包含至少兩個不同靶向實體的定制選擇性和多特異性治療分子的方法及其用途

文檔序號：1294217閱讀：345來源：國知局

包含至少兩個不同靶向實體的定制選擇性和多特異性治療分子的方法及其用途
【專利摘要】本文報道了用于確定抗原結合位點的組合的方法，其包括以下步驟(i)確定大群雙特異性抗體的結合特異性和/或親和力和/或效應功能和/或體內(nèi)半衰期，通過組合第一大群抗體Fab片段或scFv抗體片段的每個成員與第二大群抗體Fab片段或scFv抗體片段的每個成員，以及在其末端之一包含第一個結合對的第二個成員并在各自另一末端包含第二個結合對的第二個成員的接頭來制備所述雙特異性抗體，由此第一大群特異性結合第一個細胞表面分子并且第二大群特異性結合第二個細胞表面分子，和(ii)選擇具有合適的結合特異性和/或親和力和/或效應功能和/或體內(nèi)半衰期的雙特異性抗體并由此確定抗原結合位點的組合。
【專利說明】包含至少兩個不同祀向實體的定制選擇性和多特異性治療分子的方法及其用途
[0001] 本文報道了用于選擇和產(chǎn)生由多膚-多核巧酸-復合體制備的多特異性治療分子的方法，其中根據(jù)治療祀標的表型選擇所述治療分子的特異性。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在過去的幾年里，已經(jīng)開發(fā)并臨床測試了多種腫瘤特異性治療蛋白質，包括細胞表面受體的抗體、抗體片段和配體。已經(jīng)將該些治療蛋白質綴合到若干種類的治療毒素上，如小分子藥物、酶、放射性同位素、蛋白毒素和用于向患者特定遞送的其他毒素。
[0004] 向疾病位點有效遞送是任何治療分子高效和低毒的前提。例如，抗體可W參與到該背景中。如果抗體本身不是治療性的，那么藥物綴合到抗體上使得可W實現(xiàn)藥物在人體內(nèi)想要位點上完美定位。該增加了該祀?yún)^(qū)域內(nèi)有效藥物的濃度，由此優(yōu)化治療劑的治療效果。此外，利用祀向遞送，臨床醫(yī)師能夠降低治療劑的劑量-如果藥物有效負荷具有相關毒性或如果待用于治療慢性狀況，該是特別相關的事情（參見例如McCarron，P.A.，等，Mol. Interventions 5 (2005)368-380)〇
[0005] 例如在WO 2004/081051中報道了雙特異性抗體的產(chǎn)生。已經(jīng)設計并開發(fā) 了廣譜的雙特異性抗體形式（參見例如Fischer, N.和Leger，0.，化thobiology 74(2007)3-14)。馨合的重組抗體（CRAbs)最初由 Neri，D.，等（Neri，D.，等，J. Mol. Biol. 246 (1995) 367-373)報道。Wri曲和 Deonarain，M.P. (Mole州lar Immunology 44(2007)2860 - 2869)報道了用于產(chǎn)生馨合重組抗體的瞻菌體展示文庫。
[000引用于碑1向藥物遞送的分子載體由Backer, M. V.，等，Biocon化gate 化em. 13(2002)462-467報道。WO 2010/118169報道了具有受控的血清藥物動力學的人蛋白質支架。在W0 2009/105671中報道了與具有C末端元件的膚和蛋白質相關的方法和組合物。在W0 2007/038658中，報道了抗體-藥物綴合物和使用方法。在W0 2004/062602 中報道了用于祀向生物遞送分子載體的組合物和方法。在W0 2002/072141中報道了祀向配體。
[0007] 在W0 2009/037659中報道了小實體的磁力檢測。在W0 2006/137932中報道了同質分析物檢測。在US 2008/0044834中報道了用于檢測大分子和其他分析物的H組分生物傳感器。在W0 95/05399中報道了雙特異性試劑的設計和合成。
[0008] 在US 2002/051986中報道了通過核酸報告物檢測分析物的方法。在W0 95/05399 中報道了通過使用雙鏈DNA作為化學和空間限定的交聯(lián)劑設計并合成雙特異性試劑。
[0009] Gos址e, H.，等報道了 kDNA作為分子標簽的應用（Nucl. Acids Symp. Ser. 49 (200巧 261-262。兩親性螺旋（amphi地atic helices)在大腸桿菌巧.coli) 中產(chǎn)生具有高親合力的功能性柔性連接的二聚Fv片段的用途由化ck，P.，等 (Biochem. 31 (1992) 1579-1584)報道。Kostelny，S. A.，等報道了通過使用亮氨酸拉鏈形成雙特異性抗體（J. Immunol. 148(1992) 1547-1553)。組合兩種特異性的具有親合力的二聚雙特異性微抗體由 Muller, K.M.，等（陽BS Lett. 432(1998)45-49)報道。Goldenberg，D.M.，等報道了通過用于改善的癌成像的dock-and-lock方法和通過預先祀向的療法產(chǎn)生多功能性抗體（J. Nuc. Med. 49 (2008) 158-163)。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本文報道了提供定制的高度特異的多特異性治療分子用于在需要治療的患者中治療疾病，如癌癥的方法，由此所述治療分子適合患者的疾病特征和/或患者的基因型/表型。
[0012] 通過考慮患者攜帶疾病/受影響細胞的基因型/表型制備定制分子實現(xiàn)該種適合。
[0013] 在第一步中，確定旨在利用治療分子祀向的細胞的基因型/表型（疾病特異性細胞表面抗原的存在和數(shù)目/數(shù)量）。該例如通過細胞成像技術，如使用英光標記的單特異性 (治療性或診斷性）抗體對來自例如血液和/或活組織檢查材料的患者細胞免疫組織化學染色（IHC，免疫組織化學）來實現(xiàn)?；蛘撸蒞在利用標記的治療或診斷抗體染色后使用基于FACS的方法分析細胞的基因型/表型。體內(nèi)成像技術，包括光學成像、分子成像、英光成像、生物發(fā)光成像、MRI、陽T、SPECT、CT和活體顯微鏡檢查也可W用于確定患者的疾病相關細胞的基因型/表型。根據(jù)患者的疾病相關細胞確定的基因型/表型，祀向/結合實體的定制組合可W是/被選擇并且組合在治療分子中。該治療分子可W是例如雙特異性抗體。
[0014] 此類定制的治療分子i)將是高度特異的，ii)將具有好的功效，并且iii)與常規(guī) 選擇的治療劑相比將誘導較少的副作用。該可W通過提供具有改善的祀向和/或改善的定制遞送性質，例如對其預期的作用位點上的治療有效負荷的治療分子來實現(xiàn)。
[0015] 可W通過祀向治療分子與常規(guī)選擇的治療分子相比較高的/增加的選擇性和/或特異性來實現(xiàn)向其作用位點，如例如癌細胞實現(xiàn)改善遞送治療分子。治療分子包含至少兩個實體，其特異性結合不同的抗原（例如兩個不同的表面標志物）或同一抗原上的不同表位（例如同一表面標志物上的兩個不同的表位）。
[0016] 可W通過兩個祀向實體同時結合其各自的祀標/表位實現(xiàn)定制治療分子的增加的選擇性和/或特異性，即通過親合力作用來實現(xiàn)。尤其適合的是對其各自的祀標/表位具有低親和力到中等親和力的兩個結合實體的組合。此外，脫祀結合被極大地減少或甚至可W被完全消除。
[0017] 結合特異性可W由形成多特異性治療分子的初始組分分別提供。因此，可W簡單地通過確定細胞，例如癌細胞上存在的表面標志物，將特異性結合該些表面標志物的各結合實體，如抗體片段綴合到核酸上并通過接頭核巧酸將該些連接起來，來定制多特異性治療分子，如雙特異性抗體。
[0018] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，為了祀向遞送效應部分，包含多膚和多核巧酸組分的復合體尤其有用。復合體的效應部分、多膚組分和多核巧酸接頭彼此非共價結合。該允許模塊產(chǎn)生復合體的各組分。由于復合體的模塊結構，可W在不需要改變復合體的其他組分的情況下改變各個組分。該允許容易且有效地裝配大量復合體變體，例如用于提供該樣的文庫，基于所述文庫可W選擇定制的高度特異的多特異性治療分子。
[0019] 如本文報道的一方面是用于從結合實體的集合/文庫中選擇至少兩個結合實體用作治療劑的方法，通過溫育W下物質在單個多特異性結合分子中裝配所述結合實體：(a) 各自包含或綴合第一個結合對的第一個配偶體或成員的抗體Fab片段或scFv抗體片段，由此F油片段或scFv特異性結合第一種細胞表面標志物或第一種細胞表面標志物的第一個表位，（b)各自包含或綴合第二個結合對的第一個配偶體或成員的抗體Fab片段或scFv抗體片段，由此Fab片段或scFv抗體片段特異性結合第二種細胞表面標志物或第一種細胞表面標志物的第二個表位，和（C)在其末端之一包含第一個結合對的第二個成員并在各自另一末端包含第二個結合對的第二個成員的接頭。該物質具有改善的祀向/遞送性質。
[0020] 如本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生多特異性結合分子的方法，其包括W下步驟：
[0021] (i)確定在含有細胞的樣品中存在的細胞表面標志物和i)選擇其至少第一種細胞表面標志物和任選地第二種細胞表面標志物，或ii)選擇其對應于多特異性結合分子的許多結合特異性的大量細胞表面標志物，
[002引扣）溫育（a)各自包含結合對的第一個配偶體或成員的大量結合實體，由此每個結合實體特異性結合不同的細胞表面標志物或其配體或同一細胞表面標志物的表位，由此結合對的各自第一個配偶體或成員僅結合其對應的第二個配偶體或成員而不結合結合對的任何其他第二個配偶體或成員，和化）包含結合對的對應第二個成員的接頭，
[0023] 并由此產(chǎn)生多特異性結合分子。
[0024] 如本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，其包括W下步驟：
[00巧](i)確定樣品中細胞表面上存在的細胞表面標志物并選擇其第一種表面標志物和第二種表面標志物，
[0026] (ii)溫育（a)包含或綴合第一個結合對的第一個配偶體或成員的抗體F油片段或scFv抗體，由此F油片段或scFv特異性結合第一種細胞表面標志物，化）包含或綴合第二個結合對的第一個配偶體或成員的抗體Fab片段或scFv抗體片段，由此Fab片段或scFv 抗體片段特異性結合第二種細胞表面標志物，和（C)在其末端之一包含第一個結合對的第二個成員并在各自另一末端包含第二個結合對的第二個成員的接頭，
[0027] 并由此產(chǎn)生雙特異性抗體.
[0028] 如本文報道的一個方面是用于確定多特異性結合分子的結合實體的組合的方法，其包括W下步驟
[0029] (i)確定大量多特異性結合分子的結合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或效應功能和/或體內(nèi)半衰期，由此在大量多特異性結合分子中包含結合實體的每個（可能）組合，
[0030] 和
[0031] (ii)選擇具有合適的結合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或效應功能和/ 或體內(nèi)半衰期的多特異性結合分子并由此確定抗原結合實體的組合。
[0032] 如本文報道的一個方面是用于確定抗原結合位點的組合的方法，其包括W下步驟：
[0033] (i)確定大量雙特異性抗體的結合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或效應功能和/或體內(nèi)半衰期，通過組合包含或綴合第一個結合對的第一個成員的第一大群抗體 Fab片段或scFv抗體片段的每個成員與包含或綴合第二個結合對的第一個成員的第二大群抗體Fab片段或scFv抗體片段的每個成員W及在其末端之一包含第一個結合對的第二個成員并在各自另一末端包含第二個結合對的第二個成員的接頭來制備所述雙特異性抗體，
[0034] 由此第一大群特異性結合第一種細胞表面標志物并且第二大群特異性結合第二種細胞表面標志物，
[00巧]和
[0036] (ii)選擇具有合適的結合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或效應功能和/ 或體內(nèi)半衰期的雙特異性抗體并由此確定抗原結合位點的組合。
[0037] 如本文報道的一個方面是雙特異性抗體，其包含
[0038] a)第一個F油片段或scFv抗體片段
[003引 U其特異性結合第一種表面標志物，并且
[0040] ii)其綴合第一個結合對的第一個成員，
[0041] b)第二個F油片段或scFv抗體片段
[0042] i)其特異性結合第二種表面標志物，并且
[0043] ii)其綴合第二個結合對的第一個成員，和
[0044] C)對映體DNA多核巧酸接頭
[0045] i)其綴合第一個結合對的第二個成員，并且
[0046] ii)其綴合第二個結合對的第二個成員，
[0047] 由此第一個和第二個F油片段或scFv抗體片段形成非共價復合體。
[0048] W下是如本文報道的所有方面的實施方案。因此指出，每個實施方案可W與每個方面組合并且還可W與如本文給出的所有其他各實施方案組合。
[0049] 在一個實施方案中，結合實體彼此獨立地選自基于da巧in結構域的結合實體、基于anticalin結構域的結合實體、T細胞受體片段像基于scTCR結構域的結合實體、基于駱駝VH結構域的結合實體、基于第十個纖連蛋白3結構域的結合實體、基于結合膊糖蛋白結構域的結合實體、基于巧粘蛋白結構域的結合實體、基于ICAM結構域的結合實體、基于肌聯(lián)蛋白結構域的結合實體、基于GCSF-R結構域的結合實體、基于細胞因子受體結構域的結合實體、基于糖巧酶抑制劑結構域的結合實體、基于超氧化物歧化酶結構域的結合實體或抗體片段（F油或scFv片段）。
[0050] 在所有方面的一個實施方案中，多特異性結合分子是雙特異性抗體，或第一個和第二個結合實體彼此獨立地是抗體片段。
[0051] 在一個實施方案中，抗體片段選自F油、F油'、F油'-SH、F(油'）2、雙抗體、線性抗體、scFv、scF油S 和 dsFvSo
[0052] 在一個實施方案中，包含效應部分、結合特異性和多核巧酸接頭的雙特異性抗體的至少兩個組分彼此非共價結合。
[0053] 在一個實施方案中，結合實體選自抗體、抗體片段、受體、受體配體和祀標結合支架，條件是所述受體配體不是腸促膜島素受體配體多膚。
[0054] 在一個實施方案中，抗體片段選自F油、F油'、F油'-SH、F (油'）2、雙抗體、線性抗體、scFv、scF油S 和 dsFvSo
[0055] 在一個實施方案中，祀標結合支架選自da巧ins、血紅素蛋白樣分子和 anticalins。
[0056] 在一個實施方案中，受體選自T細胞受體片段和scTCR。
[0057] 在一個實施方案中，多特異性結合分子是復合體，其包含
[0058] a)第一個結合實體
[0059] i)其特異性結合第一種細胞表面標志物或其配體，并且
[0060] ii)其綴合第一個結合對的第一個成員，
[0061] a)第二個結合實體
[0062] i)其特異性結合第二種細胞表面標志物或其配體，并且
[0063] ii)其綴合第二個結合對的第一個成員，和
[0064] C)多核巧酸接頭
[0065] i)其綴合第一個結合對的第二個成員，并且
[0066] ii)其綴合第二個結合對的第二個成員。
[0067] 在一個實施方案中，雙特異性抗體是復合體，其包含
[0068] a)第一個F油片段或scFv抗體片段
[006引 U其特異性結合第一種細胞表面標志物，并且
[0070] ii)其綴合第一個結合對的第一個成員，
[0071] b)第二個F油片段或scFv抗體片段
[0072] i)其特異性結合第二種細胞表面標志物，并且
[0073] ii)其綴合第二個結合對的第一個成員，和
[0074] C)多核巧酸接頭
[00巧]i)其綴合第一個結合對的第二個成員，并且
[0076] ii)其綴合第二個結合對的第二個成員。
[0077] 在一個實施方案中，復合體是非共價復合體。
[0078] 在一個實施方案中，復合體還包含其他多膚i)其特異性結合第二個祀標，并且 ii)其綴合第二個結合對的第一個成員，并且多核巧酸接頭綴合第二個結合對的第二個成員。
[0079] 在一個實施方案中，復合體還包含效應部分，其綴合與多核巧酸接頭的至少一部分互補的多核巧酸。
[0080] 在一個實施方案中，復合體還包含綴合多核巧酸的效應部分，所述多核巧酸i)與綴合第一個或第二個結合實體或Fab片段或scFv抗體片段的多核巧酸的至少一部分互補并且ii)不與多核巧酸接頭互補。
[0081] 在一個實施方案中，第一個和第二個結合實體或F油片段或scFv抗體片段結合同一個祀標和其上的非重疊表位。
[0082] 在一個實施方案中，多核巧酸接頭包含8、10、15、20、25、50、100個核巧酸。在一個實施方案中，多核巧酸接頭包含高達500、750、1000或2000個核巧酸。在一個實施方案中，多核巧酸接頭包含10-500個核巧酸。
[0083] 在一個實施方案中，多核巧酸接頭是對映體DNA。在一個實施方案中，對映體DNA 是kDNA。在一個實施方案中，kDNA是單鏈kDNA (ssA-DNA)。
[0084] 在一個實施方案中，效應部分選自結合部分、標記部分和生物活性部分。
[0085] 在一個實施方案中，多核巧酸接頭在其第一個或第二個末端綴合結合實體、Fab片段或scFv抗體片段。
[0086] 在一個實施方案中，多核巧酸接頭綴合兩個結合對的兩個第二個成員，由此第一個結合對的第二個成員綴合多核巧酸接頭的第一個末端并且第二個結合對的第二個成員綴合多核巧酸接頭的第二個末端。
[0087] 在一個實施方案中，第一個結合對的第一個和第二個成員分別包含SEQ ID NO:05 和SEQ ID NO:08的核酸序列。
[0088] 在一個實施方案中，第二個結合對的第一個和第二個成員分別包含SEQ ID NO:06 和SEQ ID NO:07的核酸序列。
[0089] 在一個實施方案中，所述方法包括W下步驟：
[0090] a)合成第一個結合實體或Fab片段或scFv抗體片段，其特異性結合第一種細胞表面標志物或其配體并且其綴合第一個結合對的第一個成員，
[0091] b)合成第二個結合實體或Fab片段或scFv抗體片段，其特異性結合第二種細胞表面標志物或其配體并且其綴合第二個結合對的第一個成員，
[0092] C)合成多核巧酸接頭，其綴合第一個結合對的第二個成員并且其綴合第二個結合對的第二個成員，和
[0093] d)通過組合合成的組分形成復合體。
[0094] 如本文報道的另一方面是包含如本文報道的多特異性結合分子或雙特異性抗體和任選地藥學上可接受的載體的藥物制劑。
[0095] 如本文報道的其他方面是如本文報道的多特異性結合分子或雙特異性抗體用作藥物。
[0096] 同樣，如本文報道的方面是如本文報道的多特異性結合分子或雙特異性抗體用于治療癌癥。
[0097] 如本文報道的另一方面是如本文報道的多特異性結合分子或雙特異性抗體在制造藥物中的用途。
[0098] 在一個實施方案中，藥物用于治療癌癥。
[0099] 如本文報道的方面是治療患有癌癥的個體的方法，其包括向所述個體施用有效量的如本文報道的多特異性結合分子或雙特異性抗體。
[0100] 發(fā)明詳述
[0101] I.定義
[0102] 冠詞"a"和"an"在本文中用于指冠詞的語法對象之一或多于一個（即至少一個）。例如，"抗體"表示一個抗體或多于一個抗體。
[0103] "受體人構架"是包含來自如下文定義的人免疫球蛋白構架或人共有構架的輕鏈可變域（VU構架或重鏈可變域（VH)構架的氨基酸序列的構架。"來自"人免疫球蛋白構架或人共有構架的受體人構架可W包含相同的氨基酸序列，或者它可W含有氨基酸序列變化。在一些實施方案中，氨基酸變化的數(shù)目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些實施方案中，化受體人構架與化人免疫球蛋白構架序列或人共有構架序列在序列上相同。
[0104] 術語"親和力"表示分子（例如多膚或抗體）的單個結合位點與其結合配偶體（例如祀標或抗原）之間非共價相互作用的總強度。除非另有說明，如本文所用，"結合親和力" 指內(nèi)在結合親和力，其反映結合對的成員之間（例如多膚-多核巧酸-復合體中，或多膚與其祀標之間，或抗體與其抗原之間）的1 ;1相互作用。一般可W通過解離常數(shù)化的代表分子X對其配偶體Y的親和力。可W通過本領域已知的常用方法，如表面等離振子共振，也包括本文報道的那些方法測定親和力。
[0105] "親和力成熟的"抗體指在一個或多個高變區(qū)（HVRs)中具有一個或多個改變的抗體，與不擁有此類改變的親本抗體相比，此類改變導致該抗體對抗原的親和力改善。
[0106] 術語"籠住的"表示效應物被在血清和體液中具有受控的半衰期的保護基團保護。可W通過內(nèi)源酶酶促切割保護基團。可W由通過注射外部施用或經(jīng)口腔給藥的第二個效應物，如抗壞血酸去除、切割、降解、酶促消化或代謝保護基團?？蒞通過體液中天然存在的酶激活籠住的效應分子?？蒞通過體液中同樣存在的還原劑，如抗壞血酸激活籠住的效應部分。
[0107] 術語"效應部分"表示任何分子或分子組合，期望所述分子的活性向細胞遞送和/ 或定位在細胞中。效應部分包括，但不限于標記、細胞毒素（例如假單胞菌外毒素、籬麻蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素等）、酶、生長因子、轉錄因子、藥物、放射性核素、配體、抗體、抗體化區(qū)、脂質體、毫微粒、病毒顆粒、細胞因子等。
[010引本文中的術語"抗體最廣義使用，并且包括多種抗體結構，包括但不限于單克隆抗體和抗體片段，只要它們展現(xiàn)出想要的抗原結合活性。
[0109] 術語"抗體片段"表示完整或全長抗體的片段，其保留特異性結合抗原的能力?？贵w片段的實例包括但不限于Fv、FAB、FAB'、FAB' -SH、F(油'）2 ;雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子（例如scFv)。對于某些抗體片段的綜述，參見化dson，P. J.，等，化t. Med. 9 (2003) 129-134。更詳細地，術語"抗體片段"包括的是（i) FAB片段，即由化、VHXL和 CH1結構域組成的單價抗體片段（對于包含挽救受體結合表位殘基并具有增加的體內(nèi)半衰期的FAB和F(ab'）2片段的討論，參見US 5,869,046)，（U)F(ab'）2片段，即包含在較鏈區(qū) 通過二硫鍵連接的兩個FAB片段的二價片段，（iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段，（iv) 由抗體單條臂的化和VH結構域組成的Fv片段（參見例如Plueckthun，The化armacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 和 Moore (編牽茸），（Springer-Verlag, 爬訊￥〇'10，（1994)第 269-315 頁，胖0 93/16185、口5 5,571，894、口55,587,458)，（￥)(^6片段 (參見例如Ward, E.S.，等，化Uire 341 (1989) 544-546)，其由VH結構域組成，和（vi)分離的互補決定區(qū)（CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個結構域化和VH由分別的基因編碼，但是可 W使用重組方法通過使得它們能夠被制備成單條蛋白質鏈（其中化和VH區(qū)配對形成單價分子，稱為單鏈 Fv (scFv)，參見例如 Bird,化 E.，等，Science 242 (1988) 423-426 ;Huston, J.S.，等，Proc.化tl. Acad. Sci. USA 85(1988)5879-5883)的合成接頭將它們連接起來?？?W使用本領域技術人員已知的常規(guī)技術獲得該些抗體片段并且可與完整抗體相同的方式篩選其結合性質。
[0110] 與參照抗體"結合相同表位的抗體"指該樣的抗體，其在競爭測定中阻斷參照抗體結合其抗原50%或更多，并且反過來，參照抗體在競爭測定中阻斷抗體結合其抗原50%或更多。
[0111] 術語"嵌合"抗體指其中重鏈和/或輕鏈的部分來自特定的來源或物種，而重鏈和 /或輕鏈的剩余部分來自不同來源或物種的抗體。
[0112] 抗體的"種類"指其重鏈擁有的恒定域或恒定區(qū)的類型。有5大類抗體；IgA、I曲、 I班、IgG和IgM，并且該些中的幾種可W進一步分成亞類（同種型），例如，IgGi、IgG2、IgGs、 IgG4、IgAi和IgA2。對應于不同種類免疫球蛋白的重鏈恒定域分別稱為a、5、e、y和y。
[0113] "化學治療劑"是用于治療癌癥的化學化合物。化學治療劑的實例包括焼化齊U，如喔替派和環(huán)磯醜胺（CYTOXAN?);焼基賴酸鹽，如白消安、二丙胺賴醋和脈泊舒凡；氮丙巧類，如benzodopa、卡波釀、me1:uredopa和uredopa ;己帰亞胺類和甲基戊胺類，包括六甲蜜胺、H亞胺嗦、H亞己基磯醜胺、H亞己基硫化磯醜胺和H甲基H聚氯胺 (trimethylomelamine);氮芥，如苯下酸氮芥、蔡氮芥、氯磯醜胺、雌氮芥、異環(huán)磯醜胺、氮芥、氧氮芥氨氯化物、美法倉、新氮芥、膽留醇對苯己酸氮芥、潑尼莫司汀、曲磯胺、尿嚼巧氮芥；硝基脈，如卡莫司汀、氯脈菌素、福莫司汀、環(huán)己亞硝脈、尼莫司汀、雷莫司??；抗生素，如阿克拉霉素、放線菌素、奧萊霉素、偶氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素、加利車霉素、car油icin、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔紅霉素、地巧比星、6-重氮基-5-氧-心正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酷酸、諾加霉素、橄攬霉素、培來霉素、potfiromycin、嘿嶺霉素、H鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈脈菌素、殺結核菌素、烏苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代謝物，如氨甲噪嶺和 5-氣尿嚼巧巧-FU);葉酸類似物，如二甲葉酸、氨甲噪嶺、蝶羅嶺、曲美沙特；嘿嶺類似物，如氣達拉濱、6-琉基嘿嶺、硫咪嘿嶺、硫鳥嘿嶺；嚼巧類似物，如環(huán)胞巧、阿扎胞巧、6-阿扎尿巧、卡莫氣、阿糖胞巧、二脫氧尿巧、去氧氣尿巧、依諾他濱、氣尿巧、5-FU;雄激素，卡普睪麗、丙酸甲雄焼麗、環(huán)硫雄醇、美雄焼、睪內(nèi)醋；抗腎上腺素，如氨魯米特、米巧坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，如亞葉酸；醋葡酵內(nèi)醋；酵磯醜胺糖巧；氨基麗戊酸；胺苯嚇巧；bestrabucil ; 必?？?；伊達曲殺；defofamine ;地美可辛；地嚇釀；elfornithine ;依利醋饋；依巧格魯；硝酸嫁；輕基脈；香茹多糖；氯尼達明；米巧脈蹤；米巧意釀；單脈潘生下；硝氨丙嚇巧；噴司他下通氨氮芥；化喃阿霉素；鬼日酸己脫；2-己基醜脫；甲基予脫；PSK?;丙亞胺巧佐喃；錯螺胺；替奴佐酸；H亞胺釀；2, 2'，2"-H氯H己胺；烏拉坦；長春地辛；氮帰咪胺；甘露莫司??；二漠甘露醇；二漠衛(wèi)矛醇；脈泊漠焼；gawtosine ;阿糖胞巧廣Ara-C");環(huán)磯醜胺；喔替派；紫杉焼類，例如紫杉醇（TAXOL⑥，Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton'NJ)和多西他賽（TAXOTERE?,Mi6ne-Poulenc Rorer,Antony,Rrance); 苯下酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘿嶺；琉嘿嶺；氨甲噪嶺；笛類似物，如順笛和碳笛；長春堿；笛；依巧泊巧（VP-16);異環(huán)磯醜胺；絲裂霉素 C ;米巧意釀；長春新堿；長春帰堿；諾維本；諾消靈；替尼泊巧；道諾霉素；氨基蝶嶺；希羅達；伊班麟酸鹽；CPT-II ;35拓撲異構酶抑制劑RFS 2000 ;二氣甲基鳥氨酸值MF0);視黃酸；埃斯波霉素；卡培他濱；和上述任何藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。該定義中還包括抗激素劑，其作用于調(diào)節(jié)或抑制激素在腫瘤上的作用，如抗雌激素，包括例如H苯氧胺、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4 (5)-咪哇類、4-輕H 苯氧胺、曲沃昔芬、雷洛西芬、LY117018、奧那司麗和巧瑞米芬（法樂通）；和抗雄激素，如氣他胺、尼魯米特、比卡魯胺、己酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任何藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。
[0114] "抗血管發(fā)生劑"指在一定程度上阻斷或干擾血管發(fā)育的化合物?？寡馨l(fā)生劑例如可W是小分子或抗體，其結合參與促進血管發(fā)生的生長因子或生長因子受體。在一個實施方案中，抗血管發(fā)生因子是結合血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)的抗體。
[0115] 術語"細胞因子"是用于由作為細胞間介導物作用于另一細胞上的一個細胞群體釋放的蛋白質的總稱。此類細胞因子的實例是淋己因子、單核因子和常規(guī)的多膚激素。細胞因子中包括的是生長激素，如人生長激素、N-甲硫氨醜基人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；膜島素；膜島素原；恥骨松弛激素；恥骨松弛激素原；糖蛋白激素，如促卵胞激素（FSH)、促甲狀腺激素（TSH)和促黃體生成激素（LH);肝生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-a和-P ;mullerian抑制物質；小鼠絨促性素相關膚；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素（TPO);神經(jīng) 生長因子，如NGF-P ;血小板生長因子；轉化生長因子（TGFs)，如TGF-a和TGF-P ;膜島素樣生長因子-I和-II ;促紅細胞生成素巧P0);骨誘導因子；干擾素，如干擾素-a、-P和-y ;集落刺激因子（CSFs)，如集落刺激因子-CSF (M-CS巧；粒細胞-巨瞻細胞-CSF佑M-CS巧；和粒細胞-CSF佑CS巧；白細胞介素（ILs)，如比-1、比-la、比-2、比-3、比-4、比-5、比-6、比-7、比-8、比-9、比-10、比-II、比-12 ;腫瘤壞死因子，如TNF-a或TNF-P ;和其他多膚因子，包括LIF和kit配體化L)。如本文所用，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質和天然序列細胞因子的生物活性等同物。
[0116] 術語"fMLP"表示由N-甲醜甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸組成的H膚。在一個實施方案中，效應部分是fMLP或其衍生物。
[0117] 術語"患者的表型"表示來自患者的一種細胞中的細胞表面受體的組合物。所述組合物可W是定性的W及定量的組合物。為其確定/給出基因型的細胞可W是單細胞或包含細胞的樣品。
[0118] 術語"前體藥物"指與親本藥物相比對腫瘤細胞的細胞毒性較少并且能夠被酶促激活或轉化成更活躍的親本形式的藥物活性物質的前體或衍生物形式。參見例如Wilman， "Prodrugs in Cancer Chemotherapy"Biochemical Society Transactions,第14卷，615th Meeting Belfast(1986)第 375-382 頁和Stella,等，"Pro 化 ugs:A Qiemical Approach to Targeted Drug Delivery"，Directed Drug DeliveiT'Borchar化，等，（編輯），第 247-267 頁，Humana Press(1985)?？蒞用作效應部分的前體藥物包括，但不限于含磯酸鹽的前體藥物、含硫代磯酸鹽的前體藥物、含硫酸鹽的前體藥物、含膚的前體藥物、D-氨基酸修飾的前體藥物、糖基化的前體藥物、含b-內(nèi)醜胺的前體藥物，任選地取代的含苯氧己醜胺的前體藥物或任選地取代的含苯己醜胺的前體藥物、5-氣胞嚼巧和可W轉化成更具活性的細胞毒性游離藥物的其他5-氣脈嚼巧前體藥物?？蒞衍生成用于本發(fā)明的前體藥物形式的細胞毒素藥物的實例包括，但不限于本文所述的那些化學治療劑。
[0119] 術語"細胞毒性部分"指抑制或防止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括，但不限于放射性同位素（例如，At 2ii、I"i、li25、YW、Rei86、Rei88、Smi 53、Bi2i2、 P32、Pb2i2和Lu的放射性同位素）；化學治療劑或藥物（例如氨甲噪嶺、a化iamicin、長春花生物堿（長春新堿、長春堿、依巧泊巧）、阿霉素、美法侖、絲裂霉素 C、苯下酸氮芥、柔紅霉素或其他嵌入劑）；生長抑制劑；酶及其片段，如溶核酶；抗生素；毒素，如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體；及本文公開的多種抗腫瘤或抗癌劑。
[0120] 物質（例如藥物制劑）的"有效量"指在必需的劑量和時段上有效實現(xiàn)想要的治療或預防結果的量。
[0121] 術語'卞C區(qū)"在本文中用于定義免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)，其含有恒定區(qū)的至少一部分。所述術語包括天然序列化區(qū)和變體化區(qū)。在一個實施方案中，人IgG重鏈化區(qū) 從切s226或從Pro230延伸至重鏈的駿基末端。然而，化區(qū)的C末端賴氨酸（Lys447)可 W存在或缺失。除非本文另有規(guī)定，化區(qū)或恒定區(qū)中氨基酸殘基的編號根據(jù)抓編號系統(tǒng)，也稱為抓索弓I，女口 Kabat,等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, ^tional Institutes of Health, Bethesda，MD(1991)中所述。
[0122] 術語"構架"或"FR"指除高變區(qū)（HVR)殘基W外的可變域殘基?？勺冇虻腇R - 般由四個FR結構域組成；FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般 W W下順序出現(xiàn)；FR1-H1 (L1) -FR2-肥（L2) -FR3-冊（L3) -FR4。
[0123] 術語"全長抗體"、"完整抗體"和"全抗體"在本文中可互換使用，指與天然抗體結構具有基本上類似的結構或具有含有如本文中定義的化區(qū)的重鏈的抗體。該抗體一般包含兩條重鏈和兩條輕鏈。
[0124] "人抗體"是擁有該樣的氨基酸序列的抗體，所述氨基酸序列對應于由人或人細胞產(chǎn)生的或來自利用人抗體所有組成成分或其他人抗體編碼序列的非人來源的抗體的氨基酸序列。人抗體的此定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
[01巧]"人源化"抗體指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體會包含至少一個，通常兩個基本上整個可變域，其中所有或基本上所有HVR (例如CDR)對應于非人抗體的那些，且所有或基本上所有FR對應于人抗體的那些。任選地，人源化抗體可W包含來自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少一部分?？?體，例如非人抗體的"人源化形式"指已經(jīng)經(jīng)歷人源化的抗體。
[0126] 如本文所用的術語"高變區(qū)"或"HVR"指抗體可變域中在序列上高變的和/或形成結構上限定的環(huán)（"高變環(huán)"）的每個區(qū)。一般地，天然的4鏈抗體包含6個HVR;H個在 VH中化1、H2、H3)，且H個在化中（L1、12、13)。HVR -般包含來自高變環(huán)和/或來自 "互補決定區(qū)"(CDR)的氨基酸殘基，后一種具有最高序列變異性和/或參與抗原識別。示例性高變環(huán)存在于氨基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (肥）和 96-101化3)上（參見 Chothia，C.和 Lesk，A.M.，J. Mol. Biol. 196(1987)901-917)。示例性 CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-Hl、CDR-肥和 CDR-冊）存在于 LI 的氨基酸殘基 24-34、 L2 的 50-56、L3 的 89-97、HI 的 31-35B、肥的 50-65 和冊的 95-102 上（參見 K油at,等， Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 片反 Public Health Service, P^Jational Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))。除了 VH 中的 CDRl 夕h, CDR -般包含形成高變環(huán)的氨基酸殘基。CDR還包含"特異性決定殘基"或"SDR",其是接觸抗原的殘基。SDR包含在稱為縮短的CDR或CDR的CDR的區(qū)內(nèi)。示例性a-CDR(a-CDR-Ll、a-CDR-L2、 3--〔01?-1^3、3-〔01?-化、3-〔01?-肥和3-〔01?-冊）存在于1^的氨基酸殘基31-34、1^2的 50-55、 L3 的 89-96、Hl 的 31-35B、肥的 50-58 和冊的 95-102 上（參見 Almagro, J. C.和化ansson, J.，化ont.Biosci. 13(2008) 1619-1633)。除非另有說明，可變域中的HVR殘基和其他殘基 (例如，F(xiàn)R殘基）在本文中根據(jù)K油at等，上文編號。
[0127] "免疫綴合物"是綴合到一個或多個非抗體來源分子，包括但不限于結合對的成員、核酸或效應部分上的抗體或抗體片段。
[012引"個體"或"受試者"是哺乳動物。哺乳動物包括，但不限于家養(yǎng)動物（例如，奶牛、羊、貓、狗和馬）、靈長類（例如，人和非人靈長類，如猴子）、兔和曬齒類（例如，小鼠和大鼠）。在某些實施方案中，個體或受試者是人。
[0129] 術語"單克隆抗體"指從基本上同質的抗體群體獲得的抗體，即包含群體的各個抗體是相同的和/或結合相同表位，除了例如含有天然發(fā)生的突變或在單克隆抗體制備物的產(chǎn)生過程中出現(xiàn)的可能的變體抗體外，此類變體一般W極小量存在。與通常包括針對不同決定簇（表位）的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每個單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。因此，修飾語"單克隆"表示抗體自基本上同質的抗體群體獲得的特性，而不應解釋為要求通過任何特定方法來產(chǎn)生抗體。例如，可W通過多種技術制備待在如本文報道的復合體中使用的單克隆抗體或單克隆抗體片段，包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、瞻菌體展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，本文中描述了用于制備單克隆抗體的此類方法和其他示例性方法。
[0130] 術語"單價結合多膚"或"單價結合抗體片段"表示僅具有單個位點或區(qū)域用于結合其祀標或抗原的分子。單價結合多膚的實例是膚、膚模擬物、適體、小的有機分子（能夠特異性結合祀標多膚的抑制劑）、da巧ins、銷蛋白重復序列蛋白質、Kunitz類型結構域、單個結構域抗體（參見出ey，T.，等，Trends Biotechnol. 23 (2005) 514-522)、細胞表面受體的（天然的）配體、全長抗體的單價片段等。例如，全長抗體對其祀標具有兩個結合位點，因此其是二價的，然而scFv或FAB'抗體片段對其祀標僅具有一個結合位點，因此其是單價的。如果單價抗體或抗體片段用作多膚，那么該位點被稱為互補位。
[0131] 術語"裸抗體"或"裸抗體片段"表示未與非抗體部分（例如核酸或細胞毒性部分或放射性標記物）綴合的抗體或抗體片段。
[0132] "天然抗體"指具有不同結構的天然發(fā)生的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈通過二硫鍵組成。從N至C末端，每條重鏈具有一個可變區(qū)（V田，又稱作可變重域或重鏈可變域，接著是H個恒定域（CH1、C肥和C冊）。類似地，從N至C末端，每條輕鏈具有一個可變區(qū)（VL)，又稱作可變輕域或輕鏈可變域，接著是一個恒定輕（CL)域?；谄浜愣ㄓ虻陌被嵝蛄?，抗體輕鏈可歸入兩種類型中的一種，稱作K和入。
[0133] 術語"藥物制劑"指該樣的制劑，其是處于該樣的形式，W允許其中含有的活性成分的生物活性有效并且其不含有對將被施用制劑的受試者具有不可接受的毒性的額外組分。
[0134] "藥學上可接受的載體"指藥物制劑中除活性成分W外的成分，其對受試者無毒。藥學上可接受的載體包括但不限于緩沖液、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。
[0135] 術語"多核巧酸"或"核酸序列"表示短的，一般是單鏈的多核巧酸，其包含至少8 個核巧酸和至多約1000個核巧酸。在一個實施方案中，多核巧酸具有至少9、或10、或11、或12、或15、或18、或21、或24、或27、或30個核巧酸的長度。在一個實施方案中，多核巧酸具有不多于200、或150、或100、或90、或80、或70、或60、或50、或45、或40、或35、或30 個核巧酸的長度。在其他實施方案中，多核巧酸具有至少9、或10、或11、或12、或15、或18、或21、或24、或27、或30個核巧酸和不多于200、或150、或100、或90、或80、或70、或60、或50、或45、或40、或35、或30個核巧酸的長度。
[0136] 術語"k多核巧酸"表示包含多于50%的k核巧酸作為單體結構單元的核酸，女口 kDNA。在一個實施方案中，k多核巧酸僅包含心核巧酸。應理解該心多核巧酸的核巧酸數(shù)量在一個k核巧酸到任何數(shù)量的范圍內(nèi)。然而在一個實施方案中，k核巧酸的數(shù)量是至少10、或15、或20、或25、或30、或35、或40、或45、或50、或55、或60、或70、或80、或 90或100個核巧酸。k多核巧酸由kA、kG、kC、kU、kT及其組合組成，由此kA表示 k核糖-腺嘿嶺等。L多聚脫氧核巧酸由kdA、kdG、kdC、k加、kdT及其組合組成，由此kdA表示k脫氧核糖-腺嘿嶺等。
[0137] 術語"多核巧酸接頭"表示將兩條核巧酸序列連接在一起的部分。在一個實施方案中，多核巧酸接頭是多核巧酸。在一個實施方案中，多核巧酸接頭包含至少一個多核巧酸和至少一個非多核巧酸。非多核巧酸可W是多膚、聚合物或多糖。在一個實施方案中，多核巧酸接頭包含長度從10-30個核巧酸的多核巧酸和線性聚（己二醇）。
[0138] "多膚"是由通過膚鍵（無論是天然產(chǎn)生的還是合成產(chǎn)生的）連接的氨基酸組成的聚合物。少于約20個氨基酸殘基的多膚可W稱為"膚"，然而由兩個或多個多膚組成的或包含多于100個氨基酸殘基的一個多膚的分子可W稱為"蛋白質"。多膚還可W包含非氨基酸組分，如碳水化合物基團、金屬離子或駿酸醋。非氨基酸組分可W由表達多膚的細胞添加，并且可W根據(jù)細胞的類型而變化。多膚在本文中其氨基酸骨架結構或編碼它們的核酸方面進行定義。添加，如碳水化合物基團一般是未指定的，但是可W存在。
[0139] "多膚表位"表示相應的單價結合多膚結合的多膚祀標上的結合位點。其一般由氨基酸組成。結合多膚結合線性表位，即由一段5-12個連續(xù)氨基酸組成的表位，或者結合多膚結合由多膚祀標若干短區(qū)段的空間排列形成的H維結構。可W認為結合多膚，例如抗體或抗體片段的抗原識別位點或互補位識別的H維表位是抗原分子的H維表面特征。該些特征精確地適合結合多膚的相應結合位點并且由此利于結合多膚與其祀標之間的結合。
[0140] 術語"特異性結合"表示，多膚或抗體或抗體片段W 1(T8m或更小，在一個實施方案中為在一個實施方案中為在一個實施方案中為在一個實施方案中為10-8M-10-"M，或在一個實施方案中為10- 9M-10-"M的解離常數(shù)（KD)結合其祀標。所述術語進一步用于表示，所述多膚不特異性結合存在的其他生物分子，即其W 1(T4M 或更大，在一個實施方案中為10-4M-1M的解離常數(shù)（KD)結合其他生物分子。
[0141] 如本文所用，"治療（treatment)"(及其語法變體，如"治療（treat)"或"治療 (treating)")指嘗試改變被治療的個體的天然過程的臨床干預，并且可W為預防或在臨床病理學過程中進行。想要的治療效果包括，但不限于防止疾病的發(fā)生或復發(fā)、減輕癥狀、消除疾病的任何直接或間接病理學結果、防止轉移、降低疾病發(fā)展的速率、改善或緩和疾病狀態(tài)，和減緩或提高預后。在一些實施方案中，如本文報道的復合體用于延遲疾病的發(fā)生或減緩疾病的進行。
[0142] 術語"可變區(qū)"或"可變域"指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體結合其抗原的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變域（分別為VH和VL) -般具有類似的結構，其中每個結構域包含4個保守的構架區(qū)（FRs)和3個高變區(qū)（HVRs)(參見例如KiiKlt，等，Kuby Immunology,第 6 版，W. H. Rreeman and Co.，第 91 頁（2007))。單個 VH 或 VL 結構域可 W 足W賦予抗原結合特異性。此外，可W分別使用來自結合抗原的抗體的VH或化結構域篩選互補化或VH結構域的文庫來分離結合特定抗原的抗體（參見例如化dolano, S.，等， J. Immunol. 150 (1993) 880-887, Clarckson，T.，等，化Uire 352 (1991) 624-628)。
[0143] 如本文所用，術語"載體"指能夠增殖與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術語包括作為自身復制型核酸結構的載體及整合到其已經(jīng)引入的宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導與其有效連接的核酸的表達。此類載體在本文中稱為"表達載體"。
[0144] II.定制的多特異性結合分子
[0145] 在大多數(shù)基于細胞的疾病中，通過受體分子的基于抗體的結合祀向疾病相關的細胞是一種有前途的方法。然而，臨床相關的表面受體（=祀標）的表達水平根據(jù)患者而不同并且基于標準化的抗體的藥物的功效因此非常不同。該尤其應用于二特異性和多特異性結合分子，其作用方式是同時祀向兩個不同的表位/受體。
[0146] 一種有前途的方法是設計特別用于各患者的特定/個體情況的藥物（本文中是二特異性或多特異性結合分子）。
[0147] 基于患者的疾病相關細胞的臨床相關表面受體的表達譜數(shù)據(jù)，從文庫中特異地選擇一系列結合實體（例如Fab片段）并組合到多特異性結合分子中作為患者特異性藥物。在各疾病相關細胞（如例如，基于例如表面受體的表達水平的腫瘤細胞）方面特別選擇該些所選擇的結合分子，并因此選擇各患者的需要和表型。
[014引組合/連接結合實體的接頭長度上的變化使得能夠選擇正確的靈活性和距離，其可能為同時結合兩個結合實體所需，并因此為選擇性和/或特異性和/或功效所需。
[0149] 此外，可W通過有效負荷與接頭的特異性雜交添加有效負荷，如效應功能或毒素。該可能性進一步增加治療應用的生命力。
[0150] 可W在多種細胞體外測定/細胞樣品中測試所選患者特異的多特異性結合分子的相關標準（例如最佳結合/結合配偶體，最佳接頭長度等）：
[0151] -確定磯酸酪氨酸激酶的磯酸化狀態(tài)
[0152] -確定JNK抑制
[0153] -確定分子誘導的程序性細胞死亡
[0154] -利用單特異性相對于多特異性結合分子進行結合測定
[0155] -確定增殖抑制
[0156] 利用該方法，產(chǎn)生定制的并因此高度有效的治療分子是可能的。該些分子將通過改善的祀向/遞送（例如用于腫瘤細胞的有效負荷）減少副作用并且改善的祀向祀標細胞基于祀向組分（包含至少兩個結合分子）更高的選擇性和特異性。
[0157] 多特異性結合分子更高的選擇性和特異性是由于減少可能的"脫祀"結合的兩個 "低親和力"結合劑的組合的同時結合（親合力）。
[0158] 來自個體的每個細胞在所表達的細胞表面分子，如受體的數(shù)量和種類方面不同。該對于癌細胞和非癌細胞尤其正確。因此，可W通過存在的細胞表面分子來表征細胞。
[0159] 可W通過基于體外和體內(nèi)的細胞成像技術完成該表征。體內(nèi)成像技術包括例如光學成像、分子成像、英光成像、生物發(fā)光成像、MRI、陽T、SPECT、CT和活體顯微鏡檢查。體外成像技術包括例如利用例如英光標記的抗體（識別特定的細胞表面標志物）免疫組織化學染色患者細胞并通過顯微鏡分析英光信號?；蛘?，可W在利用標記的治療或診斷抗體染色后使用基于FACS的方法分析細胞的基因型/表型。
[0160] 在一個實施方案中，通過基于FACS的方法確定患者來源細胞的基因型/表型。在一個實施方案中，通過使用英光標記的診斷或治療抗體確定細胞表面標志物。在一個實施方案中，使用英光標記的治療抗體。
[0161] 某些疾病可W與特定細胞表面分子的數(shù)量的改變或新細胞表面分子的出現(xiàn)相關。
[0162] 受該疾病影響的個體將在某些范圍內(nèi)展示疾病和/或個體特異的細胞表面標志物模式。
[0163] 該必須納入考慮，W向個體提供定制的祀向治療劑。
[0164] 針對細胞表面分子及其配體的許多治療抗體是已知的，其可W用于選擇和構建定制的多特異性祀向實體，如Rituxan/MabHiera/利妥昔單抗、2H7/0crelizumab、Zevalin/ Ibrizumomab、Arzerra/Ofatumumab (CD20)、HLL2/ 依帕珠單抗、Ino1:uzomab (CD22)、賽尼脈 /達克珠單抗、Simulect/己利昔單抗（CD25)、Herceptin/曲妥珠單抗、Pertuzumab化er2/ ERBB2)、麥羅培/吉妥珠單抗（CD33)、Raptiva/依法珠單抗（Cdlla)、艾比特思/西妥昔單抗巧GFR，表皮生長因子受體）、IMC-1121B(VEGF受體2)、Tys油ri/那他珠單抗（a4目1 和a4目7整聯(lián)蛋白的a4-亞基）、ReoPro/阿昔單抗（甜1扣-甜Ila和a V目3-整聯(lián) 蛋白）、Orthoclone 0KT3/Muromon油-CD3(CD3)、Benlysta/Belimumab(BAFF)、Tolerx/ Oteliximab 仰3)、Soliris/E州lizumab (C5 組分蛋白質）、Actemra/Tocilizumab (IL-6R)、 Panorex/ 依決洛單抗巧pCAM，上皮細胞粘附分子）、CEA-CAM5/Ubetuzumab(CD66/CEA, 癌胚抗原）、CT-11 (PD-1，程序性死亡-IT-細胞抑制受體、CD-d279)、肥24G11 (c-Met 受體）、SAR3419 (CD19)、IMC-A12/Cixutumum 油（IGF-1R，膜島素樣生長因子 1 受體）、 MEDI-575 (PDGF-R，血小板衍生的生長因子受體）、CP-675、206/Tremelimumab (細胞毒性T 淋己細胞抗原4)、R05323441 (胎盤生長因子或PGF)、HGS1012/Mapatumum油(TRA比-R1)、 SGN-70(CD70)、Vedotin (SGN-35)/化en化ximab(CD30)和 ARH460-16-2(CD44)。
[0165] 為了確定例如患者樣品中存在的細胞表面標志物，已知有不同的方法。一種示例性方法基于英光激活的細胞分選（FACS)，特別是特異性染色和分選細胞群體的分析。在該方法中，通過使用針對該些標志物的英光標記的抗體在呈現(xiàn)的細胞表面標志物方面分析個體細胞實現(xiàn)樣品（細胞群體）的表型分型，任選地包括細胞群體中表面標志物的統(tǒng)計分布。尤其適合使用已經(jīng)用英光標記為此目的標記的治療抗體，因為于是保證后者定制的多特異性結合分子將結合與診斷抗體相同的表位。如本文報道的多特異性結合分子/雙特異性抗體可W用于制備用于治療例如腫瘤疾病、也血管疾病、傳染病、炎癥疾病、自身免疫性疾病、代謝（例如內(nèi)分泌）疾病或神經(jīng)學（例如，神經(jīng)變性）疾病的藥物。該些疾病的示例性非限制性實例是阿爾茨海默氏病、非霍奇金淋己瘤、B-細胞急性和慢性淋己樣白血病、伯基特淋己瘤、霍奇金淋己瘤、毛細胞白血病、急性和慢性髓細胞性白血病、T細胞淋己瘤和白血病、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)膠質瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥、癌（如口腔癌、胃腸道癌、結腸癌、胃癌、肺道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、膀脫癌、膜腺癌、骨癌、肝癌、膽囊癌、腎癌、皮膚癌和睪丸癌）、黑素瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質瘤，和皮膚癌、急性特發(fā)性血小板減少性紫薇、慢性特發(fā)性血小板減少性紫薇、皮肌炎、西登哈姆舞蹈病、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、風濕熱、多腺體綜合征、大瘡性類天瘡瘡、糖尿病、亨諾-許蘭氏紫薇、鏈球菌感染后腎炎、結節(jié)性紅斑、化kayasu' S動脈炎、艾迪生病、類風性濕關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、肉瘤樣病、潰瘍性結腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結節(jié)性多動脈炎、強直性脊柱炎、肺出血腎炎綜合征、閉塞性血栓性脈管炎、干燥綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本甲狀腺炎、甲狀腺毒癥、硬皮病、慢性活動性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多發(fā)性軟骨炎、尋常性天瘡瘡、Wegener' S肉芽腫、膜性腎病、肌萎縮性側索硬化癥、脊髓巧、巨細胞動脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進性腎小球腎炎、牛皮癖或纖維性肺泡炎。
[0166] 許多細胞表面標志物及其配體是已知的。例如，已經(jīng)報道癌細胞表達W下細胞表面標志物和或配體中的至少一個，包括但不限于碳酸酢酶IX、甲胎蛋白、a-ctinin-4、 A3 (對 A33 抗體特異的抗原）、ART-4、B7、Ba-733、BAGE、Bi~E3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、 CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CDl、CDla、CD2、CD3、CD4、CDS、CD8、CDl-lA、CD14、CD15、CD16、 CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、 CD40L、CD45、CD46、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、 CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CX化 12、 HIF-l-a、結腸特異的抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAM、EGFR、EGFRvIII、 EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、葉酸鹽受體、G250 抗原、GAGE、GROB、HLA-DR、歷1.24、人體絨毛膜促性腺激素（HCG)及其亞基、肥R2/neu、HMGB-l、低氧可誘導的因子 (HIF-1)、HSP70-2M、HST-2 或 la、IGF-1R、IFN-y、IFN-a、IFN-目、比-2、IL-4R、比-6R、比-13R、比-15R、比-17R、比-18R、比-6、比-8、比-12、比-15、比-17、比-18、比-25、膜島素樣生長因子-1 (IGF-1)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/即T、巨瞻細胞游走抑制因子（MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ES0-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、 MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、膜腺癌粘蛋白、胎盤生長因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磯酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PIGF、ILGF、ILGF-IR、比-6、比-25、RS5、RANTES、TlOl、SAGE、SlOO、存活蛋白、存活蛋白-2B、TAC、TAG-72、膊糖蛋白、TRAIL 受體、TNF-a、Tn-抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、腫瘤壞死抗原、VEGFR、邸-B纖連蛋白、WT-1U7-1A-抗原、補體因子〔3、〔33、〔313、〔53、〔5、血管發(fā)生標志物、6(31-2、 bd-6、Kras、cMET、致癌基因標志物和致癌基因產(chǎn)物（參見例如，Sensi等，Clin. Cancer Res. 12(2006)5023-5032 ;Parmiani 等，J. Immunol. 178(2007) 1975-1979 ;Novellino 等， Cancer Immunol. Immunother. 54 (2005) 187-207)。
[0167] 因此，識別特定細胞表面受體的抗體（包括其配體）可W用于特異性地和選擇性地祀向并結合與疾病相關的許多/大量細胞表面標志物。細胞表面標志物是定位在細胞 (例如疾病相關細胞）表面上的多膚，其例如與信號傳遞事件或配體結合相關。
[0168] 在一個實施方案中，為了治療癌癥/腫瘤，使用多特異性結合分子/雙特異性抗體，其祀向腫瘤相關的抗原，如在化rberman, "Immunodia即osis of Cancer"，F(xiàn)leisher 編牽茸，"The Clinical Biochemistry of Cancer",第 347 頁（American Association of (：1111^31〇161111313，1979)和口5 4，150，149;口8 4,361，544;和口5 4,444,744 中報道的那些。
[0169] 關于腫瘤相關抗原（TAAs)的報道包括Miz址ami等，化1:腳6 Med. 11 (2005)992-997 ;Hatfield 等，Curr. Cancer Drug Targets 5(2005)229-248; Vallbo timer 等，J. Clin. On col. 23 (2005) 3536-3544;和 Ren 等，Ann. Surg. 242(2005)55-63)，各自在鑒定的TAAs方面作為參考并入本文。
[0170] 疾病涉及淋己瘤、白血病或自身免疫性疾病時，祀向抗原可W選自CD4、CD5、CD8、 CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD54、 CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、CXCR4、B7、MUCl 或 24、HLA-DR、膊糖蛋白、VEGF、P1GF、邸-B纖連蛋白、癌基因、癌基因產(chǎn)物（例如，c-met或PLAGL2)、CD66a-d、壞死抗原、比-2、1'101、146、比-6、]?伴、1^比-1?1值1?4)和1^比-1?2值貼）。
[0171] 已知許多雙特異性抗體針對兩個不同的祀標，如BCMA/CD3,肥R家族中不同抗原的組合巧GFR、肥R2、肥R3)、CD19/CD3、IL17RA/1L7R、比-6/比-23、比-1-目 /比-8、比-6 或比-6R/比-21或比-21R，針對選自Lewis x-、Lewis b-和Lewis廠結構、Globo H-結構、 KH1、Tn-抗原、TF-抗原和粘蛋白的碳水化合物結構、CD44、糖脂類和糖巧神經(jīng)銷脂類，女口 Gg3、抓3、GD3、GD2、抓5、Gml、Gm2、sial}dtetraosylceramide 的抗原的糖表位的第一個特異性和針對選自EGFR、肥R2、肥R3和肥R4的化bB受體酪氨酸激酶的第二個特異性、與第二個抗原結合位點組合的GD2與選自W下的免疫細胞相關；T-淋己細胞、NK細胞、B-淋己細胞、樹突細胞、單核細胞、巨瞻細胞、嗜中性粒細胞、間充質干細胞、神經(jīng)干細胞、ANG2/ VEGF、VEGF/PDGFR-目、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)受體 2/CD3、PSMA/CD3、EPCAM/CD3,選自 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、化T3、C-FMS/CSF1R、RET、c-Met、EGFR、Her2/neu、肥R3、肥R4、、 16尸3、？06。1?、(3-1(口、8〇?、整聯(lián)蛋白和匪?8的抗原與選自￥66。、66。、？16。、？06。、服。和血管生成素、ERBB-3/C-MET、ERBB-2/C-MET、EGF 受體 1/CD3、EGFR/肥R3、PSCA/CD3、C-MET/CD3、 END0SIALIN/CD3、EPCAM/CD3、IGF-1R/CD3、FAPALPHA/CD3、EGFR/IGF-1R、IL 17A/F、EGF 受體1/CD3,和CD19/CD16的水溶性配體的組合。
[0172] 因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過使用如本文報道的模塊方法，可W提供定制的雙特異性治療抗體。在實際上存在于需要治療的個體細胞上的細胞表面分子方面或在與該細胞表面分子相互作用的配體方面定制該些抗體。通過確定個體的細胞表面分子狀態(tài)，可W選擇治療祀標的定制組合。
[0173] 通過組合用于同時祀向和結合兩個不同表位的2個單一治療分子定制產(chǎn)生雙特異性治療劑，與單一治療分子相比可W預期累加/協(xié)同效果。
[0174] 通過使用早已可用的單特異性治療結合實體，如來自治療抗體的那些，可W實現(xiàn) 快速并容易地產(chǎn)生所需的多特異性結合分子。
[0175] 該些親和力改造的結合分子/抗體可W結合單個細胞上存在的兩個或多個細胞表面標志物。如果所有/兩個結合實體同時結合細胞，才僅希望該結合。為此目次，中等到高度精煉的抗體尤其合適。另一方面，該也允許在篩選過程中排除結合特異性的較不特異的組合。
[017引"Combimatrix"方法
[0177] 希望組合第一個結合實體，如抗體F油片段與另一個特異的結合實體，如第二個抗體Fab片段。此外，可W篩選當將第一個結合實體連接到許多不同的其他結合實體時，第一個結合實體是否顯示更好的性質。使用所謂的Combimatrix方法，可容易的方式解決結合實體的大量組合。應該指出，第二個結合實體可W結合不同的祀標/表位/抗原，或可W結合相同的抗原，但是不同的表位，或可W結合相同的表位，但是單一結合實體的不同變體（例如，人源化候選物）。
[0178] 在該方案中，自動化平臺可W執(zhí)行任務來吸取、純化并組合結合實體及其反應物或衍生物。使用例如96孔板或其他高通量形式的任何平臺均是合適的，如化pendorf 巧Motion 5075vac移液機器人。
[0179] 首先，進行結合實體（如抗體F油片段）編碼構建體的克隆。一般通過基因合成獲得具有結合實體編碼核酸的質粒，由此所編碼的結合實體的C-末端區(qū)域含有分選酶-motive和化s標簽。將質粒分別轉移到多孔板的各孔中（可W裝載整個板）。然后，用切開結合實體編碼區(qū)的限制性內(nèi)切核酸酶混合物消化質粒。希望W僅需要一種限制性內(nèi)切核酸酶混合物用于所有質粒的方式設計所有的基因合成。然后，任選的清洗步驟產(chǎn)生純化的 DNA片段。該些片段連接到已經(jīng)用如上提及的同一限制性混合物從受體載體切開的質粒骨架中。或者，可W通過化1C介導的克隆步驟進行克隆方法。連接后，自動化的平臺將所有的連接混合物轉移到具有感受態(tài)大腸桿菌細胞（例如，ToplOMulti Shot, Invitrogen)的其他多孔板中并且進行轉化反應。培養(yǎng)細胞至想要的密度。從培養(yǎng)混合物的等分試樣中可W 獲得甘油原種。從培養(yǎng)物中分離質粒（例如使用質粒分離小量試劑盒（例如NucleoSpin96 Plasmid，Macher巧&化gel))。通過用適當?shù)南拗泼富旌衔锵确衷嚇雍蚐DS-凝膠電泳 (例如E-Gel 48, Invitrogen)檢查質粒身份。然后，可W用質粒的等分試樣裝載新的平板用于進行對照測序反應。
[0180] 在下一步中，表達結合實體。因而，將肥K細胞接種到多孔板（例如48孔板）中并用分離的質粒（在適當?shù)墓羌茌d體中含有結合實體編碼區(qū)）進行轉染。將轉染的HEK細胞培養(yǎng)若干天并收集（例如，使用真空操作臺通過1. 2 y m和0. 22 y m濾板過濾）?？蒞通過進行例如化ISA監(jiān)測滴度。
[0181] 可W使用分選酶介導的轉膚反應將結合實體共價連接寡核巧酸結合對的各成員。在多孔形式中組合結合實體和分選酶反應混合物。在37C溫育4-16小時后，通過使用負向His標簽選擇方法（將混合物應用到例如His MultiTrap HP平板上佑E Healthcare)) 收集結合實體-寡核巧酸綴合物并過濾，由此仍然具有His標簽的所有分子結合到層析柱上，然而在濾液中發(fā)現(xiàn)了所有其他分子，像寡核巧酸綴合物；例如應該通過將結合實體-寡核巧酸綴合物應用到超濾膜上或通過使用含有對結合實體特異的親和介質的平板，利用濾液進行緩沖液交換；緩沖液交換（其也去除了過量的游離寡核巧酸）后，可W連接結合實體-寡核巧酸綴合物，W變成多特異性結合分子。
[0182] 使用Combimatrix方法制備多特異性結合分子，參見下表。
[0183]
【權利要求】
1. 用于產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，其包括以下步驟 (i) 確定樣品中細胞表面上存在的表面標志物并選擇其第一種表面標志物和第二種表面標志物， (ii) 溫育（a)綴合第一個結合對的第一個成員的抗體Fab片段或scFv抗體片段，由此 Fab片段或scFv特異性結合第一種表面標志物，（b)綴合第二個結合對的第一個成員的抗體Fab片段或scFv抗體片段，由此Fab片段或scFv抗體片段特異性結合第二種表面標志物，和（c)對映體DNA多核苷酸接頭，其在其末端之一包含第一個結合對的第二個成員并在各自另一末端包含第二個結合對的第二個成員，由此產(chǎn)生雙特異性抗體。
2. 用于確定抗原結合位點的組合的方法，其包括以下步驟 (i) 確定大量雙特異性抗體的結合特異性和/或親和力和/或效應功能和/或體內(nèi)半衰期，通過組合各自連接第一個結合對的相同第一個成員的第一大群抗體Fab片段或scFv 抗體片段的每個成員與各自連接第二個結合對的相同第一個成員的第二大群抗體Fab片段或scFv抗體片段的每個成員，以及在其末端之一包含第一個結合對的第二個成員并在各自另一末端包含第二個結合對的第二個成員的對映體DNA多核苷酸接頭來制備所述雙特異性抗體，由此第一大群特異性結合第一種細胞表面標志物并且第二大群特異性結合第二種細胞表面標志物，和 (ii) 選擇具有合適的結合特異性和/或親和力和/或效應功能和/或體內(nèi)半衰期的雙特異性抗體并由此確定抗原結合位點的組合。
3. 前述權利要求任一項的方法，其特征在于所述雙特異性抗體是這樣的復合體，其包含 a) 第一個Fab片段或scFv抗體片段 i) 其特異性結合第一種表面標志物，并且 ii) 其綴合第一個結合對的第一個成員， b) 第二個Fab片段或scFv抗體片段， i) 其特異性結合第二種表面標志物，并且 ii) 其綴合第二個結合對的第一個成員，和 c) 對映體DNA多核苷酸接頭 i) 其綴合第一個結合對的第二個成員，并且 ii) 其綴合第二個結合對的第二個成員。
4. 前述權利要求任一項的方法，其特征在于所述復合體是非共價復合體。
5. 前述權利要求任一項的方法，其特征在于所述結合對是多核苷酸的互補對。
6. 前述權利要求任一項的方法，其特征在于所述復合體進一步包含綴合多核苷酸的效應部分，所述多核苷酸與接頭的至少一部分互補。
7. 權利要求6的方法，其特征在于所述復合體包含綴合多核苷酸的第二個效應部分，所述多核苷酸與綴合第一個效應部分的多核苷酸的至少一部分互補并且ii)不與所述多核苷酸接頭互補。
8. 前述權利要求任一項的方法，其特征在于所述第一個和第二個Fab片段或scFv抗體片段結合相同靶標和其上的非重疊表位。
9. 前述權利要求任一項的方法，其特征在于所述多核苷酸接頭包含8-1000個核苷酸。在一個實施方案中，所述多核苷酸接頭包含10-500個核苷酸。
10. 前述權利要求任一項的方法，其特征在于所述對映體DNA是L-DNA。
11. 權利要求10的方法，其特征在于所述L-DNA是單鏈L-DNA(ss-L-DNA)。
12. 藥物制劑，其包含通過權利要求1-11任一項的方法獲得的雙特異性抗體和任選地藥學上可接受的載體。
13. 通過權利要求1-11任一項的方法獲得的雙特異性抗體用作藥物。
14. 通過權利要求1-11任一項的方法獲得的雙特異性抗體在制造藥物中的用途。
15. 治療患有癌癥的個體的方法，其包括向所述個體施用有效量的通過權利要求1-11 任一項的方法獲得的雙特異性抗體。
16. 雙特異性抗體，其包含 a) 第一個Fab片段或scFv抗體片段 i) 其特異性結合第一種表面標志物，并且 ii) 其綴合第一個結合對的第一個成員， b) 第二個Fab片段或scFv抗體片段 i) 其特異性結合第二種表面標志物，并且 ii) 其綴合第二個結合對的第一個成員，和 c) 對映體DNA多核苷酸接頭 i) 其綴合第一個結合對的第二個成員，并且 ii) 其綴合第二個結合對的第二個成員，由此第一個和第二個Fab片段或scFv抗體片段與對映體DNA多核苷酸接頭形成非共價復合體。
【文檔編號】A61K39/395GK104395340SQ201380033855
【公開日】2015年3月4日申請日期:2013年6月25日優(yōu)先權日:2012年6月27日
【發(fā)明者】D·海因德爾, P·M·許爾斯曼, B·卡魯扎, E·科佩茨基, G·尼德菲爾納, G·蒂分塔勒申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司

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