Ang2結(jié)合分子的制作方法
【專利摘要】Ang2結(jié)合分子，優(yōu)選Ang2結(jié)合免疫球蛋白單一可變域樣VHH和域抗體，包含它們的藥物組合物，及其在治療與Ang2介導的對血管生成的作用相關(guān)的疾病中的用途。編碼Ang2結(jié)合分子的核酸、宿主細胞及其制備方法。
【專利說明】ANG2結(jié)合分子 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及人的治療，特別是癌癥治療的領(lǐng)域以及適用于該治療中的藥物及組合 物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 如 US 2008/0014196、TO 2008101985 和 US 2011/0027286 中所述，血管生成是借 以形成新血管的生物學過程，且涉及包括實體瘤和轉(zhuǎn)移以及眼病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機 制。當腫瘤達到約Imm3的臨界大小時，它們變得依賴于血管生成以保持氧氣和營養(yǎng)物的血 液供應(yīng)以便進一步生長。抗血管生成治療已成為若干類型腫瘤的重要治療選擇。
[0004] -種最為重要的促血管生成因子是促血管生成素2(Ang2)，Tie2受體（Tie2)的一 種配體，其通過使其他的血管生成因子（如VEGF)能夠發(fā)揮功能來調(diào)控血管重構(gòu)。在本領(lǐng) 域中，Ang2還被稱為Tie2配體（美國專利號5, 643, 755, Yancopoulos等人? 2000, Nature 407 :242-248) 〇
[0005] Ang2主要由內(nèi)皮細胞表達，由缺氧和其他血管生成因子強烈誘導，并已證明其調(diào) 節(jié)腫瘤血管的可塑性，使血管能夠應(yīng)答VEGF和FGF2(Augustin等人，Nat Rev Mol Cell Biol. 2009年3月；10(3): 165-77)。與該作用相一致，Ang2的缺失或抑制導致血管生成 減少（Falc6n等人，Am J Pathol. 2009年11月；175 (5) :2159-70)。已經(jīng)報道患有結(jié)腸直 腸癌（CRC)、非小細胞肺癌（NSCLC)和黑素瘤的患者具有升高的Ang2血清濃度（Goede等 人，& J Cancer. 2010 年 10 月 26 日；103 (9) : 1407-14) (Park 等人，Chest. 2007 年 7 月； 132 (1):200-6) (Helfrich 等人，Clin Cancer Res. 2009 年 2 月 15 日；15 (4) :1384-92)。在 CRC癌癥中，Ang2血清水平與抗VEGF治療的治療應(yīng)答相關(guān)。
[0006] Ang-Tie系統(tǒng)由2個受體（Tiel和Tie2)和3個配體（Angl、Ang2和Ang4)組成 (Augustin 等人，Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 年 3 月；10 (3) :165-77) oTieS'Angl 和 Ang2 是這個家族中得到最好研究的成員，Tiel是一個孤兒受體而Ang4對血管重構(gòu)的作用仍然 需要明確。Ang2和Angl在Tie2的結(jié)合和活化中介導相反的功能。Ang2介導的Tie2活化 導致內(nèi)皮細胞活化、周細胞解離、血管滲漏和誘導血管萌芽。與Ang2相反，Angl信號傳導 通過募集周細胞維持血管完整性，從而保持內(nèi)皮細胞靜止。
[0007] 促血管生成素2(Ang2)是一種分泌的、66kDa的Tie2受體酪氨酸激酶的配體 (Augustin 等人，Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 年 3 月；10 (3) :165-77)。Ang2 由 N-末端 卷曲螺旋域和C-末端的纖維蛋白原樣域組成，后者是與Tie2相互作用需要的。Ang2主要 由內(nèi)皮細胞表達并由缺氧和其他血管生成因子（包括VEGF)強烈誘導。Tie2存在于內(nèi)皮 細胞、造血干細胞和腫瘤細胞上。已經(jīng)證明Ang2-Tie2調(diào)節(jié)腫瘤血管的可塑性，使血管應(yīng)答 VEGF 和 FGF2。
[0008] 在體外已經(jīng)表明Ang2在人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC)中充當溫和的有絲分裂原、趨 化吸引劑（chemoattractant)和管形成的誘導物。Ang2誘導成纖維細胞中異位表達的Tie2 的酪氨酸磷酸化，并促進下游信號傳導事件，例如HUVEC中ERK-MAPK、AKT和FAK的磷酸化。 已經(jīng)描述了 Ang2在Angl誘導的內(nèi)皮細胞應(yīng)答中的拮抗作用。
[0009] 已經(jīng)表明Ang2缺乏導致了小鼠中嚴重的淋巴模式（lymphatic patterning)缺 陷。雖然Ang2喪失不是胚胎血管發(fā)育所必需的，但是Ang2缺陷小鼠在視網(wǎng)膜和腎臟中具 有持久性血管缺陷。結(jié)合在血管生成部位（例如卵巢）的Ang2表達的動態(tài)模式，這些結(jié)果 表明Ang2通過使其他的血管生成因子（如VEGF)能夠發(fā)揮功能而調(diào)控血管重構(gòu)。
[0010] Ang2_Tie2系統(tǒng)在血管生成開關(guān)和腫瘤血管生成后期階段中發(fā)揮至關(guān)重要的作 用。在腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮中Ang2的表達強烈上調(diào)。當腫瘤植入Ang2缺陷小鼠，特別是在腫 瘤生長的早期階段植入時，觀察到了腫瘤生長減少。使用Ang2單克隆抗體治療性阻斷Ang2 已經(jīng)在各種腫瘤異種移植模型中顯示出廣泛的療效。
[0011] 如上述美國2008/0014196中所概述，血管生成牽涉于包括實體瘤及轉(zhuǎn)移的多種 疾病的發(fā)病機制中。
[0012] 在腫瘤生長的情況下，血管生成對于自增生轉(zhuǎn)變?yōu)樾律[瘤及對于為腫瘤生長及 轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)似乎是至關(guān)重要的（Folkman等人，Nature 339-58 (1989))，這使得腫瘤細胞 相比于正常細胞獲得生長優(yōu)勢。因此，抗血管生成治療已成為若干類型腫瘤的重要治療選 擇。這些治療集中于阻斷VEGF途徑（Ferrara等人，Nat Rev Drug Discov. 2004年5月； 3(5) :391-400)。
[0013] 結(jié)合Ang2和Angl的抗體及其它肽抑制劑在例如美國專利號6, 166, 185 ; 7, 521，053 ;7, 205, 275 ;和美國專利申請?zhí)?2006/0018909 和 2006/0246071 中被提及。此 夕卜，美國2011/0027286公開了不拮抗相關(guān)分子Angl的特異性單克隆Ang2抗體。
[0014] 然而，現(xiàn)有技術(shù)的單克隆抗體（Mb)及融合蛋白鑒于其治療應(yīng)用具有若干缺點： 為了防止其降解，其必須儲存在接近冰點的溫度。此外，因為其在消化道中快速消化，所以 其不適于口服給藥。Mb用于癌癥治療的另一主要限制為轉(zhuǎn)運不良，這導致濃度低且不能靶 向于腫瘤中的所有細胞。
[0015] 本發(fā)明的一個目的在于提供新的改良的Ang2結(jié)合分子，即阻斷Ang2與Tie2結(jié)合 卻不阻斷Angl與Tie2結(jié)合的納米抗體。
[0016] 更具體地，本發(fā)明的目的在于提供新的Ang2結(jié)合分子，且具體是結(jié)合哺乳動物 Ang2而不結(jié)合哺乳動物Angl的Ang2結(jié)合分子,且特別是結(jié)合人Ang2而不結(jié)合人Angl的 Ang2i結(jié)核分子，其中此類分子或多肽適用于如本文所述的治療和診斷目的。本發(fā)明的另一 目的是提供特異性結(jié)合Ang2而不結(jié)合Angl的免疫球蛋白單一可變域。
[0017] 此類Ang2結(jié)合分子或Ang2拮抗劑可用作預防、治療、緩解和/或診斷與Ang2介 導的對血管生成的作用相關(guān)的疾病或狀況的組合物中的藥理學活性劑。
[0018] 此類疾病的實例是癌癥或癌性疾病，例如乳腺癌、腎細胞癌、卵巢癌和胰腺癌，眼 病例如年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病變，和/或慢性腎病例如糖尿病腎病、腎 后性腎衰、腎前性氮質(zhì)血癥和內(nèi)在腎功能衰竭。
[0019] 本發(fā)明的另一個目的在于提供預防、治療、減輕和/或診斷這些疾病、病癥或病狀 的方法，其涉及使用和/或給予這些Ang2結(jié)合分子及包含這些Ang2結(jié)合分子的組合物。具 體地，本發(fā)明的一個目的在于提供這種藥理學活性的Ang2結(jié)合分子、組合物和/或方法，其 相比于當前使用的和/或本領(lǐng)域中已知的藥劑、組合物和/或方法體現(xiàn)出優(yōu)勢。這些優(yōu)勢 包括改良的治療性質(zhì)和/或藥理學性質(zhì)和/或其他有利的性質(zhì)例如對于制造目的而言有利 的性質(zhì)，尤其是與如上所述的常規(guī)抗體或其片段相比。
[0020] 發(fā)明概述
[0021] 根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種包含免疫球蛋白單一可變域的Ang2結(jié)合分子， 其中所述免疫球蛋白單一可變域包含三個互補決定區(qū)⑶R1XDR2和⑶R3,其中⑶Rl具有選 自SEQ ID NO: 168至170中所示氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有選自SEQ ID No: 171 至173中所示氨基酸序列的氨基酸序列且⑶R3具有選自SEQ ID NO: 174至177中所示氨 基酸序列的氨基酸。
[0022] 本發(fā)明還涉及由所述免疫球蛋白單一可變域組成的Ang2結(jié)合分子。
[0023] 此外，本發(fā)明涉及具有選自由SEQ ID No:167、166、129和138組成的組的序列的 Ang2結(jié)合分子。
[0024] 根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了編碼所述Ang2結(jié)合分子的核酸以及包含所述核酸 的表達載體。
[0025] 本發(fā)明還涉及攜帶攜帶一種或多種包含所述核酸的表達載體的宿主細胞。
[0026] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生或生成根據(jù)本發(fā)明的Ang2結(jié)合分子的方法，所述方法包括以 下步驟：
[0027] (a)用一種或多種包含所述核酸分子的所述載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，
[0028] (b)培養(yǎng)所述宿主細胞，以及
[0029] (c)回收并純化所述Ang2結(jié)合分子。
[0030] 本發(fā)明的另一方面涉及包含作為活性成分的一種或多種所述Ang2結(jié)合分子以及 至少生理學上可接受的載體的藥物組合物。
[0031] 本發(fā)明還涉及本文所述的Ang2結(jié)合分子、核酸、宿主細胞、產(chǎn)品和組合物的應(yīng)用 及用途，以及涉及用于預防和/或治療與Ang2介導的對血管生成的作用相關(guān)的疾?。▋?yōu)選 癌癥、癌性疾病和眼?。┑姆椒?。
[0032] 本發(fā)明的這些及其他方面、實施方案、優(yōu)勢及應(yīng)用將由下文進一步描述而變得明 確。
[0033] 定義
[0034] 除非另有指示或定義，否則所有所用術(shù)語均具有本領(lǐng)域中的通常含義，該含義 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是清楚的。參考例如標準手冊，如Sambrook等人，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual，'（第 2 版），第 1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) ;Lewin, "Genes IV"，Oxford University Press,New York, (1990);及 Roitt 等人，"Immunology"（第 2 版），Gower Medical Publishing, London，New York(1989)，以 及本文中引用的一般現(xiàn)有技術(shù)；此外，除非另有說明，否則未具體詳述的所有方法、步驟、技 術(shù)及操作均可以以本身已知的方式進行，該方式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是清楚的。還可 參考例如標準手冊、上述一般背景現(xiàn)有技術(shù)及其中引用的其他參考文獻。
[0035] 除非規(guī)定為來自非人類物種（例如"小鼠 Ang2"等），否則術(shù)語"促血管生成素2" 或"Ang2"是指人Ang2或其生物活性片段（例如可在體外或體內(nèi)誘導血管生成的Ang2蛋白 的片段），即，是指登錄號為匪001147. 2的人Ang2(變體1)、具有登錄號NM_001118887. 1 的人Ang2(變體2)或者具有登錄號NM_001118888. 1的人Ang2(變體3)，和/或它們的生 物活性片段。Ang2非人類物種，例如小鼠 Ang2和猴Ang2的氨基酸序列分別可從蛋白序列 數(shù)據(jù)庫的登錄號：NM_〇〇7426.3(SEQ ID NO: (SEQ ID 188)和 AB172643. 1(SEQ ID N0:187) 下獲得。
[0036] 除非規(guī)定為來自非人類物種（例如"小鼠 Ang2"等），否則術(shù)語"促血管生成素1" 或"Angl"是指人Angl或其生物活性片段（例如可在體外或體內(nèi)誘導血管生成的Angl蛋 白的片段），即，是指登錄號為NM_〇〇l 146. 3的人Angl或其生物活性片段。
[0037] 除非另有說明，否則術(shù)語"免疫球蛋白"及"免疫球蛋白序列"在本文中無論是用 于指重鏈抗體還是指常規(guī)4鏈抗體，均用作一般術(shù)語以包括全長抗體、其單個的鏈以及其 所有部分、域或片段（分別包括但不限于抗原結(jié)合域或片段，如VHH域或VH/VL域）。此外， 本文所用的術(shù)語"序列"（例如在"免疫球蛋白序列"、"抗體序列"、"（單一）可變域序列"、 "VHH序列"或"蛋白序列"等的術(shù)語中），一般應(yīng)理解為既包括相關(guān)氨基酸序列，又包括編碼 所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更限定的解釋。
[0038] 如本文所用的術(shù)語（多肽或蛋白的）"域"是指折疊蛋白結(jié)構(gòu)，其能夠獨立于蛋白 的其余部分維持其三級結(jié)構(gòu)。一般而言，域負責蛋白的各種功能性質(zhì)，且在許多情況下可添 力口、移除或轉(zhuǎn)移至其他蛋白而不損失蛋白的其余部分和/或域的功能。
[0039] 如本文所用的術(shù)語"免疫球蛋白域"是指抗體鏈（如常規(guī)4鏈抗體的鏈或重鏈抗 體的鏈）的球形區(qū)域，或是指基本上由這類球形區(qū)域組成的多肽。免疫球蛋白域的特征在 于其維持抗體分子的免疫球蛋白折疊特征，其由排列在兩個3折疊中任選由保守二硫鍵 穩(wěn)定的約7條反平行P鏈的2層夾層（sandwich)組成。
[0040] 如本文所用的術(shù)語"免疫球蛋白可變域"是指基本上由本領(lǐng)域及下文中分別稱為 "框架區(qū)1 "或" FR 1 "、"框架區(qū)2 "或" FR2 "、"框架區(qū)3 "或" FR3 "、及"框架區(qū)4 "或" FR4 " 的四個"框架區(qū)"組成的免疫球蛋白域；所述框架區(qū)被本領(lǐng)域及下文中分別稱為"互補決 定區(qū)1"或"⑶R1"、"互補決定區(qū)2"或"⑶R2"、及"互補決定區(qū)3"或"⑶R3"的三個"互 補決定區(qū)"或"CDR"間隔。因此，免疫球蛋白可變域的一般結(jié)構(gòu)或序列可如下表示為： FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變域因具有抗原結(jié)合位點而賦予抗體對 抗原的特異性。
[0041] 如本文所用的術(shù)語"免疫球蛋白單一可變域"是指能夠在不與其他免疫球蛋白可 變域配對的情況下特異性結(jié)合抗原的表位的免疫球蛋白可變域。本發(fā)明含義中的免疫球 蛋白單一可變域的一個實例為"域抗體"，例如免疫球蛋白單一可變域VH及VL (VH域及VL 域）。免疫球蛋白單一可變域的另一實例為如下文定義的來自駱駝科的"VHH域"（或簡稱 為"麗，，）。
[0042] 鑒于以上定義，常規(guī)4鏈抗體（例如本領(lǐng)域中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分 子）或源自所述常規(guī)4鏈抗體的Fab片段、F (ab'）2片段、Fv片段（例如二硫鍵連接的Fv 或scFv片段）、或雙特異抗體（均為本領(lǐng)域中已知）的抗原結(jié)合域，通常不視為免疫球蛋白 單一可變域，這是因為在該情況下，通常并非通過一個（單一）免疫球蛋白域與抗原的各別 表位發(fā)生結(jié)合，而是通過共同結(jié)合各別抗原表位的一對（締合）免疫球蛋白域（例如輕鏈 及重鏈可變域），即通過免疫球蛋白域的VH-VL對發(fā)生結(jié)合。
[0043] "VHH域"，也稱為VHH、VhH域、VHH抗體片段和VHH抗體，最初被描述為"重鏈抗 體"（即"缺乏輕鏈的抗體"）的抗原結(jié)合免疫球蛋白（可變）域（Hamers-Casterman C， Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R. : "Naturally occurring antibodies devoid of light chains" ；Nature 363， 446-448 (1993))。已選擇術(shù)語"VHH域"從而將這些可變域與存在于常規(guī)4鏈抗體中的重 鏈可變域（其在本文中稱為"VH域"或"VH域"）以及存在于常規(guī)4鏈抗體中的輕鏈可變域 (其在本文中稱為"'域"或"VL域"）進行區(qū)分。VHH域可特異性結(jié)合表位而無其他抗原 結(jié)合域（此與常規(guī)4鏈抗體中的VH或VL域相反，在該情況下表位由VL域與VH域一起識 別）。VHH域為由單一免疫球蛋白域形成的小型、魯棒且高效的抗原識別單元。
[0044] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語VHH域、VHH、VhH域、VHH抗體片段、VHH抗體以及 "Nanobody?"及"Nanobody?域"（"Nanobody" 為比利時根特 Ablynx N. V?公司的商 標）可互換使用且表示免疫球蛋白單一可變域（具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 結(jié)構(gòu)且特異性結(jié)合表位無需存在第二免疫球蛋白可變域），且其通過例如WO 2009/109635 圖1中定義的所謂"印記殘基（hallmark residue)"區(qū)別于VH域。
[0045] 如例如 Riechmann 及 Muyldermans，J. Immunol. Methods 231，25-38 (1999)的圖 2中所示，適用于駱駝科的VHH域，根據(jù)Kabat等人給出的VJt的通用編號法（"Sequence of proteins of immunological interest",US Public Health Services,NIH Bethesda, MD,公開案第91號）來編號免疫球蛋白單一可變域（如VHH)的氨基酸殘基。
[0046] 根據(jù)該編號法，
[0047] -FRl包含在位置1-30處的氨基酸殘基，
[0048] -⑶Rl包含在位置31-35處的氨基酸殘基，
[0049] -FR2包含在位置36-49處的氨基酸，
[0050] -⑶R2包含在位置50-65處的氨基酸殘基，
[0051] -FR3包含在位置66-94處的氨基酸殘基，
[0052] -⑶R3包含在位置95-102處的氨基酸殘基，且
[0053] -FR4包含在位置103-113處的氨基酸殘基。
[0054] 然而應(yīng)注意，如本領(lǐng)域中對于Vh域及VHH域所公知的，各CDR中的氨基酸殘基的 總數(shù)可能不同，且可能不對應(yīng)于由Kabat編號法所指示的氨基酸殘基的總數(shù)（即根據(jù)Kabat 編號法的一個或多個位置可能在實際序列中未被占據(jù)，或?qū)嶋H序列可能含有多于Kabat編 號所允許數(shù)目的氨基酸殘基）。這意味著一般而言，根據(jù)Kabat的編號可能對應(yīng)或可能不對 應(yīng)于實際序列中氨基酸殘基的實際編號。
[0055] 對Vh域的氨基酸殘基進行編號且還可以類似方式應(yīng)用于VHH域的替代方法在本 領(lǐng)域中是已知的。然而，除非另有說明，否則在本說明書、權(quán)利要求書及附圖中，將遵循如上 所述根據(jù)Kabat且應(yīng)用于VHH域的編號法。
[0056] VHH域中的氨基酸殘基的總數(shù)將通常在110-120范圍內(nèi)，常常介于112與115之 間。然而應(yīng)注意較小及較長序列也可適于本文所述的目的。
[0057] 免疫球蛋白單一可變域，例如根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施方案的VHH及域抗體具有大量 使其高度有利于在治療中用作功能性抗原結(jié)合分子的獨特結(jié)構(gòu)特征及功能性質(zhì)。特別地， 且不對其進行限制，VHH域（其已本質(zhì)上經(jīng)"設(shè)計"為在不與輕鏈可變域配對情況下功能性 地結(jié)合抗原）可充當單一、相對較小、功能性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)單元。
[0058] 由于其獨特性質(zhì)，如本文定義的免疫球蛋白單一可變域，例如VHH或VH (或VL)，無 論是單獨存在還是作為較大多肽（例如雙互補位分子）的一部分，均提供許多顯著優(yōu)點：
[0059] ?僅需要單一域以高親和力及高選擇性地結(jié)合抗原，因而無需存在兩個單獨的 域，也無需確保這兩個域以正確的空間構(gòu)象及構(gòu)型存在（即通過使用特別設(shè)計的接頭，如 scFv的接頭）；
[0060] ?免疫球蛋白單一可變域可從單一核酸分子表達且不需要任何翻譯后修飾（如 糖基化）；
[0061] ?免疫球蛋白單一可變域可輕易經(jīng)工程改造為多價及多特異性形式（如本文進 一步論述的）；
[0062] ?免疫球蛋白單一可變域?qū)ζ浒悬c具有高特異性及親和力，具有低固有毒性，并 且可通過輸注或注射以外的替代途徑給予；
[0063] ?免疫球蛋白單一可變域?qū)?、pH、蛋白酶及其他變性劑或變性條件高度穩(wěn)定，因 此可在不使用制冷設(shè)備情況下制備、儲存或運輸；
[0064] ?免疫球蛋白單一可變域無論是以小規(guī)模還是以生產(chǎn)規(guī)模制備均較為容易且相 對廉價。例如，免疫球蛋白單一可變域可使用微生物發(fā)酵（例如下文進一步描述的）產(chǎn)生， 不需要像例如常規(guī)抗體那樣使用哺乳動物表達系統(tǒng)；
[0065] ?相比于常規(guī)4鏈抗體及其抗原結(jié)合片段，免疫球蛋白單一可變域是相對較小的 (約15kDa，或為常規(guī)IgG的1/10)，因此顯示（更）高的組織（包括但不限于實體瘤及其他 致密組織）穿透性，且可以以高于這些常規(guī)4鏈抗體及其抗原結(jié)合片段的劑量給予；
[0066] ? VHH具有特定的所謂"空腔結(jié)合性質(zhì)"（cavity-binding properties)(尤其是 由于相比于4鏈抗體的VH域，其⑶R3環(huán)更為伸展），因此其也能夠進入常規(guī)4鏈抗體及其 抗原結(jié)合片段不能進入的靶點及表位；
[0067] ? VHH具有高度可溶性和極其穩(wěn)定且沒有聚集趨勢的特別優(yōu)勢（如同由Ward等 人，Nature 341:544-546 (1989)所述的小鼠源抗原結(jié)合域）。
[0068] 本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域，其獲得的具體生物來源或具體制備方法不受限 制。例如，獲得VHH可包括以下步驟：
[0069] (1)分離天然存在的重鏈抗體的VHH域；或篩選包含重鏈抗體或VHH的文庫且從 中分離VHH ;
[0070] (2)表達編碼具有天然存在序列的VHH的核酸分子；
[0071] (3)任選在親和力成熟之后使具有天然存在序列的VHH "人源化"（如本文所述 的），或表達編碼這類人源化VHH的核酸；
[0072] (4)使動物物種（特別是哺乳動物物種，例如人）天然存在抗體的免疫球蛋白單一 可變重域"駱駝化"（如下所述），或表達編碼這類駱駝化域的核酸分子；
[0073] (5)使VH "駱駝化"，或表達編碼這類駱駝化VH的核酸分子；
[0074] (6)使用以合成方式或半合成方式制備蛋白、多肽或其他氨基酸序列的技術(shù)；
[0075] (7)使用核酸合成技術(shù)制備編碼VHH域的核酸分子，隨后表達由此獲得的核酸；
[0076] (8)使重鏈抗體或VHH經(jīng)受親和力成熟、誘變（例如隨機誘變或定點誘變）和/或 任何其他技術(shù)以增加 VHH的親和力和/或特異性；和/或
[0077] (9)組合或選擇上述步驟。
[0078] 適于進行上述步驟的方法及技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的且將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 了解。舉例而言，獲得結(jié)合特異性抗原或表位的VHH域的方法已經(jīng)在WO 2006/040153和WO 2006/122786 中描述。
[0079] 根據(jù)具體實施方案，本發(fā)明的或存在于本發(fā)明的多肽中的免疫球蛋白單一可變域 為氨基酸序列基本上對應(yīng)于天然存在VHH域的氨基酸序列的VHH域，但其已經(jīng)"人源化"或 "序列優(yōu)化"（任選在親和力成熟之后），即通過以人的常規(guī)4鏈抗體可變重域中相應(yīng)位置處 存在的一個或多個氨基酸殘基置換該天然存在VHH序列的氨基酸序列中的一個或多個氨 基酸殘基。這可使用本領(lǐng)域中已知的方法進行，所述方法可由本領(lǐng)域技術(shù)人員以常規(guī)方式 使用。
[0080] 人源化的VHH域可含有一個或多個完全人框架區(qū)序列，且在一個進一步更具體的 實施方案中，可含有源自人生殖系Vh3序列DP-29、DP-47、DP-51的人框架區(qū)序列或其部分， 或與其高度同源，任選與JH序列（例如JH5)組合。因此，人源化方案可包含單獨或組合使 用生殖系VH基因（例如DP 47、DP 29及DP 51)的相應(yīng)框架1、2和3(FR1、FR2和FR3)殘 基來置換任何VHH殘基。本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域的適合的框架區(qū)（FR)可選自那 些例如WO 2006/004678中公開的FR，且具體地包括所謂"KERE"及"GLEW"類型。實例為在 約位置44-47處具有氨基酸序列G-L-E-W的免疫球蛋白單一可變域及其分別的人源化對應(yīng) 物。人源化VHH域可包含一個或多個完全的人框架區(qū)序列。
[0081] 例如，屬于103P，R，S組和/或GLEW組（如下文所定義）的VHH的人源化取代是 將108Q取代成108L。使免疫球蛋白單一可變域人源化的方法在本領(lǐng)域中是已知的。
[0082] 在治療應(yīng)用方面具有改良的性質(zhì)（例如增強的親和力或降低的免疫原性）的結(jié)合 免疫球蛋白單一可變域，可通過如下本領(lǐng)域中已知的技術(shù)而從各別的結(jié)合分子獲得：親和 力成熟（例如從合成、隨機或天然存在的免疫球蛋白序列起始）、CDR移植、人源化、合并源 自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重疊引物的PCR組裝、及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的用于 工程改造免疫球蛋白序列的類似技術(shù)；或任何上述技術(shù)的任何適合組合，也稱為如本文所 述的術(shù)語"序列優(yōu)化"。例如參考標準手冊以及其他描述及實施例。
[0083] 適當時，可通過使另一結(jié)合分子親和力成熟來獲得親和力增加的結(jié)合分子，就親 和力成熟分子而言所述另一結(jié)合分子表示"親本"結(jié)合分子。
[0084] 獲得結(jié)合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已描述于例如WO 2006/040153及WO 2006/122786中。如其中所詳述的，源自駱駝科的VHH域可通過以人常規(guī)4鏈抗體VH域中 相應(yīng)位置處存在的一個或多個氨基酸殘基置換原始VHH序列的氨基酸序列中的一個或多 個氨基酸殘基來"人源化"（本文中也稱為"序列優(yōu)化"，除人源化外，"序列優(yōu)化"可涵蓋通 過提供VHH改良性質(zhì)的一個或多個突變對序列進行的其他修飾，如移除潛在的翻譯后修飾 位點）。人源化VHH域可含有一個或多個完全人框架區(qū)序列，且在一進一步更具體實施方 案中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51的人框架區(qū)序列，或其部分，任選與JH序列（例如 JH5)組合。
[0085] "域抗體"，也稱為 "Dab" 及"dAb"（術(shù)語"域抗體（Domain Antibodies)" 及 "dAb"被GlaxoSmithKline公司集團用作商標），已描述于例如以下文獻中：Ward, E. S.， 等人："Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli，'；Nature 341: 544-546 (1989) ；Holt, L. J?等人："Domain antibodies:proteins for therapy" ；TRENDS in Biotechnology 21 (11):484-490(2003);及 TO 2003/002609。
[0086] 域抗體基本上對應(yīng)于非駱駝科哺乳動物的抗體（特別是人4鏈抗體）的VH或VL 域。為了以單一抗原結(jié)合域的形式（即在不與VL域或VH域分別配對的情況下）結(jié)合表位， 需要例如通過使用人單一 VH或VL域序列的文庫對這些抗原結(jié)合性質(zhì)進行具體選擇。
[0087] 域抗體如VHH的分子量為約13kDa至約16kDa，且若源自完全人序列，則不需要進 行人源化以供例如人治療使用。在VHH域的情況下，域抗體在原核表達系統(tǒng)中也很好地得 以表達，從而顯著降低總制造成本。
[0088] 此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還將了解，有可能將一個或多個上述⑶R "移植"于其他"支 架"（包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架）上。用于這種CDR移植的適合支架及技 術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。
[0089] 可互換使用的術(shù)語"表位"及"抗原決定簇"是指大分子（例如多肽）的一部分，其 由抗原結(jié)合分子（例如常規(guī)抗體或本發(fā)明的多肽）識別，且更具體地由所述分子的抗原結(jié) 合位點識別。表位定義免疫球蛋白的最小結(jié)合位點，因此表示免疫球蛋白的特異性的靶點。 [0090] 可"結(jié)合"或"特異性結(jié)合"某一表位、抗原或蛋白（或其至少一部分、片段或表 位）、對其"具有親和力"和/或"具有特異性"的多肽（例如免疫球蛋白、抗體、本發(fā)明的免 疫球蛋白單一可變域、或一般而言抗原結(jié)合分子或其片段）是指"對抗"或"針對"該表位、 抗原或蛋白，或為對于該表位、抗原或蛋白的"結(jié)合"分子。在上下文中，Ang2結(jié)合分子也可 稱為"Ang2中和分子"。
[0091] 一般而言，術(shù)語"特異性"是指特定抗原結(jié)合分子或抗原結(jié)合蛋白（例如本發(fā)明的 免疫球蛋白單一可變域）分子可結(jié)合的不同類型抗原或表位的數(shù)目。抗原結(jié)合分子的特異 性可基于其親和力和/或親抗原性（avidity)來測定。由抗原與抗原結(jié)合蛋白的解離平衡 常數(shù)（KD)所表示的親和力，是表位與抗原結(jié)合蛋白上抗原結(jié)合位點之間結(jié)合強度的量度： KD值越小，表位與抗原結(jié)合分子之間的結(jié)合強度越強（或者，親和力也可表示為親和力常 數(shù)（KA)，其為1/KD)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解（例如基于本文其他公開的內(nèi)容），取決于 具體感興趣的抗原，可以以本身已知方式測定親和力。親抗原性為抗原結(jié)合分子（如免疫 球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變域或含有免疫球蛋白單一可變域的多肽）與相關(guān)抗原 之間結(jié)合強度的量度。親抗原性與以下兩者均有關(guān)：表位與其抗原結(jié)合分子上的抗原結(jié)合 位點之間的親和力，以及存在于抗原結(jié)合分子上的相關(guān)結(jié)合位點的數(shù)目。
[0092] 抗原結(jié)合分子（如本發(fā)明抗體或免疫球蛋白單一可變域）識別表位的部分稱為 "互補位"。
[0093] 除非另有說明，否則術(shù)語"Ang2結(jié)合分子"包括抗Ang2抗體、抗Ang2抗體片段、 "抗Ang2抗體樣分子"、及與上述任一者的綴合物。抗體包括但不限于單克隆抗體及嵌合單 克隆抗體。術(shù)語"抗體"涵蓋通過于宿主細胞中重組表達產(chǎn)生的完全免疫球蛋白（如單克 隆抗體）、以及Ang2結(jié)合抗體片段或"抗體樣分子"，包括單鏈抗體及線型抗體，如例如描述 于TO 02/056910中的所謂的"SMIP"（ "小模塊免疫藥物"）。抗Ang2抗體樣分子包括如本 文定義的免疫球蛋白單一可變域。抗體樣分子的其他實例為免疫球蛋白超家族抗體（IgSF) 或⑶R移植分子。
[0094] "Ang2結(jié)合分子"是指單價靶結(jié)合分子（即與Ang2的一個表位結(jié)合的分子） 以及含有一個以上Ang2結(jié)合免疫球蛋白單一可變域的Ang2結(jié)合分子，亦稱為"形式化 (formatted) "Ang2結(jié)合分子。所述形式化Ang2結(jié)合分子除Ang2結(jié)合免疫球蛋白單一可 變域外也可包含接頭和/或具有效應(yīng)器功能的部分，例如半衰期延長部分（如白蛋白結(jié)合 免疫球蛋白單一可變域）、和/或融合配偶體（如血清白蛋白）和/或附接的聚合物（如 PEG)。
[0095] 即使是次優(yōu)選的，形式化Ang2結(jié)合分子也可包含識別相同或重疊表位的兩個相 同的Ang2結(jié)合免疫球蛋白單一可變域或兩個不同的免疫球蛋白單一可變域。在此情況下， 所述兩個免疫球蛋白單一可變域可與形成Ang2二聚體的兩個單體中每一單體的相同或重 疊表位結(jié)合。包括競爭性ELISA分析的實驗數(shù)據(jù)揭示當與單一 Ang2結(jié)合分子的個體構(gòu)件 比較時，形式化Ang2二聚體的效力顯著改善（數(shù)據(jù)未示出）。
[0096] 通常，本發(fā)明的Ang2結(jié)合分子將以（如于Biacore或KinExA分析中測量的）10E-5 至10E-14摩爾/升（M)或10E-14摩爾/升以下、且優(yōu)選10E-7至10E-14摩爾/升（M)或 10E-14摩爾/升以下、更優(yōu)選10E-8至10E-14摩爾/升、且進一步更優(yōu)選10E-11至10E-13 的解離常數(shù)（K d)結(jié)合，和/或以至少10E7ME-1、優(yōu)選至少10E8ME-1、更優(yōu)選至少10E9ME-1， 如至少10E11ME-1的締合常數(shù)（K a)結(jié)合。任何大于10E-4M的Kd值一般都視為指示非特異性 結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽將以小于500nM、優(yōu)選小于200nM、更優(yōu)選小于10nM，例如小于 500pM的K d結(jié)合所要結(jié)合的抗原（即Ang2)?？乖Y(jié)合蛋白對抗原或表位的特異性結(jié)合可以 以本身已知的任何適合方式來測定，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析（Scatchard analysis)和/或競爭性結(jié)合分析（例如放射免疫分析（RIA)、酶免疫分析（EIA)及夾心式 競爭性分析（sandwich competition assay)及本領(lǐng)域中本身已知的其不同變化形式。
[0097] 氨基酸殘基將根據(jù)如本領(lǐng)域中公知且達成一致的標準三字母或單字母氨基酸碼 加以指示。在比較兩個氨基酸序列時，術(shù)語"氨基酸差異"是指相比于第二序列，在該參考序 列某一位置處指定數(shù)目氨基酸殘基的插入、缺失或取代。在取代的情況下，所述取代將優(yōu)選 為保守氨基酸取代，所述保守氨基酸取代是指氨基酸殘基被化學結(jié)構(gòu)類似的另一氨基酸殘 基置換，且其對多肽的功能、活性或其他生物學性質(zhì)影響較小或基本上無影響。這些保守氨 基酸取代在本領(lǐng)域中是公知的，例如根據(jù)W098/49185,其中保守氨基酸取代優(yōu)選是以下群 組（i)-(v)內(nèi)的一個氨基酸被同一群組內(nèi)的另一氨基酸殘基所取代：（i)較小脂族非極性 或弱極性殘基4]^、561'、1111'、？1'〇及617 ;(;[;0極性帶負電殘基及其（不帶電）酰胺：八8口、 AsruGlu及Gln ; (iii)極性帶正電殘基：His、Arg及Lys ; (iv)較大脂族非極性殘基：Met、 Leu、Ile、Val及Cys ;及（V)芳族殘基：Phe、Tyr及Trp。特別優(yōu)選的保守氨基酸取代如下：
[0098] Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代； Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或 Gln取代；IIe被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met 被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp 被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。
[0099] 例如相比于其天然生物來源和/或獲得該多肽或核酸分子的反應(yīng)介質(zhì)或培養(yǎng)基， 當多肽或核酸分子已與至少一種在該來源或介質(zhì)（培養(yǎng)基）中通常與之相關(guān)的其他組分分 離時，其被視為"（呈）基本上分離（的形式）"（所述其他組分例如另一蛋白/多肽、另一 核酸、另一生物組分或大分子或至少一種污染物、雜質(zhì)或微量組分）。特別地，多肽或核酸分 子在其已純化至少2倍、特別是至少10倍、更特別是至少100倍且多達1000倍或1000倍 以上時被視為"基本上分離的"。經(jīng)適合的技術(shù)（例如適合的色譜技術(shù)，例如聚丙烯酰胺凝 膠電泳）確定，"呈基本上被分離的形式"的多肽或核酸分子優(yōu)選基本上為同質(zhì)的。
[0100] 術(shù)語"N端"（又稱氨基端、NH2端、N-末端或胺端）是指由具有游離氨基（-NH 2)的 氨基酸終止的蛋白/多肽（即Ang2結(jié)合分子）的起點。肽序列的書寫慣例是將N端放在 左邊并從N端至C端進行書寫。當所述蛋白翻譯自信使RNA時，其從N端至C端創(chuàng)建。 [0101] 兩個Ang2結(jié)合分子序列之間的"序列同一性"指示序列之間相同氨基酸的百分 t匕。其可如WO 2008/020079第49及50頁段落f)中所述加以計算或測定。"序列相似度" 指示相同或表示保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。
[0102] 對Vh域的氨基酸殘基進行編號并且也可以類似方式應(yīng)用于VHH域的替代方法在 本領(lǐng)域中是已知的。然而，除非另有說明，否則在本說明書、權(quán)利要求書及附圖中，將遵循如 上所述根據(jù)Kabat且應(yīng)用于VHH域的編號法。
[0103] "親和力成熟"的Ang2結(jié)合分子，特別是VHH或域抗體，在一個或多個⑶R中具有 一個或多個變化，所述變化導致對Ang2的親和力相比于其各自的親本Ang2結(jié)合分子有所 增加。本發(fā)明親和力成熟的Ang2結(jié)合分子可通過例如由以下所述的本領(lǐng)域中已知的方法 來制備：Marks 等人，1992，Biotechnology 10:779-783 或 Barbas 等人，1994，Proc. Nat. Acad. Sci，USA 91:3809-3813. ;Shier 等人，1995, Gene 169:147-155;Yelton 等人，1995， Immunol. 155:1994-2004 ;Jackson 等人，1995，J. Immunol. 154 (7) : 3310-9 ;及 Hawkins 等 人，1992, J.Mol.Biol. 226(3):889896 ;KS Johnson 及 RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display"，Oxford University Press 1996。
[0104] 對于本發(fā)明，除非另有說明，則"SEQ ID NO:x的氨基酸序列"包括：與各自SEQ ID N0:x中所顯示的序列100%相同的氨基酸序列；
[0105] a)與各自SEQ ID NO:X中所示序列具有至少80%氨基酸同一性的氨基酸序列；
[0106] b)與各自SEQ ID NO:X中所示序列具有3個、2個或1個氨基酸差異的氨基酸序 列。
[0107] 術(shù)語"癌癥"及"癌性"是指或描述哺乳動物中通常以不受調(diào)控的細胞生長/增殖 為特征的生理狀況。可用本發(fā)明的Ang2結(jié)合分子治療的癌癥的實例包括但不限于癌瘤、淋 巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。這些癌癥的更具體的實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非 小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、子 宮頸癌、卵巢癌、肝癌（liver cancer)、膀胱癌、肝癌（hepatoma)、乳癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸 癌、腎細胞癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎臟癌、肝癌（liver cancer)、前列腺癌、夕卜 陰癌、甲狀腺癌、肝癌（hepatic carcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各種類型的頭頸癌。血管生成 的調(diào)控異?？蓪е略S多可由本發(fā)明組合物及方法治療的病癥。這些病癥包括非腫瘤性癥狀 及腫瘤性癥狀兩者。腫瘤性病癥包括但不限于上述病癥。
[0108] 非腫瘤性病癥包括但不限于不希望的或異常的肥大、關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié) 炎（RA)、牛皮癬、牛皮癬斑塊、類肉瘤?。╯arcoidosis)、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化 斑塊、糖尿病性及其他增生性視網(wǎng)膜?。òㄔ绠a(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織增生 (retrolental fibroplasia)、新生血管性青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性黃斑水 腫、角膜新血管生成（corneal neovascularization)、角膜移植新血管生成、角膜移植 排斥、視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管生成、隅角新血管生成（虹膜紅變（rubeosis))、眼新血管 ?。╫cular neovascular disease))、血管再狹窄（vascular restenosis)、動靜脈畸 形（arteriovenous malformations，AVM)、脊膜瘤（meningioma)、血管瘤、血管纖維瘤 (angiofibroma)、甲狀腺增生（包括格雷夫氏?。℅rave's disease))、角膜及其他組織移 植、慢性炎癥、肺炎癥、急性肺損傷/ARDS、敗血癥、原發(fā)性肺動脈高壓（primary pulmonary hypertension)、惡性肺積液（malignant pulmonary effusion)、腦水腫（例如與急性中 風/閉鎖性頭部損傷（closed head injury)/外傷相關(guān)）、滑液炎癥、RA中的血管翳形成 (pannus formation)、骨化性肌炎（myositis ossificans)、肥大性骨形成（hypertropic bone formation)、骨關(guān)節(jié)炎（OA)、難治愈的腹水癥、多囊性卵巢疾?。╬olycystic ovarian disease)、子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis)、第 3 間隔體液疾?。?rd spacing of fluid disease)(胰腺炎、間隔綜合征（compartment syndrome)、灼傷、腸?。⒆訉m纖維瘤、早產(chǎn)、 例如IBD(克羅恩氏病（Crohn's disease)及潰瘍性結(jié)腸炎）的慢性炎癥、腎同種異體移 植排斥、發(fā)炎性腸病、腎病綜合征、不希望的或異常的組織大量生長（非癌）、血友病性關(guān) 節(jié)（hemophilic joint)、肥厚性瘢痕（hypertrophic scar)、頭發(fā)生長抑制、奧斯勒-韋 伯綜合征（Osier-Weber syndrome)、化膿性肉芽腫晶狀體后纖維組織增生（pyogenic granuloma retrolental fibroplasias)、硬皮?。╯cleroderma)、沙眼、血管黏附（vascular adhesion)、滑膜炎（synovitis)、皮炎、子癇前癥（preeclampsia)、腹水癥、心包積液 (pericardial effusion)(例如與心包炎（pericarditis)相關(guān)的心包積液）、及胸膜積液 (pleural effusion)〇
[0109] 術(shù)語〃眼病"是指增生性視網(wǎng)膜病變，包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、晶體后纖維增生癥、 新生血管性青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新生血管形成、角膜移 植新生血管形成、角膜移植排斥反應(yīng)、視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新生血管形成。
[0110] 術(shù)語"慢性腎病"是指糖尿病腎病、腎后性腎衰竭、腎前性氮質(zhì)血癥和內(nèi)在腎功能 衰竭。
[0111] 發(fā)明詳述
[0112] 在第一方面中，本發(fā)明涉及包含免疫球蛋白單一可變域的Ang2結(jié)合分子，其中所 述免疫球蛋白單一可變域包含三個互補決定區(qū)⑶R1XDR2和⑶R3,其中⑶Rl具有選自SEQ ID NO: 168至170中所示氨基酸序列的氨基酸序列，CDR2具有選自SEQ ID No: 171至173 中所示氨基酸序列的氨基酸序列且CDR3具有選自SEQ ID NO: 174至177中所示氨基酸序 列的氨基酸。
[0113] ⑶Rl具有選自以下的序列：
[0114] SEQ ID N0:168DYAIG
[0115] SEQ ID N0:169DYALG
[0116] SEQ ID N0:170YYAIG
[0117] ⑶R2具有選自以下的序列：
[0118] SEQ ID N0:171AIRSSGGSTYYADSVKG
[0119] SEQ ID N0:172CIRCSGGSTYYADSVKG
[0120] SEQ ID N0:173CISSSGGITYYADSVKG
[0121] ⑶R3具有選自以下的序列：
[0122] SEQ ID N0:174VPAGRLRFGEQWYPLYEYDA
[0123] SEQ ID N0:175VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA
[0124] SEQ ID N0:176SIVPRSKLEPYEYDA
[0125] SEQ ID N0:177DSGGYIDYDCSGLGYDY
[0126] 根據(jù)優(yōu)選實施方案，所述Ang2結(jié)合分子包含免疫球蛋白單一可變域，其中
[0127] (a)CDRl具有SEQ ID NO: 168中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 171中 所示的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO: 174中所示的氨基酸序列，或者其中
[0128] (b)CDRl具有SEQ ID NO: 168中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 171中 所示的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO: 175中所示的氨基酸序列，或者其中
[0129] (c)CDRl具有SEQ ID NO: 169中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 172中 所示的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO: 176中所示的氨基酸序列，或者其中
[0130] (d)CDRl具有SEQ ID NO: 170中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 173中 所示的氨基酸序列且⑶R3具有SEQ ID NO: 177中所示的氨基酸序列。
[0131] 根據(jù)另一優(yōu)選實施方案，所述Ang2結(jié)合分子包含免疫球蛋白單一可變域，其中所 述免疫球蛋白單一可變域為VHH或域抗體。
[0132] 根據(jù)又更優(yōu)選的實施方案，所述Ang2結(jié)合分子包含免疫球蛋白單一可變域，其中 所述免疫球蛋白單一可變域為VHH。
[0133] 根據(jù)具體實施方案，所述VHH由具有選自由SEQ ID No: 167、166、129和138組成 的組的序列的免疫球蛋白單一可變域組成。
[0134] 在另一方面中，本發(fā)明涉及由所述免疫球蛋白單一可變域組成的Ang2結(jié)合分子。
[0135] 根據(jù)本發(fā)明的Ang2結(jié)合物序列可在其N端被修飾（即缺失或置換第一氨基酸） 而不顯著降低其結(jié)合活性。此修飾增強在細菌宿主（例如但不限于大腸桿菌）中胞內(nèi)/胞 質(zhì)表達期間的N端甲硫氨酸的翻譯間/后切割。
[0136] 在一個方面中，由免疫球蛋白單一可變域組成的所述VHH在N端具有修飾或置換， 其中所述修飾是缺失第一氨基酸且所述置換是由另一氨基酸替代所述第一氨基酸。
[0137] 在一個優(yōu)選實施方案中，N端的所述第一氨基酸是纈氨酸（V)或天冬氨酸（D)，被 例如丙氨酸（A)所替代。
[0138] 在治療應(yīng)用方面具有改良性質(zhì)（例如增強的親和力或降低的免疫原性）的Ang2 結(jié)合組分，可通過如下技術(shù)而從本發(fā)明的各別Ang2結(jié)合組分獲得：親和力成熟（例如從合 成、隨機或天然存在的免疫球蛋白序列起始）、CDR移植、人源化、合并源自不同免疫球蛋白 序列的片段、使用重疊引物的PCR組裝，及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的用于工程改造免疫球蛋 白序列的類似技術(shù)；或任何上述技術(shù)的任何適合組合。例如參考標準手冊以及其他描述及 實施例。
[0139] 優(yōu)選地，具有增強的親和力的本發(fā)明的Ang2結(jié)合組分是通過另一 Ang2結(jié)合組分 的親和力成熟來獲得的，就親和力成熟分子而言所述另一 Ang2結(jié)合組分代表"親本"Ang2 結(jié)合組分。
[0140] 因此，在另一項優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的Ang2結(jié)合分子是通過使上述親本免疫 球蛋白單一可變域的親和力成熟獲得的免疫球蛋白單一可變域。
[0141] 在另一項優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及通過使VHH的親和力成熟獲得的免疫球蛋 白單一可變域。
[0142] 在一項優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及免疫球蛋白單一可變域，其用于人源化具有 SEQ ID NO: 1、17和80中所示氨基酸序列的VHH。
[0143] 在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及通過使具有SEQ ID NO: 127、132和146中所 示氨基酸序列的VHH人源化而獲得的免疫球蛋白單一可變域。
[0144] 本發(fā)明也涉及Ang2結(jié)合分子，其通過上述定義的VHH的親和力成熟和/或序列優(yōu) 化而獲得，例如涉及通過使具有SEQ ID NO: 167、166、129和138所示氨基酸序列的VHH序 列優(yōu)化獲得的VHH。
[0145] 在另一項更優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及通過使具有SEQ ID NO: 167所示氨基酸 序列的VHH親和力成熟而獲得的免疫球蛋白單一可變域。
[0146] 在進一步更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及通過使具有SEQ ID NO: 166所示氨基 酸序列的VHH親和力成熟而獲得的免疫球蛋白單一可變域。
[0147] 在另一項優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及通過使具有SEQ ID NO: 129所示氨基酸序 列的VHH親和力成熟而獲得的免疫球蛋白單一可變域。
[0148] 在又一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及通過使具有SEQ ID NO: 138中所示氨基酸序 列的VHH親和力成熟而獲得的免疫球蛋白單一可變域。
[0149] 在另一實施方案中，本發(fā)明或存在于本發(fā)明多肽中的代表性種類的Ang2結(jié)合免 疫球蛋白單一可變域具有對應(yīng)于已經(jīng)"駱駝化"的天然存在VH域的氨基酸序列的氨基酸 序列，即通過以一個或多個存在于重鏈抗體VHH域中相應(yīng)位置處的氨基酸殘基替代常規(guī) 4鏈抗體的天然存在的可變重鏈氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基。這可以本領(lǐng)域 技術(shù)人員所了解的本身已知的方式進行，且可另外參考WO 1994/04678。這種駱駝化可優(yōu) 先發(fā)生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置處及所謂的駱駝科印記殘基處（也參見例如WO 1994/04678)。這些"人源化"及"駱駝化"技術(shù)及與此相符的優(yōu)選框架區(qū)序列的詳述也可 參見WO 2006/040153的第46頁和第98頁及WO 2006/122786的第107頁。
[0150] 本發(fā)明的Ang2結(jié)合組分（例如免疫球蛋白單一可變域和/或含有其的多肽）對 Ang2具有特異性，因為其包含與Ang2分子內(nèi)的一個或多個表位特異性結(jié)合的一個或多個 免疫球蛋白單一可變域。
[0151] Ang2結(jié)合組分對其抗原Ang2的特異性結(jié)合可以以本身已知的任何適合的方 式，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或競爭性結(jié)合分析（例如放射免疫分析 (RIA)、酶免疫分析（EIA和ELISA)及夾心式競爭分析）及本領(lǐng)域中本身已知的其不同變化 形式來測定。
[0152] 關(guān)于抗原Ang2,本發(fā)明的Ang2結(jié)合組分（例如免疫球蛋白單一可變域）在物種方 面不受限制。因此，若欲用于人的治療目的，則本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域或含有其的 多肽優(yōu)選結(jié)合至人Ang2。然而，結(jié)合至另一哺乳動物物種的Ang2的免疫球蛋白單一可變域 或含有其的多肽也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。與一個物種的Ang2形式結(jié)合的本發(fā)明的免疫球蛋 白單一可變域，可與一個或多個其他物種的Ang2發(fā)生交叉反應(yīng)。例如，結(jié)合人Ang2的本發(fā) 明的免疫球蛋白單一可變域可表現(xiàn)出與一個或多個其他靈長類物種的Ang2和/或與用于 疾病動物模型（且特別是用于與Ang2介導的對血管生成的作用相關(guān)的疾病及病癥的動物 模型）（例如本文提及的物種及動物模型）中的一個或多個動物物種（例如猴（特別是食 蟹猴或恒河猴）、小鼠、大鼠、兔、豬、犬）的Ang2的交叉反應(yīng)性。表現(xiàn)所述交叉反應(yīng)性的本 發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域，在研究和/或藥物開發(fā)中是有利的，因為其允許在公認的 疾病模型（例如猴（特別是食蟹猴或恒河猴）、或小鼠及大鼠）中對本發(fā)明的免疫球蛋白單 一可變域進行測試。
[0153] 而且,本發(fā)明的Ang2結(jié)合組分不限于其所針對的Ang2的特定域或Ang2的抗原決 定簇或不由其所針對的Ang2的特定域或Ang2的抗原決定簇限定。優(yōu)選地，對于與除人以外 的物種（欲在治療性Ang2拮抗劑的開發(fā)期間將該物種用作動物模型）的一種或多種Ang2 分子的交叉反應(yīng)性，Ang2結(jié)合組分識別與人Ang2具有高同一'丨生的感興趣的Ang2區(qū)域中的 表位。舉例而言，對于使用小鼠模型，本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域識別完全或部分位于 FLD-域內(nèi)的表位，所述 FLD-域發(fā)表在 Kim H-Z，Jung K，Kim HM，Cheng Y 和 Koh GY(2009) 中。一種經(jīng)設(shè)計的促血管生成素2變體，五聚體C0MP-Ang2,強烈活化Tie2受體并刺激血管 生成。Biochim Biophys Acta 1793,772-780。
[0154] 因此，根據(jù)一項優(yōu)選實施方案，本發(fā)明涉及Ang2結(jié)合組分，具體涉及免疫球蛋白 單一可變域或含有其的多肽，其中所述免疫球蛋白單一可變域選自與完全或部分地包含于 FLD域（SEQ ID NO: 188-190)內(nèi)的表位結(jié)合的免疫球蛋白單一可變域。
[0155] 優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域以小于500nM、優(yōu)選小于200nM、更優(yōu)選 小于IOnM,例如小于500pM(如通過表面等離子共振分析所測定）的親和力結(jié)合Ang2。
[0156] 優(yōu)選地，如競爭ELISA分析中所測得，本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域具有的IC5tl 值在KT6至KTltl摩爾/升或KTltl摩爾/升以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在KT 8至KTltl摩爾/升 或KTltl摩爾/升以下的范圍內(nèi)、且進一步更優(yōu)選在1〇_ 9至KTltl摩爾/升或KTltl摩爾/升 以下的范圍內(nèi)。
[0157] 根據(jù)本發(fā)明的一個非限制性但優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的Ang2結(jié)合免疫球蛋白 單一可變域或含有其的多肽以1〇_ 5至1〇_12摩爾/升（M)或KT12摩爾/升以下、且優(yōu)選KT7 至KT12摩爾/升（M)或KT12摩爾/升以下、且更優(yōu)選KT8至KT 12摩爾/升（M)或KT12摩 爾/升以下的解離常數(shù)（Kd)，和/或以至少IO 7M'優(yōu)選至少IO8M'更優(yōu)選至少IO9M'例如 至少IO12M- 1的締合常數(shù)（Ka);且特別是以小于500nM、優(yōu)選小于200nM、更優(yōu)選小于10nM，例 如小于500pM的K d結(jié)合Ang2。可測定本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域針對Ang2的Kd及 Ka值。
[0158] 根據(jù)另一實施方案，所述免疫球蛋白單一可變域為如本文所定義的域抗體。
[0159] 存在于本發(fā)明的單特異性結(jié)合分子中的免疫球蛋白單一可變域具有對應(yīng)于已經(jīng) "駱駝化"的天然存在VH域的氨基酸序列的序列，即通過以一個或多個存在于重鏈抗體VHH 域中相應(yīng)位置處的氨基酸殘基置換常規(guī)4鏈抗體的天然存在可變重鏈的氨基酸序列中的 一個或多個氨基酸殘基。這可以本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的本身已知的方式進行，且可另外 參考WO 94/04678。這種駱駝化可優(yōu)先發(fā)生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置處及所謂駱 駝科印記殘基處（也參見例如W094/04678)。這些"人源化"及"駱駝化"技術(shù)及與此相符的 優(yōu)選框架區(qū)序列的詳述也可參見WO 2006/040153的第46頁和第98頁及WO 2006/122786 的第107頁。
[0160] 所述結(jié)合組分對Ang2具有特異性，因為在一項優(yōu)選實施方案中其包含與Ang2分 子內(nèi)的一個或多個表位特異性結(jié)合的一個免疫球蛋白單一可變域。
[0161] 結(jié)合組分對其抗原Ang2的特異性結(jié)合可以以本身已知的任何適合的方式，包括 例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或競爭性結(jié)合分析（例如放射免疫分析（RIA)、酶 免疫分析（EIA和ELISA)及夾心式競爭分析）及本領(lǐng)域中本身已知的其不同變化形式來測 定。
[0162] 關(guān)于抗原Ang2,免疫球蛋白單一可變域在物種方面不受限制。因此，若欲用于人 中的治療目的，則免疫球蛋白單一可變域優(yōu)選結(jié)合人Ang2。然而，結(jié)合另一哺乳動物物種 的Ang2的免疫球蛋白單一可變域或含有其的多肽也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。與一個物種形式 的Ang2結(jié)合的免疫球蛋白單一可變域，可與一個或多個其他物種的各別抗原發(fā)生交叉反 應(yīng)。例如，結(jié)合人抗原的免疫球蛋白單一可變域可表現(xiàn)出與一個或多個其他靈長類物種的 各別抗原和/或與用于疾病動物模型（例如猴（特別是食蟹猴或恒河猴）、小鼠、大鼠、兔、 豬、犬）（且特別是用于可通過抑制Ang2而調(diào)節(jié)的疾病及病癥的動物模型）中的一個或多 個動物物種（例如本文提及的物種及動物模型）的抗原的交叉反應(yīng)性。表現(xiàn)這種交叉反應(yīng) 性的本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域，在研究和/或藥物研發(fā)中是有利的，因為其允許在 公認的疾病模型（例如猴（特別是食蟹猴或恒河猴）、或小鼠及大鼠）中對本發(fā)明的免疫球 蛋白單一可變域進行測試。
[0163] 而且，所述結(jié)合組分不限于其所針對的抗原的特定域或抗原決定簇或不由其所針 對的抗原的特定域或抗原決定簇限定。優(yōu)選地，對于與除人以外的物種（其欲在治療性 Ang2拮抗劑的研發(fā)期間將其用作動物模型）的一種或多種抗原分子的交叉反應(yīng)性，結(jié)合組 分識別與人抗原具有高度同一性的各別抗原的區(qū)域中的表位。舉例而言，對于使用小鼠模 型，本發(fā)明的單特異性結(jié)合分子中含有的抗Ang2免疫球蛋白單一可變域識別完全或部分 位于Ang2的EGF-2域內(nèi)的表位，該EGF-2域在人與小鼠之間顯示高同一性。
[0164] 因此，根據(jù)一項優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的單特異性結(jié)合分子包含Ang2結(jié)合分子， 其為選自與完全或部分地包含于FLD域內(nèi)的表位結(jié)合的由SEQ ID NO: 167、166、129和139 所構(gòu)成的組的免疫球蛋白單一可變域。
[0165] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的所述Ang2結(jié)合分子的核酸。
[0166] 在一項優(yōu)選實施方案中，當本發(fā)明的Ang2結(jié)合分子表達于大腸桿菌中時，其由選 自以下的核苷酸序列編碼：
【權(quán)利要求】
1. 一種Ang2結(jié)合分子，其包含免疫球蛋白單一可變域，其中所述免疫球蛋白單一可變 域包含三個互補決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3,其中CDRl具有選自SEQ ID NO: 168至170中 所示氨基酸序列的氨基酸序列，⑶R2具有選自SEQ ID N〇:171至173中所示氨基酸序列的 氨基酸序列且⑶R3具有選自SEQ ID NO: 174至177中所示氨基酸序列的氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的所述Ang2結(jié)合分子，其中 (a) CDRl具有SEQ ID NO: 168中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 171中所示 的氨基酸序列且⑶R3具有SEQ ID NO: 174中所示的氨基酸序列，或者其中 (b) CDRl具有SEQ ID NO: 168中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 171中所示 的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO: 175中所示的氨基酸序列，或者其中 (c) CDRl具有SEQ ID NO: 169中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 172中所示 的氨基酸序列且CDR3具有SEQ ID NO: 176中所示的氨基酸序列，或者其中 (d) CDRl具有SEQ ID NO: 170中所示的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID NO: 173中所示 的氨基酸序列且⑶R3具有SEQ ID NO: 177中所示的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的所述Ang2結(jié)合分子，其中所述免疫球蛋白單一可變域為VHH 或域抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的所述Ang2結(jié)合分子，其中所述免疫球蛋白單一可變 域為VHH。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的所述Ang2結(jié)合分子，其中所述VHH由具有選自由 SEQ ID No:167、166、129和138組成的組的序列的免疫球蛋白單一可變域組成。
6. 由如權(quán)利要求1至5中任一項中指出的所述免疫球蛋白單一可變域組成的Ang2結(jié) 合分子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的所述Ang2結(jié)合分子，其中由免疫球蛋白單一可變域 組成的所述VHH在N端具有修飾或置換，其中所述修飾是缺失第一氨基酸且所述置換是由 另一氨基酸替代所述第一氨基酸。
8. 編碼根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項的所述Ang2結(jié)合分子的核酸分子。
9. 包含根據(jù)權(quán)利要求8的所述核酸分子的表達載體。
10. 攜帶根據(jù)權(quán)利要求9的一種或多種表達載體的宿主細胞。
11. 產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的所述Ang2結(jié)合分子的方法，所述方法包括以 下步驟： (a) 用根據(jù)權(quán)利要求9的一種或多種所述載體轉(zhuǎn)染宿主細胞， (b) 培養(yǎng)所述宿主細胞，以及 (c) 回收并純化所述Ang2結(jié)合分子。
12. -種藥物組合物，其包含作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項的一種或多 種所述Ang2結(jié)合分子，和至少一種生理學上可接受的載體。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的所述藥物組合物，還包含一種或多種其它治療劑，例如化療劑 如癌細胞中的DNA損傷劑和/或抗有絲分裂藥物（例如紫杉醇）、或者抑制血管生成的治療 活性化合物（抗血管生成藥物如抗VEGF/VEGF受體抑制劑，例如安維汀、Nitedanib或舒尼 替尼）、或者信號轉(zhuǎn)導途徑抑制劑如mTOR抑制劑（例如替西羅莫司）、或者激素治療劑（例 如他莫昔芬）。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12至13中任一項的所述藥物組合物，其用于治療與Ang2介導的對 血管生成的作用相關(guān)的疾病。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的所述藥物組合物，其用于治療癌癥和癌性疾病，如乳腺癌、腎細 胞癌、卵巢癌和胰腺癌。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其用于治療眼病，如年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿 病性視網(wǎng)膜病變。
17. 根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其用于治療慢性腎病，例如糖尿病性腎病、腎后性 腎衰竭、腎前性氮質(zhì)血癥和內(nèi)在腎衰竭。
18. 治療有此需要的患者的如權(quán)利要求14至17任一項中所述的疾病的方法，其包括向 所述患者給予根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項的一種或多種所述Ang2結(jié)合分子，或者根據(jù)權(quán) 利要求12至1中7任一項的藥物組合物。
【文檔編號】A61K39/395GK104321344SQ201380026471
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月30日
【發(fā)明者】E·博格斯, A·格施溫德, R·G·奧特, M-A·拜斯, J·波科諾, P·默切爾斯, E·德普拉, F·史蒂夫內(nèi)特 申請人:勃林格殷格翰國際有限公司