制備單供體凝血酶血清的方法和裝置制造方法
【專(zhuān)利摘要】一種制備凝血酶血清的方法，包括：獲得血液樣品；使第一份血液與促凝劑接觸，以形成結(jié)合到促凝劑表面上的凝血酶原酶復(fù)合物，從而獲得可儲(chǔ)存的活化促凝劑。然后，該活化促凝劑可與含有凝血酶原的第二份血液接觸，以獲得凝血酶血清，可以提取該凝血酶血清，并使其與血纖蛋白原接觸，以獲得血纖蛋白。
【專(zhuān)利說(shuō)明】制備單供體凝血酶血清的方法和裝置
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本專(zhuān)利申請(qǐng)是于2012年9月25日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)61/705, 535的非臨 時(shí)申請(qǐng)，并要求該專(zhuān)利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，該專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容并入本文而形成一體的文件。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及血液中的凝血酶原向凝血酶的轉(zhuǎn)化，尤其涉及一種用于提高血液中的 活化級(jí)聯(lián)凝血蛋白的濃度的裝置和方法。

【背景技術(shù)】
[0004] 血漿凝結(jié)被認(rèn)為是通過(guò)一系列的自我擴(kuò)增型酶原-酶轉(zhuǎn)化（圖1)發(fā)生的，在這種 轉(zhuǎn)化過(guò)程的倒數(shù)第二步中產(chǎn)生凝血酶（FIIa)，凝血酶是一種強(qiáng)大的絲氨酸蛋白酶。在被稱(chēng) 為"凝血級(jí)聯(lián)"的最后步驟中，凝血酶原被稱(chēng)為凝血酶原酶復(fù)合物的含鈣多蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)化 為凝血酶。凝血酶是一種酶，它把纖維蛋白原水解為血纖維蛋白單體，這些血纖維蛋白單體 聚合為細(xì)網(wǎng)狀，而這種細(xì)網(wǎng)又使血漿形成凝膠或凝塊。凝血酶是胰蛋白酶族的絲氨酸蛋白 酶，其分子量約為34kDa。它由兩個(gè)多肽鏈構(gòu)成。
[0005] 凝血級(jí)聯(lián)過(guò)程通常分為兩個(gè)分支，以便論述和進(jìn)行凝血障礙試驗(yàn)。內(nèi)源性分支和 外源性分支可分別強(qiáng)化，但可合并為一條引生凝血酶的公共途徑。外源性途徑負(fù)責(zé)止血 控制，并對(duì)血管受傷做出響應(yīng)。當(dāng)血液與促凝物質(zhì)接觸時(shí)，內(nèi)源性途徑開(kāi)始發(fā)揮作用，導(dǎo) 致XII因子活化。在《J Biomed Mater Res.(生物醫(yī)學(xué)材料研究學(xué)報(bào)）》1995年8月刊的 29 (8) : 1005-16部分和29 (8) : 1017-28部分中，對(duì)促凝物質(zhì)對(duì)凝血的接觸活化作用進(jìn)行了 深入研究，這些文獻(xiàn)的完整內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此。
[0006] 促凝物質(zhì)指使血液形成凝血酶調(diào)節(jié)蛋白凝塊的任何元素或活性物質(zhì)。促凝劑包括 各種帶負(fù)電荷的表面，包括高嶺土、棉花、陶瓷、玻璃、鞣花酸等有機(jī)和無(wú)機(jī)材料。促凝劑已 知可單獨(dú)使用或聯(lián)合使用。
[0007] 與這些帶負(fù)電荷的表面結(jié)合會(huì)引起XII因子（FXII)發(fā)生構(gòu)造變化，從而能夠以蛋 白水解的方式活化前激肽釋放酶（PK)。PK以蛋白水解的方式活化FXII，從而形成一個(gè)正反 饋回路，該正反饋回路使系統(tǒng)增強(qiáng)，并在激肽釋放酶的作用下導(dǎo)致FXI活化和高分子量激 肽原（HK)解理。
[0008] 促凝物質(zhì)的XIIa因子活化作用的后續(xù)產(chǎn)物是形成凝血酶原酶復(fù)合物，該復(fù)合物 由絲氨酸蛋白酶、Xa因子、蛋白輔助因子、以及Va因子構(gòu)成。在鈣離子存在的條件下，該復(fù) 合物聚合在帶負(fù)電荷的磷脂膜上。向檸檬酸鹽抗凝血液添加鈣鹽以使凝血級(jí)聯(lián)過(guò)程繼續(xù)進(jìn) 行常常被稱(chēng)為復(fù)鈣。凝血酶原酶復(fù)合物催化從凝血酶原（II因子，一種不活躍的酶原）向 凝血酶（IIa因子，一種活躍絲氨酸蛋白酶）轉(zhuǎn)化的過(guò)程。雖然實(shí)驗(yàn)表明Xa因子在不與凝 血酶原酶復(fù)合物結(jié)合時(shí)可活化凝血酶原，但是在這種情況下凝血酶形成速率會(huì)顯著降低。
[0009] 在正常血液中循環(huán)的重要凝血因子的濃度比種類(lèi)繁多的其它血液蛋白（其中大 約有490種，其濃度差異超過(guò)60倍）的濃度低得多。在許多未解決的問(wèn)題中，一個(gè)問(wèn)題是， 白蛋白、纖維蛋白原或IgG等高濃度血液蛋白由于什么機(jī)制未能與活化復(fù)合蛋白在由血液 濃度低得多的蛋白質(zhì)所構(gòu)成的促凝表面上的聚合（稱(chēng)為"吸附_稀釋"效應(yīng)）競(jìng)爭(zhēng)。在2007 年10月刊的《Biomaterials (生物材料學(xué)報(bào)）》的28 (30) : 4355-4369頁(yè)上，周氏等人揭示 了 ：在始終存在活化表面的條件下，F(xiàn)XIIa在全血漿中的積聚速率會(huì)隨時(shí)間而降低，從而導(dǎo) 致FXIIa的產(chǎn)生量趨于穩(wěn)態(tài)，該產(chǎn)生量取決于懸浮在血漿中的促凝微粒的初始FXII溶液濃 度。該文獻(xiàn)的完整揭示內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此。作者解釋說(shuō)，這個(gè)結(jié)果有力地表明活化作 用與自動(dòng)抑制作用競(jìng)爭(zhēng)，在自動(dòng)抑制作用中，F(xiàn)XIIa本身抑制FXII - FXIIa。在2009年4 月刊的《Biomaterials (生物材料學(xué)報(bào)）》的第30(10) :1857-1869頁(yè)上，埃爾溫A.福格爾 和克里斯多佛A.謝德萊茨基全面考查了接觸活化凝血化學(xué)過(guò)程（包括自動(dòng)活化、自動(dòng)水解 和自動(dòng)抑制反應(yīng)）中存在的其它不確定性。參見(jiàn)圖1。
[0010] 凝血酶原酶復(fù)合物的聚合從Xa因子和Va因子結(jié)合到血漿膜上的帶負(fù)電荷的磷脂 上時(shí)開(kāi)始。在結(jié)合到血漿膜上后，Xa因子和Va因子迅速地按1 :1化學(xué)計(jì)量比聯(lián)合，從而形 成凝血酶原酶復(fù)合物。凝血酶原酶復(fù)合物的聚合取決于鈣。完全聚合后的凝血酶原酶復(fù)合 物會(huì)催化凝血酶原向絲氨酸蛋白酶凝血酶的轉(zhuǎn)化。當(dāng)與凝血酶原酶復(fù)合物聯(lián)合時(shí)，Xa因子 的催化效率會(huì)提高300000倍。
[0011] 凝血系統(tǒng)受化學(xué)計(jì)量系統(tǒng)和動(dòng)態(tài)抑制系統(tǒng)的異常嚴(yán)格的調(diào)控。血漿促凝劑、化學(xué) 計(jì)量抑制劑、以及動(dòng)態(tài)抑制過(guò)程的構(gòu)成成分的濃度在很大程度上控制產(chǎn)生的凝血酶的最終 量。例如凝血酶原酶復(fù)合物的Va因子在被活化蛋白C解理后失去活性，這降低了 V因子結(jié) 合到Xa因子上的能力。凝血酶原酶復(fù)合物的Xa因子被抗硫胺素III抑制，抗硫胺素III 還有抑制凝血酶的作用。由于血漿蛋白抗硫胺素III的抑制性質(zhì)，凝血酶在血漿中僅短暫 地保持穩(wěn)定，其半存留期約為10-15秒（《Advanced Engineering Materials (先進(jìn)工程材 料期刊）》第11卷第12期，B251-B260頁(yè)，2009年12月，其完整內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此）。
[0012] 凝血系統(tǒng)的自動(dòng)活化、自動(dòng)水解和自動(dòng)抑制反應(yīng)的精確化學(xué)過(guò)程仍未知。為了解 決改進(jìn)接觸活化反應(yīng)方案的問(wèn)題，可能需要解決蛋白質(zhì)吸收和蛋白質(zhì)吸附競(jìng)爭(zhēng)的煩惱問(wèn) 題，并大大增加對(duì)酶原表面活化中涉及的生物化學(xué)作用的了解。
[0013] 例如，在J. R. Soc. Interface (2009) 10, 1-10頁(yè)上，詹姆妮等人考查了凝血酶在凝 血級(jí)聯(lián)中的作用以及其在血纖蛋白膠體生物工程應(yīng)用中的用途，該文獻(xiàn)的完整內(nèi)容通過(guò)引 用結(jié)合于此。凝血酶在臨床上用于在燒傷和某些創(chuàng)傷狀況的外科手術(shù)中進(jìn)行止血。牛凝血 酶也是某些商售組織膠產(chǎn)品中的成分。
[0014] 常規(guī)的商售凝血酶治療劑是從人和動(dòng)物的混合血液制品提純而成的，因此存在著 染有病毒的危險(xiǎn)，例如HIV和肝炎病毒。在比較這些商售凝血酶制劑時(shí)，鈴木和桜川發(fā)現(xiàn)， 這種制劑含有污染性蛋白，人源制劑含有免疫球蛋白G、乙型肝炎表面抗原抗體和人類(lèi)免疫 缺陷抗體。據(jù)報(bào)道，使用牛凝血酶進(jìn)行異種免疫時(shí)，在病人體內(nèi)產(chǎn)生了對(duì)人凝血酶和人凝血 因子V(凝血因子V是牛凝血酶制劑中的污染物）的自反應(yīng)抗體。另外，近來(lái)對(duì)帶有病原體 的牛類(lèi)制品（例如牛海綿狀腦炎藥劑）可能造成的污染的關(guān)注程度有所提高，而這種病原 體是通過(guò)常規(guī)手段無(wú)法檢測(cè)或滅活的。人血治療藥品也易受到肝炎病毒和人類(lèi)免疫缺陷性 病毒等病毒微粒的污染。牛凝血酶被認(rèn)為不適合于臨床使用還有著文化和宗教原因。
[0015] 重組凝血酶最近獲得了 FDA的批準(zhǔn)，并且正在被商業(yè)宣傳為是基于牛血漿的凝血 酶產(chǎn)品的替代品，因?yàn)榛谂Ｑ獫{的凝血酶可能導(dǎo)致形成牛凝血酶抑制抗體，并且還存在 著與動(dòng)物血液制品相關(guān)的安全考慮。但是，重組凝血酶已被證明在接受這種產(chǎn)品的某些病 人中也具有致免疫性問(wèn)題。
[0016] 但是，業(yè)界長(zhǎng)期以來(lái)所理解的是，對(duì)于需要血纖蛋白粘合劑的手術(shù)病人來(lái)說(shuō)，最安 全的狀況是采用雙組分生物粘合劑制劑，凝血酶組分與纖維蛋白原組分是從同一個(gè)供體獲 得的--這能形成完全自體同源的生物粘合劑或粘合膠，從而避免血源性疾病傳播的任何 危險(xiǎn)。
[0017] 利用源自于正在接受醫(yī)療過(guò)程的同一個(gè)病人的凝血酶和/或纖維蛋白原的理念 可追溯到1974年，并不是一個(gè)新奇的理念。塞德霍爾姆-威廉的PCT專(zhuān)利（W094/00566-10， 1994年1月）中說(shuō)明了一種經(jīng)過(guò)改進(jìn)的血纖蛋白膠，其中，凝血酶組分與源自于同一個(gè)供體 的血漿的纖維蛋白原組分結(jié)合，該凝血酶組分需要經(jīng)過(guò)十三個(gè)步驟來(lái)制備，包括離心處理、 中間析出物的分離、以及血液離子濃度和血漿PH值的調(diào)節(jié)。但是，這么多的制備步驟太耗 費(fèi)時(shí)間，因而在處理時(shí)間應(yīng)短于一小時(shí)的圍術(shù)期室中變得不實(shí)用。
[0018] 三年后，在1997年，赫什等人（美國(guó)專(zhuān)利5, 643, 192)繼承塞德霍爾姆-威廉的理 念，揭示了準(zhǔn)備血纖蛋白膠的另一種方法，其中，血纖蛋白膠的纖維蛋白原和凝血酶組分都 源自于同一個(gè)供體的血漿。赫什的專(zhuān)利說(shuō)明了一種制備凝血酶的方法，其中，首先沉淀并去 除血漿中的大部分纖維蛋白原，以制備上清液，然后，使上清液中的剩余纖維蛋白原塊凝。 該方法不同于塞德霍爾姆-威廉揭示的方法，并且比塞德霍爾姆-威廉的方法更簡(jiǎn)單，但是 未能形成可商用的凝血酶，因?yàn)槟竷H能在4分鐘內(nèi)維持五秒或短于五秒的塊凝速度， 并且僅能在47分鐘內(nèi)維持短于10秒的塊凝速度。
[0019] 這種塊凝速度不能滿(mǎn)足外科醫(yī)生的需求，外科醫(yī)生無(wú)法在赫什等人的血纖蛋白膠 的限制內(nèi)規(guī)劃其整個(gè)外科手術(shù)。
[0020] 外科醫(yī)生主要要求快速塊凝時(shí)間（〈5秒），以實(shí)現(xiàn)止血和組織封合或粘合。慢速塊 凝生物膠（>5秒）常常會(huì)被滲血或流血從創(chuàng)口處沖走，來(lái)不及發(fā)揮作用。利用赫什血纖蛋 白膠的外科醫(yī)生需要安排其外科手術(shù)，使得采用赫什血纖蛋白膠處理的止血和組織封合能 在塊凝速度短于5秒的4分鐘時(shí)間窗口內(nèi)實(shí)現(xiàn)，這對(duì)于需要在手術(shù)時(shí)間可能長(zhǎng)達(dá)六個(gè)小時(shí) 的外科手術(shù)中進(jìn)行快速止血和組織粘合的大多數(shù)外科醫(yī)生來(lái)說(shuō)，赫什的發(fā)明完全不實(shí)用。
[0021] 斯滕伯格在《Br J ExpPathol.(病理學(xué)期刊）》的1947年6月刊28 (3) : 168-177 頁(yè)上揭示了乙醇可用于穩(wěn)定血漿中的凝血酶活性，該文獻(xiàn)的完整內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此。 科埃略等人在美國(guó)專(zhuān)利7, 056, 722中揭示了一種使用乙醇作為凝血酶穩(wěn)定劑從供體的血 液制備穩(wěn)定的人凝血酶的簡(jiǎn)單、實(shí)用、快速的方法。該方法通過(guò)添加8%至18%濃度的乙 醇實(shí)現(xiàn)了在很長(zhǎng)的外科手術(shù)中（例如六個(gè)小時(shí)）穩(wěn)定的快速塊凝（短于5秒）?？瓢Ｂ缘?人還說(shuō)明了使用乙醇從未經(jīng)過(guò)穩(wěn)定化的血液制備凝血酶的裝置對(duì)于很廣泛的使用凝血酶 的外科手術(shù)范圍完全不實(shí)用。這些發(fā)明人不得不確定一個(gè)很窄的乙醇濃度范圍，該乙醇濃 度足夠低，以避免凝血級(jí)聯(lián)的抑制，從而避免妨礙凝血酶的產(chǎn)生，但是該乙醇濃度也要足夠 高，以便穩(wěn)定凝血酶。
[0022] 庫(kù)馬爾等人在 JECT 2005 ;37:390-395 和 JECT 2007 ;39:18-23 中揭示了 向枸櫞 酸鈉血漿添加鈣離子是使凝血酶開(kāi)始產(chǎn)生的最簡(jiǎn)單途徑，該文獻(xiàn)的完整內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合 于此。此時(shí)，過(guò)量的鈣會(huì)使凝血級(jí)聯(lián)開(kāi)始發(fā)生，并開(kāi)始產(chǎn)生凝血酶。庫(kù)馬爾還說(shuō)明了，這個(gè) 過(guò)程的缺點(diǎn)是，在產(chǎn)生的凝血酶中，凝血酶活性的穩(wěn)定時(shí)間很短，由于S蛋白、C蛋白和抗凝 血酶III對(duì)凝學(xué)級(jí)聯(lián)的抑制作用，凝血酶的活性通常在凝血酶產(chǎn)生后20分鐘內(nèi)降低至不起 作用的狀態(tài)。庫(kù)馬爾等人還揭示了繞過(guò)這些限制的一種方法和裝置，其中，當(dāng)使用乙醇對(duì)抑 制酶進(jìn)行部分地鈍化時(shí)，能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的凝血酶產(chǎn)物。為了濃縮和活化凝血酶，在存在帶負(fù) 電荷的表面的條件下，向枸櫞酸鈉抗凝血漿添加氯化鈣和乙醇的混合物。帶負(fù)電荷的表面 開(kāi)始形成凝血酶原-FV-FXa復(fù)合物，而氯化鈣和乙醇的混合物（凝血酶劑）提供鈍化凝血 酶抑制劑和部分地穩(wěn)定凝血酶的化學(xué)組分，從而使凝血酶能夠在產(chǎn)生后有效數(shù)小時(shí)。庫(kù)馬 爾和查普曼在JECT 2007 ;39:18-23中還揭示了一種在30分鐘周期內(nèi)從作為起動(dòng)源生物液 的全血而不是血漿來(lái)產(chǎn)生自體同源的人凝血酶的方法，但是，像許多其它的現(xiàn)有技術(shù)一樣， 該方法仍利用乙醇作為添加劑來(lái)穩(wěn)定凝血酶產(chǎn)物，然而，即使在4°C存儲(chǔ)溫度下，這種凝血 酶的活性也會(huì)隨時(shí)間不斷降低。
[0023] 科埃略等人在美國(guó)專(zhuān)利7, 056, 722中揭示的和庫(kù)馬爾所揭示的凝血酶血清/乙醇 制劑與森普爾等人在J Oral Maxillofacial Surg 66:632-638, 2008(其完整內(nèi)容通過(guò)引 用結(jié)合于此）中揭示的制劑不是生物相容的溶液。這種制劑是有細(xì)胞毒性的，除非其在施 用前被充分地稀釋至小于4%的最終乙醇濃度。
[0024] 在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文件2004/0120942中，麥金尼斯等人也揭示了使用乙醇作為凝 血酶穩(wěn)定劑的方法，該文獻(xiàn)的完整內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此。麥金尼斯等人還揭示了一種使 用"接觸活化劑"的方法，該接觸活化劑指在內(nèi)源性凝血途徑中涉及的藥劑，并且包括但不 局限于玻璃、玻璃珠、硅藻土、陶瓷、高嶺土、以及它們的任何組合。
[0025] 在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文件2009/0044852(其完整內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此）中，卡納因 科等人揭示了 ：使凝血酶組分與穩(wěn)定劑接觸，以形成穩(wěn)定壽命超過(guò)約10小時(shí)的凝血酶組 分，其中，該穩(wěn)定劑包括8%至25%濃度范圍的乙醇、多元醇、PEG、硫酸銨、非極性溶劑、極 性溶劑、甲基異丁基酮醇、乙二醇、三氯乙酸、乙酸鹽或它們的任何組合。雖然此系統(tǒng)確實(shí)能 提供更長(zhǎng)壽命的凝血酶產(chǎn)生組分，但是由于穩(wěn)定劑的存在，會(huì)使生物相容性復(fù)雜化。
[0026] 在2000年12月12日公布的美國(guó)專(zhuān)利6, 159, 232、2002年11月12日公布的美國(guó) 專(zhuān)利6, 478, 808、2002年11月19日公布的美國(guó)專(zhuān)利6, 482, 223、以及2006年1月4日公布 的美國(guó)專(zhuān)利6, 989, 022和2006年8月10日公布的美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文件2006/0178610中（這 些文獻(xiàn)的完整內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此），諾瓦科夫斯基揭示了一種創(chuàng)口封合方法和裝置，其 中，當(dāng)血液處于體外并處于基本上封閉的無(wú)菌容器中時(shí)，首先開(kāi)始血液的凝學(xué)級(jí)聯(lián)。凝血級(jí) 聯(lián)啟動(dòng)裝置可包括促凝劑（能夠使血液形成為凝塊的組分）、大致中和抗凝血?jiǎng)┑臋C(jī)制（例 如向血液添加液體硫酸魚(yú)精蛋白，以抑制肝素抗凝血?jiǎng)?、或大致中和抗塊凝劑的機(jī)制（抗 塊凝抑制劑的例子有抗血纖溶環(huán)酸和血纖蛋白溶酶原粘結(jié)物質(zhì)）。然后，在持續(xù)發(fā)生塊凝的 創(chuàng)口周?chē)逊e塊凝活化血液。
[0027] 近來(lái)，業(yè)界研究了凝血酶除了在塊凝過(guò)程中的關(guān)鍵角色之外的重要作用。在《J Cell Physiol (細(xì)胞生理學(xué)）》2009;219 (3) :744-751中（其完整內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此）， 巴氏等人聲稱(chēng)，凝血酶除了通過(guò)把纖維蛋白原解理為血纖蛋白在血塊形成過(guò)程中扮演著核 心角色外，還有與炎癥、過(guò)敏、腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移病變、細(xì)胞凋亡、以及組織重塑相關(guān)的多種生 物活性。在許多情況中，凝血酶的調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能的能力是通過(guò)與特定細(xì)胞表面受體的 相互作用實(shí)現(xiàn)的。所有已知的凝血酶受體都屬于蛋白酶活化受體（PAR)族系，其特征是具 有特殊的蛋白酶活化機(jī)制。當(dāng)凝血酶解理接觸系鎖配體的受體的胞外域時(shí)，發(fā)生受體活化。 具體而言，在PAR族系的受體之中，凝血酶可與PAR-1、PAR-3和PAR-4相互作用。另外，對(duì) 于某些細(xì)胞，凝血酶還是強(qiáng)大的有絲分裂促進(jìn)劑。
[0028] 雖然業(yè)界已取得了上述的進(jìn)展，但是在醫(yī)護(hù)場(chǎng)所仍缺少制備單供體凝血酶血清的 理想方法。理想的凝血酶制備裝置和方法必須可在人體內(nèi)安全使用，因此必須源自于病人 的自有血液，而且不應(yīng)需要利用乙醇等有細(xì)胞毒性的添加劑來(lái)克服凝血酶穩(wěn)定性的問(wèn)題。
[0029] 上述的現(xiàn)有技術(shù)說(shuō)明反映了 申請(qǐng)人:對(duì)當(dāng)前技術(shù)的了解，包含在此的目的是表明申 請(qǐng)人已履行揭示相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)的既定義務(wù)。但是，應(yīng)說(shuō)明的是，這些參考文獻(xiàn)之中的任何一 個(gè)的教導(dǎo)或它們的任何可設(shè)想的組合都不會(huì)使下文中更詳細(xì)說(shuō)明的和在權(quán)利要求中具體 主張的本發(fā)明顯而易見(jiàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0030] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備凝血酶血清的新型改進(jìn)方法和裝置。對(duì)所屬技 術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員來(lái)說(shuō)，通過(guò)閱讀說(shuō)明書(shū)和所附的權(quán)利要求，能夠更清晰地理解本發(fā)明的 其它目的和優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明更好地滿(mǎn)足了對(duì)于在醫(yī)護(hù)場(chǎng)所從單個(gè)供體的血液制備安全有效的 醫(yī)用凝血酶血清的簡(jiǎn)單、實(shí)用、快速的方法的需求。本發(fā)明揭示一種制備凝血酶血清的方法 和裝置，其中，可根據(jù)治療醫(yī)師的需求以快速、可重復(fù)的方式從血液制備凝血酶血清。本發(fā) 明揭示了一種從血液獲得凝血酶血清的兩階段方法。在第一階段中，通過(guò)在促凝劑表面上 獲得凝血酶原酶復(fù)合物而把促凝劑轉(zhuǎn)化為活化促凝劑。該凝血酶原酶復(fù)合物源自于血液中 存在的凝血蛋白。在第二階段中（此步驟可根據(jù)操作人員的需求即刻執(zhí)行），通過(guò)使活化促 凝劑與包含凝血蛋白（包括凝血酶原）的生物液接觸而從凝血酶原獲得凝血酶。由于這些 凝血途徑的反應(yīng)依賴(lài)鈣，因此必須向反應(yīng)混合物添加適當(dāng)濃度的鈣離子。本發(fā)明還揭示了 一種用于盛裝反應(yīng)混合物的裝置以及一種用于添加和抽取輸送流體的構(gòu)件。
[0031] 就本發(fā)明之目的來(lái)說(shuō)，促凝劑是能夠把血液系統(tǒng)的凝血級(jí)聯(lián)活化到至少能夠產(chǎn)生 凝血酶的程度的物質(zhì)，該促凝劑優(yōu)選是能夠把血液系統(tǒng)的凝血級(jí)聯(lián)活化到能夠獲得血纖蛋 白的程度的物質(zhì)（圖1)。使優(yōu)選的促凝劑與血液接觸，從而具有很大的表面面積，此過(guò)程 最好使用粒徑小于5毫米的促凝劑微粒或多孔顆粒來(lái)完成。活化步驟是通過(guò)在有游離鈣離 子存在的條件下使促凝劑與第一份血液（first blood fluid aliquot)接觸而完成的。雖 然不應(yīng)被理論所局限，但是業(yè)界普遍認(rèn)為，在分子水平上，所述裝置的第一階段活化是由于 在促凝劑的表面上產(chǎn)生亞穩(wěn)定型的凝血酶原酶復(fù)合物。在使用血液時(shí)，所述裝置的活化僅 需要五至十分鐘?；罨癄顟B(tài)以較高的水平維持至少十小時(shí)，然后在二十四小時(shí)內(nèi)逐漸衰退 到無(wú)效水平?；罨癄顟B(tài)的這種維持時(shí)間歸因于具有這種功能穩(wěn)定性持續(xù)時(shí)間的凝血酶原 酶復(fù)合物，考慮到凝血級(jí)聯(lián)的其它成分的半壽命期都很短以避免過(guò)度塊凝，這種功能穩(wěn)定 性持續(xù)時(shí)間即是令人驚訝的，也是不可預(yù)測(cè)的。十小時(shí)促凝劑活化維持時(shí)間是很幸運(yùn)的， 因?yàn)樗却蠖鄶?shù)外科手術(shù)的時(shí)間都長(zhǎng)。在活化后，該裝置可立即用于從添加至該裝置的第 二份血液（second blood fluid aliquot)快速制備（例如，約1分鐘）可醫(yī)用量的凝血 酶。能夠快速產(chǎn)生凝血酶歸因于在促凝劑的很大表面面積上形成的大量凝血酶原酶復(fù)合物 對(duì)凝血酶原向凝血酶轉(zhuǎn)化的催化作用。由于凝血酶原酶復(fù)合物的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與凝血酶和抗 凝血酶III形成不活躍復(fù)合物的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的差異，凝血酶的形成速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)抗凝血酶 III等凝血酶中和劑中和凝血酶的速度。凝血酶產(chǎn)生和凝血酶中和之間的動(dòng)力學(xué)差異產(chǎn)生 了能夠獲得可臨床使用的凝血酶量的時(shí)間窗口。能夠達(dá)到的凝血酶產(chǎn)生速度越快（例如， 形成的凝血酶原酶復(fù)合物越多），則可臨床使用的凝血酶量在凝血酶血清中存留的持續(xù)時(shí) 間就越長(zhǎng)。而且，通過(guò)實(shí)驗(yàn)得知，凝血酶和抗凝血酶III的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)比凝血酶產(chǎn)生的反應(yīng) 動(dòng)力學(xué)對(duì)溫度更敏感（在溫度低于KTC時(shí)會(huì)被抑制），因此，若使用冷凍的血液制品，則能 夠儲(chǔ)存更多可用的凝血酶量，并且通過(guò)冷藏能夠顯著延長(zhǎng)形成的凝血酶血清的可用儲(chǔ)存壽 命。因此，本發(fā)明支持根據(jù)手術(shù)人員的需求從病人的自有血液快速產(chǎn)生生物相容的凝血酶 血清。本發(fā)明還揭示了一種重復(fù)使用所述裝置的方式，即，可以按相同的方式向同一個(gè)裝置 添加第二、第三、第四份血液，等等，以產(chǎn)生更多份凝血酶血清。而且，本發(fā)明還揭示了 ：每次 使用所述裝置制備凝血酶血清時(shí)，都會(huì)使促凝劑的活化狀態(tài)延續(xù)另外十個(gè)小時(shí)，從而支持 操作人員從單個(gè)設(shè)備連續(xù)不斷地快速產(chǎn)生凝血酶。通過(guò)支持在醫(yī)護(hù)場(chǎng)所使用病人的自有血 液產(chǎn)生大量凝血酶，本發(fā)明的另一個(gè)有益方面是其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和節(jié)省成本的潛力。
[0032] 血漿是血液的非細(xì)胞性成分，它包含大量蛋白，包括凝血級(jí)聯(lián)蛋白和血纖蛋白原。 當(dāng)血纖蛋白原在凝血酶的作用下被轉(zhuǎn)化為血纖蛋白時(shí)，血漿中的血纖蛋白原濃度會(huì)顯著降 低，此時(shí)血漿被稱(chēng)為血清，而不再是血漿。就本發(fā)明之目的來(lái)說(shuō)，凝血酶血清是用于描述含 有可檢測(cè)的把血纖蛋白原轉(zhuǎn)化為血纖蛋白的凝血酶塊凝活性的任何生物液的一個(gè)術(shù)語(yǔ)，此 術(shù)語(yǔ)中不考慮該生物液的細(xì)胞性成分。就本發(fā)明之目的來(lái)說(shuō)，血液在此是用于描述源自于 具有在凝血級(jí)聯(lián)活化時(shí)能產(chǎn)生凝血酶原酶復(fù)合物的功能容量的供體的生物液的一個(gè)術(shù)語(yǔ)， 該生物液可選自全血、檸檬酸鹽抗凝全血或血漿、或具有凝血酶原成分的任何其它適當(dāng)?shù)?血液成分、血漿（包括富血小板血漿、富血沉棕黃層血漿、貧血小板血漿）、全骨髓、檸檬酸 鹽抗凝骨髓、全臍帶血、檸檬酸鹽抗凝骨髓、以及任何其它的能夠發(fā)生凝血級(jí)聯(lián)的血液制 齊U。而且，本發(fā)明還揭示了不同的血液可在同一個(gè)裝置中使用。在本發(fā)明中，通過(guò)非限定性 的例子說(shuō)明，促凝劑的第一活化階段可通過(guò)向裝置添加全血來(lái)完成，對(duì)于產(chǎn)生凝血酶血清 的第二階段，所用的血液可以是不同的血液，例如富血小板血漿。
[0033] 在下文中更詳細(xì)地說(shuō)明和在權(quán)利要求中具體主張的本發(fā)明是通過(guò)一系列意外、不 可預(yù)測(cè)和令人驚訝的實(shí)驗(yàn)觀(guān)測(cè)所發(fā)現(xiàn)的，包括以下發(fā)現(xiàn)：1)在所述裝置中，在血液、鈣與促 凝劑混合的最初數(shù)分鐘內(nèi)，凝血酶原酶復(fù)合物在優(yōu)選的促凝劑的很大表面面積上形成，凝 血酶原酶復(fù)合物在形成后保持持續(xù)的酶活性功能狀態(tài)，在至少六個(gè)小時(shí)（但不超過(guò)二十四 小時(shí)）的可臨床使用時(shí)間內(nèi)，能夠促進(jìn)凝血酶原向凝血酶的快速轉(zhuǎn)化，從而支持"按需地" 從儲(chǔ)存的活化裝置制備凝血酶；2)在凝血酶原血源與活化促凝劑接觸時(shí)，在數(shù)秒內(nèi)而不是 數(shù)分鐘內(nèi)就能極快速地大量產(chǎn)生凝血酶，從而支持比以前（例如1分鐘培育時(shí)間）更快的 速度可靠地到達(dá)可臨床使用的凝血酶濃度，因而支持"按需地"從儲(chǔ)存的活化裝置制備凝血 酶；3)在低于KTC的溫度下儲(chǔ)存收獲的凝血酶血清能夠顯著提高凝血酶的穩(wěn)定性，而無(wú)需 像庫(kù)馬爾等人在2007年揭示的那樣需要有乙醇作為穩(wěn)定劑，這進(jìn)一步使"按需地"制備生 物相容的凝血酶血清的方法具有實(shí)用性；4)可重復(fù)使用單個(gè)裝置產(chǎn)生多批凝血酶，并且， 每次產(chǎn)生凝血酶時(shí)，還能使裝置內(nèi)的促凝劑藥劑保持活化狀態(tài)至少另外10個(gè)小時(shí)，這進(jìn)一 步支持使用單個(gè)裝置從單個(gè)供體產(chǎn)生大量新鮮凝血酶的商用可行性；5)不再像現(xiàn)有技術(shù) 揭示的那樣需要血液中存在乙醇才能制備單供體凝血酶，這樣，能夠支持更快速地活化促 凝劑，從而僅需要10分鐘就能獲得產(chǎn)生可臨床使用的凝血酶的能力，而不是像現(xiàn)有技術(shù)揭 示的那樣在向血液添加乙醇的情況下需要30至60分鐘才能獲得這種能力，因而能夠更快 速地向病人提供單供體凝血酶；10)在促凝劑的第一活化階段完成后可添加乙醇，通過(guò)這 種方式，仍然可采用向血液添加18%至25%濃度（體積百分比）的乙醇的方法，以穩(wěn)定凝 血酶，從而改進(jìn)了現(xiàn)有技術(shù)，即，在現(xiàn)有技術(shù)中，由于乙醇必須以精確的濃度存在以避免凝 血級(jí)聯(lián)弱化（乙醇濃度過(guò)高）或無(wú)法穩(wěn)定凝血酶（乙醇濃度不足），因此凝血酶的產(chǎn)生速度 很慢并且不可靠。
[0034] 本發(fā)明揭示了一種重復(fù)使用和儲(chǔ)存已在有鈣離子存在的條件下通過(guò)與第一份血 液接觸被活化的單個(gè)裝置的方法，該方法能夠極大地加速凝血酶的獲得和增加凝血酶的數(shù) 量，所述凝血酶包含在按需地在10小時(shí)內(nèi)通過(guò)與附加的一份或多份血液接觸而制備的一 份或多份凝血酶制劑中。由本發(fā)明產(chǎn)生的暫時(shí)穩(wěn)定的凝血酶在制備時(shí)不采用凝血酶穩(wěn)定添 加劑。相應(yīng)地，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例揭示了一種按需地從血液產(chǎn)生可臨床使用的凝血酶制 劑的實(shí)用方法，從而改善或克服了現(xiàn)有技術(shù)的一個(gè)或多個(gè)嚴(yán)重缺點(diǎn)，所述血液選自包括血、 單供體全血、血漿、混合血漿、富血小板血漿、貧血小板血漿、或全血成分，包括具有完好的 凝血級(jí)聯(lián)的血漿（在此稱(chēng)為血液）。在使用本發(fā)明制備凝血酶時(shí)，可在控制、效能、可靠性、 安全性和性?xún)r(jià)比方面實(shí)現(xiàn)顯著改善。具體而言，本發(fā)明所揭示的方法和裝置支持在很長(zhǎng)的 外科手術(shù)時(shí)間內(nèi)利用單個(gè)裝置快速、可復(fù)現(xiàn)、可重復(fù)和有計(jì)劃地從隨時(shí)可用的生物液制備 大量可臨床使用的凝血酶制劑，以實(shí)現(xiàn)止血，促進(jìn)傷口愈合，或提供細(xì)胞成分，該制備過(guò)程 能夠由普通技術(shù)人員輕松進(jìn)行。本發(fā)明還提供一種執(zhí)行上述方法的裝置，從而提供一種可 方便地實(shí)施上述方法的凝血酶血清制備方式。
[0035] 所述促凝劑優(yōu)選選自與功能性凝血酶原酶復(fù)合物相關(guān)的并且被定義為活化促凝 劑的玻璃、玻璃珠、玻璃纖維、陶瓷、鞣花酸和硅藻土等，但不局限于這些物質(zhì)。優(yōu)選的促凝 劑是粒徑在50微米和2毫米之間的硼硅酸鹽玻璃珠，它們易于容納在反應(yīng)室中，并且可通 過(guò)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的構(gòu)造（例如濾網(wǎng)、深層濾芯等）使血細(xì)胞（約6-10微米直 徑）穿過(guò)。為促凝劑提供較大的表面面積、使其平鋪在反應(yīng)室的底部上比較有利。在反應(yīng) 室中布置具有較大直徑和較大質(zhì)量的其它分散的物體尤其有利，這些物體可用于通過(guò)物理 攪動(dòng)（例如手工地?fù)u動(dòng)所述裝置）來(lái)磨碎已形成的血纖蛋白膠。例如，適當(dāng)?shù)姆稚⑽矬w可 以是由可醫(yī)用的材料制成的用于與血液接觸的粒徑為6至8毫米的珠子，例如玻璃、聚苯乙 烯、聚碳酸酯和聚乙烯，當(dāng)然，可以理解的是，也可利用其它構(gòu)造來(lái)磨碎已形成的血纖蛋白 膠。所述裝置的所有部分優(yōu)選是與人類(lèi)使用生物相容的，并且能夠承受通過(guò)一種或多種已 知的消毒方法進(jìn)行消毒，包括射線(xiàn)照射、電子束照射、或者不太推薦的環(huán)氧乙烷氣消毒。
[0036] 雖然在反應(yīng)混合物中存在凝血酶原酶復(fù)合物抑制物質(zhì)（抗凝血酶III和活化C蛋 白和S蛋白）以及大量的其它吸附性蛋白，例如白蛋白和免疫球蛋白，但是出乎意料并且令 人驚訝的是，凝血酶原酶復(fù)合物在很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)保持足夠的穩(wěn)定性。但是，這種增強(qiáng) 的凝血酶產(chǎn)生化學(xué)作用不是永久的，在室溫下儲(chǔ)存24小時(shí)后會(huì)失效。值得注意的是，延長(zhǎng) 穩(wěn)定性的原因是未知的，并且大多數(shù)凝血蛋白因凝血系統(tǒng)的相互制衡而失效的速度出奇的 快，因此沒(méi)有科學(xué)證據(jù)可支持所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員在不經(jīng)實(shí)驗(yàn)的情況下就能預(yù)見(jiàn)到可發(fā)現(xiàn) 這種穩(wěn)定性時(shí)間。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員不能預(yù)見(jiàn)到可實(shí)現(xiàn)至少10小時(shí)但短于24小時(shí)的穩(wěn) 定性。
[0037] 本發(fā)明提供一種易用、手持型、廉價(jià)和可靠的裝置，該裝置可用于在醫(yī)護(hù)場(chǎng)所優(yōu)選 利用單供體或優(yōu)選利用自體同源的血源工作（參見(jiàn)圖4-6)。
[0038] 本發(fā)明為醫(yī)師提供了一種與現(xiàn)有凝血酶產(chǎn)品相比對(duì)凝血酶制劑的受體更安全的 凝血酶制劑。提高安全性的第一個(gè)手段是，本發(fā)明通過(guò)避免添加作為穩(wěn)定劑的化學(xué)摻雜劑 (例如有細(xì)胞毒性濃度的乙醇）降低了與現(xiàn)有凝血酶制劑有關(guān)的危險(xiǎn)。不具有這種化學(xué)添 加劑特別有價(jià)值，因?yàn)樗嗽谙蚴荏w輸送凝血酶制劑時(shí)化學(xué)中毒反應(yīng)的危險(xiǎn)。提高安 全性的第二個(gè)手段是，本發(fā)明所述的凝血酶制劑不是像牛凝血酶或轉(zhuǎn)基因鼠類(lèi)細(xì)胞系列產(chǎn) 品那樣源自于異類(lèi)生物，從而避免了病原體傳播和免疫原性反應(yīng)的危險(xiǎn)。提高安全性的第 三個(gè)手段是，本發(fā)明使得凝血酶制劑源自于單個(gè)供體，而不是像目前的慣例那樣源自于數(shù) 百或數(shù)千供體的混合血漿，從而降低了混合制品中殘存的傳染性疾病傳播的危險(xiǎn)。提高安 全性的第四個(gè)手段是，凝血酶的制備非常簡(jiǎn)單且快速，完全可以在醫(yī)護(hù)場(chǎng)所制備，從而支持 使用病人的自有血液制備凝血酶。自體同源的血液制品被廣泛認(rèn)可為最安全的生物制劑。 提高安全性的第五個(gè)手段是，本發(fā)明的方法和裝置非常簡(jiǎn)單，完全可以在手術(shù)室的無(wú)菌現(xiàn) 場(chǎng)使用，避免了把材料轉(zhuǎn)出無(wú)菌現(xiàn)場(chǎng)然后在轉(zhuǎn)回?zé)o菌現(xiàn)場(chǎng)的要求，從而避免了增加無(wú)菌現(xiàn) 場(chǎng)的微生物污染危險(xiǎn)，并且最終避免了增加病人受到醫(yī)院感染的危險(xiǎn)。
[0039] 已知的是，按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的凝血酶也可用于常規(guī)的凝血酶治療應(yīng)用，并 且，哈姆等人最近在《Journal of Blood Medicine(血液醫(yī)學(xué)雜志）》的2010:1135-142中 對(duì)此進(jìn)行了考查，該參考文獻(xiàn)的完整內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合于此。本發(fā)明提供一種產(chǎn)生凝血酶 制劑的方法，所產(chǎn)生的凝血酶制劑在使用時(shí)具有足夠的凝血酶濃度，對(duì)于從血纖蛋白原產(chǎn) 生血纖蛋白的預(yù)定目的很有效。本發(fā)明特別適合于產(chǎn)生用于輸送細(xì)胞（例如血小板和干細(xì) 胞）的血纖蛋白膠。根據(jù)Akingboye等人在2010年3月刊的AA, J Extra CorporTechnol 的42(1) :20-9頁(yè)上發(fā)布的最近考查內(nèi)容，向富血小板血漿添加凝血酶制劑以形成富血小 板凝膠在醫(yī)療行業(yè)中應(yīng)用很廣泛。
[0040] 本發(fā)明所說(shuō)明的用于產(chǎn)生所揭示的凝血酶制劑的方法和材料都很實(shí)用，因?yàn)樗鼈?可快速、可靠、方便地使用，可用于各種不同的環(huán)境中，包括手術(shù)室、醫(yī)護(hù)場(chǎng)所、或?qū)嶒?yàn)室環(huán) 境等，或者，它們可由具有不同水平的技能的用戶(hù)和手術(shù)室護(hù)士使用。而且，該裝置和方法 能夠最大限度縮短上手時(shí)間，并把整個(gè)操作過(guò)程的總時(shí)間縮短到10分鐘左右，這短于現(xiàn)用 的任何方法所需的時(shí)間。該方法不需要使用機(jī)電裝置（例如離心機(jī)或加熱器）來(lái)制備凝血 酶血清。
[0041] 諾瓦科夫斯基、科埃略、庫(kù)馬爾提出的技術(shù)以及其余現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有單獨(dú)地或相互 結(jié)合地揭示、推薦或啟發(fā)出：1)本發(fā)明所揭示的制造凝血酶血清的兩階段過(guò)程；2)通過(guò)儲(chǔ) 存活化促凝劑來(lái)克服凝血酶血清不穩(wěn)定性的實(shí)用方法；3)重復(fù)使用活化促凝劑從單個(gè)設(shè) 備制備多批凝血酶血清的方法；或4)包含用于磨碎在反應(yīng)室中形成的血纖蛋白膠的構(gòu)件， 以便使用分散的物體從血纖蛋白膠釋出凝血酶血清。
[0042] 考慮到現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明之主要目的是，通過(guò)簡(jiǎn)單到可由醫(yī)務(wù)人員（例如 醫(yī)護(hù)場(chǎng)所的手術(shù)護(hù)士）操作的過(guò)程，按需從單個(gè)供體的血液提供生物相容的凝血酶，并且 不需要使用有細(xì)胞毒性的凝血酶穩(wěn)定化學(xué)藥劑。
[0043] 本發(fā)明之另一個(gè)目的是提供一種制備凝血酶血清的實(shí)用方法，該方法的最短處理 時(shí)間為10分鐘左右。
[0044] 本發(fā)明之再一個(gè)目的是提供一種生物相容的凝血酶血清，該凝血酶血清能在短于 10秒的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)塊凝。
[0045] 本發(fā)明之另一個(gè)目的是提供一種可單獨(dú)地或與血纖蛋白原源液一起通過(guò)很小的 管口噴出或通過(guò)細(xì)管輸送的凝血酶。
[0046] 本發(fā)明之另一個(gè)目的是提供一種制備生物相容的凝血酶的方法，該方法包括：獲 得第一份血液；向第一份血液添加足量的氯化鈣（CaCl2)以再次鈣化血液，添加促凝劑，并 形成第一混合物，該形成步驟包括：短暫地?cái)噭?dòng)第一組分，使其混合；儲(chǔ)存第一組分至少10 分鐘左右，但短于六個(gè)小時(shí)；儲(chǔ)存所述第一混合物一段時(shí)間，直到預(yù)計(jì)該凝血酶血清可以使 用；獲得第二份血液；向第二份血液添加足量的氯化鈣（CaCl2)以再次鈣化血液，向儲(chǔ)存的 第一混合物添加第二份含氯化鈣（CaCl2)的血液，以產(chǎn)生第二混合物組分；短暫地?cái)噭?dòng)第二 混合物組分，使其混合；培育第二組分，直到形成血纖蛋白膠，磨碎血纖蛋白膠以釋出凝血 酶血清；以及，過(guò)濾凝血酶血清以去除顆粒，從而使凝血酶通過(guò)濾膜，該濾膜的孔徑足以使 流體向凝血酶血清流動(dòng)，但能防止促凝劑透過(guò)（例如，20微米孔徑）；在室溫下或更優(yōu)選地 在冰水混合物上（<l〇°C )儲(chǔ)存收獲的凝血酶血清，并最終使凝血酶血清與血纖蛋白原源液 接觸，以產(chǎn)生血纖蛋白。
[0047] 本發(fā)明之另一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)生凝血酶血清的方法，該方法適合于把活細(xì)胞 懸浮液制備為血纖蛋白膠，以便準(zhǔn)備組織組織移植，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行診斷性試驗(yàn)、或者 用于利用血纖蛋白粘合劑組合細(xì)胞和組織【技術(shù)領(lǐng)域】中的其它目的。在準(zhǔn)備活細(xì)胞復(fù)合物移 植時(shí)，為了保持血纖蛋白移植物中的細(xì)胞的活性，使用生物相容的凝血酶特別重要。
[0048] 本發(fā)明之另一個(gè)目的是提供一種裝置，該裝置可重復(fù)用于多次提取凝血酶血清， 而無(wú)需活化。在上一次向該裝置添加一份血液后的10小時(shí)內(nèi)，通過(guò)向該裝置添加第三、第 四、第五份血液或更多份血液可實(shí)現(xiàn)上述目的。若使用檸檬酸鈉等鈣螯合劑作為抗凝血?jiǎng)?則每份血液應(yīng)使用氯化鈣（CaCl2)溶液處理，以再次鈣化血液。本發(fā)明不適合于與已使用 肝素進(jìn)行抗凝的血液，除非采用由諾瓦科夫斯基揭示的步驟從血液去除肝素。
[0049] 本發(fā)明通過(guò)克服本領(lǐng)域中其它發(fā)明成果所示的限制提供了一種產(chǎn)生醫(yī)用凝血酶 的改進(jìn)方法。本發(fā)明提供的凝血酶的濃度使其在冗長(zhǎng)的外科手術(shù)中（例如，十個(gè)小時(shí)）當(dāng)根 據(jù)需要與血纖蛋白原源液結(jié)合時(shí)能實(shí)現(xiàn)快速塊凝（〈5至10秒）。本領(lǐng)域的以前成果（希爾 施等人）以實(shí)例說(shuō)明了凝血酶的穩(wěn)定性非常低，因而凝血酶只能在極短的四至五分鐘時(shí)間 內(nèi)實(shí)現(xiàn)血纖蛋白原的快速塊凝（即，短于5秒）的問(wèn)題，或者需要太多的制備步驟和時(shí)間， 因而不適合于圍術(shù)期制備的問(wèn)題，這兩個(gè)問(wèn)題都使得該技術(shù)對(duì)于很寬范圍的外科手術(shù)完全 不實(shí)用。本領(lǐng)域中以前的努力（例如，科埃略等人）曾嘗試通過(guò)添加乙醇作為凝血酶化學(xué) 穩(wěn)定劑的方法來(lái)克服凝血酶血清的穩(wěn)定性非常短的限制，但是由于需要達(dá)到細(xì)胞毒性濃度 的乙醇來(lái)改善凝血酶的穩(wěn)定性，因此這樣做會(huì)帶來(lái)新的生物相容性問(wèn)題。
[0050] 相應(yīng)地，在本發(fā)明中以更完美的方式解決了凝血酶不穩(wěn)定性的問(wèn)題。通過(guò)產(chǎn)生一 個(gè)兩階段過(guò)程，可以制備并儲(chǔ)存活化促凝劑，直至到達(dá)需要使用凝血酶血清的時(shí)間，通過(guò)這 樣的方式，延緩了凝血酶血清的制備，從而克服的眾所周知的凝血酶暫態(tài)穩(wěn)定性的問(wèn)題。當(dāng) 在室溫下儲(chǔ)存從活化裝置收獲的凝血酶制劑時(shí)，該凝血酶制劑能保持其快速塊凝能力至少 15分鐘，當(dāng)在低于KTC的溫度下儲(chǔ)存時(shí)，該凝血酶制劑能保持其快速塊凝能力至少1小時(shí)， 而無(wú)需化學(xué)添加劑。通過(guò)儲(chǔ)存活化裝置而不是儲(chǔ)存由科埃略、庫(kù)馬爾和其他人的現(xiàn)有技術(shù) 揭示的用乙醇穩(wěn)定的凝血酶血清，本發(fā)明提供了在醫(yī)護(hù)場(chǎng)所從單個(gè)供體更快速地提供可臨 床使用的凝血酶血清制劑的方法，該凝血酶血清制劑具有快速的塊凝速度（例如，短于10 秒），并且是生物相容的。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0051] 通過(guò)參考下文中參照附圖做出的詳細(xì)說(shuō)明，能夠更好地理解本發(fā)明的上述方面和 許多附帶優(yōu)點(diǎn)，在附圖中：
[0052] 圖1是現(xiàn)有技術(shù)中已知的凝血級(jí)聯(lián)的概圖；
[0053] 圖2是詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中的方法的一個(gè)流程圖；
[0054] 圖3是詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中的方法的一個(gè)流程圖；
[0055] 圖4a是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的反應(yīng)室頂蓋的一個(gè)實(shí)施例；
[0056] 圖4b是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的反應(yīng)室頂蓋和反應(yīng)室的俯視圖；
[0057] 圖4c是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的反應(yīng)室頂蓋和反應(yīng)室的側(cè)視圖；
[0058] 圖4d是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的反應(yīng)室頂蓋和反應(yīng)室的分解透視圖；
[0059] 圖5是示例性的已組裝好的反應(yīng)室及用于收獲凝血酶血清的布置的示意圖；
[0060] 圖6是示例性的反應(yīng)室及與該示例性反應(yīng)室結(jié)合使用以收獲凝血酶血清的注射 器的不意圖；
[0061] 圖6A是現(xiàn)有技術(shù)的用于輸送收獲的凝血酶以便在需要位置形成血纖蛋白的噴嘴 施用器的示意圖；
[0062] 圖7是從本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的示例性反應(yīng)室收獲凝血酶血清的示意圖；以及
[0063] 圖8示出了形成的血纖蛋白膠具有支撐其自重的足夠強(qiáng)度。

【具體實(shí)施方式】
[0064] 以下說(shuō)明之目的是使所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠產(chǎn)生和使用本發(fā)明的各個(gè)方 面和例子。具體材料、技術(shù)和應(yīng)用的說(shuō)明僅是示例性的。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái) 說(shuō)，顯而易見(jiàn)的是，能夠?qū)Ρ疚乃龅睦幼龀龈鞣N修改，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的 前提下，在此規(guī)定的總體原則也適用于其它例子和應(yīng)用。因此，本發(fā)明不限于所述和所示的 例子，其范圍僅由所附的權(quán)利要求限定。
[0065] 首先請(qǐng)參考圖2,本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中的過(guò)程包括四個(gè)步驟，這些步驟優(yōu)選按順 序發(fā)生：1)通過(guò)結(jié)合在有游離鈣離子存在的條件下具有凝血級(jí)聯(lián)能力的第一份生物液并 對(duì)其培育約10分鐘來(lái)制備活化促凝劑；2)然后，可把該活化促凝劑儲(chǔ)存最長(zhǎng)約10小時(shí)；3) 在從添加第一份血液算起的大約1分鐘至10小時(shí)范圍內(nèi)，當(dāng)預(yù)計(jì)需要使用凝血酶時(shí)（預(yù)定 的凝血酶使用），向該活化促凝劑添加另外一份生物液和游離Ca++離子；以及4)磨碎隨后 形成的血纖蛋白膠，以釋出凝血酶血清，然后可以收獲該凝血酶血清。可以把該凝血酶用于 血纖蛋白原源液，以產(chǎn)生血纖蛋白。該凝血酶可作為獨(dú)立使用的液體以外用方式使用，以噴 霧方式使用，或者與另一種載劑（例如可吸收止血?jiǎng)?，包括海綿膠、氧化再生纖維素、以及 微纖維膠原）一起使用，或與血纖蛋白原結(jié)合以產(chǎn)生"膠體"或"凝膠"。
[0066] 對(duì)于這種應(yīng)用，應(yīng)注意的是，"活化"促凝劑與促凝劑是不一樣的。與未活化的促 凝劑相比，活化促凝劑能使血漿以快得多的速度發(fā)生膠凝。在一種識(shí)別方案中，可通過(guò)比較 兩種促凝劑樣品使含有作為抗凝血?jiǎng)┑臋幟仕猁}的新鮮冰凍血漿發(fā)生膠凝所需的時(shí)間來(lái) 識(shí)別活化促凝劑，其中，血漿已在其預(yù)定使用前兩小時(shí)內(nèi)解凍。具體而言，在第一個(gè)12毫 米X75毫米聚苯乙烯試管中，加入已經(jīng)與血液接觸過(guò)的0. 5克促凝劑。在第二個(gè)相似試管 中，加入未與血液接觸的相同促凝劑，作為控制樣品。向每個(gè)試管加入含有作為抗凝血?jiǎng)┑?檸檬酸鹽的已解凍新鮮冰凍血漿（血漿已在其預(yù)定使用前兩小時(shí)內(nèi)解凍），并把添加時(shí)間 記為零時(shí)。記錄每個(gè)試管中的液體血漿轉(zhuǎn)變?yōu)槟z所需的時(shí)間，若被測(cè)促凝劑使血漿發(fā)生 膠凝所需的時(shí)間是控制促凝劑使血漿發(fā)生膠凝的時(shí)間的兩倍或更多，則被測(cè)促凝劑可確定 為活化促凝劑。若被測(cè)促凝劑使血漿發(fā)生膠凝所需的時(shí)間與控制促凝劑使血漿發(fā)生膠凝的 時(shí)間相比不到兩倍，則被測(cè)促凝劑可確定為不是活化促凝劑。
[0067] 現(xiàn)在回到本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，還應(yīng)注意的是，收獲的凝血酶僅是短暫穩(wěn)定的，可 在室溫下存儲(chǔ)的30分鐘內(nèi)添加至血纖蛋白原源液，以形成血纖蛋白。若需要快速形成血纖 蛋白（快速塊凝時(shí)間），則優(yōu)選在15分鐘內(nèi)使血纖蛋白原與收獲的凝血酶接觸，更優(yōu)選的是 在收獲凝血酶以后之后立即接觸（在5分鐘內(nèi)）。若推遲凝血酶的預(yù)定使用時(shí)間，則可被凝 血酶放在冰上儲(chǔ)存（<l〇°C )，這會(huì)顯著增強(qiáng)凝血酶的穩(wěn)定，從而可在3小時(shí)內(nèi)使用，更優(yōu)選 的是在60分鐘內(nèi)使用。
[0068] 使用含有多孔膜（例如，20至80微米孔徑）的過(guò)濾器對(duì)凝血酶溶液進(jìn)行過(guò)濾可保 留促凝劑并去除血纖蛋白顆粒物質(zhì)，否則的話(huà)，血纖蛋白顆粒物質(zhì)可能妨礙凝血酶從小噴 嘴噴出，或者妨礙使用如圖6A所示的裝置使凝血酶通過(guò)細(xì)管輸送到創(chuàng)口處。圖6A是現(xiàn)有技 術(shù)的一種噴嘴施用器的示意圖，其中，一個(gè)注射器充有血纖蛋白原源液，另一個(gè)注射器充有 凝血酶血清，兩個(gè)注射器內(nèi)的液體在通過(guò)噴霧元件噴射的同時(shí)彼此混合，產(chǎn)生氣溶膠噴霧， 這會(huì)使混合物以液體形式輸送，由于血纖蛋白的形成，并且血纖蛋白起著密封劑的作用，該 液體會(huì)迅速變?yōu)楣腆w。
[0069] 現(xiàn)在請(qǐng)看圖4A至圖4D，其中示出了本發(fā)明的一個(gè)方面。圖4A至圖4C示出了用于 實(shí)踐所述方法的裝置的不同視圖。該裝置包括封裝反應(yīng)室2的殼體1。反應(yīng)室2優(yōu)選為圓 筒形腔室，具有寬端2a和窄端2b。寬端2a具有護(hù)帽結(jié)構(gòu)3,該護(hù)帽結(jié)構(gòu)3配置為壓入配合 在寬端2a的開(kāi)口中。窄端2b配置為接收接頭4?，F(xiàn)在請(qǐng)參考圖4D，它是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施 例的護(hù)帽結(jié)構(gòu)3和接頭4的部件分解圖。窄端2b配置為形成噴嘴狀結(jié)構(gòu)2c，該噴嘴狀結(jié)構(gòu) 2c連接至接頭4 (參見(jiàn)圖4A至圖4C)。接頭4包括雙魯爾接口內(nèi)螺紋接頭5。雙魯爾接口 內(nèi)螺紋接頭5具有第一端5a和第二端5b。第一端5a適合于配裝到噴嘴狀結(jié)構(gòu)2c中。第 二端5b適合于接收無(wú)針入口孔6的第一端6a。無(wú)針入口孔6的第二端6b配置為形成螺紋 結(jié)構(gòu)6b。無(wú)針入口孔6的螺紋結(jié)構(gòu)6b連接至護(hù)帽7。護(hù)帽7能防止無(wú)針入口孔6被污染。 護(hù)帽結(jié)構(gòu)3包括密封件8。密封件8為環(huán)狀構(gòu)造，內(nèi)圈8a配置為收納到護(hù)帽9中，外圈8b 配置為適貼配合到容器2的寬端2a中。護(hù)帽9具有凹部9a，該凹部9a配置為接收并保持 濾膜10。濾膜10通過(guò)擋環(huán)11被保持在護(hù)帽9的凹部9a中。
[0070] 在此所述的裝置包括無(wú)菌的無(wú)熱源液路容器，該容器具有引入、盛裝和排空流體 的構(gòu)件，并且不會(huì)發(fā)生泄漏，優(yōu)選能防止流體與室內(nèi)空氣直接接觸，從而降低微生物污染的 危險(xiǎn)，該容器還作為用于活化凝血級(jí)聯(lián)的反應(yīng)室，反應(yīng)室盛有足夠數(shù)量的促凝劑，并具有能 夠高效地活化待使用的生物液中的凝血級(jí)聯(lián)的表面面積，反應(yīng)室還具有能夠在每個(gè)培育步 驟中使促凝劑與生物液密切接觸的形狀，并包括磨碎形成在其中的血纖蛋白膠的構(gòu)件（優(yōu) 選通過(guò)盛有質(zhì)量比促凝劑大的較大分散物體來(lái)實(shí)現(xiàn)），反應(yīng)容器在腔室內(nèi)具有足夠的內(nèi)表 面積，從而當(dāng)操作人員對(duì)反應(yīng)室進(jìn)行機(jī)械攪動(dòng)（例如搖動(dòng)）時(shí)，較大的分散物體會(huì)運(yùn)動(dòng)，并 磨碎較小的促凝劑顆粒周?chē)难w蛋白膠。容器的容積優(yōu)選至少為生物液、促凝劑和分散 的大物體的總體積的兩倍。在研磨凝膠時(shí)，較大的分散物體在反應(yīng)室內(nèi)的運(yùn)動(dòng)會(huì)產(chǎn)生可聽(tīng) 到的聲音，從而向操作人員警示已完成研磨。較大的分散物體由醫(yī)用級(jí)塑料小球或玻璃珠 構(gòu)成。這種較大的分散物體的優(yōu)選形狀為球形，其優(yōu)選粒徑為5至15毫米，并由醫(yī)用級(jí)塑 料或玻璃制成。反應(yīng)室優(yōu)選提供用于引入鈣離子溶液的構(gòu)件，其引入量?jī)?yōu)選小于預(yù)定的一 份血液的體積的10%，并且鈣離子源自于氯化鈣。需要添加的鈣離子的量可由本領(lǐng)域技術(shù) 人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定，但應(yīng)足夠?qū)λ龅囊环菅哼M(jìn)行再鈣化，其中，增加的氯化鈣的最終濃 度是5至30mM，更優(yōu)選的是10至20mM。鈣可在可切換閥門(mén)后的液路中的任何位置添加，因 為注入系統(tǒng)的血漿會(huì)把鈣攜帶至反應(yīng)室。下文中更詳細(xì)地說(shuō)明的一個(gè)不太優(yōu)選但很有用的 例子表明，可在旋塞閥和單向鴨嘴閥之間的位置添加干鈣。
[0071] 下面詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中用于從人血漿制備凝血酶血清的一種 示例性方法。
[0072] 用于實(shí)踐所述方法的一個(gè)示例性裝置在圖5中示出。在此示例性實(shí)施例中，該裝 置包括盛有促凝劑12的反應(yīng)室2。反應(yīng)室2還盛有用于磨碎血纖蛋白膠的分散球體13。提 供一個(gè)包括流量控制手柄14A的四通旋塞閥14,用于控制流體從反應(yīng)室2流出和向反應(yīng)室 2流入。單向鴨嘴閥15連接至反應(yīng)室2,防止流體從反應(yīng)室2流出。在四通旋塞閥14的一 端連接有過(guò)濾罩16,過(guò)濾罩16包含孔徑為20微米左右的濾膜，用于留住顆粒物質(zhì)，包括促 凝劑和血纖蛋白顆粒。該裝置還包括可切換的單向無(wú)針入口孔17,用于避免在向反應(yīng)室2 輸送流體和從反應(yīng)室2排出流體的過(guò)程中防止與室內(nèi)空氣接觸，以提高裝置的微生物安全 性。
[0073] 反應(yīng)室的準(zhǔn)備：雖然可以使用各種適當(dāng)?shù)娜萜?，佰是在此示例件?shí)施例中，一個(gè) 60毫升注射器提供了方便的原型反應(yīng)室2。反應(yīng)室2可通過(guò)去除注射器柱塞并添加作為促 凝劑12的玻璃珠來(lái)準(zhǔn)備。在此示例性方法中，例如可使用粒徑在0. 5毫米和5毫米之間的 20克玻璃珠作為促凝劑12。另外，可以向反應(yīng)室添加7克大聚苯乙烯球（10毫米直徑）或 其它適當(dāng)?shù)牟牧?，作為用于磨碎已形成的血纖蛋白膠的固體分散物體13。然后，可以把柱 塞推回到注射器上的50毫升標(biāo)記的位置，以產(chǎn)生足夠的空間，使較大的分散珠子13在搖動(dòng) 過(guò)程中能夠運(yùn)動(dòng)，從而打碎（磨碎）已形成的血纖蛋白膠。在產(chǎn)生凝血酶血清的過(guò)程中，柱 塞不需要移動(dòng)，可以保持在固定位置。本發(fā)明的商用實(shí)施方式可使用注塑成型容器作為反 應(yīng)容器，而不是使用注射器。在優(yōu)選實(shí)施例中包括帶有手柄14a的四通旋塞閥14,以提供 控制流體流入反應(yīng)室和從反應(yīng)室流出的方向的手段。旋塞閥14旋至第一位置A，在該位置 時(shí)，液路始于第一無(wú)針入口孔17,通過(guò)單向鴨嘴閥15,然后進(jìn)入反應(yīng)室2(在此例子中為注 射器筒）。圖6是示例性的反應(yīng)室及與該示例性反應(yīng)室結(jié)合使用以收獲凝血酶血清的注射 器的示意圖。在此所述的示例性反應(yīng)室與其它的注射器19、20和21結(jié)合使用，以便輸送流 體，例如生物液和含鈣離子的流體。當(dāng)旋塞閥處于位置A時(shí)，可向裝置注入流體。旋塞閥手 柄14a可轉(zhuǎn)至第二位置B，在該位置，液路始于第二無(wú)針入口孔18,通過(guò)過(guò)濾器16,然后進(jìn)入 反應(yīng)室2 (在此例子中為注射器筒）。在此旋塞閥手柄位置B時(shí)，注射器可附接至第二可切 換入口孔，可外抽注射器柱塞，以便產(chǎn)生低壓空間或真空，從而使凝血酶血清通過(guò)過(guò)濾器16 從反應(yīng)室2被抽出，并進(jìn)入注射器。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，包括具有多孔膜的過(guò)濾器， 過(guò)濾器的孔徑尺寸足夠小，能夠留住促凝劑（由于太小，無(wú)法在此圖中示出）和血纖蛋白微 粒，但是允許凝血酶血清流過(guò)。通過(guò)包含用于允許注射器探入該裝置的防泄漏、無(wú)菌的可切 換入口孔，實(shí)現(xiàn)了一種封閉系統(tǒng)，從而提高了該裝置的微生物安全性。
[0074] 氯化鈣（CaCL)溶液的制各：可通過(guò)在200毫升水中溶解15. 5克氯化鈣來(lái) 制備354mM六水氯化鈣溶液（在此購(gòu)自密蘇里州圣路易斯市Sigma公司，產(chǎn)品編號(hào)為 21110-1KG-F，批號(hào)為#BCBC3343，MW 219. 08)。對(duì)于每5毫升檸檬酸鹽抗凝血液，可添加0. 2 毫升CaCl2溶液，以便把血液溶液再鈣化為大約14mM最終濃度?？墒褂?毫升注射器通過(guò) 可切換入口把CaCl2輸送到反應(yīng)室中?；蛘?，在過(guò)程開(kāi)始前，也可在反應(yīng)室中預(yù)先加入干鈣， 若存在干鈣，則無(wú)需在此方法的后續(xù)步驟中使用液體鈣。
[0075] 血液：例如，可以使用檸檬酸鹽抗凝全血或檸檬酸鹽抗凝新鮮人血漿作為方便的 實(shí)驗(yàn)用血液，但不僅限于這些。
[0076] 凝血酶血清的啼施：在收獲凝血酶血清時(shí)，可以俥用啼嘴施用器來(lái)啼施凝血酶血 清，使其與作為血纖蛋白原源液的另一份解凍血漿結(jié)合，例如，可以使用由明尼蘇達(dá)州圣保 羅市的Micromedics Corp.制造的噴嘴施用器（參見(jiàn)如圖6A所示的帶有噴嘴SA-3674的 Fibri jet混合連接器）。
[0077] 下面說(shuō)明本發(fā)明的用于產(chǎn)生凝血酶血清的優(yōu)選過(guò)程的一個(gè)實(shí)施例：
[0078] 第1步：向按如上所述準(zhǔn)備的反應(yīng)室加入用于第一次培育的反應(yīng)物：
[0079] a.通過(guò)無(wú)針入口孔把盛有CaCl2溶液的1毫升注射器附接至反應(yīng)室，并注入0. 2 毫升，然后拆下注射器。
[0080] b.通過(guò)無(wú)針入口孔把盛有5毫升血漿的5毫升注射器附接至反應(yīng)室，并向反應(yīng)室 注入全部血漿，然后拆下注射器。
[0081] c.使反應(yīng)室保持在水平位置，充分搖動(dòng)反應(yīng)室，使促凝劑和分散的大塑料珠運(yùn)動(dòng)， 從而使反應(yīng)室中的物質(zhì)混合，使促凝劑完全浸濕。
[0082] 第2步：第一次培育
[0083] a.把注射器放在平坦表面上，使促凝劑分布均勻，并開(kāi)始第一次培育過(guò)程，這個(gè)過(guò) 程可能需要大約10分鐘至大約10小時(shí)。
[0084] b.在經(jīng)過(guò)約10分鐘后，產(chǎn)生了足夠的凝血酶，從而把生物液中的可溶血纖蛋白原 轉(zhuǎn)化為不溶性血纖蛋白，因而導(dǎo)致形成第一血纖蛋白膠。通過(guò)用肉眼觀(guān)察混合物喪失流動(dòng) 性，并觀(guān)察即使當(dāng)反應(yīng)室處于堅(jiān)直位置時(shí)促凝劑和塑料珠也在反應(yīng)壁上結(jié)塊，能夠很明顯 地發(fā)現(xiàn)血纖蛋白膠。
[0085] 第3步：在需要使用凝血酶血清時(shí)，向反應(yīng)室加入用于第二次培育的反應(yīng)物。
[0086] a.通過(guò)無(wú)針入口孔把盛有CaCl2溶液的1毫升注射器附接至反應(yīng)室，并注入0. 2 毫升，然后拆下注射器。
[0087] b.通過(guò)無(wú)針入口孔把盛有5毫升血漿的5毫升注射器附接至反應(yīng)室，并向反應(yīng)室 注入全部血漿，然后拆下注射器。
[0088] c.使反應(yīng)室保持在堅(jiān)直位置，上下猛烈搖動(dòng)反應(yīng)室，直到所有珠子在反應(yīng)室中自 由運(yùn)動(dòng)（約3至10秒），從而磨碎第一次形成的血纖蛋白膠，并混合反應(yīng)室中的物質(zhì)。
[0089] 第4步：第二次培育
[0090] a.把注射器放在平坦表面上，使玻璃珠分布均勻，并開(kāi)始第二次培育過(guò)程，這個(gè)過(guò) 程可能需要大約1分鐘至大約60分鐘。在形成第二血纖蛋白膠后，可隨時(shí)收獲凝血酶血 清。能夠很明顯地發(fā)現(xiàn)血纖蛋白膠，因?yàn)檠獫{不再是液態(tài)，并且珠子穩(wěn)固地貼到反應(yīng)容器壁 上。此方法產(chǎn)生短暫地穩(wěn)定的凝血酶制劑，并且血纖蛋白原的凝血酶的塊凝活性隨血纖蛋 白膠的儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)而降低。因此，為了使凝血酶血清中的凝血酶保持最高的活性，優(yōu)選在 形成血纖蛋白膠后就立即按如下所述收獲凝血酶血清（例如，在形成第二血纖蛋白膠之后 大約15分鐘之內(nèi)進(jìn)行收獲，更優(yōu)選地是在形成第二血纖蛋白膠之后大約5分鐘之內(nèi)收獲， 最優(yōu)選的是在形成第二血纖蛋白膠之后大約1分鐘之內(nèi)收獲）。
[0091] 第5步：使用10毫升注射器收獲凝血酶血清
[0092] a.在形成第二血纖蛋白膠后，充分?jǐn)噭?dòng)反應(yīng)室，以驅(qū)動(dòng)反應(yīng)室中的珠子，從而打碎 存在的血纖蛋白膠。
[0093] b.把具有多孔膜的過(guò)濾器附接至與反應(yīng)室相連的可切換入口，以防止顆粒物質(zhì)進(jìn) 入10暈升收獲注射器。
[0094] c.把反應(yīng)室置于堅(jiān)直位置，使10毫升注射器在反應(yīng)室下面，回抽10毫升注射器 的柱塞，以便在反應(yīng)室中產(chǎn)生低壓區(qū)或真空，直到收獲所需數(shù)量的凝血酶血清（最多約5毫 升），通過(guò)這樣的方式來(lái)收獲凝血酶血清，如圖7所示。圖7中示出了從示例性反應(yīng)室2收 獲凝血酶血清是如下完成的：回抽注射器柱塞21以產(chǎn)生真空，然后等待一段時(shí)間，直到所 需數(shù)量的凝血酶血清被吸出反應(yīng)室并進(jìn)入注射器21。
[0095] d.收獲的血漿可在室溫下儲(chǔ)存，并可用于在添加第二份血液后15分鐘內(nèi)與血纖 蛋白原接觸，以形成血纖蛋白，或者，也可以把其放在冰水混合物上儲(chǔ)存（<10°c)，并在添 加第二份血液后1小時(shí)內(nèi)使其與血纖蛋白原接觸，以形成血纖蛋白。
[0096] 第6步（可選）：如果需要產(chǎn)生更多的凝血酶血清制劑，那么可以使用更多份新鮮 血液，并重復(fù)第3、4、5步，最多可重復(fù)六次。
[0097] 在下文中綜述的實(shí)驗(yàn)中，示出了如下的發(fā)現(xiàn)：在裝置中的血液、鈣和促凝劑混合物 首次接觸的過(guò)程中，在促凝劑表面上形成凝血酶原酶復(fù)合物，該凝血酶原酶復(fù)合物在形成 后保持持久的酶活性功能狀態(tài)，在至少十小時(shí)但短于二十四小時(shí)的可臨床使用時(shí)間內(nèi)能夠 把凝血酶原快速轉(zhuǎn)化為凝血酶。
[0098] 在此研究中，按如上所述準(zhǔn)備了六個(gè)反應(yīng)室。為此實(shí)驗(yàn)采用的有代表性的血液是 新鮮血漿。在稱(chēng)為零時(shí)的時(shí)刻，對(duì)于全部六個(gè)注射器，按如上所述向反應(yīng)室添加血漿和鈣 (第1步）。對(duì)于六個(gè)注射器中的每一個(gè)，改變第一次培育期的持續(xù)時(shí)間（第2步），使培育 試驗(yàn)條件為0小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)、10小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)。在第一次培育時(shí)間結(jié)束時(shí)， 按如上所述向反應(yīng)室添加第二份鈣和血漿（第3步）。第二次培育（第4步）的持續(xù)時(shí)間 固定為形成第二血纖蛋白膠所需的時(shí)間，并記錄該時(shí)間。按如上所述收獲凝血酶血清（第 5步），在收獲凝血酶血清5分鐘后，測(cè)量凝血酶的活性。在此實(shí)驗(yàn)中，凝血酶的活性是通過(guò) 使用由新澤西州Troy Hills市的DiagnosticaStago Inc.制造的STart止血分析儀記錄 血纖蛋白原塊凝時(shí)間來(lái)測(cè)量的。下表中示出的數(shù)據(jù)表明，12小時(shí)以上的儲(chǔ)存時(shí)間會(huì)使促凝 劑活化能力損失，因?yàn)檠w蛋白原的塊凝時(shí)間會(huì)隨著凝血酶活性的降低而加長(zhǎng)，但是，即使 在12小時(shí)后，活化能力也未完全喪失，與儲(chǔ)存24小時(shí)后的情況不同。有趣的是，每批制備 好的凝血酶都會(huì)使促凝劑的活性再延長(zhǎng)10小時(shí)以上。下表中的數(shù)據(jù)證明了，在室溫下儲(chǔ)存 時(shí)，活化促凝劑的穩(wěn)定性能至少維持10小時(shí)。
[0099]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備凝血酶血清的方法，該方法包括以下步驟： 獲得活化促凝劑；以及 使所述活化促凝劑與一份血液接觸，以形成包含凝血酶血清的混合物；以及 從所述混合物提取所述凝血酶血清。
2. -種制備凝血酶血清的方法，該方法包括以下步驟： 使第一份血液與促凝劑接觸，以形成活化促凝劑； 儲(chǔ)存所述活化促凝劑； 使第二份血液與儲(chǔ)存的所述活化促凝劑接觸，以形成包含凝血酶血清的混合物；以及 從所述混合物提取所述凝血酶血清。
3. -種制備凝血酶血清的方法，該方法包括以下步驟： 使第一份血液與促凝劑接觸，以形成活化促凝劑，該活化促凝劑包含結(jié)合到促凝劑的 表面上的凝血酶原酶復(fù)合物； 儲(chǔ)存所述活化促凝劑； 使儲(chǔ)存的所述活化促凝劑與第二份血液接觸，以形成包含血纖蛋白膠的混合物； 磨碎所述血纖蛋白膠； 在所述磨碎步驟后，從所述混合物提取凝血酶血清；以及 使提取的所述凝血酶血清與血纖蛋白原接觸，以獲得血纖蛋白。
4. 一種制備乙醇穩(wěn)定凝血酶血清的方法，該方法包括以下步驟： 使第一份血液與促凝劑接觸，以形成活化促凝劑，該活化促凝劑包含處于促凝劑的表 面上的凝血酶原酶復(fù)合物； 儲(chǔ)存所述活化促凝劑； 在所述儲(chǔ)存步驟后，使活化促凝劑與含有濃度為大約15%至25% (體積百分比）的 乙醇的第二份血液接觸，以獲得補(bǔ)充有乙醇的凝血酶血清，并形成包含血纖蛋白膠的混合 物； 磨碎所述血纖蛋白膠； 在所述磨碎步驟后，從所述混合物提取補(bǔ)充有乙醇的凝血酶血清；以及 使提取的補(bǔ)充有乙醇的凝血酶血清與血纖蛋白原接觸，以獲得血纖蛋白。
5. 如權(quán)利要求1、2、3和4中任一項(xiàng)所述的方法，還包括從單個(gè)供體獲得血液的步驟，其 中，前述各份血液是從所述血液提取的。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中，獲得的血液是自體同源的血液。
7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述血液選自由以下物質(zhì)所構(gòu)成的組：全血；檸檬 酸鹽抗凝全血或血漿；包括富血小板血漿、富血沉棕黃層血漿、貧血小板血漿的血漿；全骨 髓；檸檬酸鹽抗凝骨髓；全臍帶血；檸檬酸鹽抗凝骨髓；包含凝血酶原的血液組分；以及它 們的組合。
8. 如權(quán)利要求1、2、3和4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，前述各份血液經(jīng)過(guò)復(fù)鈣處理，以 包含游離鈣離子。
9. 如權(quán)利要求1、2、3和4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述促凝劑選自由玻璃、玻璃珠、 玻璃棉、高嶺土、陶瓷、棉、鞣花酸、以及它們的組合所構(gòu)成的組。
10. 如權(quán)利要求1、2和4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，凝血酶血清的提取是通過(guò)回抽注 射器的柱塞來(lái)進(jìn)行的。
11. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，補(bǔ)充有乙醇的凝血酶血清的提取是通過(guò)回抽注射 器的柱塞來(lái)進(jìn)行的。
12. 如權(quán)利要求2、3和4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述活化促凝劑的儲(chǔ)存時(shí)間在約 1分鐘至10小時(shí)之間。
13. 如權(quán)利要求2、3和4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述活化促凝劑重復(fù)地與更多份 血液結(jié)合使用，以按需地產(chǎn)生凝血酶血清。
14. 如權(quán)利要求3或4所述的方法，其中，所述血纖蛋白膠的研磨進(jìn)行一次或多次。
15. 如權(quán)利要求3或4所述的方法，其中，所述血纖蛋白膠的研磨是通過(guò)機(jī)械攪動(dòng)進(jìn)行 的。
16. -種處理血液的裝置，該裝置包括： 反應(yīng)室，包括配置為容納促凝劑和血液并且基本不會(huì)發(fā)生泄漏的一個(gè)或多個(gè)隔室，其 中，容納的所述促凝劑配置為與所述血液反應(yīng)，以形成血纖蛋白膠； 用于向反應(yīng)室中引入和從反應(yīng)室中排出流體的構(gòu)件； 用于留存反應(yīng)室中的顆粒物質(zhì)的構(gòu)件； 用于從血纖蛋白膠分離凝血酶血清的構(gòu)件；以及 其中，在反應(yīng)室中有一個(gè)或多個(gè)固態(tài)的分散物體，所述固態(tài)的分散物體的大小適合于 磨碎血纖蛋白膠。
17. 如權(quán)利要求16所述的裝置，其中，所述固態(tài)的分散物體具有至少4毫米的橫截面尺 寸。
18. 如權(quán)利要求16所述的裝置，其中，反應(yīng)室是圓筒形瓶，包括由護(hù)帽密封的窄端，該 護(hù)帽包括至少一個(gè)盧爾鎖構(gòu)件。
19. 如權(quán)利要求16所述的裝置，其中，用于引入流體的所述構(gòu)件是接頭，一個(gè)四通旋塞 閥連接置所述接頭，并且該四通旋塞閥包括至少兩個(gè)單向閥。
20. 如權(quán)利要求16所述的裝置，還包括用于留存顆粒物質(zhì)的過(guò)濾器，該過(guò)濾器的孔徑 尺寸比促凝劑的尺寸小。
21. 如權(quán)利要求20所述的裝置，其中，所述過(guò)濾器的孔徑使其能夠留存粒徑大于約30 微米的顆粒物質(zhì)。
22. 如權(quán)利要求16所述的裝置，其中，用于引入流體的所述構(gòu)件具有至少一個(gè)用于引 入和排出液體的可切換口。
23. 如權(quán)利要求16所述的裝置，還包括配置為避免反應(yīng)室持續(xù)承壓的通氣孔。
24. 如權(quán)利要求16所述的裝置，其中，反應(yīng)室是由塑料制成的。
25. 如權(quán)利要求16所述的裝置，其中，反應(yīng)室是由玻璃制成的。
26. 如權(quán)利要求16所述的裝置，其中，固態(tài)的分散物體選自由玻璃物體、金屬物體、塑 料物體、以及它們的組合構(gòu)成的組。
27. 如權(quán)利要求16所述的裝置，其中，固態(tài)的分散物體不是促凝劑。
28. 如權(quán)利要求16所述的裝置，其中，所述血液選自由以下物質(zhì)所構(gòu)成的組：全血；檸 檬酸鹽抗凝全血或血漿；包括富血小板血漿、富血沉棕黃層血漿、貧血小板血漿的血漿；全 骨髓；檸檬酸鹽抗凝骨髓；全臍帶血；檸檬酸鹽抗凝骨髓；包含凝血酶原的血液組分；以及 它們的組合。
29. 如權(quán)利要求16所述的裝置，其中，所述反應(yīng)室補(bǔ)充有干鈣鹽。
30. 如權(quán)利要求16所述的裝置，其中，所述反應(yīng)室補(bǔ)充有鈣鹽溶液。
31. 如權(quán)利要求29或30所述的裝置，其中，所述鈣鹽是氯化鈣。
【文檔編號(hào)】A61M1/36GK104349805SQ201380027782
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月25日
【發(fā)明者】J.R.查普曼 申請(qǐng)人:干細(xì)胞合伙有限責(zé)任公司