成纖維細(xì)胞生長因子21蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥理學(xué)有效的和穩(wěn)定的人成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)的蛋白質(zhì)，含有FGF21蛋白的藥物組合物，以及使用這類蛋白質(zhì)治療2型糖尿病、肥胖、異常脂血癥和/或代謝綜合征的方法。
【專利說明】成纖維細(xì)胞生長因子21蛋白
[0001] 本發(fā)明涉及成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)蛋白質(zhì)，含有FGF21蛋白的藥物組合 物，以及用于治療2型糖尿病、肥胖、異常脂血癥和/或代謝綜合征的方法。
[0002] FGF21是一種激素，其作為葡萄糖和脂質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要代謝調(diào)節(jié)物發(fā)揮作用。通過 上調(diào)GLUT1表達(dá)，F(xiàn)GF21促進(jìn)脂肪細(xì)胞中的葡萄糖攝取，其機(jī)制不同于胰島素。在糖尿病嚙 齒動物和猴子中，人FGF21降低葡萄糖空腹血清濃度，并降低甘油三酯、胰島素和胰高血糖 素的空腹血清濃度。此外，在飲食誘導(dǎo)的肥胖嚙齒類動物模型中，施用FGF21導(dǎo)致累計(jì)體重 呈劑量依賴性喪失。因此，F(xiàn)GF21具有用于治療糖尿病、肥胖、異常脂血癥、代謝綜合征的潛 在效用。
[0003] 在 TO2010/042747、W02010/285131 和 W02009/149171 中已經(jīng)描述了 FGF21 蛋白。
[0004] 與人野生型FGF21和已知的FGF21蛋白相關(guān)的問題是分子的短的體內(nèi)半壽期、低 的效力和/或藥物不穩(wěn)定性。因此，仍然需要一種長期作用的、有效和/或穩(wěn)定的替代性 FGF21蛋白。
[0005] 本發(fā)明提供了替代性的FGF21蛋白。本發(fā)明的某些FGF21蛋白具有人野生型FGF21 和本領(lǐng)域公開的已知的FGF21蛋白沒有的優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)包括具有延長的半壽期、改善的 效力和/或改善的藥物穩(wěn)定性。除改善的效力外，本發(fā)明的某些FGF21蛋白具有一種或多 種有利的穩(wěn)定性特征，這些特征對作為治療性蛋白質(zhì)的有效制備和/或配制是有用的，包 括在體內(nèi)降低的蛋白質(zhì)水解降解、降低的對氧化的易感性、減少的在高濃度聚集的傾向、降 低的在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中生產(chǎn)期間的翻譯后修飾和蛋白水解水平、和/或改善的化學(xué)穩(wěn) 定性。另外，本發(fā)明的FGF21蛋白對2型糖尿病、肥胖、異常脂血癥和/或代謝綜合征的治 療具有潛在的作用。
[0006] 本發(fā)明提供了 FGF21蛋白，其中氨基酸序列由與第二多肽融合的第一多肽組成， 其中第一多肽包含IgG4 Fc部分，其中Fc部分由抗體的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域組 成，第二多肽包含具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列的FGF21蛋白，且其中第一多肽的C-末 端通過接頭與第二多肽的N-末端融合。
[0007] 此外，本發(fā)明提供了這樣的FGF21蛋白，其中氨基酸序列由與第二多肽融合的第 一多肽組成，其中第一多肽包含具有SEQ ID N0 :14的氨基酸序列的IgG4 Fc部分，第二多 肽包含具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列的FGF21蛋白，且其中第一多肽的C-末端通過接頭 與第二多肽的N-末端融合。
[0008] 本發(fā)明還提供了這樣的FGF21蛋白，其中氨基酸序列由與第二多肽融合的第一多 肽組成，其中第一多肽包含具有SEQ ID N0:14的氨基酸序列的IgG4 Fc部分，第二多肽包 含具有SEQ ID N0 :1的氨基酸序列的FGF21蛋白，且其中第一多肽的C-末端通過具有SEQ ID N0 :11的氨基酸序列的接頭與第二多肽的N-末端融合。
[0009] 本發(fā)明提供了這樣的FGF21蛋白，其中氨基酸序列是
[0010] ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS lslgGGGCSGGOGSGGGGSAhpipdsspllqfggqvrqrylytddaqqtechleiredgtvgcmd QSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLP⑶KSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE(SEQIDNO：5).
[0011] 上述3￡〇10勵(lì)：5的？6?21蛋白包括3￡〇10勵(lì)：14的1864?(：部分，表示為粗體 的SEQIDNO:11的接頭序列，下劃線的SEQIDNO:1的FGF21蛋白。
[0012] 此外，本發(fā)明提供了這樣的FGF21蛋白，其中氨基酸序列是
[0013] ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGGGGGSGGGGSGGGGSAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLK ALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREXiU^EDGYNVYQSEAHGLPLHLP⑶KSPHRKPAPRG PARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLX3SPSFX4X5(SEQIDNO：15)
[0014] 其中乂:是匕或0，\是1或1(，&是1?或1，乂4是1或E，且\是6或空缺。本發(fā)明 還提供了SEQIDN0:15的FGF21蛋白，其中父1是0，&是1或1(，&是1，父4是L，且&是6。 此外，本發(fā)明還提供了SEQIDN0:15的FGF21蛋白，其中乂1是1或0，&是1或1(，&是1?， 父 4是￡，且X5空缺。
[0015] 本發(fā)明提供了SEQIDN0 :15的FGF21蛋白，其中FGF21蛋白選自SEQIDN0 :5、 SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8 和SEQIDNO:9。本發(fā)明還提供了SEQIDNO: 15的FGF21蛋白，其中FGF21蛋白選自SEQIDN0:8和SEQIDN0:9。此外，本發(fā)明提供了 SEQIDNO:15 的FGF21 蛋白，其中FGF21 蛋白選自SEQIDNO:5、SEQIDNO:6 和SEQID N0:7。最優(yōu)選的FGF21蛋白是SEQIDN0:5。
[0016] 本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的FGF21蛋白、和至少一種可藥用的 載體、稀釋劑或賦形劑。
[0017] 本發(fā)明還提供了治療患者2型糖尿病、肥胖、異常脂血癥和/或代謝綜合征的方 法，包括向所述患者施用本發(fā)明的FGF21蛋白。
[0018] 本發(fā)明還提供了治療患者2型糖尿病、肥胖、異常脂血癥和/或代謝綜合征的方 法，包括向所述患者施用本發(fā)明的藥物組合物。
[0019] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了本發(fā)明的FGF21蛋白用于治療。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了本 發(fā)明的FGF21蛋白用于治療2型糖尿病、肥胖、異常脂血癥和/或代謝綜合征。
[0020] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了本發(fā)明的FGF21蛋白在制備用于治療2型糖尿病、肥胖、 異常脂血癥和/或代謝綜合征的藥物中的用途。
[0021] 本發(fā)明還涉及編碼上述本發(fā)明的FGF21蛋白的多核苷酸。
[0022] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的FGF21蛋白的多核苷酸，其中FGF21蛋白的 氨基酸序列由與第二多肽融合的第一多肽組成，其中第一多肽包含IgG4Fc部分，其中Fc 部分由抗體的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域組成，第二多肽包含具有SEQIDNO:1的氨 基酸序列的FGF21蛋白，且其中第一多肽的C-末端通過接頭與第二多肽的N-末端融合。
[0023] 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的FGF21蛋白的多核苷酸，其中FGF21蛋白的氨基酸 序列由與第二多肽融合的第一多肽組成，其中第一多肽包含具有SEQIDN0 :14的氨基酸序 列的IgG4Fc部分，第二多肽包含具有SEQIDN0:1的氨基酸序列的FGF21蛋白，且其中第 一多肽的c-末端通過接頭與第二多肽的N-末端融合。
[0024] 此外，本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的FGF21蛋白的多核苷酸，其中FGF21蛋白的氨 基酸序列由與第二多肽融合的第一多肽組成，其中第一多肽包含具有SEQIDN0 :14的氨基 酸序列的IgG4Fc部分，第二多肽包含具有SEQIDN0:1的氨基酸序列的FGF21蛋白，且其 中第一多肽的C-末端通過具有SEQIDN0 :11的氨基酸序列的接頭與第二多肽的N-末端 融合。
[0025] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的FGF21蛋白的多核苷酸，其中FGF21蛋白的 氨基酸序列是
[0026] ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGGGGGSGGGGSGGGGSAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLK ALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLP⑶KSPHRKPAPRGP ARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE(SEQ ID NO ：5).
[0027] 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的FGF21蛋白的多核苷酸，其中核苷酸序列是SEQ ID NO:13。
[0028] 編碼上述蛋白質(zhì)的多核苷酸可以是RNA的形式，或者DNA的形式，所述DNA包括 cDNA和合成的DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈的。編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的編碼序列可以由于 遺傳密碼的冗余或簡并性的結(jié)果而不同。
[0029] 編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸可以包含如下：僅僅蛋白的編碼序列，蛋白的編碼序 列和其他的編碼序列，如引導(dǎo)序列或分泌序列或前蛋白序列；蛋白的編碼序列和非編碼序 列，如內(nèi)含子或蛋白的編碼序列的5'和/或3'非編碼序列。因此，術(shù)語"編碼蛋白的多核 苷酸"涵蓋這樣的多核苷酸，所述多核苷酸可不僅僅包括蛋白的編碼序列，還包括包括其他 的編碼序列和/或非編碼序列的多核苷酸，如SEQ ID N0:13。
[0030] 序列被有效地連接至表達(dá)調(diào)控序列后，本發(fā)明的多核苷酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)。表 達(dá)載體通常作為附加體或作為宿主染色體DNA的整體部分在宿主生物體中復(fù)制。一般地， 表達(dá)載體含有選擇標(biāo)記物，例如，四環(huán)素、新霉素、和二氫葉酸還原酶，以允許檢測被期望的 DNA序列轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞。
[0031] 本發(fā)明的FGF21蛋白可以容易地在如下細(xì)胞中生產(chǎn)：在哺乳動物細(xì)胞中如CH0、 NS0、HEK293或C0S細(xì)胞；在細(xì)菌細(xì)胞中如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)、 突光假單胞菌（Pseudomonas fluorescence);或在真菌或酵母細(xì)胞中。使用本領(lǐng)域已知 的技術(shù)培養(yǎng)宿主細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動物宿主細(xì)胞是含有谷氨酰胺合成酶（GS)表達(dá)系統(tǒng)的 CH0K1SV 細(xì)胞系（參見 US 5, 122, 464)。
[0032] 可以通過熟知的方法將含有目的多核苷酸序列（例如FGF21蛋白和表達(dá)調(diào)控序 列）的載體轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中，這樣的方法取決于宿主細(xì)胞的類型而不同。例如，氯化鈣轉(zhuǎn) 化通常用于原核細(xì)胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用于其他宿主細(xì)胞。
[0033] 可采用多種蛋白質(zhì)純化的方法，這些方法是本領(lǐng)域公知的，例如， 在 Deutscher，Methods in Enzymology 182:83-89(1990)和 Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,第 3 版，Springer，NY(1994)中描述的。
[0034] 本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)同源二聚體的方法，其中所述同源二聚體的每條多肽的 氨基酸序列是SEQ ID N0:5,所述方法包括步驟：
[0035] i)在使得所述多核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)包含多核苷酸的哺乳動物宿主細(xì) 胞，所述多核苷酸編碼具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的多肽；和
[0036] ii)從所述宿主細(xì)胞回收同源二聚體，其中所述同源二聚體的每條多肽的氨基酸 序列是 SEQ ID N0:5。
[0037] 當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，本發(fā)明的FGF21蛋白是同源二聚體。"同源二聚體" 在本文中指具有相同氨基酸序列（例如SEQ ID N0:5)的兩條本發(fā)明的FGF21蛋白，其通過 非共價(jià)相互作用和Fc部分中的分子間二硫鍵締合。
[0038] 本發(fā)明提供了FGF21蛋白的同源二聚體，其中氨基酸序列由與第二多肽融合的第 一多肽組成，其中第一多肽包含IgG4Fc部分，其中Fc部分由抗體的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3恒 定區(qū)結(jié)構(gòu)域組成，第二多肽包含具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列的FGF21蛋白，且其中第一 多肽的C-末端通過接頭與第二多肽的N-末端融合。
[0039] 進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了FGF21蛋白的同源二聚體，其中氨基酸序列由與第二多 肽融合的第一多肽組成，其中第一多肽包含具有SEQIDN0:14的氨基酸序列的IgG4Fc部 分，第二多肽包含具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列的FGF21蛋白，且其中第一多肽的C-末 端通過接頭與第二多肽的N-末端融合。
[0040] 本發(fā)明還提供了FGF21蛋白的同源二聚體，其中氨基酸序列由與第二多肽融合的 第一多肽組成，其中第一多肽包含具有SEQIDN0:14的氨基酸序列的IgG4Fc部分，第二 多肽包含具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列的FGF21蛋白，且其中第一多肽的C-末端通過具 有SEQIDN0:11的氨基酸序列的接頭與第二多肽的N-末端融合。
[0041] 本發(fā)明提供了 FGF21蛋白的同源二聚體，其中氨基酸序列是ESKYGPPCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL gCGCGSGOC?S?CCCSAhpipdsspllqfggqyrqrylytddaqqtechleiredgtygcaadqsp ESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLP⑶KSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE(SEQ ID NO ：5).
[0042] 上述SEQIDNO :5的FGF21蛋白包括SEQIDNO :14的IgG4Fc部分，粗體顯示的 SEQIDN0 :11的接頭序列，和下劃線的SEQIDN0 :1的FGF21蛋白。
[0043] 進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了 FGF21蛋白的同源二聚體，其中氨基酸序列是
[0044] ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGGGGGSGGGGSGGGGSAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLK ALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREXiU^EDGYNVYQSEAHGLPLHLP⑶KSPHRKPAPRG PARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLX 3SPSFX4X5(SEQ ID NO ：15)
[0045] 其中乂:是匕或0，\是1或1(，&是1?或1，乂4是1或E，且\是6或空缺。本發(fā)明 還提供了 SEQ ID N0:15的FGF21蛋白的同源二聚體，其中乂丨是口，&是1或K，&是匕X4 是L，且&是6。此外，本發(fā)明還提供了 SEQ ID N0:15的FGF21蛋白的同源二聚體，其中Xi 是L或D，X2是L或K，X3是R，X4是E，且X5空缺。
[0046] 本發(fā)明提供了 SEQ ID N0:15的FGF21蛋白的同源二聚體，其中FGF21蛋白選自 SEQ ID N0 :5、SEQ ID N0 :6、SEQ ID N0 :7、SEQ ID N0 :8 和 SEQ ID N0 :9。本發(fā)明還提供 了 SEQ ID N0:15的FGF21蛋白的同源二聚體，其中FGF21蛋白選自SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9。此外，本發(fā)明提供了 SEQ ID勵(lì):15的？6?21蛋白的同源二聚體，其中？6?21蛋白選 自 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6 和 SEQ ID N0:7。最優(yōu)選的 FGF21 蛋白是 SEQ ID N0:5。
[0047] 本發(fā)明還涉及編碼上述本發(fā)明的FGF21蛋白的同源二聚體的多核苷酸。
[0048] 本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的FGF21蛋白的同源二聚體、和至少 一種可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0049] 本發(fā)明還提供了治療患者的2型糖尿病、肥胖、異常脂血癥和/或代謝綜合征的方 法，包括向所述患者施用本發(fā)明的FGF21蛋白的同源二聚體。
[0050] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了本發(fā)明的FGF21蛋白的同源二聚體用于治療。優(yōu)選地，本 發(fā)明提供了本發(fā)明的FGF21蛋白的同源二聚體用于治療2型糖尿病、肥胖、異常脂血癥和/ 或代謝綜合征。
[0051] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了本發(fā)明的FGF21蛋白的同源二聚體在制備用于治療2型 糖尿病、肥胖、異常脂血癥和/或代謝綜合征的藥物中的用途。
[0052] 本發(fā)明的FGF21蛋白可以在Fc部分中高保守的N-糖基化位點(diǎn)糖基化。進(jìn)一步的， 當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，本發(fā)明的FGF21蛋白是同源二聚體。"同源二聚體"在本文中 指具有相同氨基酸序列（例如SEQ ID N0:5)的兩條本發(fā)明的FGF21蛋白，其通過非共價(jià)相 互作用和Fc部分中的分子間二硫鍵締合。
[0053] 全長人野生型FGF21是包含27個(gè)氨基酸信號肽的208個(gè)氨基酸的多肽。成熟人野 生型FGF21包含不具有27個(gè)氨基酸信號肽的全長多肽，因而其為181個(gè)氨基酸的多肽（SEQ ID NO ：2) 〇
[0054] 本發(fā)明FGF21蛋白中氨基酸位置的改變由不含IgG4 Fc部分和接頭的成熟人野生 型FGF21(SEQ ID N0:2)多肽中的氨基酸位置決定。例如，SEQ ID N0:5的FGF21蛋白的 IgG4 Fc部分包括氨基酸1至228, SEQ ID N0 :5的FGF21蛋白的接頭包括氨基酸229至 244，SEQ ID N0:5的FGF21蛋白的FGF21蛋白包括氨基酸245至424。因此，文中描述的取 代"A31C"指在成熟人野生型FGF21的位置31處由氨基酸Cys取代野生型氨基酸Ala。
[0055] 需要注意的是在特定蛋白中一個(gè)氨基酸殘基的取代可以影響蛋白作為整體的特 征，其總體效果可能對藥理學(xué)效力和/或藥物穩(wěn)定性有益或有害。例如，一個(gè)氨基酸取代， PI 15W，增加FGF21蛋白的效力，但是，也認(rèn)為PI 15W導(dǎo)致引起聚集的自身締合。因而，其總體 效果對蛋白是有害的，所以，P115W取代不包含在本發(fā)明的FGF21蛋白中。另一個(gè)例子涉及 氨基酸取代R175L，其增加FGF21蛋白的效力。但是，發(fā)現(xiàn)具有R175L取代的FGF21蛋白對 蛋白水解易感，因而其總體效果是有害的。為了解決本發(fā)明的FGF21蛋白中觀察到的C-末 端蛋白水解，在180和181位的氨基酸（第180位是L，第181位是G)在第180位用氨基 酸E取代，并且在第181位的氨基酸被刪除。這些修飾實(shí)質(zhì)性地減少了 C-末端蛋白水解， 但也降低了 FGF21蛋白的藥理學(xué)效力25倍，如在人293細(xì)胞-PKlotho-SRE luc測定法中 測量的。令人驚訝的是，通過將第175位的氨基酸殘基（R175L)還原為野生型R，可以恢復(fù) 效力。因此，該取代的總體效果對蛋白是有害的，所以，R175L取代不包含在本發(fā)明的優(yōu)選 的FGF21蛋白中。
[0056] 某些本發(fā)明的FGF21蛋白是有效的、生物活性的蛋白質(zhì)，如實(shí)施例2和3中所示的 SEQ ID N0:5。本發(fā)明優(yōu)選的FGF21蛋白包含這樣的氨基酸取代，所有這些取代在一起不僅 僅改善效力，而且與其他氨基酸改變是相容的，這反過來提供了改善的穩(wěn)定性性質(zhì)，和增加 的體內(nèi)穩(wěn)定性。在本發(fā)明的優(yōu)選FGF21蛋白中改善效力的氨基酸取代包含D127K、S167R和 G174L (參見，實(shí)施例2和3)。
[0057] 人野生型FGF21的濃縮蛋白質(zhì)溶液暴露于藥物防腐劑、例如間甲酚時(shí)，增加蛋白 質(zhì)形成聚集體的傾向。通過引入額外的二硫鍵產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性改善了人野生型FGF21的 防腐劑相容性和熱穩(wěn)定性。本發(fā)明的FGF21蛋白并入了氨基酸取代A31C和G43C，其極大地 改善了熱穩(wěn)定性和防腐劑相容性，而不影響生物活性。之前也曾經(jīng)描述過包含A31C/G43C 取代的高效力FGF21蛋白。那些報(bào)道的蛋白與野生型FGF21相比，呈現(xiàn)顯著改善的防腐劑 相容性，但是其在存在防腐劑的條件下仍然傾向于聚集。此蛋白質(zhì)聚集增加免疫原性風(fēng)險(xiǎn)， 因而降低了蛋白質(zhì)作為治療性蛋白質(zhì)的可接受性。
[0058] FGF21蛋白與Fc部分的融合也使自身締合更顯著。該行為可能由于Fc融合體的 同源二聚體結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)導(dǎo)致親合力，穩(wěn)定化自身相互作用和凝聚。
[0059] 本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)包含氨基酸取代L98D和L100K，其令人驚訝地導(dǎo)致高濃度下 顯著更低的高分子量聚集體形成。有利地，氨基酸取代L98D和L100K不降低蛋白質(zhì)的效力， 但使有害的凝聚問題最小化。
[0060] 用于制備本發(fā)明FGF21蛋白的優(yōu)選的商售表達(dá)系統(tǒng)是哺乳動物CH0-K1細(xì)胞系。 然而，哺乳動物細(xì)胞系CH0-K1和HEK293可能通過位置179的酪氨酸側(cè)鏈硫酸鹽化作用引 起成熟的人野生型FGF21翻譯后修飾。在位置179和180 (如果存在的話）的酪氨酸殘基 的硫酸鹽化作用降低了效力，并且是不想要的產(chǎn)品異質(zhì)性的來源。因此，當(dāng)在位置179和/ 或180具有Tyr的FGF21蛋白質(zhì)從CH0-K1或HEK293細(xì)胞系表達(dá)時(shí)，一定比例的表達(dá)蛋白 質(zhì)可能在位置179被硫酸鹽化，另一些可能在位置180被硫酸鹽化，而另一些可能在兩個(gè)位 置均被硫酸鹽化，而另一些在任何位置均未被硫酸鹽化。這導(dǎo)致了具有降低的效力的異質(zhì) 的且不可預(yù)知的蛋白質(zhì)群體。
[0061] 本發(fā)明的優(yōu)選的FGF21蛋白包括解決了該有害的硫酸鹽化作用的氨基酸取代。因 此，蛋白質(zhì)中并入了氨基酸取代Y179F。Y179F消除了在CH0-K1和HEK293細(xì)胞中生產(chǎn)導(dǎo)致 的硫酸鹽化作用。而且，氨基酸取代Y179F與本發(fā)明其他有利的氨基酸取代是相容的，且確 認(rèn)了其是關(guān)于效力的中性改變。
[0062] 人野生型FGF21易感于體內(nèi)的蛋白質(zhì)水解降解。用野生型FGF21靜脈內(nèi)或皮下注 射小鼠或食蟹猴后，從血清回收的主要蛋白質(zhì)水解片段是中止于位置171的片段。在體外 效力測定法中，確定了跨越殘基1至171的FGF21片段效力低?100倍。因此，消除該蛋白 質(zhì)水解切割位點(diǎn)可通過增加對活性藥物的暴露而改善了藥效。已經(jīng)表明氨基酸取代G170E 在小鼠中顯著減緩切割，且在食蟹猴中在24小時(shí)后測量時(shí)，實(shí)質(zhì)上消除了在位置171處的 蛋白質(zhì)水解。G170E取代不影響效力，且與期望的物理化學(xué)穩(wěn)定性譜相容。因此，氨基酸取 代G170E并入本發(fā)明的FGF21蛋白中。
[0063] 人野生型FGF21也對CH0-K1制備中產(chǎn)生的羧肽酶易感，并且氨基酸取代A180E和 第181位的氨基酸刪除減緩了該過程，因而降低了所表達(dá)的蛋白長度的異質(zhì)性（S卩，在由細(xì) 胞系表達(dá)的成熟蛋白中氨基酸殘基數(shù)目的異質(zhì)性）。盡管氨基酸取代A180E和第181位的 氨基酸刪除并不消除哺乳動物細(xì)胞表達(dá)中的C末端蛋白質(zhì)水解，其非常有效地減緩蛋白質(zhì) 水解，同時(shí)維持本發(fā)明FGF21蛋白中存在其它所需氨基酸取代的條件下的效力。鑒于該有 利的特征，氨基酸取代A180E和第181位的氨基酸刪除并入本發(fā)明的優(yōu)選的FGF21蛋白。
[0064] 本發(fā)明的FGF21蛋白通過接頭與免疫球蛋白的Fc部分融合。本發(fā)明的FGF21蛋 白使用的Fc部分源自IgG4 Fc部分。甚至更優(yōu)選的是本發(fā)明的FGF21蛋白包含F(xiàn)c部分， 所述Fc部分源自人IgG4,但相比野生型人序列包含一個(gè)或多個(gè)取代。如本文中使用的，免 疫球蛋白的Fc部分具有免疫學(xué)領(lǐng)域術(shù)語的常規(guī)含義。具體而言，該術(shù)語指不含有來自抗體 的2個(gè)抗原結(jié)合區(qū)（Fab片段）的抗體片段。Fc部分由抗體的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3恒定區(qū)結(jié) 構(gòu)域組成。
[0065] 本領(lǐng)域普遍已知的是在哺乳動物中表達(dá)抗體導(dǎo)致糖基化。通常，糖基化發(fā)生在抗 體的Fc部分中的高保守的N-糖基化位點(diǎn)上。N-聚糖通常附著于天冬酰胺。
[0066] 因此，本發(fā)明的FGF21蛋白源自與本發(fā)明的FGF21蛋白融合的免疫球蛋白的人 IgG4 Fc部分。優(yōu)選地，F(xiàn)GF21蛋白的Fc部分包括SEQ ID N0:14的序列：
[0067] ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLG(SEQ ID NO ：14)
[0068] 本發(fā)明的FGF21蛋白的N-末端氨基酸通過富含甘氨酸（富含G-)的接頭與Fc部 分的每條重鏈的C-末端融合，所述接頭被稱為L，L前面緊挨的數(shù)字指分隔開FGF21蛋白 與Fc部分的重復(fù)接頭單元的數(shù)量。接頭單元被定義為Gly-Gly-Gly-Gly-Ser序列（SEQ ID NO : 10)。如果使用多個(gè)接頭重復(fù)，則接頭任選含有與末端Ser連接的Ala。
[0069] 本發(fā)明的FGF21蛋白的Fc部分優(yōu)選通過1、2或3個(gè)富含G的肽接 頭，-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQ ID N0 :10)，被稱為1L，融合在一起。本發(fā)明的其他的富含 G 的膚接頭包含序列-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala(SEQ ID N0 :12)， 稱為 2L，和-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala (SEQ ID NO :11)，稱為3L。本發(fā)明的最優(yōu)選的富含甘氨酸的肽接頭是接頭3L，-Gly-Gly-Gly-Gl y-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Se;r-Ala(SEQ ID NO :11)。
[0070] 應(yīng)理解，IgG4 Fc由IgG4抗體的兩條重鏈的恒定區(qū)構(gòu)成。因此，本發(fā)明的FGF21蛋 白由在每個(gè)IgG4 Fc部分多肽的每個(gè)C-末端通過富含G的肽接頭與具有相同氨基酸序列 的兩條FGF21蛋白融合的IgG4 Fc部分構(gòu)成。
[0071] 可通過本領(lǐng)域已知的任何方法施用本發(fā)明的FGF21蛋白的藥物組合物，實(shí)現(xiàn)通常 預(yù)期的治療2型糖尿病、肥胖、異常脂血癥和/或代謝綜合征的目的。優(yōu)選的給藥途徑是胃 腸外途徑。給藥劑量取決于接收者的年齡、健康狀態(tài)和體重，如果有，還取決于同時(shí)治療的 種類，治療的頻率，以及期望效果的性質(zhì)。典型的劑量水平可使用標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)優(yōu)化，并取 決于給藥模式和患者狀態(tài)，可由具有本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)的人員確定。
[0072] 根據(jù)已知的方法配制本發(fā)明的FGF21蛋白，以制備可藥用的組合物。期望的制 劑是穩(wěn)定的凍干產(chǎn)品，其與合適的高純度稀釋劑或水性溶液重建，所述高純度稀釋劑或水 性溶液任選帶有可藥用的載體、防腐劑、賦形劑或穩(wěn)定劑[Remington, The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，Gennaro,編輯，Mack Publishing Co.,Easton, PA 1995]。
[0073] 本發(fā)明的FGF21蛋白可以與可藥用的緩沖液配制，調(diào)節(jié)pH以提供可接受的穩(wěn)定 性，以及給藥可接受的pH。另外，本發(fā)明的FGF21組合物可放置于容器內(nèi)，如藥瓶、藥筒、筆 遞送裝置、注射器、靜脈內(nèi)給藥管或靜脈內(nèi)給藥袋。
[0074] 術(shù)語"異常脂血癥"指脂蛋白質(zhì)代謝病癥，包括脂蛋白質(zhì)過量產(chǎn)生或不足。異常脂 血癥可表現(xiàn)為血液中總膽固醇、低密度脂蛋白質(zhì)（LDL)膽固醇和甘油三酯濃度的升高和/ 或高密度脂蛋白質(zhì)（HDL)膽固醇濃度的降低。
[0075] 術(shù)語"代謝綜合征"的特征在于一個(gè)人中的一組代謝風(fēng)險(xiǎn)因子。它們包括：腹部肥 胖-在大多數(shù)男人中，有40英寸或更大的腰圍；高血糖-禁食后至少110毫克每分升（mg/ dl);高甘油三酯-血流中至少150mg/dL ;低HDL-少于40mg/dl ;和/或血壓130/85或更 商。
[0076] 術(shù)語"肥胖"定義為其中具有相對于瘦體重的比例過量的皮下脂肪的狀態(tài) (Stedman , s Medical Dictionary 第 28 版，2006, Lippincott Williams&Wilkins)〇
[0077] "患者"是哺乳動物，優(yōu)選人。
[0078] 術(shù)語"治療"指減緩、降低或逆轉(zhuǎn)現(xiàn)有的癥狀、紊亂、狀態(tài)或疾病的進(jìn)展或嚴(yán)重性。
[0079] 術(shù)語"治療有效量"指本發(fā)明的蛋白質(zhì)的量或劑量，其通過單次或多次劑量給藥于 患者提供期望的治療。
[0080] 術(shù)語"2型糖尿病"特征在于盡管有可利用的胰島素，仍然產(chǎn)生過量的葡萄糖，且由 于葡萄糖清除不足導(dǎo)致循環(huán)的葡萄糖水平持續(xù)過高。
[0081] 可以參考下列實(shí)施例實(shí)施本發(fā)明。但是，這些實(shí)施例不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范 圍。進(jìn)一步的，實(shí)施例中描述和示例的本發(fā)明的FGF21蛋白是在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的，因 此是同源二聚體。
[0082] 實(shí)施例1
[0083] CH0K1SV細(xì)朐中FGF21蛋白的表汰
[0084] 使用CH0K1SV細(xì)胞在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生本發(fā)明的FGF21蛋白。將編碼 本發(fā)明的FGF21蛋白的基因亞克隆至含有谷氨酰胺合成酶（GS)的表達(dá)質(zhì)粒骨架中（基于 PEE12. 4的質(zhì)粒）。編碼本發(fā)明的FGF21蛋白的cDNA序列與優(yōu)選信號肽序列的編碼序列符 合讀框融合，以增加期望的產(chǎn)品分泌到組織培養(yǎng)基中。優(yōu)選信號肽序列是如氨基酸序列SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的多肽。
[0085] 由巨細(xì)胞病毒（CMV)啟動子驅(qū)動表達(dá)。使用電穿孔以及適當(dāng)量的重組表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn) 定轉(zhuǎn)染CH0K1SV細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以足夠的細(xì)胞密度維持在懸浮培養(yǎng)中。通過在含有甲硫 氨酸砜亞胺（methionine sulfoximine，MSX)、不含血清的培養(yǎng)基中生長完成轉(zhuǎn)染細(xì)胞的選 擇，并將其孵育在35-37 °C和5-7% C02中。
[0086] 使用流式細(xì)胞儀測量或確定克隆來源的細(xì)胞系。在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的FGF21 蛋白通常產(chǎn)生天然的N末端序列，ESKY，S卩，在N末端沒有甲硫氨酸殘基，如氨基酸序列SEQ ID N0:5所示的FGF21蛋白。
[0087] 按照標(biāo)準(zhǔn)的層析技術(shù)，通過蛋白A親和層析以及隨后的制備性尺寸排阻層析，純 化由CHO細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中的FGF21蛋白。簡而言之，用PBS pH7. 4運(yùn)行緩沖液將來自 收獲的培養(yǎng)基中的FGF21蛋白捕獲到Mab Select Protein A(GE，Piscataway，NJ)上；用運(yùn) 行緩沖液簡單洗滌以去除非特異性結(jié)合的材料；并用l〇mM檸檬酸pH3.0洗脫?；旌虾?FGF21蛋白的級分，通過添加1/10體積的1M Tris pH 8.0中和pH。濃縮所中和的混合物， 將其上樣到Superdex 200尺寸排阻層析柱（GE，Piscataway，NJ)上，移動相為PBS pH7.4。 混合、濃縮并儲藏含有單體FGF21蛋白（共價(jià)連接的同源二聚體）的級分。
[0088] 可選地，可以將含有FGF21蛋白的無細(xì)胞培養(yǎng)基加熱至50-60°C，維持至多2小時(shí)， 冷卻，用洗滌劑（Triton X-100)處理失活病毒，并將其加載至Mab Select Protein A (GE Healthcare)柱上，用有或無氯化鈉的pH 7Tris緩沖的溶液連續(xù)洗漆以去除非特異性結(jié)合 的材料。使用20mM檸檬酸pH 3從柱上洗脫FGF21蛋白，并在pH 3. 4至3. 7下保持至多2 小時(shí)使病毒失活。通過加入Tris緩沖液和氯化鈉，調(diào)節(jié)溶液pH 4. 8到5. 2之間，并混合至 少15分鐘。通過深度過濾（Millipore)去除沉淀物。使用樹脂，例如Poros HS 50(Life Technologies)或SP Sepharose HP (GE Healthcare)通過陽離子交換層析進(jìn)一步純化 FGF21蛋白。用pH 5的醋酸鈉緩沖溶液中的氯化鈉洗脫該陽離子交換柱。通過使用Tris 緩沖液將pH從7調(diào)節(jié)至8,添加硫酸鈉并應(yīng)用于柱，再用逆濃度梯度的硫酸鈉洗脫，通過在 苯基瓊脂糖HP (GE Healthcare)上的疏水性相互作用層析進(jìn)一步純化FGF蛋白。使純化的 FGF21蛋白通過病毒滯留過濾器，如Planova 20N(Asahi Kasei Medical),而后在再生纖維 素膜（Millipore)上通過切向流超濾濃縮/滲濾至pH為7的10mM檸檬酸、150mM NaCl中。
[0089] 實(shí)施例2
[0090] 3T3-L1- 13 Klotho成纖維細(xì)朐的葡萄糖攝取測定
[0091] 3T3-L1-0 Klotho成纖維細(xì)胞由3T3-L1成纖維細(xì)胞通過CMV驅(qū)動的哺乳動物表達(dá) 載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生，所述CMV驅(qū)動的哺乳動物表達(dá)載體含有野生型小鼠3 Klotho 和殺稻瘟菌素抗性標(biāo)記物的編碼序列。在15 y M殺稻瘟菌素存在下，生長14天后選擇殺 稻瘟菌素抗性細(xì)胞，應(yīng)用抗3Klotho抗體通過免疫印跡證實(shí)3Klotho變體表達(dá)。在含有 10%小牛血清和15 iiM殺稻瘟菌素的Dulbecco's Modified Eagle培養(yǎng)基（DM EM)中維持 3T3-L1- 0 Klotho成纖維細(xì)胞，直至鋪板用于實(shí)驗(yàn)用途。
[0092] 對于葡萄糖攝取，3T3-L1- 0 Klotho成纖維細(xì)胞以20, 000個(gè)細(xì)胞/孔鋪板于96孔 平板，在含有10%小牛血清的DMEM中孵育48小時(shí)。在含有或不含有目的FGF21蛋白、含有 0. 1%牛血清白蛋白質(zhì)（BSA)的DMEM中孵育細(xì)胞3小時(shí)，而后在含有或不含有FGF21蛋白、 含有 lOOiiM 2-脫氧-D-(14C)葡萄糖的Krebs-Ringer磷酸鹽（KRP)緩沖液（15mM Hepes，pH 7. 4, 118mM NaCl, 4. 8mM KC1, 1. 2mM MgS04, 1. 3mM CaCl2, 1. 2mMKH2P04, 0? 1% BSA)中孵育 1 小時(shí)。通過在含有ImM 2-脫氧-D-(14C)葡萄糖的Krebs-Ringer重碳酸鹽Afepes (KRBH) 緩沖液中孵育選擇的孔確定非特異結(jié)合。通過向細(xì)胞加入20 ii M細(xì)胞松弛素B中止反應(yīng)， 使用液體閃爍計(jì)數(shù)器測量葡萄糖攝取。
[0093] 基本遵循如上所述的操作程序，在3T3-L1-0 Klotho成纖維細(xì)胞的葡萄糖攝取測 定法中，SEQ ID N0:5的FGF21蛋白的同源二聚體的體外效力（EC5Q)測定為0. 070nM。
[0094] 實(shí)施例3
[0095] 人 293 細(xì)朐 13 Klotho-SRE luc 測定法
[0096] 293- 0 Klotho-SRE luc 報(bào)告細(xì)胞的構(gòu)建：
[0097]HEK293細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞）培養(yǎng)在37°C，5% 0)2下、含有10%胎牛血清（FBS)的 Dulbecco' s modified Eagle's的生長培養(yǎng)基（GM)中。用含有CMV啟動子驅(qū)動的人PKlotho 表達(dá)盒的質(zhì)粒和含有血清反應(yīng)元件（SRE)驅(qū)動的熒光素酶表達(dá)盒的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 3 Klotho表達(dá)質(zhì)粒還含有SV40啟動子驅(qū)動的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)盒，以賦予對氨基糖 苷類抗生素G418的抗性。用600 ii g/mL G418選擇轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞，以選擇其中轉(zhuǎn)染 的質(zhì)粒被整合至基因組的細(xì)胞。選擇的細(xì)胞被稀釋克隆，并在添加FGF21 24小時(shí)后測試熒 光素酶產(chǎn)量的增加。選擇具有最大FGF21依賴的熒光素酶增加的克隆作為用于測量相對 FGF21蛋白活性的細(xì)胞系。
[0098] 293-PKlotho-SRE luc FGF21 活性測定法：
[0099] 漂洗 293- 0 Klotho-SRE luc 細(xì)胞，將其置于 CD293 懸浮培養(yǎng)基中（Invitrogen)。 在37°C，6% C02,125rpm下、細(xì)胞在懸浮液中過夜生長。計(jì)數(shù)細(xì)胞、通過離心沉淀、并重懸 于含有0. 1 % BSA的⑶293培養(yǎng)基中。以每孔25, 000個(gè)細(xì)胞將細(xì)胞放置于白色96孔平 板。在⑶293/0. 1% BSA中制備各FGF21蛋白的四倍系列稀釋液，以生成終濃度從100nM至 0. 006nM的8個(gè)稀釋液。一式三份將稀釋液加入細(xì)胞中，在37°C，5% C02下孵育16-20小 時(shí)。通過加入等體積OneGlo?熒光素酶底物（Promega)并測量相對發(fā)光測定熒光素酶水 平。使用四參數(shù)logistic模型（XLfit版本5.1)分析數(shù)據(jù)，以擬合曲線并確定EC 5(i。
[0100] 基本遵循如上所述的操作程序，在人293細(xì)胞0 Klotho-SRE luc測定法中，SEQ ID N0:5的FGF21蛋白的同源二聚體的體外效力（EC5Q)測定為0. 51nM。
[0101] 實(shí)施例4
[0102] 物理穩(wěn)定件
[0103] R175和E180的表汰異質(zhì)件
[0104] 生產(chǎn)均質(zhì)的蛋白產(chǎn)物是理想的由于這更好地保證一致的和良好表征的產(chǎn)物。為了 評估產(chǎn)物異質(zhì)性，10 yL樣品的等分試樣與90 iiL DPBS混合。使用以下條件通過液體層析 質(zhì)譜法（LC 一 MS)分析樣品：流動相A為0. 05% TFA，流動相B為0. 04% TFA的乙腈溶液， 柱是PLRPS 2. IX 50mm柱，注射體積是15 ii L。
[0105] 表1 :液體層析分離的梯度條件
【權(quán)利要求】
1. 成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21)蛋白的同源二聚體，其中氨基酸序列由與第二多肽 融合的第一多肽組成，其中第一多肽包含IgG4Fc部分，第二多肽包含具有SEQ ID N0:1的 氨基酸序列的FGF21蛋白質(zhì)，且其中第一多肽的C-末端通過接頭與第二多肽的N-末端融 合。
2. 權(quán)利要求1的同源二聚體，其中IgG4Fc部分的氨基酸序列是SEQ ID NO :14。
3. 權(quán)利要求1或2的同源二聚體，其中接頭的氨基酸序列是SEQ ID NO : 11。
4. 權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的同源二聚體，其中氨基酸序列是 ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS LGGGGGSGGGGSGGGGSAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKALK PGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPLHLP⑶KSPHRKPAPRGPARF LPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRSPSFE(SEQ ID N0：5).
5. 權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的同源二聚體，其中蛋白質(zhì)的IgG4Fc部分是糖基化的。
6. 編碼多肽的DNA分子，其中多肽的氨基酸序列是SEQ ID N0:5。
7. 用權(quán)利要求6的DNA分子轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠表達(dá)同源二聚體， 其中所述同源二聚體的每條多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO :5。
8. 用于生產(chǎn)同源二聚體的方法，其中所述同源二聚體的每條多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO :5,所述方法包括步驟： i) 在使得所述多肽序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)包含多核苷酸的哺乳動物宿主細(xì)胞，所述 多核苷酸編碼具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽；和 ii) 從所述宿主細(xì)胞回收同源二聚體，其中每條多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO:5。
9. 由權(quán)利要求8的方法生產(chǎn)的同源二聚體。
10. 包含權(quán)利要求1至5或權(quán)利要求9中任一項(xiàng)的同源二聚體和至少一種可藥用的載 體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
11. 治療2型糖尿病、肥胖、異常脂血癥和/或代謝綜合征的方法，包括向有需要的患者 施用權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)或權(quán)利要求9的同源二聚體。
12. 權(quán)利要求1至5或權(quán)利要求9中任一項(xiàng)的同源二聚體，所述同源二聚體用于治療。
13. 權(quán)利要求1至5或權(quán)利要求9中任一項(xiàng)的同源二聚體，所述同源二聚體用于治療2 型糖尿病、肥胖、異常脂血癥和/或代謝綜合征。
【文檔編號】A61K38/18GK104394882SQ201380030788
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月11日
【發(fā)明者】R·J·達(dá)林, C·D·迪金森, D·A·德賴弗, M·D·貢西亞茨 申請人:伊萊利利公司