些實施例中，分離的LSSC 是在0. 1-21 %的氧分壓下生長。在一些實施例中，分離的LSSC是在2. 5-21 %的氧分壓下 生長。
[0070] 在一些實施例中，使LSSC生長直到LSSC實質(zhì)上不含非LSSC。在一些實施例中，使 LSSC生長直到基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加至少10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、200% 或更多。在一些實施例中，分離的LSSC是以1-10, 000個細(xì)胞/平方厘米的密度生長。在 一些實施例中，分離的LSSC是以10-500個細(xì)胞/平方厘米的密度生長。
[0071] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供一種組合物。所述組合物包含分離的淋巴系組織源 性抑制性基質(zhì)細(xì)胞（LSSC)，其中LSSC是通過本文所述的方法分離的。舉例來說，LSSC是通 過使用酶混合物與攪動的組合來消化淋巴系組織片段，并且然后收集LSSC分離的。
[0072] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供一種醫(yī)藥制劑。所述醫(yī)藥制劑包含分離的淋巴系組 織源性抑制性基質(zhì)細(xì)胞（LSSC)的組合物?？赏ㄟ^使用化學(xué)方法、機械方法和電細(xì)胞分離方 法中的一或多種處理淋巴系組織片段，并且然后收集LSSC，來分離LSSC。舉例來說，可通過 酶或化學(xué)消化、物理破壞和攪動，和/或通過使用電場來分離細(xì)胞。
[0073] 分離的LSSC可通過細(xì)胞培養(yǎng)進行擴增。在一些實施例中，所述分離的LSSC是離 體擴增的細(xì)胞。在一些實施例中，所述分離的LSSC是通過使所收集的細(xì)胞生長直到所述 LSSC實質(zhì)上不含非LSSC來擴增的?？墒辜?xì)胞在包含補充有生長因子、血清、血小板溶解產(chǎn) 物和抗生素中的一或多種的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中生長。
[0074] 在一些實施例中，分離的LSSC共同表達血小板源性生長因子受體a多肽 (H)GFR a或⑶140a)和程序性細(xì)胞死亡蛋白1配體2 (TO-L2或⑶273)。在一些實施例中，分 離的LSSC共同表達⑶140a和淋巴毒素P受體（LTBR)。在一些實施例中，所述分離的LSSC 共同表達⑶140a、PD-L2和LTBR。分離的LSSC還可表達一或多種選自由以下組成的群組 的其它淋巴標(biāo)記物：程序性細(xì)胞死亡蛋白1配體I (PD-Ll)、Thy-I細(xì)胞表面抗原（Thy-I)、 粘膜血管地址素細(xì)胞粘附分子I (MADCAM-I)、肌球蛋白重鏈11 (MYHll)、白細(xì)胞介素7受體 (IL-7R)或整合素a 7 (ITGA7)。在一些實施例中，分離的LSSC表達至少一種選自由以下 組成的群組的因子：白細(xì)胞介素6(IL-6)、趨化因子（C-C基元）配體19(CCL19)、趨化因子 (C-C基元）配體21 (CCL21)或血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)。
[0075] LSSC可從選自由以下組成的群組的物種分離：人類、非人類靈長類動物、犬科動 物、貓科動物、馬科動物、豬科動物、?？苿游锛皣X動物，并且在體外抑制T細(xì)胞增殖。
[0076] 本發(fā)明的醫(yī)藥制劑可包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑或被稀釋到醫(yī)藥學(xué)上可接受的 載劑中。如本文所使用，術(shù)語"醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑"意思指適于投予人類或其它哺乳 動物（例如狗、貓或馬）的一或多種可相容的填充劑、稀釋劑或其它此類物質(zhì)。術(shù)語"載 齊U"表示一種天然或合成的有機或無機成分，活性成分與其組合以有助于應(yīng)用。所述載劑 能夠以一定方式與本發(fā)明的制劑混合并且彼此混合，由此使得不存在會實質(zhì)上削弱所需醫(yī) 藥功效或穩(wěn)定性的相互作用。適于口服、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)等調(diào)配物的載劑可見于雷氏 藥學(xué)大全（Remington's Pharmaceutical Sciences),默克出版公司（Mack Publishing Company),賓夕法尼亞州伊斯頓（Easton, Pa)。
[0077] 以下實例將進一步說明本發(fā)明，這些實例決不應(yīng)解釋為進一步限制。本申請案全 篇所引用的所有參考文獻（包括參考文獻、頒布的專利、公開的專利申請案及同在申請的 專利申請案）的完整內(nèi)容都以引用的方式清楚地并入本文中。
[0078] SM [0079] 材料和方法
[0080] 小鼠
[0081] 4-6周齡的雄性C57B1/6小鼠是從杰克森實驗室（Jackson Laboratory)獲得。用 于免疫基因組（I_Gen)分選的小鼠的年齡精確匹配到6周。雄性C57BL/6Rag^小鼠是從 塔康尼克（Taconic)獲得。所有小鼠在運輸之后休息5天，并且不攜帶特定病原體，并根據(jù) 美國國立衛(wèi)生研究院（institutional and National Institutes of Health)指南進行護 理。實驗程序是在實驗動物護理專門委員會（Research Animal Care subcommittee)的批 準(zhǔn)下于丹娜-法伯癌癥研究院（Dana-Farber Cancer Institute)進行。
[0082] 人淋巴結(jié)
[0083] 人淋巴結(jié)是通過美國國家疾病研究交流會（National Disease Research Interchange，NDRI)資源中心（美國費城（Philadelphia, USA))從尸體供體取得。完整淋 巴結(jié)是在DMEM中于冰上運輸，并且在24小時內(nèi)處理以用于流式細(xì)胞分析或細(xì)胞培養(yǎng)。
[0084] 抗體
[0085] 對于小鼠淋巴結(jié)基質(zhì)的流式細(xì)胞分析、細(xì)胞分選和冷凍切片染色，使用以下抗體： 抗CD45抗體（克隆40-F11，BD生物科技公司（BD Biosciences))、抗腎小球足突細(xì)胞膜粘 蛋白抗體（克隆 8. 1.1，發(fā)育研究雜交瘤庫（Developmental Studies Hybridoma Bank))、 抗CD31抗體（克隆MEC13. 3,生物傳奇公司（Biolegend))、抗Lyve 1抗體（克隆10. 1.1， 由安德魯法爾（Andrew Farr)博士友情饋贈）及抗MadCAM抗體（克隆MECA-367,伊拜生物 科技公司（eBioscience))。適當(dāng)時，使用碘化丙啶和克隆TER119(生物傳奇公司）來排除 死細(xì)胞和紅細(xì)胞。對于人類細(xì)胞染色，所用抗體為：抗CD45抗體（克隆HI30,生物傳奇公 司）、抗CD31抗體（克隆WM59，BD生物科技公司）及抗腎小球足突細(xì)胞膜粘蛋白抗體（克 隆NZ-1，安吉奧生物公司（AngioBio Co))，用高度交叉吸附的抗大鼠IgG(H+L)艾力克斯 (Alexa)-488(英杰公司（Invitrogen))檢測。
[0086] 來自個別小鼠的淋巴結(jié)的酶消化
[0087] 對于流式細(xì)胞分析或細(xì)胞培養(yǎng)，解剖出個別小鼠的淋巴結(jié)，用精細(xì)鑷子刺穿一次， 并放入在冰上的5ml RPMI-1640中。在指定使用皮膚引流淋巴結(jié)時，解剖出腋下淋巴結(jié)、臂 淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)。在解剖出所有淋巴結(jié)之后，去除RPMI-1640并用2ml新鮮制備的 酶混合物更換，所述酶混合物包括含〇. 8mg/ml分散酶和0. 2mg/ml膠原酶P (都來自羅氏公 司（Roche))及0? lmg/ml DNA酶I (英杰公司）的RPMI-1640。在水浴中，在37C下培育管 并以5分鐘的時間間隔將其輕柔地倒轉(zhuǎn)以確保內(nèi)含物充分混合。20分鐘之后，使用Iml移 液管特別輕柔地抽吸并放出淋巴結(jié)，此舉破壞囊并釋放出大部分白細(xì)胞。將混合物再放入 水浴中并使較大片段沉降30秒，隨后去除酶混合物并添加IOml冰冷的FACS緩沖液（含 2% FCS、5mM EDTA的PBS)并離心（300g，4分鐘，4°C )。將2ml新鮮的酶混合物添加到消 化管中，使用Iml移液管輕柔地混合內(nèi)含物，并培育，同時使用Iml移液管有規(guī)律地進行輕 柔混合。10分鐘之后，使用Iml移液管劇烈混合細(xì)胞30秒。再次使片段沉降，取出上清液 并添加到先前離心的細(xì)胞團粒中，并將2ml新鮮的酶混合物添加到消化管中。從此時起，每 5分鐘使用Iml移液管劇烈地混合消化混合物，直到在將其舉到燈前時，明顯所有殘留的淋 巴結(jié)片段都完全消化。這一程序從第一次培育時起到完全消化通?；ㄙM50分鐘，并且從未 超過60分鐘。上清液在每次取出之后都進行離心（300g，4分鐘，4°C)，直到最后每個收集 管都含有從個別小鼠采集的淋巴結(jié)的完整細(xì)胞內(nèi)含物。使細(xì)胞濾過80 iim尼龍（nylon)篩 網(wǎng)，使用血細(xì)胞計數(shù)器進行計數(shù)，并使用臺盼藍評估活力?；盍Τ^95%。然后，在4°C下， 在冰冷的FACS緩沖液（含2%FCS、5mM EDTA的PBS)中將每次染色5X106個細(xì)胞與50iil 經(jīng)過稀釋的抗體一起培育20分鐘，之后捕獲到FACSCalibur或FACSAria IIu (BD生物科技 公司）上。
[0088] 用于細(xì)胞分選和大規(guī)模分離的來自匯集的小鼠的淋巴結(jié)的酶消化和基質(zhì)細(xì)胞富 集
[0089] 大體上如2. 1中所述進行多只匯集的小鼠的消化，不過具有如下變化（圖解描繪 于圖1中）：將來自4-10只小鼠的淋巴結(jié)匯集到單一管中并且每個消化步驟使用5ml酶 混合物進行消化。在淋巴結(jié)完全消化，并且對細(xì)胞進行離心并計數(shù)之后，使用CD45微珠和 autoMACS系統(tǒng)（均來自美天旖公司（Miltenyi))富集單細(xì)胞制劑中的非造血基質(zhì)細(xì)胞。每 107個細(xì)胞使用7 ii L珠粒，在轉(zhuǎn)輪上，在4°C下于FACS緩沖液中培育20分鐘。然后根據(jù)制 造商的說明書，使用耗盡（Depletes)程序耗盡經(jīng)標(biāo)記部分。然后對富集的基質(zhì)進行計數(shù)并 使用大體積抗體（每IO6個細(xì)胞1〇〇 U L經(jīng)稀釋抗體混合液）進行染色以用于細(xì)胞分選。
[0090] 人淋巴結(jié)的酶消化
[0091] 小心地清洗掉人淋巴結(jié)中的脂肪和結(jié)締組織，然后使用精細(xì)剪將其切成小片 (〈0. 5cm)。消化是根據(jù)第2. 4部分進行，不過RPMI-1640中的酶濃度增加到2. 4mg/ml分散 酶和0? 6mg/ml膠原酶P (均來自羅氏公司）及0? 3mg/ml DNA酶I (英杰公司）。在一些情 形中，并沒有消化整個器官，而是隨機選擇約20個混合的片段，代表淋巴結(jié)的所有區(qū)域。60 分鐘之后，對淋巴結(jié)片段進行完全消化，然后過濾，計數(shù)并且必要時進行染色，如上所詳述。
[0092] 低壓流式細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞分選
[0093] 當(dāng)使用指定的低壓、大孔徑設(shè)置時，基質(zhì)細(xì)胞的流式細(xì)胞分選得到改良；然而，在 將分選儀重新設(shè)置成非標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格并且然后成功地分選純細(xì)胞群方面存在固有的技術(shù)問題。 使用了被設(shè)定為20psi并且配備有100 ii m吸頭的FACSAria或升級的FACSAriaIIu機器， 其利用FACSDiva軟件（均來自BD科技公司）。盡管每個機器將不同，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，以下近 似規(guī)格已應(yīng)用被設(shè)置用于基質(zhì)細(xì)胞分選的至少4種不同的FACSAria機器。這些機器的不 同之處在于制造商所指定的建議設(shè)置。
[0094] 液流壓力的降低使液滴大小增加，由此在20psi下通過液流觀察窗僅可見5-6個 液滴，而非在70psi下的10-12個液滴。盡管液滴的斷離點直接影響分選的成功性并且應(yīng)始 終為可見的，但對于衛(wèi)星解析點來說，在低壓下分選時，甚至在增加液滴頻率之后，也可能 發(fā)生無法觀測的情形。這不排除成功的分選；然而，重要的是確信衛(wèi)星解析度在屏幕下出現(xiàn) 不超過1-2個液滴。這可通過2種方式合理地確定：第一，通過臨時調(diào)整液滴的斷離點高于 并且超出觀測值，由此使衛(wèi)星解析點變得可見，并且在向下重新調(diào)整之前，對在斷離點與解 析點之間的液滴數(shù)量進行計數(shù)；以及第二，通過觀察衛(wèi)星點與液滴之間遞減的距離，并且估 計液滴數(shù)量，直到解析發(fā)生。所述衛(wèi)星點如果不是在屏幕上進行解析，就應(yīng)非常接近解析。
[0095] 重要的是，決定是否應(yīng)用衰減控制（此使得液滴振幅減?。黠@改變后續(xù)的規(guī) 格。提供在利用和不利用衰減情況下的樣品設(shè)置分選報告供參考（表1)。BD生物科技 公司手冊推薦在20psi下進行分選時不應(yīng)用衰減；然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在利用FACSAria(而非 FACSAria IIu)時有必要產(chǎn)生良好的液流。使用FACSAria需要手動調(diào)整IOOm吸頭來產(chǎn)生 良好的液流，而對于FACSAria IIu系統(tǒng)，則無需移動吸頭或利用衰減，其中持久地配備有〇 形環(huán)。
[0096] 最后，已經(jīng)注意到，當(dāng)結(jié)合低壓力時，633nm激光延遲可突然改變。引起此情形的原 因尚不明了，但推薦使用CST珠粒來設(shè)定延遲，或使用SPHERO彩虹系列顆粒（BD生物科技 公司）（或任何類似的校準(zhǔn)檢查）測試激光功能。應(yīng)注意，來自633nm激光的信號的缺乏可 能需要對激光延遲進行再校準(zhǔn)。
[0097] 應(yīng)使用富集的基質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)格地進行基質(zhì)細(xì)胞分選的補償?；|(zhì)是伴隨一定程度自 發(fā)熒光的大細(xì)胞。當(dāng)分選基質(zhì)時，使用白細(xì)胞進行補償?shù)臋C器得到對細(xì)胞群的次最佳解析。 應(yīng)使用富集的基質(zhì)進行補償，因為在非富集群中，基質(zhì)通常稀少，并且發(fā)現(xiàn)自動補償軟件無 法區(qū)別消化的單細(xì)胞懸浮液中自發(fā)熒光的正常水平與實際的基質(zhì)細(xì)胞染色。
[0098] 當(dāng)最佳地校準(zhǔn)這些機器時，分選是在優(yōu)良的分選液流解析度下以良好效率進行。 分選液流應(yīng)在分選窗中良好解析為明亮的離散點；分選液流的'噴射'不應(yīng)為明顯的。
[0099] AutoMACS富集的基質(zhì)在TRIzoI (英杰公司）中常規(guī)地分選至高純度（>95% )。在 針對CD451 典化丙啶-基質(zhì)進行門控之后，亞群分選如下：成纖維細(xì)胞性網(wǎng)狀細(xì)胞（FRC)，腎 小球足突細(xì)胞膜粘蛋白+CD3r ;淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（LEC)，腎小球足突細(xì)胞膜粘蛋白+CD3r ;血 液內(nèi)皮細(xì)胞（BEC)，腎小球足突細(xì)胞膜粘蛋白XD31+ ;雙重陰性基質(zhì)細(xì)胞（DN)，腎小球足突 細(xì)胞膜粘蛋白TD31'
[0100] 微陣列檢驗和分析
[0101] 如先前所述，從10, 000-15, 000個分選的細(xì)胞中分離RNA(山形（Yamagata)等 人，2004)，然后擴增并根據(jù)制造商的說明書，使用GeneChip全轉(zhuǎn)錄物有義靶標(biāo)記檢驗 (Whole Transcript Sense Target Labeling Assay)將其與昂飛 GeneChip 小鼠基因 (Affymetrix GeneChip Mouse Gene) I. OST陣列（美國加利福尼亞州圣克拉拉（Santa Clara，CA, USA))雜交。使用設(shè)計成結(jié)合每個基因中的多個位置的探針，由此得到全轉(zhuǎn)錄物 信息。在GenePattern的Expression File Creator模塊中使用強大的多陣列平均（RMA) 預(yù)處理算法（進行背景調(diào)整、百分位正規(guī)化和匯總）對原始數(shù)據(jù)進行正規(guī)化（伊利薩里 (Irizarry)等人，2003)。針對至少一個亞群中的表達（在所有亞群中，如果平均表達值 〈120,則排除）并且針對各重復(fù)間的低方差（在任一群體中，如果變異系數(shù)>0.5,則排除） 來分析探針清單。使用了 GenePattern的Multiplot模塊來計算皮膚淋巴結(jié)FRC與腸系膜 淋巴結(jié)FRC之間的差異。如果表達的倍數(shù)變化>2并且P〈0. 05 (斯圖登氏T測試（student's T test))，那么認(rèn)為差異適于進一步分析。使用Microsoft Excel對輸出數(shù)據(jù)清單進行分 級，并且使用 DAVID 程序的功能注釋工具（Functional Annotation tool) (NIAID，david. abcc. ncifcrf.gov (丹尼斯（Dennis)等人，2003))并且在設(shè)定為 MoGene-l_〇-st-v_l 芯片 的昂飛外顯子背景下，針對整個KEGG路徑中的富集對基因清單進行分析。在多重假設(shè)（本 杰明（Benjamini))校正之后T測試P值〈0. 05的KEGG路徑分析被認(rèn)為是顯著的。數(shù)據(jù)序 列的NCBI GEO登錄號為GSE15907。
[0102] 淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
[0103] 如以上所詳述，將淋巴結(jié)消化，然后計數(shù)，并以5 X 105個細(xì)胞/平方厘米的濃度接 種。細(xì)胞培養(yǎng)基為補充有10%分批測試的低Ig FCS和1 %青霉素/鏈霉素的a MEM。24小 時之后，洗滌板以去除非粘附細(xì)胞。5天之后，小鼠細(xì)胞培養(yǎng)物主要含有LEC和FRC。人細(xì) 胞培養(yǎng)物生長較慢并且在7天之后采集。人淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物主要含有FRC和DN。常 規(guī)地利用非標(biāo)準(zhǔn)采集方案，其由在含EDTA的低濃度胰蛋白酶中短暫培育以使重要細(xì)胞表 面標(biāo)記物的基于胰蛋白酶的剪切作用減到最小組成（表2)。用PBS洗滌細(xì)胞以去除殘留蛋 白質(zhì)，并且將采集緩沖液（含0. 2%胰蛋白酶和5mM EDTA的PBS)添加到培養(yǎng)板中。在37C 下，在采集緩沖液中培育細(xì)胞2分鐘。此時，其形態(tài)變得更圓，并且向各孔中立即添加等體 積的完全培養(yǎng)基。通過使用Iml移液管輕柔攪動，從板洗滌出細(xì)胞，并且將上清液添加到另 一等體積完全培養(yǎng)基中以進行離心（300g，3分鐘，4°C )。必要時，由這一制劑對FRC和LEC 進行再接種，分選或MACS純化。
[0104] 對于三維培養(yǎng)和網(wǎng)絡(luò)分析，在由3. 2mg/ml高濃度大鼠尾膠原蛋白I (BD生物科技 公司）、I. 8mg/ml基質(zhì)膠基底膜基質(zhì)（BD生物科技公司）、在內(nèi)部由a MEM粉末（英杰公司） 制成的8.3% (v/v)的5x a MEM儲備液及含有待接種的細(xì)胞的30% (v/v)培養(yǎng)基構(gòu)造的可 變形基質(zhì)中培養(yǎng)細(xì)胞。在冰上混合凝膠組分并將200 ill接種到塑料或玻璃底培養(yǎng)皿上用 于成像（馬泰克（MatTek))。使凝膠在37C下靜置10分鐘，隨后用培養(yǎng)基覆蓋。對于收縮 檢驗，在平底96孔培養(yǎng)板中產(chǎn)生凝膠并在15小時之后拍照。使用以下等式測量收縮：收縮 凝膠的面積（cm2)/孔面積（cm2)*100=收縮％。對于時移活細(xì)胞成像，將骨髓源性樹突狀 細(xì)胞或B細(xì)胞以5:1比率與純化的經(jīng)培養(yǎng)FRC混合。在成像期間，在37C及10% C02下于 含有10% FCS的a MEM中培育凝膠。影片描繪了每90秒獲取1幀的時移圖像。
[0105] 免疫組織學(xué)分析和共聚焦顯微鏡檢術(shù)
[0106] 新鮮解剖出淋巴結(jié)并在10%三聚甲醛中固定4小時，然后放入10%蔗糖溶液中 過夜。然后，將小塊包埋于OCT化合物（VWR)中并急速冷凍，然后在-80°C下儲存。使用雷 卡冷凍切片機（Leica cryostat)對淋巴結(jié)進行冷凍切片（7 iim)，并用丙酮固定，然后使用 2% BSA阻斷30分鐘。在PBS中洗滌之后，用一次抗體對切片染色，保持60分鐘，然后洗滌 并用二次抗體染色，再保持60分鐘。使用熒光封片劑（達可公司（DAKO))用蓋玻片對載片 進行封片，并在4°C下儲存。使用雷卡Sp5共聚焦顯微鏡獲取圖像。
[0107] 統(tǒng)計學(xué)分析
[0108] 使用GenePattern的Multiplot程序針對正規(guī)化的陣列數(shù)據(jù)計算T測試的P值， 其中對于任何樣品，各重復(fù)之間的變異系數(shù)〈0.5。如果觀察到的倍數(shù)變化也是〈2的，那 么認(rèn)為P值〈0. 05是顯著的。使用DAVID程序（david. abcc. ncifcrf. gov)針對KEGG路 徑關(guān)聯(lián)來測試基因，其使用經(jīng)修改費希爾氏精確檢驗及利用本杰明多重假設(shè)校正的T測試 來比較數(shù)據(jù)，以顯示特定清單中2個或2個以上基因的富集。使用了非參數(shù)曼-惠特尼U 測試（non-parametric Mann-Whitney U test)來比較流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)（普林斯姆公司 (Prism))〇
[0109] 淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞分離和培養(yǎng)
[0110] 使用3-6周齡的C57B16/J小鼠作為FRC供體。解剖出皮膚和腸系膜淋巴結(jié)并使用 酶和機械方式進行消化。將來自10只小鼠的淋巴結(jié)在37C下于含0. 8mg/ml分散酶、0. 2mg/ ml膠原酶P及0. lmg/ml DNA酶的RPMI-1640中培育60分鐘，并且有規(guī)律地攪動并更換酶 混合物。經(jīng)由離心回收消化的細(xì)胞。一旦消化完成，就將細(xì)胞再懸浮于RPMI-1640中，濾過 80 y m篩網(wǎng)并且使用血細(xì)胞計數(shù)器和臺盼藍進行計數(shù)。將細(xì)胞以5 X IO5個細(xì)胞/平方厘米 接種于培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基由含10%分批測試的低Ig FCS和1%青霉素/鏈霉素的a MEM 組成。24小時之后，洗滌細(xì)胞，使其再生長6天，然后使用含0.2%胰蛋白酶和5mM EDTA的 PBS傳代一次，并且以1:10比率分離以進行擴增，再保持5-6天，之后待用。
[0111] MSC分離和培養(yǎng)
[0112] 從上述FRC供體小鼠的骨髓采集MSC。從10只小鼠去除大腿骨和脛骨。通過離 心來回收骨髓并且使用移液管將其再懸浮于無菌RPMI-1640中。將細(xì)胞以5 X IO5個細(xì)胞/ 平方厘米接種于培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基由含10%分批測試的低Ig FCS和1%青霉素/鏈霉素 的a MEM組成。24小時之后，洗滌細(xì)胞，使其再生長6天，然后使用含0.2%胰蛋白酶和5mM EDTA的PBS傳代一次，并且以1:10比率分離以進行擴增，再保持5-6天，之后待用。
[0113] FRC 和 MSC 純化
[0114] 使用含0.2%胰蛋白酶和5mM EDTA的PBS采集細(xì)胞，然后使用血細(xì)胞計數(shù)器和臺 盼藍進行計數(shù)（活力超過95 % )，并且將其再懸浮于含有10 iU抗⑶31-生物素和10 iU 抗CD45-生物素的Iml FACS緩沖液（含2% FCS和5mM EDTA的PBS)(每IO7個細(xì)胞）中。 15分鐘之后，洗滌細(xì)胞并將其與抗生物素微珠一起培育，并根據(jù)制造商的說明書，使其通過 MACS LS柱（美天旖生物技術(shù)公司（Miltenyi Biotec))。對于所有研究，使用MACS純化的 FRC。
[0115] 敗血病誘發(fā)：LPS模型
[0116] 使3-6周齡（幼）或18-24個月大（老）的C57B16/J小鼠接受單次LPC注射，弓丨 起無菌敗血病。幼小鼠腹膜內(nèi)接受含300 ii g LPS的100 ill生理鹽水，并且老小鼠腹膜內(nèi)接 受含150 ii g的100 ill生理鹽水。在指定時間點，以單次腹膜內(nèi)注射投予含I X IO6個FRC 的生理鹽水。如果小鼠達到以下任一終點，就對其實施安樂死：失去知覺、無法喚醒、無法站 立或低于20次呼吸/10秒的呼吸速率持續(xù)降低。
[0117] 敗血病誘發(fā)：CLP模型
[0118] 使Balb/c小鼠接受盲腸結(jié)扎穿孔（CLP)，引起多菌種性敗血病。簡單地說，將小鼠 麻醉并通過皮膚和腹膜肌肉產(chǎn)生中線切口。定位盲腸并且使其在無菌手術(shù)野上顯露出來， 然后使用6. 0縫線結(jié)扎80 %的盲腸，并且使用23g針穿刺盲腸兩次。使一小滴糞便物流出， 之后將盲腸放回原處并閉合肌肉和皮膚。小鼠皮下接受Iml生理鹽水。在指定時間點，使小 鼠接受單次腹膜內(nèi)注射的生理鹽水或含IXlO6個同種異體FRC的生理鹽水。此時，還對所 有小鼠進行抗生素治療（腹膜內(nèi)注射含15mg氨比西林（ampicillin)的生理鹽水）。每12 小時投予抗生素。如果小鼠達到以下任一終點，就對其實施安樂死：失去知覺、無法喚醒、無 法站立或低于20次呼吸/10秒的呼吸速率持續(xù)降低。
[0119] 細(xì)胞因子陣列
[0120] 如以上所詳述，獲得血液，并且通過離心來收集血漿。根據(jù)制造商的說明書，使用 盧米尼克斯公司的MAGPIX陣列和讀取器，用xPONENT軟件來獲得分析物的濃度。
[0121] 結(jié)腸炎誘發(fā)模型
[0122] 使用8周齡的雌性C/B17.scid小鼠作為結(jié)腸炎受體。使用7周齡的雌性Balb/c供 體作為細(xì)胞供體以誘發(fā)結(jié)腸炎。從20只Balb/c小鼠解剖出脾、以及皮膚和腸系膜淋巴結(jié)， 并使用機械破壞法將其懸浮于RPMI-1640中。對細(xì)胞進行過濾并計數(shù)，然后根據(jù)制造商的 說明書，使用⑶4+⑶62L+CD441?分離試劑盒（R&D系統(tǒng)公司（R&D Systems))富集天然⑶4+T 細(xì)胞。然后使用FACS對⑶4+⑶45RBhi+T細(xì)胞進行分選，并將其再懸浮于無菌RPMI-1640中。 15只(：/817.8(^(1小鼠靜脈內(nèi)接受含5\105個細(xì)胞的1001111?^1-1640。在誘發(fā)結(jié)腸炎 后2周，小鼠開始體重減輕，表明疾病發(fā)作。然后小鼠每周兩次腹膜內(nèi)注射IX IO6個同種 異體FRC，持續(xù)整個研究。如果小鼠達到以下任一終點，就對其實施安樂死：其起始體重減 輕>20%，或后肢癱瘓。
[0123] 結(jié)果
[0124] 小鼠和人淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞的酶分離
[0125] 淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞的研究集合了目前的力量，其中若干高影響力論文剖析了其最新 發(fā)現(xiàn)的在維持（林克（Link)等人，2007)和缺失（李（Lee)等人，2007,尼克斯（Nichols) 等人，2007，加德納（Gardner)等人，2008，馬格努森（Magnusson)等人，2008，葉（Yip) 等人，2009,寇漢（Cohen)等人，2010,弗萊徹（Fletcher)等人，2010)天然T細(xì)胞方面的 作用。然而，方法能力是一個限制性因素。
[0126] 因此，我們旨在開發(fā)一種低死亡率酶消化方案，其將能夠以較低可變性高度可再 現(xiàn)地分離淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞。使用酶和物理解離的組合（圖1)，在分離之后立即使用臺盼藍 對全淋巴結(jié)懸浮液（L 5%基質(zhì)）常規(guī)地分離出活力>95%的基質(zhì)細(xì)胞（圖2A)。分離并富 集基質(zhì)細(xì)胞之后六小時，使用碘化丙啶測定基質(zhì)的平均活力為87. 8% ±0. 8 (平均值土標(biāo) 準(zhǔn)偏差，n = 3次實驗）。這一高活力也允許表征并比較個別小鼠中存在的每個基質(zhì)細(xì)胞亞 群的數(shù)量，并將其作為成功分選并培養(yǎng)這些細(xì)胞的關(guān)鍵因素。使用了 CD45、腎小球足突細(xì)胞 膜粘蛋白、⑶31和MadCAM(圖2B)來研究淋巴結(jié)基質(zhì)的5個主要亞群。具體地說，先前未 分離出MadCAM+MRC亞群用于流式細(xì)胞分析。
[0127] 首先直接比較針對基質(zhì)細(xì)胞亞群的流式細(xì)胞分析策略與先前確定的原位組織學(xué) 分析（圖2C)。我們的目標(biāo)是確定能夠監(jiān)測基質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化同時監(jiān)測細(xì)胞類型的數(shù)量 或比例的變化的方法、mRNA譜及需要細(xì)胞分離的其它技術(shù)。
[0128] 因此，發(fā)現(xiàn)如通過流式細(xì)胞分析所確定的FRC如所預(yù)期的那樣在整個T細(xì)胞區(qū)中 產(chǎn)生一個網(wǎng)狀網(wǎng)絡(luò)（頂圖）。BEC表達⑶31但不表達腎小球足突細(xì)胞膜粘蛋白，并且其主要 存在于皮質(zhì)（頂圖）中，可通過其較小的大小和立方形的形態(tài)與高內(nèi)皮小靜脈相區(qū)別。通 過腎小球足突細(xì)胞膜粘蛋白和CD31的共同表達確定的LEC內(nèi)襯于骨髓（中間圖）和囊下 (數(shù)據(jù)未示出）的門區(qū)中的大淋巴管。所述門區(qū)還含有大血管（CD31+腎小球足突細(xì)胞膜粘 蛋白_)。MadCAM+網(wǎng)狀細(xì)胞內(nèi)襯于囊下（底圖）并且MadCAM染色也出現(xiàn)在B細(xì)胞區(qū)中，如 先前所報道。已發(fā)現(xiàn)囊下LEC(此處顯示表達Lyve-I)也表達MadCAM(底圖），使囊下成為 淋巴結(jié)的富含MadCAM的區(qū)域。通過流式細(xì)胞分析，從表型看，MRC在腎小球足突細(xì)胞膜粘 蛋白+⑶31-FRC門控內(nèi)形成一個亞群（圖2B)。
[0129] 假定我們的分離方法可用于分離人淋巴結(jié)基質(zhì)，從而允許建立有用的離體實驗系 統(tǒng)。人淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)通過組織學(xué)分析得到良好描述（林克等人，2011)，但尚未分離 亞群用于流式細(xì)胞分析或其它免疫研究。
[0130] 從尸體供體獲取非腸系膜來源的人淋巴結(jié)。盡管需要增加酶濃度來消化淋巴結(jié) (參看方法），但一旦消化，其基質(zhì)細(xì)胞組成就明顯類似于小鼠（比較圖2D與2B)。這些結(jié) 果表明，鼠類淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞技術(shù)可同樣適用于人類研究。
[0131] 腸系膜淋巴結(jié)含有的FRC少于皮膚引流淋巴結(jié)
[0132] 為了進一步驗證我們的消化，通過評估年齡相配的小鼠之間淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞亞群 的構(gòu)成比例的變化程度來測試其再現(xiàn)性。還比較了皮膚引流淋巴結(jié)與腸系膜淋巴結(jié)的基質(zhì) 細(xì)胞組成。盡管這些淋巴結(jié)具有充分確定的結(jié)構(gòu)類似性并且通過組織學(xué)分析進行了充分 研究，但其受試者發(fā)生是在不同時間出現(xiàn)并且取決于不同的信號傳導(dǎo)路徑（米布斯（米布 斯），2003)。此外，腸系膜淋巴結(jié)不斷地暴露于腸和胃粘膜源性抗原，而皮膚引流淋巴結(jié)則 不是。
[0133] 意外的是，我們發(fā)現(xiàn)盡管從每個皮膚引流或腸系膜淋巴結(jié)分離出數(shù)量類似的細(xì)胞 (圖3A)，但基質(zhì)細(xì)胞組成明顯不同（圖3B)。與腸系膜淋巴結(jié)相比較，在皮膚引流淋巴結(jié) 中，在整個T細(xì)胞區(qū)中生長的FRC以更高頻率存在（圖3B，圖2B)并且數(shù)量更多（圖3C)。 LEC、BEC、DN和MRC在兩個部位處是以類似數(shù)量存在（圖3C)，使得差異為FRC特異性的。
[0134] 要了解這一差異是否是由于MRC亞群比例的偏移（片貝等人，2008)，發(fā)現(xiàn)其在 FRC門控的范圍內(nèi)（圖2B)。在5周齡的雄性小鼠中，在FRC門控內(nèi)10-20%的細(xì)胞表達 MadCAM，其中腸系膜淋巴結(jié)中的比例高于皮膚引流淋巴結(jié)（圖2B，3D)。然而，盡管各部位之 間的MRC比例顯著變化，但類似于LEC，其總體數(shù)量不變（圖3E)。這表明MRC數(shù)量和FRC數(shù) 量是以不同方式調(diào)控，因為MRC與其它基質(zhì)細(xì)胞亞群一樣，在各部位之間數(shù)量類似，而FRC 在腸系膜淋巴結(jié)中較少。
[0135] 在一些淋巴系器官（例如胸腺）中，主要的基質(zhì)細(xì)胞亞群的數(shù)量與發(fā)育的T細(xì)胞 同時擴大或縮小。我們使用缺乏T細(xì)胞和B細(xì)胞的Rag+小鼠測試了這是否適用于FRC群。 FRC在Rag+淋巴結(jié)中發(fā)育，但其是否響應(yīng)淋巴細(xì)胞數(shù)量而擴大和收縮尚未可知。這一問題 與感染特別相關(guān)，因為淋巴結(jié)必須在短時間內(nèi)急劇擴大以容納增殖的淋巴細(xì)胞。
[0136] 盡管與年齡相配的野生型對照（圖3G)相比較，Rag+小鼠具有較小淋巴結(jié)（圖 3F)，但其具有正常的FRC數(shù)量。然而，LEC數(shù)量明顯減少，表明其數(shù)量的動態(tài)平衡與成熟淋 巴細(xì)胞的存在相關(guān)聯(lián)。RagvTRC與WT在細(xì)胞更新速率（數(shù)據(jù)未示出）方面并無不同，并且 在將LPS注射到小鼠中之后，F(xiàn)RC的數(shù)量未隨著T細(xì)胞和B細(xì)胞擴大（數(shù)據(jù)未示出）。因 此，在淋巴細(xì)胞減少、穩(wěn)態(tài)及炎癥性病況下，F(xiàn)RC數(shù)量的維持與成熟淋巴細(xì)胞完全無關(guān)。
[0137] 意外的是，我們發(fā)現(xiàn)MRC亞群在Ra，小鼠中發(fā)育不全（圖3H-J)。據(jù)報道，組織 學(xué)分析顯示在Rag+小鼠中存在MadCAM+MRC (片貝等人，2008)，但在我們看來，MadCAM+MRC 的數(shù)量和每個MRC中MadCAM蛋白的量顯著降低（圖2H-J)。這也適用于MadCAM+LEC(圖 3H-J)，表明在兩種細(xì)胞類型中MadCAM表達的上調(diào)表示發(fā)育階段需要淋巴細(xì)胞的存在，不 過蛋白質(zhì)本身的表達可在其不存在的情況下發(fā)生。盡管WT與Rag+之間MadCAM+LEC的比 例類似（圖3H)，但總LEC的顯著減少（圖3G)轉(zhuǎn)換成MadCAM+LEC數(shù)量的減少（圖31)。
[0138] 富集并分選淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞亞群
[0139] 在成功消化淋巴結(jié)之后，接下來采用成功分選并培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞的手段。分選基質(zhì) 細(xì)胞在技術(shù)上看是很難的（參看方法）并且我們使用了基于MACS的造血細(xì)胞耗盡法來減 少分選時間并增加所得純度。此另外的步驟得到最少的基質(zhì)損失（圖4A、B)并且不會明顯 地改變基質(zhì)細(xì)胞組成；我們發(fā)現(xiàn)在MACS后基質(zhì)細(xì)胞亞群無選擇性損失（圖4C)，并且在分 選之后獲得了優(yōu)良的純度（圖4D)。
[0140] 使用這一方法，從皮膚引流淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)分選出FRC作為多中心免疫基 因組聯(lián)盟的一部分。這涉及在高度控制、最少變化的條件下對所分選的細(xì)胞進行轉(zhuǎn)錄組分 析，其中總體目標(biāo)是產(chǎn)生公共數(shù)據(jù)庫以提供免疫基因組的全面、交叉參考的圖譜。
[0141] 對來自皮膚引流淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)的FRC中25, 194探針的表達進行分析 以得到在皮膚引流淋巴結(jié)或腸系膜淋巴結(jié)中表達超過任意臨界值（平均表達值>120)的 11，162個探針的清單。同時針對各重復(fù)之間的低（〈0.5)變異系數(shù)對這些探針進行過濾。
[0142] 首先確定來自這些不同位置的FRC共有先前公開的FRC特異性標(biāo)記物（例如 CD140a、CCL19和IL-7)的表達（數(shù)據(jù)未示出），然后分析這些數(shù)據(jù)的差異。將皮膚引流淋巴 結(jié)FRC與腸系膜淋巴結(jié)FRC相比較，描繪倍數(shù)變化和P值的火山圖顯示，與腸系膜淋巴結(jié)相 比較，130個探針在來自皮膚引流淋巴結(jié)的FRC中顯著上調(diào)，而與皮膚引流淋巴結(jié)相比較， 有97個探針的表達在腸系膜淋巴結(jié)FRC中顯著更高（>2倍數(shù)變化，P〈0. 05)(圖5A)。在將 這些探針定位到獨特基因之后，這些數(shù)據(jù)對應(yīng)于皮膚引流淋巴結(jié)FRC中126個基因的上調(diào) (數(shù)據(jù)未示出）以及腸系膜淋巴結(jié)FRC中54個基因的上調(diào)（數(shù)據(jù)未示出）。
[0143] 作為任何位點特異性特化的線索，有關(guān)這些清單是否含有特定基因路徑的活 化，或在任一細(xì)胞類型中獨特操作的基因網(wǎng)絡(luò)的證據(jù)引起了關(guān)注。使用免費在線程序 DAVID(6. 7版；美國國家過敏癥和傳染病研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases))，我們使用了網(wǎng)絡(luò)分析工具（KEGG)來搜索有關(guān)這些基因之間的 已知生物聯(lián)系的清單，然后使用統(tǒng)計學(xué)分析工具來評估相連的基因是否一起以高于意外 預(yù)期的頻率出現(xiàn)。與腸系膜相比較，涵蓋細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用的KEGG路徑 mmu04060在來自皮膚引流淋巴結(jié)的FRC中顯著富集（基因出現(xiàn)的頻率是意外預(yù)期的頻率 的4. 8倍，本杰明校正的P值=0. 0055)。這一清單包括在皮膚引流淋巴結(jié)FRC中上調(diào)至 少兩倍的具有免疫相關(guān)性的十個基因（圖5B)。在腸系膜淋巴結(jié)中上調(diào)的基因在可鑒別的 KEGG路徑中未顯著富集，但明顯包括調(diào)控成纖維細(xì)胞生長所涉及的基因、與腸微環(huán)境相關(guān) 的基因，例如視黃酸代謝或MadCAM表達、內(nèi)皮細(xì)胞交互應(yīng)答、細(xì)胞外基質(zhì)分泌及外周神經(jīng) 元生長所涉及的基因（表3)。
[0144] 培養(yǎng)的FRC模擬體內(nèi)功能并且支持白細(xì)胞遷移
[0145] 接下來測試淋巴結(jié)基質(zhì)在培養(yǎng)物中生長的能力。我們發(fā)現(xiàn)，成功消化的淋巴結(jié)細(xì) 胞懸浮液中的基質(zhì)將易于在接種2小時內(nèi)粘附到組織培養(yǎng)板，并且以消耗CD45+白細(xì)胞為 代價開始擴增，所述白細(xì)胞在5天之后形成培養(yǎng)物的不到10% (圖6A)。FRC和LEC易于在培 養(yǎng)物中生長，而BEC和DN細(xì)胞則不然（圖6A)。FDC不在培養(yǎng)物中生長（圖6B)。重要的是， 低胰蛋白酶、高EDTA采集方案允許保留重要的表面標(biāo)記物，例如⑶31 (圖6C)和⑶140a(未 示出；參看表2)。發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)5天之后，5 X 105個細(xì)胞/平方厘米（含有約5 X 103個基質(zhì) 細(xì)胞），常規(guī)地得到約1. 5-2 X 104個基質(zhì)/平方厘米。這一培養(yǎng)系統(tǒng)能夠容易地擴增并操 作 FRC、LEC 和 MRC。
[0146] 具體地說，F(xiàn)RC在二維（2D)培養(yǎng)物中變得高度極化（圖6D)，顯示較強的F-肌動 蛋白應(yīng)力纖維（圖6E)。這無法模擬其體內(nèi)形態(tài)；因此，使用優(yōu)化的膠原蛋白I、基質(zhì)膠和富 集的a MEM的混合物，另外探索FRC和LEC的三維（3D)培養(yǎng)作為檢查當(dāng)容許如同其在體內(nèi) 那樣擴增并呈三維連接時其功能。發(fā)現(xiàn)FRC當(dāng)在3D中生長時伸長并形成廣大的網(wǎng)絡(luò)（圖 6D、E)，而LEC偏好平坦表面并且在2D培養(yǎng)中生長更成功（圖6D)。有趣的是，任一細(xì)胞類 型在3D條件下都未生長達到超匯合（數(shù)據(jù)未示出），表明在2D培養(yǎng)中未發(fā)生細(xì)胞密度的 先天調(diào)控。為了驗證這一體外FRC網(wǎng)絡(luò)的生物相關(guān)性，進行了兩個實驗。第一，將較大數(shù)量 的FRC放入較小的基質(zhì)膠塞中，并監(jiān)測其收縮凝膠的能力（圖6F)。FRC表達高水平a平 滑肌肌動蛋白并且為高度可收縮的（林克等人，2007)。我們發(fā)現(xiàn)FRC以高效率收縮凝膠， 并且當(dāng)將Src酪氨酸激酶抑制劑PP2添加到凝膠中時，阻止這一收縮。第二，將骨髓源性樹 突狀細(xì)胞（DC)或脾源性淋巴細(xì)胞添加到含有FRC的凝膠中，并且使用活體成像方法發(fā)現(xiàn)， 如在體內(nèi)所報道的，DC和淋巴細(xì)胞有效地并且優(yōu)先沿FRC網(wǎng)絡(luò)蠕動（照片顯示于圖6G中， 并附上以補充影片1和2顯示的完整時移影片）。
[0147] 使用相同方法，成功地培養(yǎng)出人淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞亞群。與鼠類細(xì)胞不同，BEC和DN 細(xì)胞在體外隨LEC和FRC -起生長（圖6H)。
[0148] 總體而言，這些結(jié)果顯示，鼠類淋巴結(jié)基質(zhì)易于分離用于流式細(xì)胞分析和分選，并 且可在不存在白細(xì)胞情況下培養(yǎng)，仍產(chǎn)生廣大的3D網(wǎng)絡(luò)，使白細(xì)胞易于在其上蠕動，如體 內(nèi)所報道。這些數(shù)據(jù)表明，人淋巴結(jié)基質(zhì)類似地適于使用鼠類技術(shù)進行研究。
[0149] 總體而言，這些結(jié)果描述了適用于在多種離體和體外條件下研究小鼠和人類淋巴 結(jié)基質(zhì)細(xì)胞的一套技術(shù)的驗證。
[0150] 淋巴系組織源性抑制細(xì)胞抑制活化的同種異體脾細(xì)胞增殖
[0151] 將未分級分離的LSSC與從不相關(guān)供體新鮮分離的人脾細(xì)胞一起培養(yǎng)。脾細(xì)胞用 CFSE(當(dāng)細(xì)胞分裂時稀釋的一種熒光染料）標(biāo)記。使用PHA和IL-2活化脾細(xì)胞群內(nèi)的T 細(xì)胞。圖7顯示的柱狀圖描繪了通過T細(xì)胞抗原受體的表達鑒別的T細(xì)胞。比率指示脾細(xì) 胞與基質(zhì)的比例。在無培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞情況下刺激的T細(xì)胞對其CFSE的稀釋作用超過與 LSSC -起培養(yǎng)的細(xì)胞，并且LSSC以劑量依賴性方式抑制T增殖（圖7)。
[0152] LSSC抑制活化的異種異體T細(xì)胞增殖
[0153] 將未分級分離的LSSC與新鮮分離的小鼠脾細(xì)胞一起培養(yǎng)。脾細(xì)胞用當(dāng)細(xì)胞分裂 時稀釋的CFSE標(biāo)記。然后使用抗⑶3抗體和抗⑶28抗體活化T細(xì)胞。圖8顯示的柱狀圖 描繪了通過T細(xì)胞抗原受體的表達鑒別的T細(xì)胞。比率指示脾細(xì)胞與基質(zhì)的比例。在無培 養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞情況下刺激的血液源性T細(xì)胞對其CFSE的稀釋作用超過與LSSC -起培養(yǎng)的 細(xì)胞，PDPN+LSSC和H)PN-LSSC亞群能夠同等地抑制T細(xì)胞。LSSC是異種異體反應(yīng)的有效 抑制劑（與圖7中所示的同種異體抑制作用相比較）。
[0154] LSSC經(jīng)由新穎基質(zhì)抑制T細(xì)胞增殖
[0155] 在小鼠中，來源于淋巴結(jié)的H)PN+基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)由特別需要T細(xì)胞源性IFNg和基質(zhì) 細(xì)胞源性一氧化氮的機制抑制自體T細(xì)胞增殖（盧卡斯-科內(nèi)克（Lukacs-Kornek)等人， 自然免疫學(xué)（Nature Immunology)，2011)。我們想要測試LSSC是否使用這些機制抑制T細(xì) 胞反應(yīng)。
[0156] 將未分級分離的LSSC與來源于野生型或IFNg-/-小鼠的新鮮分離的脾細(xì)胞一起 培養(yǎng)。脾細(xì)胞用當(dāng)細(xì)胞分裂時稀釋的CFSE標(biāo)記。然后使用抗CD3抗體和抗CD28抗體活化 T細(xì)胞。圖9A顯示的柱狀圖描繪了通過T細(xì)胞抗原受體的表達鑒別的T細(xì)胞。比率指示脾 細(xì)胞與基質(zhì)的比例。
[0157] 將roPN+LSSC、PDPN-LSSC和未分級分離的LSSC與從不相關(guān)供體新鮮分離的純化 的人血液源性T細(xì)胞一起培養(yǎng)。T細(xì)胞用當(dāng)細(xì)胞分裂時稀釋的CFSE標(biāo)記。使用PHA和IL-2 活化T細(xì)胞。圖9B顯示的柱狀圖描繪了通過T細(xì)胞抗原受體的表達鑒別的T細(xì)胞。收集 上清液并測試亞硝酸鹽（一氧化氮的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物）的存在。
[0158] 發(fā)現(xiàn)LSSC與野生型T細(xì)胞同樣良好地抑制IFNgV-T細(xì)胞。在所述抑制檢驗中， PDPN+LSSC和H)PN-LSSC亞群以及未分級分離的LSSC都未產(chǎn)生可檢測的一氧化氮/亞硝 酸鹽。LSSC使用新穎的不依賴于IFNg和一氧化氮的機制抑制T細(xì)胞增殖，并因此與小鼠 PDPN+淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞群明顯不同。
[0159] 兩個主要的淋巴系組織源性抑制細(xì)胞亞群各自抑制活化的同種異體T細(xì)胞增殖
[0160] 在圖IOA中，基于糖蛋白-36(又稱為H)PN)的表達或缺乏來純化兩個LSSC亞群。 兩個亞群都為非內(nèi)皮細(xì)胞（⑶31陰性）并且非造血細(xì)胞（⑶45陰性）的。
[0161] 將roPN+LSSC、PDPN-LSSC或未分級分離的LSSC與從不相關(guān)供體新鮮分離的純化 的人血液源性T細(xì)胞以1:5的比率（LSSC比T細(xì)胞）一起培養(yǎng)。T細(xì)胞用當(dāng)細(xì)胞分裂時稀 釋的CFSE標(biāo)記。使用PHA和IL-2活化T細(xì)胞。圖IOB顯示的柱狀圖描繪了通過T細(xì)胞抗 原受體的表達鑒別的T細(xì)胞。比率指示脾細(xì)胞與基質(zhì)的比例。
[0162] 觀察到在無培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞情況下刺激的血液源性T細(xì)胞對其CFSE的稀釋作用 超過與LSSC -起培養(yǎng)的細(xì)胞，PDPN+LSSC和H)PN-LSSC亞群能夠同等地抑制T細(xì)胞。
[0163] LSSC停止預(yù)先活化的同種異體T細(xì)胞的分裂
[0164] LSSC的一些治療應(yīng)用需要將其輸注或移植到具有正在進行的免疫反應(yīng)的受試者 中。因此，我們想要了解LSSC是否能抑制預(yù)先活化的T細(xì)胞。
[0165] 將H)PN+LSSC、PDPN-LSSC或未分級分離的LSSC與從不相關(guān)供體新鮮分離的純化 的人血液源性T細(xì)胞一起培養(yǎng)。T細(xì)胞用當(dāng)細(xì)胞分裂時稀釋的CFSE標(biāo)記。使用PHA和IL-2 活化T細(xì)胞，使其分裂2天，并且然后將一些T細(xì)胞再接種到LSSC上并進行再刺激，或在無 LSSC情況下進行再接種和再刺激，或進行再接種而不進行再刺激。圖11顯示的柱狀圖描繪 了通過T細(xì)胞抗原受體的表達鑒別的T細(xì)胞。比率指示LSSC與T細(xì)胞的比例。
[0166] 發(fā)現(xiàn)已經(jīng)刺激2天并且然后在LSSC存在下再接種并再刺激的T細(xì)胞中止細(xì)胞分 裂，盡管事實是其已經(jīng)完全活化并且在再接種之前已經(jīng)歷數(shù)次細(xì)胞分裂（以"進行再接種 而不進行再刺激的"對照顯示）。PDPN+LSSC和ToPN-LSSC亞群能夠同等地抑制預(yù)先活化的 同種異體T細(xì)胞。
[0167] LSSC顯著降低患有嚴(yán)重移植物抗宿主疾病的小鼠的早期致死率
[0168] 使受體小鼠接受同種異體骨髓移植（分劑量致死照射，隨后靜脈內(nèi)注射全骨髓）。 在移植時，通過共注射含有同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞的供體來源的脾細(xì)胞來誘發(fā)嚴(yán)重GVHD。 在誘發(fā)GVHD之后的多個時間點，腹膜內(nèi)注射I X IO6個人LSSC，而對照小鼠接受生理鹽水 (媒劑）。監(jiān)測存活率。
[0169] 所有小鼠在類似時間點發(fā)生GVHD，不過接受LSSC的小鼠在早期時間點顯示顯著 降低的GVHD相關(guān)性致死率，表明LSSC降低免疫攻擊。早期LSSC投予的作用持續(xù)到注射后 3周，此時保護變得無效，表明可能指示再投藥。投予嚴(yán)重患病小鼠的最后一次LSSC注射 (第24天）沒有逆轉(zhuǎn)發(fā)病率或死亡率。
[0170] 如圖15中所示，離體擴增的小鼠淋巴結(jié)基質(zhì)使小鼠急性敗血性休克的致死率降 低。
[0171] LSSC的轉(zhuǎn)錄特征
[0172] 使用針對表面標(biāo)記物的流式細(xì)胞分析和針對分泌因子的RT-PCR(圖13A)，以及使 用昂飛人基因STL 0基因陣列獲得mRNA轉(zhuǎn)錄組（圖13B)來獲得人LSSC的轉(zhuǎn)錄特征。
[0173] LSSC(黑線）與相關(guān)陰性染色對照（灰色）的比較的代表性流式細(xì)胞分析曲線（圖 13A)顯示了間充質(zhì)標(biāo)記物TOGFRa、耐受性相關(guān)蛋白PD-Ll和TO-L2、肌肉相關(guān)蛋白ITGA7， 及淋巴系器官基質(zhì)特有的蛋白質(zhì)LTBR、IL7R和TOPN的表達。TOPN和ITGA7可能是由大量 LSSC組成的亞群表達。選用名或基因名稱示于括號中。RT-PCR顯示，LSSC表達趨化因子 CCL19和CCL21的轉(zhuǎn)錄物（相對于作為陽性對照的LTbR顯示）。
[0174] 使用基因陣列，還評估了選自3個LSSC樣品的基因的轉(zhuǎn)錄，并與公開可得的3個 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞樣品（登錄號GM241199、GM241201、GM241203)的數(shù)據(jù)相比較。數(shù)據(jù) (圖138)顯示，與81-]\^(：相比較，1^5(：表達高水平？0-12、1^1^、1七§37、]\^1111。1^5(：和]^〇 表達類似水平的CXCL12、Thyl、L7R，并且類似地對例如LYVEl、CD3G、PECAMl (CD31)、CD34、 FCGR2B及PTPRC(CD45)等譜系特異性標(biāo)記物呈陰性。先前已報道，MSC不表達PD-L2,這一 蛋白質(zhì)也不能通過暴露于炎性細(xì)胞因子IFNg進行誘導(dǎo)。
[0175] LSSC的形態(tài)特征
[0176] 在補充有胎牛血清的a -MEM中培養(yǎng)生長的LSSC顯示類成纖維細(xì)胞形態(tài)（圖14)。 其通常展現(xiàn)較長過程，板狀偽足、絲狀偽足、有褶皺的前導(dǎo)端及粘著斑。此外，從淋巴結(jié)和扁 桃腺分離的LSSC在表型上是類似的（圖19)。
[0177] 在2個不同的小鼠模型中，當(dāng)在治療時間點投予FRC時，其防止敗血病。
[0178] 在無菌敗血病模型和盲腸結(jié)扎穿刺（CLP)敗血病模型中，F(xiàn)RC賦予顯著的存活率 益處（圖16)。圖16E顯示在FRC處理的小鼠的血液中炎性細(xì)胞因子的水平降低。這些炎 性細(xì)胞因子通常與先天免疫系統(tǒng)相關(guān)。因此，在敗血病中，F(xiàn)RC與先天免疫系統(tǒng)相互作用。
[0179] FRC防止結(jié)腸炎死亡率。
[0180] 通過將純化的天然T細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠中來誘發(fā)結(jié)腸炎。在2周時，即在 小鼠開始顯示疾病病征并且體重顯著減輕（治療時程）后，投予同種異體FRC。從第2周到 第6周，每周兩次注射FRC，并與生理鹽水處理的對照組相比較，并監(jiān)測存活率。FRC賦予顯 著的存活率益處（圖17)。
[0181] 人LSSC分泌可溶性細(xì)胞因子并且從淋巴結(jié)和扁桃腺分離的細(xì)胞顯示相當(dāng)水平的 經(jīng)由可溶性因子引起的T細(xì)胞抑制。
[0182] 經(jīng)顯示，培養(yǎng)的人LSSC分泌許多可溶性細(xì)胞因子（圖18)。從淋巴結(jié)和扁桃腺分 離的LSSC顯示相當(dāng)水平的經(jīng)由可溶性因子進行的T細(xì)胞抑制（圖20)。
[0183] 討論
[0184] 免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中常用的技術(shù)，例如由原始組織產(chǎn)生具有可再現(xiàn)組成的活性 單細(xì)胞懸浮液，當(dāng)應(yīng)用于淋巴結(jié)基質(zhì)時產(chǎn)生困難。因此，組織學(xué)分析和全器官PCR或涉及淋 巴細(xì)胞讀出的體內(nèi)系統(tǒng)已成為本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)。這些引起了有關(guān)淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞亞群在穩(wěn)態(tài) 耐受性和免疫性中的作用的若干重要發(fā)展；不過，還存在許多直接生物和醫(yī)學(xué)相關(guān)的問題 未得到探索。我們相信，將需要經(jīng)過改進和改編以用于這些稀少并且靈敏的細(xì)胞類型的現(xiàn) 代免疫和細(xì)胞生物技術(shù)來回答這些問題。
[0185] 這一未滿足的需求最突出的是，特別是DN基質(zhì)仍幾乎完全未確定。若干團體現(xiàn)已 報道這一非造血基質(zhì)細(xì)胞亞群的存在（其可為或可不為同源的）（林克等人，2007,寇漢等 人，2010,弗萊徹等人，2010)，但盡管構(gòu)成>10 %的淋巴結(jié)基質(zhì)小生境并且?guī)в斜磉_Aire 的細(xì)胞類型（寇漢等人，2010,弗萊徹等人，2010)，其仍然是幾乎完全未得到表征的。如形 態(tài)、譜系、表面表型和功能等基本特征尚未報道。這些不足直接道出了研究淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞 固有的難題。
[0186] 在研究DN細(xì)胞方面的一個此類難題是頻臨死亡或染色不良的淋巴細(xì)胞看來為 CD45較少或陰性的，出現(xiàn)在基質(zhì)細(xì)胞門控中，具有與DN基質(zhì)相同的表型（CD31-腎小球足突 細(xì)胞膜粘蛋白_)。這極大歪曲了真實基質(zhì)細(xì)胞亞群的比例，使得難以確定甚至淋巴結(jié)基質(zhì) 細(xì)胞小生境最基本的組成比例。事實上，由于基質(zhì)僅占淋巴結(jié)細(xì)胞的1-2%，故無活力淋巴 細(xì)胞數(shù)量常常超過基質(zhì)，即使是在高活力（>95%存活）單細(xì)胞懸浮液中。根據(jù)經(jīng)驗，包括例 如碘化丙啶等死細(xì)胞染色無法充分地去除在消化后呈低CD45的細(xì)胞。
[0187] 出于這一原因，我們認(rèn)為可再現(xiàn)地分離基質(zhì)的關(guān)鍵是開發(fā)一種低死亡率酶消化方 案。使用分散酶、DNA酶I和膠原酶P的組合，常規(guī)分離出活力>95%的較大數(shù)量的基質(zhì)細(xì) 胞。這也使得能在個別小鼠和人類中比較每個基質(zhì)細(xì)胞亞群，并且成功分選出稀少亞群，包 括DN細(xì)胞和MRC，這將成為進一步研究的主題。通過組織學(xué)分析尚不可能鑒別DN基質(zhì)，因 為未報道獨特或有差別表達的表面標(biāo)記物。然而，可使用本文所述的分選策略來進行揭露 這一稀少亞群所需的基于陣列的無偏差方法。
[0188] 類似地，這些方法使得能直接從原始組織分離四個主要的人淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞 群，為復(fù)雜的臨床和臨床前研究開啟了一道門。現(xiàn)已充分確定，小鼠淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞表 達許多臨床上相關(guān)的自體抗原并且將其直接呈遞到T細(xì)胞以對其產(chǎn)生耐受性（李（Lee) 等人，2007,尼克斯（Nichols)等人，2007,加德納（Gardner)等人，2008,馬格努森 (Magnusson)等人，2008，寇漢等人，2010，弗萊徹等人，2010)。可能的情況是，相同機制 可在人類中起作用。研究顯示，當(dāng)在培養(yǎng)中模擬體內(nèi)所見的相互作用時，F(xiàn)RC和LEC保留了 將PTA呈遞到天然T細(xì)胞的能力（寇漢等人，2010,弗萊徹等人，2010)，不過尚不清楚這是 由目標(biāo)PTA的連續(xù)轉(zhuǎn)錄還是肽-MHC的保留引起的。這些技術(shù)都可用于解決這一問題及有 關(guān)人淋巴結(jié)生物學(xué)的許多其它突出問題。
[0189] 此外，針對淋巴結(jié)的3D培養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)將允許建立模擬體內(nèi)條件和相互作用的 高度控制的實驗系統(tǒng)。已發(fā)現(xiàn)DC和淋巴細(xì)胞在體外易于并且優(yōu)先在FRC網(wǎng)絡(luò)上遷移，如已 在體內(nèi)觀察到的一樣。這些技術(shù)特別適用于利用人類細(xì)胞進行的研究。
[0190] 我們意外地發(fā)現(xiàn)在年齡相配的幼雄性C57B1/6小鼠之間基質(zhì)細(xì)胞亞群存在較少 變化。在測試特定基質(zhì)細(xì)胞亞群的擴增是否需要淋巴細(xì)胞與基質(zhì)之間的交互應(yīng)答時，發(fā)現(xiàn) FRC、LEC、BEC和DN基質(zhì)在Ragv_小鼠中是以正常比例存在，顯示在其發(fā)育或擴增中不需要 T細(xì)胞或B細(xì)胞。先前未分離MRC (MadCAM-I+)基質(zhì)細(xì)胞亞群進行流式細(xì)胞分析，并且發(fā)現(xiàn) MRC在腎小球足突細(xì)胞膜粘蛋白+CD31_FRC門控內(nèi)形成亞群。盡管MRC與FRC顯示相似性， 艮P，表達VCAM-I和ICAM-I，并且分泌ECM組分（例如層粘連蛋白），但其另外產(chǎn)生大量的 CXCL13并且可通過MadCAM-I的表達進行鑒別（片貝等人，2008)。
[0191] 意外的是，在Rag+小鼠中MRC的數(shù)量顯著減少。每個細(xì)胞中MadCAM蛋白的水 平也較低。通過組織學(xué)分析，MadCAM+MRC在皮膚引流Rag+淋巴結(jié)中是可見的（片貝等 人，2008)，不過MadCAM表達和MRC數(shù)量的數(shù)量和定量流式細(xì)胞分析先前是不可能進行的。 這些數(shù)據(jù)表明，淋巴細(xì)胞確實是MRC正常發(fā)育所需的。有趣的是，來自Rag+小鼠的LEC在 較低比例下也發(fā)育成MadCAM+細(xì)胞，并且每個細(xì)胞顯示較少蛋白質(zhì)。MRC和MadCAM+LEC在 Rag+小鼠中無法正常擴增還是僅僅無法上調(diào)MadCAM仍不清楚。MadCAM+LEC的作用也未 描述。
[0192] 由于MRC顯示與LTo細(xì)胞相同的表型（片貝等人，2008)，其構(gòu)造淋巴毒素信 號傳導(dǎo)下游和NF-k B2轉(zhuǎn)錄程序的淋巴結(jié)（米布斯（Mebius) ,2003，寇勒（Coles)等 人，2010)，故已經(jīng)推斷出MRC可能在淋巴結(jié)基質(zhì)的出生后維持或再生方面起到作用（片貝 等人，2008)。結(jié)果顯示，F(xiàn)RC、BEC和DN基質(zhì)的正常擴增不需要MadCAM+MRC的正常擴增和 /或成熟。然而，將需要其它功能研究來確定MRC功能（例如趨化因子的表達）和MadCAM 表達是否是緊密聯(lián)系的。
[0193] -個出乎意料的發(fā)現(xiàn)是皮膚引流淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)的FRC在比例、數(shù)量和轉(zhuǎn) 錄譜方面顯著不同。在腸系膜淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)明顯較少的FRC，其含有若干重要細(xì)胞因子和趨 化因子的較少表達：IL6、IL7、BAFF、CXCL9、CXCL10、ILl受體輔助蛋白（ILlRAP)、激活素受 體I1A、VEGFa、LIF及cKIT-配體。從統(tǒng)計學(xué)上看，路徑分析顯示這些基因明顯不太可能偶 然簇集。值得關(guān)注的是確定這些改變的發(fā)生是由先天發(fā)育差異引起，還是在暴露于不同的 炎性提示（例如抗原暴露頻率或劑量的差異）之后引起。使皮膚引流淋巴結(jié)和腸系膜淋巴 結(jié)暴露于明顯不同的微環(huán)境刺激物。除非皮膚屏障被打破，否則在本研究中，預(yù)期駐留在皮 膚引流淋巴結(jié)中的FRC相對少見遭遇大劑量的微生物來源的抗原。然而，腸系膜FRC通過 腸的正常功能而經(jīng)常地暴露于具有病原體相關(guān)性分子模式的阻擋，并且在Treg誘導(dǎo)和口 服耐受性方面具有重要的穩(wěn)態(tài)作用（哈迪斯（Hadis)等人，2011)?？珊侠淼仡A(yù)期這些日常 因素將改變表達譜，從而達到未知的作用。
[0194] 已報道皮膚引流淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)的發(fā)育差異：腸系膜淋巴結(jié)的完整補體存 在于Cxcll3-/-和Cxcr5-/-小鼠中，而許多皮膚引流淋巴結(jié)則遺失，或在特定位置發(fā)生變 化（安賽爾（Ansel)等人，2000)。類似地，Ltb-/-小鼠發(fā)育腸系膜淋巴結(jié)（盡管異常） 但缺乏許多皮膚引流淋巴結(jié)（科尼（Koni)等人，1997)。由于淋巴結(jié)發(fā)育是在胚胎發(fā)生期 間起始，故這些結(jié)果表明，能夠補償CXCL13或LT P的細(xì)胞因子在出生前腸系膜淋巴結(jié)中 的可用性高于皮膚引流淋巴結(jié)中。類似地，與腸系膜淋巴結(jié)相比較，較低比例的推定的淋 巴結(jié)組織者細(xì)胞存在于新生兒的皮膚引流淋巴結(jié)中（庫佩多（Cupedo)等人，免疫學(xué)雜志 (JImm) 2004)。最后，在將皮膚引流淋巴結(jié)移植到腸系膜中之后，發(fā)現(xiàn)MadCAiTBEC不呈現(xiàn)腸 系膜MadCAM+表型，表明所述差異是發(fā)育差異并且不是暴露于腸源性抗原的結(jié)果（艾倫特 (Ahrendt)等人，2008)。近期的研究也有趣地表明，假定在移植之后被供體細(xì)胞進行性置 換的所攜帶的造血細(xì)胞沒有影響，則來自移植的外周和腸系膜淋巴結(jié)的基質(zhì)可能在其誘導(dǎo) 口服耐受性方面不同（布特納（Buettner)等人，2011)。
[0195] 在6周齡小鼠的皮膚引流淋巴結(jié)中，發(fā)現(xiàn)已知在淋巴結(jié)中起作用的若干細(xì)胞因子 的高水平表達。IL6在來自皮膚引流淋巴結(jié)的FRC中上調(diào)6倍，其為一種經(jīng)歷復(fù)雜調(diào)控的 細(xì)胞因子。當(dāng)在暴露于促炎性ILl之后，在免疫反應(yīng)中較早產(chǎn)生時，IL6具有有效的免疫刺 激性，而且還能通過減低TNFa和IL-I信號傳導(dǎo)以及上調(diào)ILlO來發(fā)揮消炎功能?；|(zhì)不 表達ILlO (數(shù)據(jù)未示出）。相反，發(fā)現(xiàn)在皮膚引流淋巴結(jié)中ILl受體輔助蛋白（ILlRap)上 調(diào)>3倍，表明皮膚引流淋巴結(jié)FRC能夠在感染早期增加IL6的產(chǎn)生。因此，在穩(wěn)態(tài)期間， 來自皮膚引流淋巴結(jié)的FRC也表達高水平ILlRldLlRap的高親和力結(jié)合搭配物），并且不 表達誘騙類似物ILl-RN(迪納雷洛（Dinarello)，1996)(數(shù)據(jù)未示出）。支持這些發(fā)現(xiàn)的 是，先前已報道FRC在數(shù)小時內(nèi)對TLR3信號傳導(dǎo)起反應(yīng)（弗萊徹等人，2010)，表明FRC很 快地對感染起反應(yīng)。還值得注意的是，平滑肌細(xì)胞在伸長后產(chǎn)生具有消炎能力的IL6 (派 德森（Pedersen)，2006)，作為使TOGF-受體磷酸化并刺激細(xì)胞收縮的一種手段（胡（Hu) 等人，1998,扎佩塔奇（Zampetaki)等人，2005)。類似地，在皮膚肌成纖維細(xì)胞中，IL6調(diào) 節(jié)a平滑肌肌動蛋白以增強收縮和傷口閉合（蓋魯奇（Gallucci)等人，2006)。與肌成 纖維細(xì)胞一樣，F(xiàn)RC是表達大量a平滑肌肌動蛋白的高收縮性細(xì)胞（（林克等人，2007)并 且數(shù)據(jù)未示出）。IL6與LIF共用一種受體，LIF在來自皮膚引流淋巴結(jié)的FRC中也上調(diào)。 與IL6-樣，LIF在收縮的肌細(xì)胞中上調(diào)，作為誘導(dǎo)自分泌或旁分泌肌肉細(xì)胞增殖的一種手 段。IL6、ILlRap和LIF代表了在所鑒別的網(wǎng)絡(luò)中由來自皮膚引流淋巴結(jié)的FRC上調(diào)最多 的3種基因。
[0196] 利用淋巴細(xì)胞功能的直接相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在皮膚引流FRC中IL7和BAFF上調(diào)超過兩 倍。IL7是已知的FRC產(chǎn)物，并且用于維持天然T細(xì)胞（林克等人，2007)。BAFF是B細(xì)胞 的有效存活因子和共刺激活化劑。在次級淋巴系器官中，已知其是由非造血FDC產(chǎn)生，但先 前在FRC中未曾報道。然而，在淋巴結(jié)外部的基質(zhì)細(xì)胞的BAFF表達多有報道，不過這看來 需要慢性炎癥并且先前未曾與穩(wěn)態(tài)基質(zhì)相關(guān)聯(lián)（馬凱（Mackay)等人，2009)。我們的細(xì)胞 分選不含F(xiàn)DC污染，因為在轉(zhuǎn)錄分析期間，未發(fā)現(xiàn)Fe Y受體表達的證據(jù)，并且〈1%的淋巴結(jié) 基質(zhì)細(xì)胞對FDC-Ml或⑶35染色呈陽性（數(shù)據(jù)未示出）。FDC局限于B細(xì)胞濾泡，同時FRC 包圍B細(xì)胞濾泡，并且偶爾延伸到B細(xì)胞濾泡中。然而，兩種細(xì)胞類型被認(rèn)為是從共同的前 體發(fā)育而來（米布斯（Mebius)，2003)。這一結(jié)果支持并擴大了這些細(xì)胞類型之間所述相似 性的清單。
[0197] 意外的是，結(jié)果指示，在皮膚引流淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中FRC表達CXCL9和 CXCL10。這些趨化因子都通過由活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞表達的CXCR3進行信號傳 導(dǎo)，并且IFNy、IFNa和其它促炎性刺激物使其轉(zhuǎn)錄上調(diào)（穆勒（Muller)等人，2010)。 盡管未描述CXCLlO在穩(wěn)態(tài)期間于淋巴結(jié)中的作用，但在一些感染期間，CXCLlO在保持淋巴 結(jié)中的Thl淋巴細(xì)胞方面具有重要作用，這一機制促使新活化的T細(xì)胞也變?yōu)門hl，從而產(chǎn) 生極化的適合微生物的反應(yīng)（米山（Yoneyama)等人，2002)。然而,截至目前,僅在淋巴結(jié) 內(nèi)的成熟DC中鑒別出CXCLlO的產(chǎn)生（米山等人，2002)。這些數(shù)據(jù)顯示，穩(wěn)態(tài)FRC也表達 CXCLIOmRNA，其功能未知。
[0198] 對于CXCL9研究很少，但已在來自癌癥相關(guān)淋巴系組織和引流淋巴結(jié)的樹突狀細(xì) 胞中觀察到（大谷（Ohtani)等人，2009)。其在淋巴結(jié)中細(xì)胞遷移的穩(wěn)態(tài)調(diào)控方面的任何 作用并未報道。
[0199] 有趣的是，來自腸系膜淋巴結(jié)和皮膚引流淋巴結(jié)二者的FRC都表達涉及向內(nèi)皮細(xì) 胞傳導(dǎo)信號的基因。已知FRC是在穩(wěn)態(tài)條件下皮膚引流淋巴結(jié)中VEGF的主要產(chǎn)生者（邱 (Chyou)等人，2008)。意外地發(fā)現(xiàn)來自皮膚引流淋巴結(jié)的FRC的VEGFa表達水平高于來 自腸系膜淋巴結(jié)的FRC。事實上，與皮膚引流淋巴結(jié)相比較，腸系膜淋巴結(jié)顯示相對較短 的上調(diào)基因清單，并且當(dāng)針對多重假設(shè)進行穩(wěn)健統(tǒng)計校正時，這些結(jié)果未定位到功能路徑。 然而，觀察到腸系膜淋巴結(jié)中MadCAM表達和淋巴細(xì)胞隔離所需的已知腸相關(guān)基因（例如， Nkx2_3)上調(diào)（帕斯特（Pabst)等人，2000);以及Lrat、Tgm2、Meisl及Pltp上調(diào)。這些 基因或涉及到視黃酸代謝循環(huán)，或在視黃酸作用下上調(diào)（馬特蘇拉（Matsuura)等人，1993， 曹（Cao)等人，2002,蓋爾頓（Galdones)等人，2006,雷柏（Rebe)等人，2009)，視黃酸在腸 系膜淋巴結(jié)中進行加工以對T細(xì)胞賦予腸特異性歸巢表型（艾瓦塔（Iwata)，2009)。還發(fā) 現(xiàn)若干血管舒張劑（Vipr2、Itih4、Nprl)和血管收縮劑（Agt)的表達，表明FRC積極地與淋 巴結(jié)血管通訊。類似地，誘導(dǎo)神經(jīng)突觸生長的基因（Efna5、gprl26、Tmem35和Ngf)上調(diào)表 明了在維持淋巴結(jié)正常交感神經(jīng)支配方面的潛在作用（帕努西奧（Panuncio)等人，1999)。 將需要其它研究來驗證這些結(jié)果。
[0200] 總體而言，皮膚引流淋巴結(jié)中細(xì)胞因子和趨化因子表達的變化提出了通過FRC調(diào) 控微環(huán)境的一個新穎前景。BAFF和CXCR3配體的表達意味著先前未報道的與造血系統(tǒng)交互 應(yīng)答的機制。類似地，IL-6、ILlRap和LIF上調(diào)表明，與其腸系膜淋巴結(jié)對應(yīng)物相比較，皮 膚引流淋巴結(jié)FRC可為收縮性更強和/或活躍分裂更快的，類似地影響內(nèi)皮細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄 增加的VEGF a來保持一致。
[0201] 然而，這些轉(zhuǎn)錄事件沒有同等地發(fā)生在所有FRC中。淋巴結(jié)含有許多未充分了 解的FRC微小生境。其中研究最多的是皮質(zhì)T細(xì)胞區(qū)FRC(有時稱為TRC)，其產(chǎn)生IL-7、 CCL19、CCL21，維持管道系統(tǒng)并且被用作DC、T細(xì)胞和B細(xì)胞遷移的支架。然而，成纖維細(xì)胞 性gp38+CD3r細(xì)胞存在于整個淋巴結(jié)中；毗鄰B細(xì)胞濾泡的囊下區(qū)中；作為周皮細(xì)胞；以及 整個骨髓中。仍不太可能區(qū)分這些不同的FRC類型，并且如果其有差別地表達所鑒別的細(xì) 胞因子和趨化因子，那么皮膚引流淋巴結(jié)與腸系膜淋巴結(jié)之間的差異可能涉及其比例的變 化。
[0202] 總體而言，這些數(shù)據(jù)表示了適用于淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞的全面技術(shù)目錄。
[0203] 表1 :在FACSAria和FACSAria IIu (BD生物科技公司）中對于100 ii m吸頭的低 壓基質(zhì)細(xì)胞分選參數(shù)的樣品范圍。n = 4-8個獨立實驗
[0204]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于抑制免疫反應(yīng)的方法，其包含： 向需要此類治療的受試者投予有效抑制所述受試者的所述免疫反應(yīng)的量的分離淋巴 系組織源性抑制性基質(zhì)細(xì)胞LSSC。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中投予所述受試者的所述LSSC是離體擴增的細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中投予所述受試者的所述LSSC實質(zhì)上不含非LSSC。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中將至少10萬個LSSC/kg投予所述受試者。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中將至少100萬個LSSC/kg投予所述受試者。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一權(quán)利要求所述的方法，其中投予所述受試者的所述LSSC 是來源于淋巴結(jié)、脾、胸腺、扁桃腺、腺樣增殖體和/或派爾集合淋巴結(jié)（Peyer's patch)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述LSSC是在植入所述受試者中的二維或三維構(gòu) 架之上或之中。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述LSSC是通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下或 肌肉內(nèi)注射或通過局部投予到病變、器官、器官囊、脂肪或淋巴結(jié)中來向所述受試者投予。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述受試者患有自體免疫性 或炎癥性疾病。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述自體免疫性或炎癥性疾病選自由以下各項 組成的群組：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、牛皮癬、炎癥性腸病、移植物抗宿主疾病及敗血 病。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述LSSC相對于所述受試 者為自體、同種異體或異種異體的。
12. -種分離淋巴系組織源性抑制性基質(zhì)細(xì)胞LSSC的方法，其包含使用酶混合物與攪 動的組合來消化淋巴系組織片段，然后收集所述LSSC。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述淋巴系組織片段的消化是以一系列步驟進 行，所述步驟包含： (i) 將所述淋巴系組織片段與酶混合物一起培育； (ii) 使用移液管攪動所述組織，隨后培育以使較大片段沉降； (iii) 取出上清液并重復(fù)步驟（i)和（ii)，直到所有片段都消化；以及 其中通過匯集所有上清液部分，隨后離心以獲得細(xì)胞團粒來收集所述LSSC。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中使所述分離LSSC在包含補充有生長因子、血清、 血小板溶解產(chǎn)物和抗生素中的一或多種的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中生長。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述分離LSSC是以1-10, 000個細(xì)胞/平方厘 米的密度生長。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述分離LSSC是在0. 1-21 %的氧分壓下生長。
17. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中使所述LSSC生長直到所述LSSC實質(zhì)上不含非 LSSC。
18. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中使所述LSSC生長直到基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加至少 10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、200% 或更多。
19. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述酶混合物包含培養(yǎng)基、分散酶、膠原酶 和DNA酶I。
20. 根據(jù)權(quán)利要求12到17中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述LSSC是來源于淋巴 結(jié)、脾、胸腺、扁桃腺、腺樣增殖體或派爾集合淋巴結(jié)。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述LSSC是使用根據(jù)權(quán)利要求12到20中任一 權(quán)利要求所述的方法分離的。
22. -種包含分離淋巴系組織源性抑制性基質(zhì)細(xì)胞LSSC的組合物，其中所述LSSC是使 用根據(jù)權(quán)利要求12到20中任一權(quán)利要求所述的方法分離的。
23. -種醫(yī)藥制劑，其包含分離淋巴系組織源性抑制性基質(zhì)細(xì)胞LSSC的組合物。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的醫(yī)藥組合物，其中所述LSSC是通過使用化學(xué)方法、機械方 法和電細(xì)胞分離方法中的一或多種處理淋巴系組織片段，然后收集所述LSSC來分離的。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的醫(yī)藥組合物，其中所述分離LSSC是通過細(xì)胞培養(yǎng)擴增的。
26. 根據(jù)權(quán)利要求23到25中任一權(quán)利要求所述的醫(yī)藥組合物，其中所述分離LSSC是 離體擴增的細(xì)胞。
27. 根據(jù)權(quán)利要求23到26中任一權(quán)利要求所述的醫(yī)藥組合物，其中所述分離LSSC是 通過使所述收集的LSSC生長直到所述LSSC實質(zhì)上不含非LSSC來進行擴增。
28. 根據(jù)權(quán)利要求23到27中任一權(quán)利要求所述的醫(yī)藥組合物，其中所述分離LSSC共 同表達CD140a和PD-L2。
29. 根據(jù)權(quán)利要求23到27中任一權(quán)利要求所述的醫(yī)藥組合物，其中所述分離LSSC共 同表達CD140a和LTBR。
30. 根據(jù)權(quán)利要求23到27中任一權(quán)利要求所述的醫(yī)藥組合物，其中所述分離LSSC共 同表達 CD140a、PD-L2 和 LTBR。
31. 根據(jù)權(quán)利要求28到30中任一權(quán)利要求所述的醫(yī)藥組合物，其中所述分離LSSC 表達至少一種選自由以下各項組成的群組的其它淋巴系標(biāo)記物：ro-Ll、Thy-1、MADCAM-1、 MYH11、IL-7R 或 ITGA7。
32. 根據(jù)權(quán)利要求23到31中任一權(quán)利要求所述的醫(yī)藥組合物，其中所述分離LSSC表 達至少一種選自由IL-6、CCL19、CCL21或VEGF組成的群組的因子。
33. 根據(jù)權(quán)利要求23到32中任一權(quán)利要求所述的醫(yī)藥組合物，其中所述細(xì)胞是從選自 由以下各項組成的群組的物種分離：人類、非人類靈長類動物、犬科動物、貓科動物、馬科動 物、豬科動物、牛科動物及嚙齒動物。
34. 根據(jù)權(quán)利要求23到33中任一權(quán)利要求所述的醫(yī)藥組合物，其中所述細(xì)胞在體外抑 制T細(xì)胞增殖。
35. 根據(jù)權(quán)利要求23到34中任一權(quán)利要求所述的醫(yī)藥組合物，其中所述LSSC是從淋 巴結(jié)、脾、胸腺、扁桃腺、腺樣增殖體或派爾集合淋巴結(jié)分離的。
【文檔編號】A61K35/26GK104349785SQ201380025601
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月21日
【發(fā)明者】安妮·弗萊徹, 沙努恩·J·特利, 比瑞·帕雷克丹 申請人:達納-法伯癌癥研究所有限公司, 通用醫(yī)院公司以麻省總醫(yī)院名義經(jīng)營