St2l拮抗劑及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及ST2L拮抗劑、編碼所述拮抗劑或其片段的多核苷酸以及制備并使用前述物質(zhì)的方法。
【專利說明】ST2L拮抗劑及使用方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年3月13日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)13/798, 204、2013年3 月13日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)13/798,226、2012年4月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?61/640, 407以及2012年4月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/640, 238的權(quán)益，所述申請(qǐng)的 全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及ST2L拮抗劑、編碼所述拮抗劑或其片段的多核苷酸以及制備并使用 前述物質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0004]ST2L(IL-1RL1或IL-33Ra)是Toll/IL-Ι受體家族成員，在多種免疫細(xì)胞的細(xì)胞 表面上表達(dá)，所述免疫細(xì)胞包括T細(xì)胞、NK/NKT細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì) 胞及新發(fā)現(xiàn)的非B/非T的2型先天性淋巴細(xì)胞、nuocytes和自然輔助細(xì)胞。也可在樹突狀 細(xì)胞（DC)、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞上誘導(dǎo)ST2L表達(dá)。ST2L能夠下調(diào)Toll樣受體TLR2、 TLR4和TLR9的響應(yīng)性，但也能經(jīng)由被其配體IL-33活化及與輔助蛋白IL-IRAcP締合而誘 導(dǎo)2型細(xì)胞因子釋放。IL-33已被描述為"警報(bào)素"，因?yàn)樵趦?nèi)穩(wěn)態(tài)過程中其以全長(zhǎng)形式存 在于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核中，但在細(xì)胞壞死過程中可被裂解并釋放。
[0005]ST2L信號(hào)傳導(dǎo)需要輔助蛋白IL-IRAcP締合于預(yù)先形成的ST2L/IL-33復(fù)合 物。IL-la/β信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物也共用輔助蛋白IL-lRAcP。已提出了ST2L、IL-33和 IL-IRAcP相互作用以及IL-IRl與IL-IRAcP之間相互作用的模型（Lingel等人，Cell 17 :1398-1410,2009;Wang等人，NatImmunolll:905-11，2010)。近來發(fā)現(xiàn)，ST2L/IL-33/ IL-IRAcP與肥大細(xì)胞上的c-Kit(干細(xì)胞因子（SCF)的受體）形成信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物。IL-33 以SCF依賴方式在原代肥大細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生（Drube等人，Blood115 :3899-906， 2010)。
[0006]ST2L的活化導(dǎo)致過度的2型細(xì)胞因子響應(yīng)（尤其是IL-5和IL-13)、肥大細(xì)胞和 嗜酸性粒細(xì)胞活化，以及氣道過度反應(yīng)，并且據(jù)報(bào)道還可通過誘導(dǎo)來自NKT細(xì)胞的IFNγ和 來自肥大細(xì)胞的IL-Iβ及IL-6放大Thl和Thl7響應(yīng)。ST2L/IL-33途徑失調(diào)已表明與多 種免疫介導(dǎo)的疾病有關(guān)，包括哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、特應(yīng)性皮炎、過敏性鼻炎、 鼻息肉以及全身性硬化癥（綜述于Palmer和Gabay，NatRevRheumatol7 :321_9, 2011和 Lloyd,CurrOpinTmmunol22 :800_6, 2010;Shimizu等人，HumMolecGen14 :2919-27, 2005,Kamekura等人，ClinExpAllergy42 :218_28,2012;Manetti等人，AnnRheumDis 69 :598-605,2010)。
[0007] 因此，需要適合用于治療ST2L介導(dǎo)的疾病和失調(diào)的ST2L拮抗劑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008] 圖1示出在與同種型對(duì)照CNT05516相比時(shí)，在經(jīng)鼻內(nèi)施用IL-33而誘導(dǎo)的肺炎癥 模型中，通過ST2L域I結(jié)合單克隆抗體CNT03914抑制氣道過度響應(yīng)。當(dāng)乙酰甲膽堿（MCH) 以升高的劑量（mg/ml)施用時(shí)，測(cè)量到氣道阻力的峰值。CNT03914/IL-33相對(duì)于CNT05516/ IL-33,#p< 0· 05 ;以及CNT03914/IL-33 相對(duì)于經(jīng)IL-33 處理的PBS組，< 0· 001。
[0009] 圖2示出在與同種型對(duì)照CNT05516相比時(shí)，在經(jīng)鼻內(nèi)施用IL-33而誘導(dǎo)的肺炎癥 模型中，通過ST2L域I結(jié)合單克隆抗體CNT03914抑制支氣管肺泡灌洗（BAL)細(xì)胞募集。 ***p< 0· 001。
[0010] 圖3示出在經(jīng)鼻內(nèi)施用IL-33而誘導(dǎo)的肺炎癥模型中，通過ST2L域I結(jié)合單克隆 抗體CNT03914在無細(xì)胞的BAL液中劑量依賴性抑制小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶I(MMCP-I)的釋 放。相對(duì)于經(jīng)IL-33處理的CNT05516 (同種型對(duì)照），#p< 0· 01，< 0· 001。
[0011] 圖4示出在體外通過ST2L域I結(jié)合單克隆抗體CNT03914,抑制小鼠骨髓源性肥大 細(xì)胞的IL-33誘導(dǎo)的GM-CSF(圖4A)、IL-5(圖4B)和TNFa(圖4C)釋放。在括號(hào)中，所使 用的CNT03914濃度示出為μg/ml，并且IL-33濃度示出為ng/ml。
[0012] 圖5示出在指定IL-33和C2494濃度，通過ST2L域I結(jié)合單克隆抗體 C2494(STLM62)，抑制IL-33所誘導(dǎo)的人臍帶血源性肥大細(xì)胞的前列腺素D2(POT2)釋放。 MOX-PDG2 :甲氧胺-POT2。
[0013] 圖6示出在StemPro-34培養(yǎng)基中的lng/mlIL-33+100ng/mlSCF(干細(xì)胞因子） 存在下，通過指定濃度（μg/ml)的ST2L域I結(jié)合單克隆抗體C2244和C2494,抑制人臍帶 血源性肥大細(xì)胞（hCBMC)中的GM-CSF(圖 6A)、IL-8 (圖 6B)、IL-5 (圖 6C)、IL-13 (圖 6D) 和IL-10 (圖6E)釋放。
[0014] 圖7示出在StemPro-34培養(yǎng)基中的lng/mlIL-33+100ng/mlSCF存在下，通過指 定濃度（yg/ml)的ST2L域III結(jié)合單克隆抗體C2519或C2521，對(duì)人臍帶血源性肥大細(xì)胞 中的GM-CSF(圖 7A)、IL-8 (圖 7B)、IL-5 (圖 7C)、IL-13 (圖 7D)和IL-10 (圖 7E)釋放的 影響。
[0015]圖 8 示出在RPMI/10 %FCS培養(yǎng)基中 3ng/mlIL-33+100ng/mlSCF存在下， 通過ST2L域I結(jié)合單克隆抗體C2494和ST2L域III結(jié)合單克隆抗體ST2M48 (M48)、 ST2M49(M49)、ST2M50(M50)和ST2M51 (M51)，對(duì)人臍帶血源性肥大細(xì)胞（hCBMC)中的A) GM-CSF;B)IL-8 ;C)IL-5 ;D)IL-13 以及E)IL-10 釋放的影響。
[0016] 圖9示出結(jié)合5了21^的域1(01)或域111(03)的抗-5了21^抗體，如所指示使用 50μg/ml或2μg/ml的每種被測(cè)抗體時(shí)，抑制人臍帶血源性肥大細(xì)胞在受IL-33和SCF誘 導(dǎo)時(shí)的GM-CSF、IL-5、IL-8、IL-10和IL-13釋放的平均百分比（％ )。負(fù)值指示活化％。
[0017] 圖10示出抗-ST2L抗體的重鏈可變區(qū)（VH)和重鏈⑶R序列，其來源于噬菌體展 示文庫(kù)，且后續(xù)經(jīng)親和力成熟篩選（affinity-maturationcampaign)。
[0018] 圖11示出抗-ST2L抗體的輕鏈可變區(qū)（VL)和輕鏈CDR序列，其來源于噬菌體展 示文庫(kù)，且后續(xù)經(jīng)親和力成熟篩選。
[0019] 圖12示出抗-ST2L抗體STLM208VHST2H257HCDR3變體的VH和VL區(qū)，以及重鏈 ⑶R的序列。
[0020] 圖13示出抗-ST2L抗體的A)VH和B)VL序列，其來源于噬菌體展示文庫(kù)，且后續(xù) 經(jīng)親和力成熟篩選。
[0021] 圖14示出轉(zhuǎn)移到人框架（被轉(zhuǎn)移部分標(biāo)記為HFA"humanframework adaptation"（人框架適應(yīng)性））的C2494VH和VL抗原結(jié)合位點(diǎn)的劃分。KabatCDR帶有 下劃線，并且ChothiaHV在所示轉(zhuǎn)移HFA區(qū)的上方以虛線指示。VH和VL殘基的編號(hào)根據(jù) Chothia。VH中以灰色突出顯示的殘基在一些HFA變體中未被轉(zhuǎn)移。C2494VH:SEQIDNO: 48 ；C2494VH：SEQIDNO：52〇
[0022] 圖15示出來源于C2494的人框架適應(yīng)性（HFA)抗體的⑶R序列。
[0023] 圖16A)抗-ST2L抗體CNT03914的血清水平；B)支氣管肺泡灌洗（BAL)細(xì)胞募集 的抑制；C)被IL-33刺激的全血細(xì)胞的IL-6分泌的抑制；D)在經(jīng)鼻內(nèi)施用IL-33而誘導(dǎo) 肺炎癥6小時(shí)模型中，給藥后24小時(shí)通過CNT03914抑制用IL-33刺激的全血細(xì)胞的MCPl 分泌。*ρ<(λ05，**p< 0· 01，***p< 0· 001;NQ=低于檢出限；@ = 一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)低于檢出 限。
[0024] 圖17各種抗-ST2L抗體之間的競(jìng)爭(zhēng)。A) 30nM經(jīng)標(biāo)記的C2244Fab與指定抗體競(jìng)爭(zhēng) 結(jié)合涂布在微孔上的ST2L-ECD。C2244與C2494競(jìng)爭(zhēng)，但不與C2539競(jìng)爭(zhēng)。B)IOnM經(jīng)標(biāo)記 的C2494與指定抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合涂布在微孔上的ST2L-ECD。C2494與STLM208和STLM213競(jìng) 爭(zhēng)，但不與C2539競(jìng)爭(zhēng)。
[0025] 圖18示出與C2244Fab復(fù)合的人ST2-ECD(SEQIDN0:119)的簡(jiǎn)化Η/D交換圖。 被抗體保護(hù)的區(qū)域以所示不同的灰度顯示。包含第18-31位殘基（虛線方框內(nèi)） IDNO:1的全長(zhǎng)ST2L的第35-48位殘基）的片段由Fab保護(hù)。包含第71-100位殘基（實(shí) 線方框內(nèi)）（對(duì)應(yīng)SEQIDNO:1的第88-117位殘基）的區(qū)域被重度糖基化且未被肽覆蓋。
[0026] 圖19示出ST2L域I結(jié)合抗體對(duì)圖中所示ST2L變體的動(dòng)力學(xué)和親和力常數(shù)。
[0027] 圖20示出抗-ST2L抗體STLM208對(duì)原代人肺肥大細(xì)胞的A)GM-CSF;B)IL-5 ;〇 IL-8 ;D)IL-13分泌的抑制。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0028] 本發(fā)明提供一種分離的人或人適應(yīng)性抗體拮抗劑或其片段，其特異性結(jié)合人ST2L 的域I(SEQIDNO:9)。
[0029] 本發(fā)明還提供特異性結(jié)合具有下列序列的人ST2L的人適應(yīng)性抗體拮抗劑：特定 輕鏈和重鏈可變區(qū)序列，或特定重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定序列。
[0030] 本發(fā)明還提供在限定表位區(qū)特異性結(jié)合人ST2L和/或具有如本文所述特定特征 的人或人適應(yīng)性抗體拮抗劑。
[0031] 本發(fā)明還提供一種分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的重鏈可變區(qū)（VH)或輕鏈可 變區(qū)（VL)。
[0032] 本發(fā)明還提供一種載體，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸。
[0033] 本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的載體。
[0034] 本發(fā)明還提供一種制備本發(fā)明的抗體的方法，該方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞 以及從所述細(xì)胞回收抗體。
[0035] 本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的分離抗體以及配藥學(xué)上可接受的 媒介物。
[0036] 本發(fā)明還提供一種治療或預(yù)防ST2L介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括將治療有效 量的本發(fā)明的分離抗體向?qū)ζ溆行枨蟮幕颊呤┯米阋灾委熁蝾A(yù)防ST2L介導(dǎo)的病癥的時(shí) 間。
[0037] 本發(fā)明還提供一種抑制患者體內(nèi)肥大細(xì)胞響應(yīng)的方法，該方法包括將治療有效量 的本發(fā)明的分離抗體向?qū)ζ溆行枨蟮幕颊呤┯米阋砸种品蚀蠹?xì)胞響應(yīng)的時(shí)間。
[0038] 本發(fā)明還提供一種在受治療者中抑制IL-33和ST2L的相互作用的方法，該方法包 括以足以抑制IL-33和ST2L的相互作用的量向該受治療者施用特異性結(jié)合ST2L的域I的 抗體。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 本說明書中所引用的所有出版物（包括但不限于專利和專利申請(qǐng)）均以引用方式 并入本文，如同在本文中完整給出。
[0040] 應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施例，并非旨在進(jìn)行限制。除非另 有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通 常所理解的含義相同。
[0041] 雖然與本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于檢 驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)踐中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保護(hù)本發(fā)明時(shí)，將使 用以下術(shù)語。
[0042] 如本文所用，術(shù)語"拮抗劑"意指通過任何機(jī)制部分或完全抑制ST2L生物活性的 分子。示例性拮抗劑是抗體、融合蛋白質(zhì)、肽、模擬肽、核酸、寡核苷酸和小分子。拮抗劑可 使用下述ST2L生物活性測(cè)定法鑒定。ST2L拮抗劑可使所測(cè)量的ST2L生物活性抑制20%、 30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。
[0043] 術(shù)語"ST2L"或"huST2L"或"人ST2L"是指具有基因庫(kù)登錄號(hào)NP057316中所示 的氨基酸序列的人ST2L多肽。SEQIDNO: 1示出全長(zhǎng)人ST2L的氨基酸序列。如本文所用， "ST2L胞外域"、"ST2L-ECD" 或 "huST2L-ECD" 意指具有SEQIDNO:1 的第 19-328 位氨基 酸的多肽。huST2L-ECD具有三個(gè)Ig樣C2型域，其跨越SEQIDNO:1的第19-122位殘基 (域I，SEQIDNO:9)、第 123-202 位殘基（域II，SEQIDNO: 10)以及第 209-324 位殘基 (域III，SEQIDN0:11)。"域I"或"ST2L域I"或"huST2L域I"或"D1"是指人ST2L上 的第一免疫球蛋白樣域，其具有SEQIDNO:9中所示的序列。"域III"或"ST2L域III"是 指人ST2L上的第三免疫球蛋白樣域，其具有SEQIDNO: 11中所示的序列。
[0044] 如本文所用，術(shù)語"IL-33"包括全長(zhǎng)IL-33(基因庫(kù)登錄號(hào)NP_254274SEQIDNO: 3)及其變體和活性形式。IL-33變體包括具有基因庫(kù)登錄號(hào)NP_001186569和基因庫(kù)登錄號(hào) NP_001186570中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。IL-33活性形式包括"成熟IL-33"，其具有 SEQIDNO:3的第112-270位殘基。另外的活性形式包括IL-33片段，其具有SEQIDNO:3 的第 11-270位、第 115-270位、第95-270位、第99-270位或第 109-270位殘基（LeFrancais 等人，ProcNatlAcadSci(USA) 109 :1673-8, 2012)，或從內(nèi)源性表達(dá)IL-33的細(xì)胞分離的 任何形式或形式的組合。"IL-33活性形式"是誘導(dǎo)ST2L生物活性的SEQIDNO:3的IL-33 的片段或變體。
[0045] 如本文所用，術(shù)語"抗體"含義廣泛且包括：免疫球蛋白分子，包括多克隆抗體；單 克隆抗體，包括鼠、人、人適應(yīng)性、人源化和嵌合單克隆抗體；抗體片段；由至少兩個(gè)完整抗 體或抗體片段所形成的雙特異性或多特異性抗體；二聚體、四聚體或多聚體抗體；以及單 鏈抗體。
[0046] 免疫球蛋白可根據(jù)重鏈恒定域氨基酸序列被指定為五種主要種類，即IgA、IgD、 IgE、IgG和IgM。IgA和IgG進(jìn)一步亞分類為同種型IgA1UgA2UgG1UgG2UgGjPIgG4。任 何脊椎動(dòng)物物種的抗體輕鏈可基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列被指定至兩種明顯不同類 型中的之一，S卩κ(κ)和λ(λ)。
[0047] 術(shù)語"抗體片段"是指免疫球蛋白分子的一部分，其保留重鏈和/或輕鏈抗原結(jié)合 位點(diǎn)，諸如重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（HCDR) 1、2和3,輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（IXDR) 1、2和3,重鏈可變區(qū) (VH)或輕鏈可變區(qū)（VL)?？贵w片段包括熟知的Fab、F(ab' ) 2、Fd和Fv片段以及由一個(gè) VH域組成的域抗體（dAb)。VH和VL域可經(jīng)由合成接頭連接在一起以形成各種類型的單鏈 抗體設(shè)計(jì)，其中在VH和VL域由單獨(dú)的單鏈抗體構(gòu)建體表達(dá)的情況下，VH/VL域在分子內(nèi)或 分子間配對(duì)，以形成單價(jià)抗原結(jié)合位點(diǎn)，諸如單鏈Fv(scFv)或雙價(jià)抗體（diabody);例如在 國(guó)際專利公開W098/44001、國(guó)際專利公開W088/01649、國(guó)際專利公開W094/13804、國(guó)際專 利公開W092/01047中所描述的。
[0048] 抗體可變區(qū)由插入有三個(gè)"抗原結(jié)合位點(diǎn)"的"框架"區(qū)組成。使用不同術(shù)語來定 義抗原結(jié)合位點(diǎn)：（丨）三個(gè)在州0?1?1、!《1?2、!《1?3)中且三個(gè)在￥1^(1^〇)1?1、1^〇)1?2、1^〇)1?3)中的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，是基于序列變異性（Wu和Kabat，JExpMed132:211-50,1970; Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealth Service,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.,1991)。（ii)三個(gè)在VH(H1、H2、 H3)中且三個(gè)在VL(LI、L2、L3)中的"超變區(qū)"、"HVR"或"HV"，是指抗體可變域中的在結(jié)構(gòu) 上超變的區(qū)域，如Chothia和Lesk所定義（Chothia和Lesk，MolBiol196 :901-17,1987)。 其他術(shù)語包括"頂GT-CDR"（Lefranc等人，DevComparatImmunol27:55-77,2003)和"特 異性決定殘基用途"（SDRU) (Almagro，MolRecognitl7 :132_43, 2004)。International ImMunoGeneTics(IMGT)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www_imgt_org)提供了抗原結(jié)合位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化編 號(hào)和定義。⑶R、HV與IMGT劃分之間的對(duì)應(yīng)性描述于Lefranc等人，DevComparatImmunol 27 :55-77,2003〇
[0049] 如本文所用，"Chothia殘基"是抗體VL和VH殘基，其根據(jù)Al-Lazikani來編號(hào) (Al-Lazikani等人，JMolBiol273 :927-48,1997)。
[0050] "框架"或"框架序列"是可變區(qū)的除了被定義為抗原結(jié)合位點(diǎn)的那些序列之外的 其余序列。因?yàn)榭乖Y(jié)合位點(diǎn)可以由如上所述的不同術(shù)語定義，所以框架的精確氨基酸序 列取決于如何定義抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0051] "人抗體"或"完全人抗體"是指包含來源于人免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū) 序列的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括置換，因此其可能不是表達(dá)的人免疫球蛋白或種系基 因序列的精確拷貝。然而，"人抗體"的定義并不包括抗原結(jié)合位點(diǎn)來源于非人物種的抗體。
[0052] "人適應(yīng)性"抗體或"人框架適應(yīng)性（HFA)"抗體是指根據(jù)美國(guó)專利公開 No.US2009/0118127中所描述的方法適應(yīng)化的抗體，并且也指將來源于非人物種的抗原結(jié) 合位點(diǎn)序列移植到人框架的抗體。
[0053] "人源化抗體"是指其中抗原結(jié)合位點(diǎn)來源于非人物種且可變區(qū)框架來源于人免 疫球蛋白序列的抗體。人源化抗體在框架區(qū)中可包括置換，因此該框架可能不是表達(dá)的人 免疫球蛋白或種系基因序列的精確拷貝。
[0054] 如本文所用，術(shù)語"基本上相同"意指所比較的兩個(gè)抗體可變區(qū)氨基酸序列是相 同的或具有"非實(shí)質(zhì)差異"。非實(shí)質(zhì)差異是在抗體或抗體可變區(qū)序列中不會(huì)不利地影響 抗體特性的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個(gè)氨基酸的置換。與本文所公開的可變區(qū)序 列基本上相同的氨基酸序列在本申請(qǐng)范圍內(nèi)。在一些實(shí)施例中，所述序列同一性可以為 約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高?？墒褂茫?(^(^階1 V. 9. 0· 0(Invitrogen，Carslbad，CA)的AlignX模塊的默認(rèn)設(shè)置，例如通過逐對(duì)比對(duì)來測(cè)定 百分比同一性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可用作執(zhí)行公共或?qū)＠麛?shù)據(jù)庫(kù)檢索的查詢序列，以例 如識(shí)別相關(guān)序列。用于執(zhí)行此類檢索的示例性程序?yàn)槭褂媚J(rèn)設(shè)置的XBLAST或BLASTP程 序（http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)、或GenomeQuest?(GenomeQuest,Westborough，MA)套 件。
[0055] 如本文所用，術(shù)語"表位"是指抗體特異性結(jié)合的抗原的一部分。表位通常由化學(xué) 活性的（諸如極性、非極性或疏水性）表面部分組而組成，諸如氨基酸或多糖側(cè)鏈，并且可 具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定的電荷特征。表位可由形成構(gòu)象空間單元的連續(xù)和/ 或不連續(xù)氨基酸構(gòu)成。對(duì)于不連續(xù)表位而言，抗原線性序列不同部分的氨基酸，通過蛋白質(zhì) 分子的折疊，在三維空間中緊密靠近。示例性表位是以SEQIDNO:9示出的huST2L的域I。
[0056] 如本文所用，術(shù)語"互補(bǔ)位"意指抗原特異性結(jié)合的抗體的一部分?；パa(bǔ)位可以是 線狀特征的或可以是不連續(xù)的，通過抗體的非連續(xù)性氨基酸之間的空間關(guān)系所形成，而非 氨基酸的線型系列。"輕鏈互補(bǔ)位"和"重鏈互補(bǔ)位"或"輕鏈互補(bǔ)位氨基酸殘基"和"重鏈 互補(bǔ)位氨基酸殘基"分別是指與抗原相接觸的抗體輕鏈和重鏈殘基。
[0057] 如本文所用，術(shù)語"特異性結(jié)合"或"特異性地結(jié)合"是指抗體以比針對(duì)其他抗原 或蛋白質(zhì)更高的親和力結(jié)合于預(yù)定的抗原。通常，抗體以IXKT7M或更小的解離常數(shù)（Kd) 結(jié)合于預(yù)定的抗原，例如IXKT8M或更小、IXKT9M或更小、IXKTkiM或更小、IXKT11M或更 小、或IXKT12M或更小，通常Kd為其結(jié)合于非特異性抗原（例如BSA、酪蛋白或任何其他特 定多肽）的Kd的至少十倍?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)程序來測(cè)量解離常數(shù)。然而，特異性結(jié)合于預(yù)定 抗原的抗體可能對(duì)其他相關(guān)的抗原具有交叉反應(yīng)性，例如對(duì)于來自其他物種（同源）的相 同預(yù)定抗原，諸如人或猴，例如食蟹猴（Macacafascicularis)(食蟹稱猴（cynomolgus))。
[0058] 如本文所用，"雙特異性"是指結(jié)合兩個(gè)不同抗原或抗原內(nèi)的兩個(gè)不同表位的抗 體。
[0059] 如本文所用，"單特異性"是指結(jié)合一個(gè)抗原或一個(gè)表位的抗體。
[0060] 如本文所用，術(shù)語"進(jìn)行組合"是指所描述藥劑可以在混合物中、作為單一藥劑同 時(shí)地或作為單一藥劑以任何順序先后地共同向動(dòng)物施用。
[0061] 如本文所用，"炎性病癥"是指對(duì)于有害刺激諸如病原體、受損細(xì)胞、物理傷害或 刺激物的急性或慢性局部或全身性響應(yīng)，所述響應(yīng)部分由細(xì)胞因子、趨化因子或炎性細(xì)胞 (如，嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）的活性介導(dǎo)，并且所述炎性病癥在多 數(shù)情況下的特征在于疼痛、發(fā)紅、腫脹和組織功能損傷。
[0062] 如本文所用，術(shù)語"ST2L介導(dǎo)的炎性病癥"是指至少部分由于不適當(dāng)?shù)腟T2L信號(hào) 傳導(dǎo)途徑活化而造成的炎性病癥。示例性ST2L介導(dǎo)的炎性病癥是哮喘和過敏。
[0063] 如本文所用，術(shù)語"ST2L介導(dǎo)的病癥"涵蓋ST2L在疾病和醫(yī)學(xué)病癥中直接或間接 發(fā)揮作用的所有疾病和醫(yī)學(xué)病癥，包括疾病或病癥的引發(fā)、發(fā)展、進(jìn)程、持續(xù)或病變。
[0064] 如本文所用，術(shù)語"ST2L生物活性"是指由于ST2L配體IL-33結(jié)合于ST2L所出現(xiàn) 的任何活性。示例性ST2L生物活性導(dǎo)致NF-κB響應(yīng)于IL-33而活化。NF-κB活化可在用IL-33誘導(dǎo)ST2L時(shí)使用報(bào)告基因測(cè)定法測(cè)定（Fursov等人，Hybridoma30 :153-62, 2011)。 其他示例性ST2L生物活性導(dǎo)致Th2細(xì)胞的增殖，或促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的分泌，例 如IL-5、GM-CSF、IL-8、IL-10或IL-13。細(xì)胞因子和趨化因子從細(xì)胞、組織中或在循環(huán)中的 釋放可使用熟知的免疫測(cè)定法來測(cè)量，諸如ELISA免疫測(cè)定法。
[0065] 術(shù)語"載體"是指能夠在生物系統(tǒng)內(nèi)復(fù)制或可以在此類系統(tǒng)間移動(dòng)的多核苷酸。 載體多核苷酸通常含有諸如復(fù)制起點(diǎn)、聚腺苷酸化信號(hào)或選擇標(biāo)記之類的元件，其功能是 促進(jìn)這些多核苷酸在生物系統(tǒng)中的復(fù)制或保持。此類生物系統(tǒng)的例子可包括細(xì)胞、病毒、動(dòng) 物、植物和用能夠復(fù)制載體的生物組分再造的生物系統(tǒng)。包含載體的多核苷酸可以是DNA 或RNA分子或這些分子的雜交體。
[0066] 術(shù)語"表達(dá)載體"是指可用于在生物系統(tǒng)或再造生物系統(tǒng)中指導(dǎo)由存在于表達(dá)載 體中的多核苷酸序列所編碼的多肽的翻譯的載體。
[0067] 術(shù)語"多核苷酸"是指包含由糖-磷酸主鏈或其它等同的共價(jià)化學(xué)方式所共價(jià)連 接的核苷酸鏈的分子。雙鏈DNA和單鏈DNA以及雙鏈RNA和單鏈RNA是多核苷酸的典型例 子。
[0068] 術(shù)語"多肽"或"蛋白質(zhì)"是指包含至少兩個(gè)由肽鍵連接以形成多肽的氨基酸殘基 的分子。少于50個(gè)氨基酸的小多肽可以稱作"肽"。
[0069] 本文使用如下的常規(guī)單字母和三字母氨基酸代碼：
[0070]
[0071]
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的人或人適應(yīng)性抗體拮抗劑或其片段，其特異性結(jié)合人ST2L的域I (SEQ ID NO: 9)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離抗體，其中所述抗體阻斷IL-33/ST2L相互作用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離抗體，其具有介于約5 X 1(T12M至約7 X 10^1之間的對(duì) 人ST2L的解離常數(shù)（KD)，介于約ZXKfM-is-1至約IXIO^^s-1之間的對(duì)人ST2L的結(jié)合速 率常數(shù)（KJ，或介于約1 X K^s-1至約1 X lO-Y1之間的對(duì)人ST2L的解離速率常數(shù)（KJ。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離抗體，其具有介于約3X1(T12M至約2X10,之間的 對(duì)食蟹猴（ifecaca /kscicw/aris (cyno)) ST2L (SEQ ID NO: 2)的解離常數(shù)（KD)，介 于約4X lOlY1至約1 X lOlY1之間的對(duì)cyno ST2L的結(jié)合速率常數(shù)（KJ，或介于約 7X lO、-1至約1 X lO、-1之間的對(duì)cyno ST2L的解離速率常數(shù)（Koff)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離抗體，其包含： a) SEQ ID NO: 160 (XAX^XJ 的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（HCDR) 1 (HCDR1);其中 Xi 為 S、F、D、I、G 或 V ; X2為Y或D ; &為A、D或S ;并且 父4為S、F或I ; b) SEQ ID NO: 161 (X5IX6GX7GGX8TX9YADSVKG)的 HCDR 2 (HCDR2);其中 X5 為 A、S、T、Y或D ; X6 為 S、R、E、K、G 或 A ; 父7為S、E或N; X8 為 S、R、E、G、T、D 或 A ;并且 x9Sy、d、n、a*s;#& c) SEQ ID NO: 162 (X1(lXnWSTEGSFFVLDY)的 HCDR 3 (HCDR3);其中 Xn*P、A、H、Y、E、Q、L、S、N、T、V、*I;#& d) SEQ ID NO: 163 (RASQSVDDX12LA)的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（LCDR) 1 (LCDR1);其中 X12為A或D ; e) SEQ ID NO: 90 (DASNRAT)的 LCDR 2 (LCDR2);以及 f) SEQ ID NO: 164 (QQX13X14X15X16X17X 18T)的 LCDR 3 (LCDR3);其中 X13為F或Y ; X14 為 Y、I 或 N ; X15SN、G、D 或 T ; X16為W或A ; X17為P或缺失；并且 X18為L(zhǎng)或I。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離抗體，其包含： a) SEQ ID NO: 97 的 HCDR1 ; b) SEQ ID NO: 114 的 HCDR2 ; c) SEQ ID NO: 84 的 HCDR3 ; d) SEQ ID NO: 130 的 LCDR1 ; e) SEQ ID NO: 90 的 LCDR2 ;以及 f) SEQ ID NO: 134 的 LCDR3 ;或 g) SEQ ID NO: 191 的 VH 和 SEQ ID NO: 209 的 VL。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離抗體，其包含如下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDR1、 LCDR2 和 LCDR3 : a) 分別為 SEQ ID NO: 78、81、84、87、90和92; b) 分別為 SEQ ID NO: 78、81、84、130、90 和 131 ; c) 分別為 SEQ ID NO: 78、81、84、130、90和132; d) 分別為 SEQ ID NO: 78、81、84、130、90和133; e) 分別為 SEQ ID NO: 78、81、84、130、90和134; f) 分別為 SEQ ID NO: 95、109、84、130、90 和 131 ; g) 分別為 SEQ ID NO: 96、110、84、130、90 和 131 ; h) 分別為 SEQ ID NO: 97、111、84、130、90 和 131; i) 分別為 SEQ ID NO: 96、110、84、130、90 和 134; j) 分別為 SEQ ID NO: 97、111、84、130、90 和 134; k) 分別為 SEQ ID NO: 97、112、84、130、90 和 134; l) 分別為 SEQ ID NO: 98、113、84、130、90 和 134; m) 分別為 SEQ ID NO: 97、114、84、130、90和134; n) 分別為 SEQ ID NO: 97、115、84、130、90 和 134; 〇)分別為 SEQ ID NO: 99、116、84、130、90和133; 口）分別為3￡〇10勵(lì)：100、117、84、130、90和133; 9)分別為3￡〇10勵(lì)：101、118、84、130、90和133; 1〇分別為3￡〇10勵(lì)：102、120、84、130、90和132; 8)分別為3￡〇10勵(lì)：103、121、84、130、90和132; t) 分別為 SEQ ID NO: 103、122、84、130、90 和 131 ; u) 分別為 SEQ ID NO: 103、123、84、130、90 和 131 ; ￥)分別為3￡〇10勵(lì)：104、124、84、130、90和131; w) 分別為 SEQ ID NO: 105、125、84、130、90 和 131 ; x) 分別為 SEQ ID NO: 106、126、84、130、90 和 131 ; y) 分別為 SEQ ID NO: 95、127、84、130、90 和 131 ; z) 分別為 SEQ ID NO: 107、128、84、130、90 和 131 ; aa)分別為 SEQ ID NO: 108、129、84、130、90 和 131 ; bb) 分別為 SEQ ID NO: 97、114、165、130、90 和 134; cc)分別為 SEQ ID NO: 97、114、166、130、90 和 134; dd)分別為 SEQ ID NO: 97、114、167、130、90 和 134; ee)分別為 SEQ ID NO: 97、114、168、130、90 和 134; ff)分別為 SEQ ID NO: 97、114、169、130、90 和 134; gg)分別為 SEQ ID NO: 97、114、170、130、90 和 134; hh)分別為 SEQ ID NO: 97、114、171、130、90 和 134; ii)分別為 SEQ ID NO: 97、114、172、130、90 和 134; jj)分別為 SEQ ID NO: 97、114、173、130、90和134; kk)分別為 SEQ ID NO: 97、114、174、130、90和134; 11)分別為 SEQ ID NO: 97、114、175、130、90 和 134; mm)分別為 SEQ ID NO: 97、114、176、130、90 和 134; nn)分別為 SEQ ID NO: 97、114、177、130、90 和 134; 〇〇)分別為 SEQ ID NO: 97、114、178、130、90 和 134; PP)分別為 SEQ ID NO: 97、114、179、130、90 和 134; qq)分別為 SEQ ID NO: 97、114、180、130、90 和 134; rr)分別為 SEQ ID NO: 97、114、181、130、90 和 134; ss)分別為 SEQ ID NO: 97、114、182、130、90 和 134; tt)分別為 SEQ ID NO: 97、114、183、130、90 和 134; uu)分別為 SEQ ID NO: 97、114、184、130、90 和 134;或 vv)分別為 SEQ ID NO: 97、114、185、130、90和134。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離抗體，其包含如下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDR1、 LCDR2 和 LCDR3 : a) 分別為 SEQ ID NO: 23、27、31、35、39和43; b) 分別為 SEQ ID NO: 24、28、32、36、40和44; c) 分別為 SEQ ID NO: 24、28、146、36、40和147;或 d) 分別為 SEQ ID NO: 24、28、146、36、40和44。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離抗體，其中所述抗體與包含SEQ ID NO: 47的重鏈可變 區(qū)（VH)和SEQ ID NO: 51的輕鏈可變區(qū)（VL)的分離抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于人ST2L (SEQ ID NO: 1)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離抗體，其中所述抗體在SEQ ID NO: 1的第35-48位氨 基酸殘基（rcprqgkpsytvdW;SEQ ID NO: 210)處結(jié)合人 ST2L。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的分離抗體，其中所述抗體還在SEQ ID NO: 1的氨基酸殘 基T93和F94處結(jié)合人ST2L。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離抗體，其包含具有來源于人IGHV3-23 (SEQ ID NO: 158)、IGHV1_24*01 (SEQ ID NO: 148)或 IGHVl-f*01 (SEQ ID NO: 149)框架序列的 VH框 架的重鏈可變區(qū)（VH)、以及具有來源于人IGKV3-11 (L6) (SEQIDNO: 159)、IGKV3-15*01 (L2) (SEQ ID NO: 150)、IGKV1-9*01 (L8) (SEQ ID NO: 151)、IGKV1_5*01 (L12) (SEQ ID NO: 152)、IGKV1-12*01 (L5) (SEQ ID NO: 153)、IGKV1_39*01 (012) (SEQ ID NO: 154)、 IGKV1-27*01 (A20) (SEQ ID NO: 155)或 IGKV1-33*01 (018) (SEQ ID NO: 156)框架序 列的VL框架的輕鏈可變區(qū)（VL)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離抗體，其為IgGl、IgG2、IgG3或IgG4型。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離抗體，其在Fc區(qū)中具有置換。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的分離抗體，其中所述置換包括置換M252Y/S254T/T256E、 V234A/G237A/P238S/H28A/V309L/A330S/P331S 或 P238S/L234A/L235A，其中殘基編號(hào)根據(jù) EU編號(hào)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離抗體，其包含與SEQ ID NO: 191的VH具有至少90% 同一性的VH和與SEQ ID NO: 209的VL具有至少94%同一性的VL。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的分離抗體，其包含SEQ ID NO: 143、144、145、186、187、 188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204或205 的711 和 SEQ ID NO: 135、136、137、138、139、140、141、142、206、207、208 或 209 的乂1。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的分離抗體，其包含如下序列的VH和VL : a) 分別為 SEQ ID NO: 186 和 SEQ ID NO: 206; b) 分別為 SEQ ID NO: 187 和 SEQ ID NO: 206; c) 分別為 SEQ ID NO: 197 和 SEQ ID NO: 206; d) 分別為 SEQ ID NO: 198 和 SEQ ID NO: 206; e) 分別為 SEQ ID NO: 199 和 SEQ ID NO: 206; f) 分別為 SEQ ID NO: 200 和 SEQ ID NO: 206; g) 分別為 SEQ ID NO: 201 和 SEQ ID NO: 206 ; h) 分別為 SEQ ID NO: 202 和 SEQ ID NO: 206; i) 分別為 SEQ ID NO: 203 和 SEQ ID NO: 206; j) 分別為 SEQ ID NO: 204 和 SEQ ID NO: 206; k) 分別為 SEQ ID NO: 205 和 SEQ ID NO: 206; l) 分別為 SEQ ID NO: 195 和 SEQ ID NO: 207; m) 分別為 SEQ ID NO: 196 和 SEQ ID NO: 207; n) 分別為 SEQ ID NO: 188 和 SEQ ID NO: 208; 〇)分別為 SEQ ID NO: 189 和 SEQ ID NO: 208; P)分別為 SEQ ID NO: 190 和 SEQ ID NO: 208; q) 分別為 SEQ ID NO: 187 和 SEQ ID NO: 209; r) 分別為 SEQ ID NO: 191 和 SEQ ID NO: 209; s) 分別為 SEQ ID NO: 192 和 SEQ ID NO: 209; t) 分別為 SEQ ID NO: 193 和 SEQ ID NO: 209;或 u) 分別為 SEQ ID NO: 194 和 SEQ ID NO: 209。
19. 一種分離的多核苷酸，其編碼 SEQ ID NO: 143、144、145、186、187、197、198、199、 200、201、202、203、204或205 的￥11，或者5￡0 1〇吣：135、136、137、138、139、140、141、142、 206、207、208 或 209 的 VL。
20. -種載體，其包含權(quán)利要求19所述的分離多核苷酸。
21. -種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求20所述的載體。
22. -種制備權(quán)利要求18所述的抗體的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求21所述的宿 主細(xì)胞以及從所述細(xì)胞回收所述抗體。
23. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求6所述的分離抗體以及配藥學(xué)上 可接受的媒介物。
24. -種治療或預(yù)防ST2L介導(dǎo)的病癥的方法，該方法包括將治療有效量的權(quán)利要求1 或權(quán)利要求6所述的分離抗體向?qū)ζ溆行枨蟮幕颊呤┯米阋灾委熁蝾A(yù)防所述ST2L介導(dǎo)的 病癥的時(shí)間。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述ST2L介導(dǎo)的病癥是哮喘、氣道過度反 應(yīng)、結(jié)節(jié)病、慢性阻塞性肺部疾?。–OPD)、特發(fā)性肺纖維化（IPF)、囊性纖維化、炎性腸病、 (IBD)、嗜酸細(xì)胞性食道炎、硬皮病、特應(yīng)性皮炎、過敏性鼻炎、大皰性類天皰瘡、慢性蕁麻 疹、糖尿病性腎病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、間質(zhì)性膀胱炎或移植物抗宿主?。℅VHD)，或與肺中的 炎性細(xì)胞募集、杯狀細(xì)胞增生、增加的粘液分泌或肥大細(xì)胞響應(yīng)相關(guān)聯(lián)。
26. -種抑制患者體內(nèi)肥大細(xì)胞響應(yīng)的方法，該方法包括將治療有效量的權(quán)利要求1 所述的分離抗體向?qū)ζ溆行枨蟮幕颊呤┯米阋砸种扑龇蚀蠹?xì)胞響應(yīng)的時(shí)間。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述抑制肥大細(xì)胞響應(yīng)包括用50|ag/ml抗體使 人臍帶血源性肥大細(xì)胞釋放的GM-CSF、IL-5、IL-8、IL-10或IL-13的水平抑制至少50%。
28. -種在受治療者中抑制IL-33和ST2L的相互作用的方法，該方法包括以足以抑制 IL-33和ST2L的相互作用的量向所述受治療者施用特異性結(jié)合ST2L的域I的抗體。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述受治療者患有ST2L介導(dǎo)的病癥。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述ST2L介導(dǎo)的病癥是哮喘、氣道過度反 應(yīng)、結(jié)節(jié)病、慢性阻塞性肺部疾病（COPD)、特發(fā)性肺纖維化（IPF)、囊性纖維化、炎性腸病、 (IBD)、嗜酸細(xì)胞性食道炎、硬皮病、特應(yīng)性皮炎、過敏性鼻炎、大皰性類天皰瘡、慢性蕁麻 疹、糖尿病性腎病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、間質(zhì)性膀胱炎或移植物抗宿主病（GVHD)，或與肺中的 炎性細(xì)胞募集、杯狀細(xì)胞增生、或增加的粘液分泌、或肥大細(xì)胞響應(yīng)相關(guān)聯(lián)。
31. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述抗體包含： a) SEQ ID NO: 97 的 HCDR1 ; b) SEQ ID NO: 114 的 HCDR2 ; c) SEQ ID NO: 84 的 HCDR3 ; d) SEQ ID NO: 130 的 LCDR1 ; e) SEQ ID NO: 90 的 LCDR2 ;以及 f) SEQ ID NO: 134 的 LCDR3 ;或 g) SEQ ID NO: 191 的 VH 和 SEQ ID NO: 209 的 VL。
32. 用于治療的權(quán)利要求1、權(quán)利要求6或權(quán)利要求9所述的抗體。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK104411333SQ201380035058
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2013年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月30日
【發(fā)明者】K.達(dá)菲, C.希利, R.拉姆布, R.馬拉維亞, M.普拉塔, N.富索夫, J.羅, M.納索, M.托內(nèi)塔, J.惠勒, S-J.吳, L.哈爾 申請(qǐng)人:詹森生物科技公司