癌癥免疫療法的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種組合療法，其依賴于小分子免疫刺激因子，環(huán)狀-二-核苷酸(CDN)，其經(jīng)由最近發(fā)現(xiàn)的被稱為STING(干擾素基因刺激因子)的胞質(zhì)受體來(lái)活化DC，所述免疫刺激因子與經(jīng)過(guò)工程化以分泌大量DC生長(zhǎng)因子GM-CSF的同種異體人腫瘤細(xì)胞系一起配制。此組合療法可提供與有效DC活化刺激物偶合的多個(gè)腫瘤相關(guān)聯(lián)抗原，DC募集和增殖的理想?yún)f(xié)同作用。
【專利說(shuō)明】癌癥免疫療法的組合物和方法
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年6月8日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/657,574的優(yōu)先權(quán)，所 述申請(qǐng)整體并入本文，包括所有表格、附圖和權(quán)利要求。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 以下發(fā)明背景論述僅提供來(lái)幫助讀者理解本發(fā)明，且并非承認(rèn)描述或構(gòu)成本發(fā)明 的現(xiàn)有技術(shù)。
[0004] 人免疫系統(tǒng)可總體上劃分成兩個(gè)支組，其被稱為"先天性免疫"和"適應(yīng)性免疫"。 免疫系統(tǒng)的先天支組經(jīng)由包括補(bǔ)體系統(tǒng)和趨化因子/細(xì)胞因子系統(tǒng)的許多可溶性因子；和 包括肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞OC)和自然殺傷細(xì)胞的許多專門(mén)細(xì)胞類型主要負(fù) 責(zé)最初炎癥響應(yīng)。相比之下，適應(yīng)性免疫支組涉及延遲和更長(zhǎng)效的抗體響應(yīng)，以及⑶8+和 CD4+T細(xì)胞響應(yīng)，其在針對(duì)抗原的免疫記憶中發(fā)揮關(guān)鍵作用。免疫系統(tǒng)的第三支組可確定 為涉及YST細(xì)胞和具有有限T細(xì)胞受體譜系的T細(xì)胞如NKT細(xì)胞和MAIT細(xì)胞。
[0005] 對(duì)于針對(duì)抗原的有效免疫響應(yīng)，抗原呈遞細(xì)胞（APC)必須加工抗原并且在適當(dāng) MHC情境下將抗原顯示給T細(xì)胞，然后引起細(xì)胞毒性和輔助T細(xì)胞的T細(xì)胞刺激。在抗原 呈遞之后，必須發(fā)生APC和T細(xì)胞上的共刺激分子的成功相互作用，否則活化中止。GM-CSF 和IL-12在許多腫瘤模型中充當(dāng)有效促炎癥性分子。舉例來(lái)說(shuō)，GM-CSF誘導(dǎo)骨髓前驅(qū)細(xì)胞 來(lái)增殖并分化成樹(shù)突狀細(xì)胞（DC)，但是需要額外信號(hào)來(lái)將其活化至成熟成為有效抗原呈遞 細(xì)胞，所述抗原呈遞細(xì)胞是活化T細(xì)胞必不可少的。有效免疫療法的障礙包括可限制適當(dāng) 大小和功能的細(xì)胞毒性CD8T細(xì)胞的誘導(dǎo)的對(duì)于目標(biāo)抗原的耐受性、所產(chǎn)生的T細(xì)胞到達(dá) 惡性細(xì)胞位點(diǎn)的輸送不佳，和所誘導(dǎo)的T細(xì)胞響應(yīng)的持久性不佳。
[0006] 吞噬腫瘤細(xì)胞殘骸的DC加工用于主要組織相容性復(fù)合物（MHC)呈遞的材料、上調(diào) 共刺激分子的表達(dá)，并且迀移至局部淋巴節(jié)來(lái)刺激腫瘤特異性淋巴細(xì)胞。此途徑導(dǎo)致與腫 瘤相關(guān)聯(lián)抗原起反應(yīng)的CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖和活化。事實(shí)上，這類細(xì)胞可常常在患 者的血液、淋巴組織和惡性病灶中檢測(cè)到。
[0007] 免疫逃避的潛在機(jī)制的新見(jiàn)解，以及經(jīng)由與免疫檢查點(diǎn)抑制劑或其它療法組合來(lái) 直接或間接地增強(qiáng)治療性疫苗接種的效力的組合治療方案充當(dāng)開(kāi)發(fā)誘導(dǎo)有效抗腫瘤免疫 力的疫苗的基礎(chǔ)。
[0008] 基因修飾來(lái)分泌GM-CSF的腫瘤細(xì)胞已被用于各種策略中以試圖產(chǎn)生針對(duì)腫瘤的 有效免疫響應(yīng)，然而在隨機(jī)化控制試驗(yàn)中，全身細(xì)胞因子施用未誘導(dǎo)直接抗癌響應(yīng)。皮下注 射至患者體內(nèi)的經(jīng)過(guò)照射的GM-CSF分泌性腫瘤細(xì)胞已被證明刺激局部反應(yīng)，包括DC、巨噬 細(xì)胞和粒細(xì)胞。大量APC的積累暗示在此模型中的GM-CSF的一個(gè)功能涉及增強(qiáng)腫瘤抗原呈 遞。此外，腫瘤細(xì)胞疫苗證明為在患者中是安全的。然而，此方法的臨床功效仍有待證明。
[0009] 在感染情形中，Toll樣受體（"TLR"）激動(dòng)劑已被證明使得樹(shù)突狀細(xì)胞活化產(chǎn)生 免疫性，而缺乏TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可導(dǎo)致耐受性。這些研宄的含義是局部TLR刺激在作為組合 疫苗的一部分給出時(shí)可以增強(qiáng)抗腫瘤響應(yīng)。W02011139769描述配制并使用組合GM-CSF-分 泌腫瘤細(xì)胞（GVAX)疫苗，以及TLR4刺激，其據(jù)報(bào)告在多個(gè)鼠科模型中提供抗腫瘤功效。然 而，它在人中的功效仍然有待證明。
[0010] 仍然需要治療可能對(duì)傳統(tǒng)治療方法頑固性的疾病如癌癥的免疫策略的改進(jìn)組合 物和方法。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明的目標(biāo)是提供治療癌癥的組合療法。
[0013] 在第一方面，本發(fā)明提供組合物，其包括：
[0014] 一種或多種環(huán)狀嘌呤二核苷酸（"⑶N"），其結(jié)合至干擾素基因刺激因子 ("STING"）并誘導(dǎo)STING-依賴性TBK1活化；和
[0015] 滅活腫瘤細(xì)胞，其表達(dá)并分泌刺激樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)、募集和/或成熟的一種或多 種細(xì)胞因子。
[0016] 如以下描述，許多⑶N適用于本發(fā)明。優(yōu)選環(huán)狀嘌呤二核苷酸包括但不限于 c-二-AMP、c-二-GMP、c-二-MP、c-AMP-GMP、c-AMP-MP、c-GMP-MP和其類似物中的一 種或多種。這個(gè)清單并非意味著要限制。
[0017] 類似地，優(yōu)選共刺激劑包括刺激樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)、募集和/或成熟的一種或多種 細(xì)胞因子，包括但不限于GM-CSF、CD40配體、IL-12、CCL3、CCL20和CCL21中的一種或多種。 這個(gè)清單并非意味著要限制。
[0018] 本發(fā)明的組合物可以含有藥學(xué)上可接受的載體、佐劑和媒介物的制劑形式通過(guò)各 種腸胃外和非腸胃外途徑來(lái)施用至有需要的個(gè)體。優(yōu)選途徑是腸胃外，并且包括但不限于 皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)和硬膜外施用中的一者或多者。尤其優(yōu)選通過(guò)皮 下施用來(lái)施用。優(yōu)選藥物組合物配制為水性或水包油乳液。
[0019] 本發(fā)明的組合物可包括或與以下一起施用，一種或多種額外藥學(xué)活性組分如佐 劑、脂質(zhì)如毛地昔皂苷、脂質(zhì)體、CTLA-4和PD-1涂徑桔抗劑、PD-1涂徑陽(yáng)斷劑、誘導(dǎo)先天件 免疫的滅活細(xì)菌（例如，滅活或減弱的單核細(xì)胞增生利斯特菌）、經(jīng)由Toll樣受體（TLR)、 (NOD)-樣受體（NLR)、基于維甲酸可誘導(dǎo)的基因（RIG)-I-樣受體（RLR)、C-類型凝集素受 體（CLR)來(lái)介導(dǎo)先天免疫活化的組合物、病原體相關(guān)聯(lián)分子模式（"PAMP")、化學(xué)治療劑等。
[0020] 如以下描述，與一種或多種脂質(zhì)一起配制的環(huán)狀嘌呤二核苷酸可展現(xiàn)改進(jìn)的性 質(zhì)，包括改進(jìn)的樹(shù)突狀細(xì)胞活化活性。因此，本發(fā)明還涉及包括一種或多種CDN和一種或多 種脂質(zhì)的組合物。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，一種或多種CDN與毛地黃皂苷、脂質(zhì)體制劑和/ 或水包油乳化液一起配制。雖然本發(fā)明的這些制劑可在沒(méi)有表達(dá)并分泌刺激樹(shù)突狀細(xì)胞誘 導(dǎo)、募集和/或成熟的一種或多種細(xì)胞因子的滅活腫瘤細(xì)胞的情況下來(lái)施用，但是在某些 實(shí)施方案中，CDN與一種或多種脂質(zhì)的制劑連同一種或多種這類細(xì)胞系一起提供。
[0021] 在相關(guān)方面，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)個(gè)體的癌癥的免疫響應(yīng)的方法。這些方法包括將根 據(jù)本發(fā)明的組合物施用至有需要的個(gè)體，其中滅活腫瘤細(xì)胞或不同腫瘤細(xì)胞的混合物與個(gè) 體的癌癥是類型匹配的。
[0022] 在某些實(shí)施方案中，滅活腫瘤細(xì)胞或不同腫瘤細(xì)胞的混合物是同種異體腫瘤細(xì)胞 或自體腫瘤細(xì)胞或兩者的混合物。
[0023] 本發(fā)明的方法可針對(duì)治療以下癌癥的患者：結(jié)直腸癌、呼吸_消化道鱗狀癌、肺 癌、腦癌、肝癌、胃癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、子宮癌、乳腺癌、黑素 瘤、前列腺癌、胰腺癌和腎上腺癌。
[0024] 附圖簡(jiǎn)述
[0025] 圖1描繪環(huán)狀嘌呤二核苷酸（"⑶N"）介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。⑶N(例如，c-二-AMP c-二-GMP、c-AMP-GMP)具有通過(guò)磷酸橋鍵以典型雙_(3'，5'）鍵或非典型2'，5'和3'，5' 鍵來(lái)交替連接的兩個(gè)嘌呤核苷，其由c[G(2'，5'）pA(3'，5'）p]表示。典型或非典型⑶N誘 導(dǎo)NF-kB依賴性促炎癥性細(xì)胞因子和IFN-0的產(chǎn)生，方法是結(jié)合至細(xì)胞質(zhì)受體STING(干 擾素基因刺激因子），經(jīng)由TBK-1/IRF-3途徑來(lái)活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，經(jīng)由結(jié)合至IFN受體和后續(xù) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)導(dǎo)致DC的自分泌和旁分泌活化。
[0026] 圖2A描繪HIVGag的CDN輔助T-細(xì)胞響應(yīng)。
[0027] 圖2B描繪在將小鼠用圖中展示的疫苗組合物免疫接種之后，PBMC中的初級(jí)和次 級(jí)OVA-特異性CD4和CD8T細(xì)胞響應(yīng)。
[0028] 圖2C描繪使用OVA作為模型抗原、由CDN輔助疫苗誘導(dǎo)的免疫響應(yīng)。
[0029] 圖3A描繪響應(yīng)于GVAX/⑶N組合疫苗（被稱為"Stingvax"）的B16黑素瘤的生長(zhǎng) 抑制。
[0030] 圖3B描繪響應(yīng)于GVAX/⑶N組合疫苗的TRAMP-GM細(xì)胞和骨髓衍生巨噬細(xì)胞中的 干擾素-0誘導(dǎo)。
[0031] 圖4描繪響應(yīng)于GVAX/⑶N組合疫苗的B16黑素瘤的生長(zhǎng)抑制的濃度依賴性。
[0032] 圖5描繪響應(yīng)于GVAX/⑶N組合疫苗的B16黑素瘤腫瘤的⑶8+T-細(xì)胞浸潤(rùn)。
[0033] 圖6描繪響應(yīng)于GVAX/⑶N組合疫苗的成熟干擾素y-產(chǎn)生脾臟DC(⑶llc+細(xì)胞） 的誘導(dǎo)。
[0034] 圖7描繪在CDN處理后的人樹(shù)突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)，如通過(guò)共刺激分子的表達(dá)來(lái)評(píng)估。
[0035]圖8描繪在用先天性免疫的各種活化劑（包括環(huán)狀-二-GMP(CDG)、干擾素刺激 DNA(ISD)和聚肌苷-胞嘧啶（Poly1:〇)刺激之后，從15個(gè)獨(dú)立供體分離的培養(yǎng)人外周血 單核細(xì)胞中的IFN-a的表達(dá)。
[0036] 圖9描繪"STINGVAX"的協(xié)同作用機(jī)制。
[0037] 發(fā)明詳述
[0038] FDA批準(zhǔn)Pr〇venge_N(DendreonCorporation)治療去勢(shì)難治性轉(zhuǎn)移性前列腺癌 (mCRPC)已經(jīng)證實(shí)有效癌癥免疫療法作為治療領(lǐng)域并且振興這個(gè)領(lǐng)域。然而，因?yàn)榛谧泽w 樹(shù)突狀細(xì)胞OC)的疫苗，Provengex是不實(shí)用的、復(fù)雜的和昂貴的，并且只提供有限的一 盡管顯著一存活益處。改進(jìn)的癌癥疫苗應(yīng)不僅應(yīng)至少與ProvengeK -樣有效，而是應(yīng)更實(shí) 用，并且優(yōu)選地能夠引起目標(biāo)響應(yīng)。此方向上的一個(gè)步驟是ProstVacVF，一種編碼PSA和 三種共刺激分子（B7. 1、ICAM-1和Lfa-3)的基于重組痘病毒的疫苗。ProstVacVF已證明 在患有mCRPC的男性之間進(jìn)行的隨機(jī)化階段2研宄中增加總體存活-雖然存活益處未達(dá) 到p〈0. 05統(tǒng)計(jì)顯著性-并且目前在階段3功效研宄中加以評(píng)估。這些疫苗使用由正常前列 腺組織和前列腺癌的表達(dá)的單一抗原。需要用治療性疫苗接種策略來(lái)靶向多個(gè)癌癥抗原以 減少抗原損失變體的潛在負(fù)面影響、腫瘤相關(guān)聯(lián)抗原表達(dá)譜的不同患者之間的差異，或MHC 單倍體型差異，所有問(wèn)題利用單一TAA疫苗接種策略。
[0039]本發(fā)明涉及新穎和高度活性組合療法，其依賴小分子免疫刺激因子，環(huán)狀_二-核 苷酸（CDN)，其經(jīng)由最近發(fā)現(xiàn)的被稱為STING(干擾素基因刺激因子）的胞質(zhì)受體來(lái)活化 DC，所述免疫刺激因子與經(jīng)過(guò)工程化以分泌大量DC生長(zhǎng)因子GM-CSF的經(jīng)過(guò)照射的同種異 體人腫瘤細(xì)胞系一起配制。此組合療法可提供與有效DC活化刺激物（CDN)偶合的多個(gè)腫 瘤相關(guān)聯(lián)抗原，DC募集和增殖（GM-CSF)的理想?yún)f(xié)同作用。
[0040] ⑶N環(huán)狀-二-AMP(由單核細(xì)胞增生利斯特菌產(chǎn)生）和它的類似物環(huán) 狀-二-GMP(由嗜肺軍團(tuán)菌產(chǎn)生）被宿主細(xì)胞辨識(shí)為PAMP(病原體相關(guān)分子模式），其結(jié)合 至被稱為STING的PRR(病原體識(shí)別受體）。STING是宿主哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的銜接 蛋白質(zhì)，其活化TANK結(jié)合激酶（TBK1) -IRF3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸，導(dǎo)致誘導(dǎo)IFN-0和強(qiáng)烈活化先 天性免疫力的其它IRF-3依賴性基因產(chǎn)物。現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到STING是宿主細(xì)胞質(zhì)監(jiān)測(cè)途徑的組 成部分，其感測(cè)細(xì)胞內(nèi)病原體的感染并且作為響應(yīng)，誘導(dǎo)IFN-0的產(chǎn)生，導(dǎo)致顯現(xiàn)適應(yīng)性 保護(hù)病原體特異性免疫響應(yīng)，所述免疫響應(yīng)由抗原特異性CD4和CD8T細(xì)胞以及病原體特異 性抗體組成。
[0041] 定義
[0042] "施用"在本文中關(guān)于人、哺乳動(dòng)物、哺乳動(dòng)物受試者、動(dòng)物、獸醫(yī)受試者、安慰劑受 試者、研宄受試者、實(shí)驗(yàn)受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體使用時(shí)，是指不限于外源性配 體、試劑、安慰劑、小分子、藥劑、治療劑、診斷劑或組合物與受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物 流體等接觸。"施用"可意指例如治療、藥代動(dòng)力學(xué)、診斷、研宄、安慰劑和實(shí)驗(yàn)方法。細(xì)胞 的處理涵蓋試劑與細(xì)胞接觸，以及試劑與流體接觸，其中流體與細(xì)胞接觸。"施用"也涵蓋試 劑、診斷劑、結(jié)合組合物或由另一個(gè)細(xì)胞在體外和離體處理例如細(xì)胞。"一起施用"不意味著 暗指兩種或更多種藥劑以單一組合物來(lái)施用。雖然本發(fā)明涵蓋以單一組合物來(lái)施用，但是 這類藥劑可以單獨(dú)施用來(lái)遞送至單一受試者，這些施用可在相同或不同時(shí)間，并且可通過(guò) 相同施用途徑或不同施用途徑。
[0043] 所謂"純化"和"分離"是指指定物質(zhì)占存在于組合物中的物質(zhì)的至少50重量％、 更經(jīng)常占至少60重量％、通常占至少70重量％、更通常占至少75重量％、最通常占至少80 重量％、通常占至少85重量％、更通常占至少90重量％、最通常占至少95重量％并且通常 占至少98%重量或更大。水、緩沖劑、鹽、洗滌劑、還原劑、蛋白酶抑制劑、穩(wěn)定劑（包括添加 的蛋白質(zhì)如白蛋白）和賦形劑的重量總體上不用于確定純度。
[0044] "特異性"或"選擇性"結(jié)合，在涉及配體/受體、核酸/互補(bǔ)核酸、抗體/抗原或其 它結(jié)合對(duì)（例如，細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體）（各自總體上在本文中稱為"靶標(biāo)生物分子"或 "靶標(biāo)"）時(shí)，指示與蛋白質(zhì)和其它生物制劑的異質(zhì)群體中的靶標(biāo)的存在相關(guān)的結(jié)合反應(yīng)。特 異性結(jié)合可意味著，例如，從所涵蓋方法的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)衍生的結(jié)合化合物、核酸配 體、抗體或結(jié)合組合物以比與非靶標(biāo)分子的親和力經(jīng)常大至少25%、更經(jīng)常大至少50%、 最經(jīng)常大至少100% (2倍）、通常大至少十倍、更通常大至少20倍并且最通常大至少100 倍的親和力結(jié)合至它的靶標(biāo)。
[0045] "配體"是指結(jié)合至靶標(biāo)生物分子的小分子、核酸、肽、多肽、糖、多糖、聚糖、糖蛋 白、糖脂或其組合。雖然這類配體可為激動(dòng)劑或拮抗劑受體，但是配體也涵蓋并非激動(dòng)劑或 拮抗劑，并且不具有激動(dòng)或拮抗性質(zhì)的結(jié)合劑。配體對(duì)于它的同源靶標(biāo)的特異性結(jié)合經(jīng)常 根據(jù)"親和力"來(lái)表示。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的配體以約10言 1與約10I1之間的親 和力結(jié)合。親和力計(jì)算為〇%胃是解離速率常數(shù)，是締合速率常數(shù)并且 Kd是平衡常數(shù)）。
[0046] 親和力可通過(guò)測(cè)量各種濃度（c)下的標(biāo)記配體的結(jié)合分率（r)來(lái)在平衡狀態(tài)下確 定。數(shù)據(jù)使用斯卡查德方程來(lái)繪制：r/c=K(n-r):其中r=平衡狀態(tài)下的結(jié)合配體的摩爾 數(shù)/受體的摩爾數(shù)；c=平衡狀態(tài)下的游離配體濃度；K=平衡締合常數(shù)；并且n=每個(gè)受體 分子的配體結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目。通過(guò)圖解分析，r/c相比于X軸上的r來(lái)在Y軸上作圖，由此 產(chǎn)生斯卡查德（Scatchard)繪圖。通過(guò)斯卡查德分析的親和力測(cè)量在本領(lǐng)域中是熟知的。 參見(jiàn)例如vanErp等人，J.Immunoassay12:425-43, 1991;Nelson和Griswold,Comput. MethodsProgramsBiomed. 27:65-8, 1988。在替代方案中，親和力可通過(guò)等溫滴定量熱 (ITC)來(lái)測(cè)量。在典型ITC實(shí)驗(yàn)中，將配體溶液滴定至它的同源靶標(biāo)的溶液中。在其相互 作用后的釋放的熱量（AH)隨著時(shí)間的推移加以監(jiān)測(cè)。因?yàn)檫B續(xù)量的配體滴定至ITC細(xì)胞 中，吸收或釋放的熱量與結(jié)合量成正比。隨著系統(tǒng)到達(dá)飽和，熱量信號(hào)減弱直到只觀察到稀 釋熱為止。然后，結(jié)合曲線從每次注射的熱量相對(duì)于細(xì)胞中的配體與結(jié)合搭配物與比率的 繪圖來(lái)獲得。結(jié)合曲線用適當(dāng)結(jié)合模型分析以確定KB、n和AH。注意KB=1/Kd。
[0047] 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"受試者"是指人或非人生物體。因此，本文所述的方法和組合 物可適用于人和獸醫(yī)疾病。在某些實(shí)施方案中，受試者是"患者"，即接受疾病或病狀的醫(yī)療 護(hù)理的活人。這包括針對(duì)病理體征進(jìn)行研宄的未患有所定義疾病的人。優(yōu)選是目前診斷患 有由本發(fā)明的組合物和方法靶向的特定癌癥的受試者。用本文所述的組合物治療的優(yōu)選癌 癥包括但不限于前列腺癌、腎癌、黑素瘤、胰癌、宮頸癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、頭和頸癌、肺癌和 乳腺癌。
[0048] "治療有效量"定義為足以展示患者益處，S卩，導(dǎo)致所治療的病狀的癥狀減少、預(yù)防 或改善的試劑或藥物組合物的量。當(dāng)試劑或藥物組合物包括診斷劑時(shí)，"診斷有效量"定義 為足以產(chǎn)生信號(hào)、圖像或其它診斷參數(shù)的量。藥物制劑的有效量根據(jù)因素如個(gè)體的易患病 程度，個(gè)體的年齡、性別和體重，和個(gè)體的特質(zhì)響應(yīng)而變化。"有效量"涵蓋不限于可改善、逆 轉(zhuǎn)、減輕、預(yù)防或診斷醫(yī)學(xué)病狀或病癥的癥狀或病征或其致病過(guò)程的量。除非另外明確地或 通過(guò)上下文來(lái)規(guī)定，否則"有效量"不限于足以改善病狀的最小量。
[0049] "治療（treatment) "或"治療（treating) "（關(guān)于病狀或疾?。┦谦@得包括并且 優(yōu)選地臨床結(jié)果的有利或所需結(jié)果的方法。出于本發(fā)明目的，關(guān)于疾病的有利或所需結(jié)果 包括但不限于以下一個(gè)或多個(gè)：預(yù)防疾病、改善與疾病相關(guān)聯(lián)的病狀、治愈疾病、減輕疾病 的嚴(yán)重性、延緩疾病進(jìn)程、減輕與疾病相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)癥狀、增加患有疾病的人的生活 質(zhì)量和/或延長(zhǎng)存活。同樣地，出于本發(fā)明目的，關(guān)于病狀的有利或所需結(jié)果包括但不限于 以下一個(gè)或多個(gè)：預(yù)防病狀、改善病狀、治愈病狀、減輕病狀的嚴(yán)重性、延緩病狀的進(jìn)程、減 輕與病狀相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)癥狀、增加患有病狀的人的生活質(zhì)量和/或延長(zhǎng)存活。例如， 在其中本文所述的組合物用于治療癌癥的實(shí)施方案中，有利或所需結(jié)果包括但不限于以下 一個(gè)或多個(gè)：減少贅生或癌細(xì)胞的增殖（或?qū)ζ溥M(jìn)行破壞）、減少在癌癥中發(fā)現(xiàn)的贅生細(xì)胞 的轉(zhuǎn)移、縮小腫瘤的尺寸、減少由癌癥產(chǎn)生的癥狀、增加患有癌癥的人的生活質(zhì)量、減少治 療疾病所需要的其它藥物的劑量、延緩癌癥的進(jìn)程和/或延長(zhǎng)患有癌癥的患者的存活。取 決于上下文，"治療"受試者可暗示受試者需要治療，例如，在受試者包括預(yù)期通過(guò)施用試劑 來(lái)改善的病癥的情況中。
[0050] 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"是指由一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白基因或其片段衍生、對(duì) 其進(jìn)行仿效或基本上由其編碼的肽或多肽，所述肽或多肽能夠特異性結(jié)合抗原或表位。 參見(jiàn)例如FundamentalImmunology,第 3 版，W.E.Paul編，RavenPress,N.Y. (1993);Wilson(1994 ；J.Immunol.Methods175:267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys. Methods25:85-97。術(shù)語(yǔ)抗體包括保持結(jié)合抗原的能力的抗原結(jié)合部分，即"抗原結(jié)合位 點(diǎn)"（例如、片段、子序列、互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R))，包括：（i)Fab片段，其為由VL、VH、CL和CH1 結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；（ii)F(ab'）2片段，其為包含由在鉸鏈區(qū)的二硫橋鍵連接的兩個(gè) Fab片段的二價(jià)片段；（iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；（iv)由抗體的單臂的VL 和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；（v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段（Ward等人（1989)Nature 341:544-546);和（vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)。單鏈抗體也包括于術(shù)語(yǔ)"抗體"中供參 考。
[0051] 免痔調(diào)節(jié)細(xì)朐系
[0052]"滅活腫瘤細(xì)胞"是指經(jīng)過(guò)處理以防止細(xì)胞分裂的腫瘤細(xì)胞（對(duì)于患者為"自體" 或"同種異體"）。出于本發(fā)明的目的，這類細(xì)胞保持其免疫原性和其代謝活性。作為癌癥 療法的一部分，這類腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)基因修飾以表達(dá)在患者體內(nèi)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因。因此，本發(fā)明 的組合物或疫苗包括贅生（例如，腫瘤）細(xì)胞，其對(duì)于經(jīng)歷治療的患者為自體或同種異體的 并且最優(yōu)選地是與困擾患者的細(xì)胞相同的一般類型的腫瘤細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，通常向患有黑 素瘤的患者施用從黑素瘤得到的基因修飾細(xì)胞。將用于本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞滅活的方法，如 使用照射在本領(lǐng)域中是熟知的。
[0053] 本發(fā)明的滅活腫瘤細(xì)胞與一種或多種共刺激分子或試劑一起施用至患者。優(yōu)選共 刺激劑包括刺激樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)、募集和/或成熟的一種或多種細(xì)胞因子。評(píng)估這類共刺 激劑的方法在文獻(xiàn)中為熟知的。DC的誘導(dǎo)和成熟通常通過(guò)在刺激之后某些膜分子如CD80 和⑶86的增加的表達(dá)，和/或如IL-12和I型干擾素的促炎癥性細(xì)胞因子的分泌來(lái)評(píng)估。
[0054] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，將滅活腫瘤細(xì)胞本身修飾以表達(dá)并分泌刺激樹(shù)突狀細(xì)胞誘 導(dǎo)、募集和/或成熟的一種或多種細(xì)胞因子。本發(fā)明關(guān)于GM-CSF的使用來(lái)示例性地描述。因 此，舉例來(lái)說(shuō)，腫瘤細(xì)胞可表達(dá)編碼GM-CSF的轉(zhuǎn)基因如美國(guó)專利號(hào)5, 637, 483、5, 904, 920、 6, 277, 368和6, 350, 445以及美國(guó)專利公布號(hào)20100150946中所描述，所述專利各自明確通 過(guò)引用并入本文。用于治療胰癌的GM-CSF表達(dá)性基因修飾癌細(xì)胞形式或"細(xì)胞因子表達(dá)性 細(xì)胞疫苗"描述于美國(guó)專利號(hào)6, 033, 674和5, 985, 290中，所述專利均明確通過(guò)引用并入本 文。
[0055] 代替或與GM-CSF-起，可由這類滅活腫瘤細(xì)胞和/或旁觀者細(xì)胞表達(dá)的其它合適 細(xì)胞因子包括但不限于⑶40配體、IL-12、CCL3、CCL20和CCL21中的一個(gè)或多個(gè)。這個(gè)清 單并非意味著要限制。
[0056] 雖然施用至受試者的滅活腫瘤細(xì)胞表達(dá)所感興趣的一種或多種細(xì)胞因子是優(yōu)選 的，但是腫瘤細(xì)胞系可伴隨有滅活旁觀者細(xì)胞系，其表達(dá)并分泌刺激樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)、募集 和/或成熟的一種或多種細(xì)胞因子。旁觀者細(xì)胞系可提供刺激樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)、募集和/或 成熟的所有細(xì)胞因子，或可補(bǔ)充由滅活腫瘤細(xì)胞表達(dá)并分泌的刺激樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)、募集 和/或成熟的細(xì)胞因子。舉例來(lái)說(shuō)，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)性旁觀者細(xì)胞系公開(kāi)于美國(guó)專 利號(hào) 6, 464, 973 和 8, 012, 469 中Dessureault等人，Ann.Surg.Oncol. 14:869-84, 2007 以 及Eager和Nemunaitis,Mol.Ther. 12:18-27, 2005,所述專利各自明確通過(guò)引用并入本文。
[0057] "粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)多肽"是指具有免疫調(diào)節(jié)活性并且與 66仙&1^登錄號(hào)44452122.1具有至少約85%氨基酸序列一致性的細(xì)胞因子或其片段。
[0058] 環(huán)狀嘌呤二核苷酸
[0059] 如本文描述，這些共刺激劑中的另一個(gè)是環(huán)狀嘌呤二核苷酸，其結(jié)合至STING并 且誘導(dǎo)STING依賴性TBK1活化。可包括在內(nèi)的其它共刺激分子在以下描述。
[0060] 原核以及真核細(xì)胞使用各種小分子用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間通信。 環(huán)狀核苷酸如cGMP、cAMP等已知在原核和真核細(xì)胞具有調(diào)控和引發(fā)活性。不同于真核細(xì) 胞，原核細(xì)胞也使用環(huán)狀嘌呤二核苷酸作為調(diào)控分子。在原核生物中，兩個(gè)GTP分子的縮合 通過(guò)酶雙鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（DGC)來(lái)催化以給出c-diGMP，其代表細(xì)菌中的重要調(diào)控因子。
[0061] 最近研宄暗示環(huán)狀diGMP或其類似物也可刺激或增強(qiáng)患者中的免疫或炎癥響應(yīng) 或可通過(guò)充當(dāng)哺乳動(dòng)物中的佐劑來(lái)增強(qiáng)對(duì)于疫苗的免疫響應(yīng)。病原體衍生DNA的細(xì)胞質(zhì)檢 測(cè)需要經(jīng)由TANK結(jié)合激酶1 (TBK1)和它的下游轉(zhuǎn)錄因子IFN-調(diào)控因子3 (IRF3)來(lái)信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)。稱為STING的跨膜蛋白質(zhì)（IFN基因的刺激因子；也稱為MITA、ERIS、MPYS和TMEM173) 充當(dāng)這些環(huán)狀嘌呤二核苷酸的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，導(dǎo)致刺激TBK1-IRF3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸和STING依 賴性I型干擾素響應(yīng)。參見(jiàn)例如圖1。Burdette等人，Nature478:515-18, 2011證明STING 直接結(jié)合至環(huán)狀雙鳥(niǎo)苷酸單磷酸，但是不結(jié)合至其它不相關(guān)的核苷酸或核酸。
[0062] 用于本發(fā)明的合適環(huán)狀嘌呤二核苷酸相當(dāng)詳細(xì)地描述于例如美國(guó)專 利號(hào) 7, 709458 和 7, 592, 326 ;TO2007/054279 ;和Yan等人，Bioorg.Med.Chem Lett. 18:5631(2008)中，其各自通過(guò)引用并入本文。優(yōu)選環(huán)狀嘌呤二核苷酸包括但不限于 c-二-AMP、c-二-GMP、c-二-MP、c-AMP-GMP、c-AMP-MP和c-GMP-MP，和其類似物，包括 但不限于硫代磷酸酯類似物。
[0063] 佐齊1丨
[0064] 除如上所述的滅活腫瘤細(xì)胞和環(huán)狀嘌呤二核苷酸之外，本發(fā)明的組合物可進(jìn)一 步包括一種或多種額外物質(zhì)，由于其輔助性質(zhì)，所述額外物質(zhì)可起作用來(lái)刺激免疫系統(tǒng)以 對(duì)存在于滅活腫瘤細(xì)胞上的癌癥抗原起響應(yīng)。這類佐劑包括但不限于脂質(zhì)、脂質(zhì)體、誘導(dǎo) 先天性免疫的滅活細(xì)菌（例如，滅活或減弱的單核細(xì)胞增生利斯特菌）、經(jīng)由Toll樣受 體（TLR)、（NOD)-樣受體（NLR)、基于維甲酸可誘導(dǎo)的基因（RIG)-I-樣受體（RLR)和/ 或C-型凝集素受體（CLR)來(lái)介導(dǎo)先天免疫活化的組合物。PAMP的實(shí)例包括脂蛋白、月旨 多肽、肽聚糖、酵母多糖、脂多糖、奈瑟氏菌孔蛋白、鞭毛蛋白、抑制蛋白、半乳糖神經(jīng)酰胺 (galactoceramide)、胞壁酰二肽。肽聚糖、脂蛋白和脂磷壁酸是革蘭氏陽(yáng)性的細(xì)胞壁組分。 脂多糖由大多數(shù)細(xì)菌表達(dá)，其中MPL是一個(gè)實(shí)例。鞭毛蛋白是指由致病和共生細(xì)菌分泌的 細(xì)菌鞭毛的結(jié)構(gòu)部件。a-半乳糖基神經(jīng)酰胺（a-GalCer)是自然殺傷細(xì)胞T(NKT)細(xì)胞 的活化劑。胞壁酰二肽是所有細(xì)菌共有的生物活性肽聚糖基元。這個(gè)清單并非意味著要限 制。優(yōu)選佐劑組合物在以下描述。
[0065] CTLA-4和PD-1涂徑桔抗劑
[0066] CTLA-4被認(rèn)為是適應(yīng)性免疫響應(yīng)的重要負(fù)性調(diào)控因子?；罨腡細(xì)胞上調(diào) CTLA-4,其以比⑶28高的親和力結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞上的⑶80和⑶86,由此抑制T-細(xì)胞刺 激、IL-2基因表達(dá)和T-細(xì)胞增殖。CTLA4阻滯的抗腫瘤效應(yīng)已經(jīng)在結(jié)腸癌、轉(zhuǎn)移性前列腺 癌和轉(zhuǎn)移性黑素瘤的鼠科模型中觀察到。
[0067] 伊匹珠單抗（Yervoy?)和曲利木單抗是結(jié)合至人CTLA4并且防止它與⑶80和 CD86的相互作用的人源化單克隆抗體。使用伊匹珠單抗和曲利木單抗的I期和II期研宄 證明在癌癥患者中的臨床活性?？赏ㄟ^(guò)類似策略來(lái)靶向的其它負(fù)性免疫調(diào)控因子包括程序 性細(xì)胞死亡1、B和T淋巴細(xì)胞弱化子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子0、白介素-10和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。
[0068] ro-i是在活化T-細(xì)胞上表達(dá)的適應(yīng)性免疫響應(yīng)的另一種負(fù)性調(diào)控因子。ro-i結(jié) 合至B7-H1和B7-DC，并且H)-l的接合抑制T-細(xì)胞活化。已經(jīng)證明H)-l途徑阻滯的抗腫 瘤效應(yīng)。BMS-936558、MK3475、CT-011、AMP-224和MDX-1106在文獻(xiàn)中報(bào)告是可適用于本發(fā) 明的ro-i途徑阻滯劑的實(shí)例。
[0069] TLR激動(dòng)劑
[0070] 如本文使用，術(shù)語(yǔ)"Toll樣受體"（或"TLR"）是指感測(cè)微生物產(chǎn)物且/或啟始適 應(yīng)性免疫響應(yīng)的Toll樣受體家族蛋白質(zhì)或其片段的成員。在一個(gè)實(shí)施方案中，TLR活化樹(shù) 突狀細(xì)胞0)C)。Toll樣受體（TLR)是最初被識(shí)別為辨識(shí)微生物病原體的先天免疫系統(tǒng)的 傳感器的模式識(shí)別受體家族。TLR包括保守性跨膜分子家族，其含有富含亮氨酸重復(fù)序列 的胞外域、跨膜域和細(xì)胞內(nèi)TIR(Toll/IL-lR)域。TLR辨識(shí)微生物中的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，經(jīng)常被稱 為"PAMP"（病原體相關(guān)聯(lián)分子模式）。配體結(jié)合至TLR引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的級(jí)聯(lián)， 誘導(dǎo)涉及炎癥和免疫的因子的產(chǎn)生。
[0071] 在人體內(nèi)，已經(jīng)識(shí)別十種TLR。在細(xì)胞表面上表達(dá)的TLR包括TLR-1、-2、-4、-5 和-6,而TLR-3、-7/8和-9表達(dá)于ER區(qū)室。人樹(shù)突狀細(xì)胞子集可基于獨(dú)特TLR表達(dá)模式來(lái) 識(shí)別。舉例來(lái)說(shuō)，骨髓或"常規(guī)"子集的DC(mDC)在被刺激時(shí)表達(dá)TLR1-8,并且產(chǎn)生活化 標(biāo)志物（例如CD80、CD86、MHCI類和II類、CCR7)、促炎癥性細(xì)胞因子和趨化因子的級(jí)聯(lián)。 此刺激和所產(chǎn)生的表達(dá)的結(jié)果是抗原特異性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞初免（priming)。這些DC 獲得吸收抗原并且將其以適當(dāng)形式呈遞至T細(xì)胞的增強(qiáng)能力。相比之下，類漿細(xì)胞子集的 DC(pDC)在活化后只表達(dá)TLR7和TLR9,并且導(dǎo)致NK細(xì)胞以及T-細(xì)胞的活化。因?yàn)樗劳瞿[ 瘤細(xì)胞可不利地影響DC功能，所以提出用TLR激動(dòng)劑來(lái)活化DC可有利于以治療癌癥的免 疫療法途徑來(lái)初免抗腫瘤免疫力。也提出使用輻射和化療來(lái)成功治療乳腺癌需要TLR4活 化。
[0072] 在本領(lǐng)域中已知并且適用于本發(fā)明的TLR激動(dòng)劑包括但不限于以下：
[0073]Pam3Cys，TLR-1/2 激動(dòng)劑；
[0074]CFA，TLR-2 激動(dòng)劑；
[0075]MALP2,TLR-2 激動(dòng)劑；
[0076]Pam2Cys，TLR-2 激動(dòng)劑；
[0077]FSL-1，TLR_2 激動(dòng)劑；
[0078]Hib-OMPC，TLR-2 激動(dòng)劑；
[0079]聚核糖肌苷酸：聚核糖酸胞苷酸（PolyI:C)，TLR-3激動(dòng)劑；
[0080]聚腺苷-聚尿苷酸（polyAU)，TLR-3激動(dòng)劑；
[0081] 用聚-L-賴氨酸和羧甲基纖維素穩(wěn)定化的聚肌苷酸-聚胞苷酸（Hiltonol?)， TLR-3激動(dòng)劑；
[0082]單磷酰脂質(zhì)A(MPL)，TLR-4激動(dòng)劑；
[0083]LPS，TLR-4 激動(dòng)劑；
[0084] 細(xì)菌鞭毛蛋白，TLR-5激動(dòng)劑；
[0085]唾液酸-Tn(STn)，與許多人癌細(xì)胞上的MUC1粘蛋白相關(guān)聯(lián)的碳水化合物和TLR-4 激動(dòng)劑；
[0086] 咪喹莫特，TLR-7激動(dòng)劑；
[0087] 雷西莫特，TLR-7/8激動(dòng)劑；
[0088] 洛索立賓，TLR-7/8激動(dòng)劑；和
[0089] 非甲基化CpG二核苷酸（CpG-ODN)，TLR-9激動(dòng)劑。
[0090] 因?yàn)槠漭o助性質(zhì)，TLR激動(dòng)劑優(yōu)選地與其它疫苗、佐劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑組合使 用，并且可以各種組合來(lái)組合。因此，在某些實(shí)施方案中，如本文描述的結(jié)合至STING并誘 導(dǎo)STING依賴性TBK1活化的環(huán)狀嘌呤二核苷酸和表達(dá)并分泌刺激樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)、募集和 /或成熟的一種或多種細(xì)胞因子的滅活腫瘤細(xì)胞可與用于治療用途的一種或多種TLR激動(dòng) 劑一起施用。
[0091] 脂質(zhì)和脂質(zhì)體
[0092] 脂質(zhì)體是由一個(gè)（"單層"）或多個(gè)（"多層"）磷脂層形成的囊泡。因?yàn)榱字Y(jié)構(gòu) 單元的兩親性，所以脂質(zhì)體通常包括親水層，及呈現(xiàn)親水外表面并且封閉親水核心。脂質(zhì)體 在并入親水性/疏水性組分中的多功能性、其無(wú)毒性質(zhì)、生物降解性、生物相容性、佐劑性、 誘導(dǎo)細(xì)胞免疫、持續(xù)釋放性質(zhì)和迅速由巨噬細(xì)胞吸收使得其成為遞送抗原的有吸引力的候 選物。
[0093] 以引用方式整體并入本文的W02010/104833描述脂質(zhì)體制劑，其包括：
[0094] a)水性媒介物；
[0095] b)脂質(zhì)體，其包括
[0096] ⑴二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿（"DMPC"），
[0097] (ii)二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（"DMPG"），二肉豆蔻三甲基銨丙烷（"DMTAP"），或 DMPG和DMTAP，
[0098] 和
[0099] (iii)至少一種固醇衍生物；和
[0100]c) 一種或多種免疫原性多肽或碳水化合物，其共價(jià)連接至1%與100%之間的所 述至少一種固醇衍生物。
[0101] 以上提及的具有或不具有"免疫原性多肽或碳水化合物"的這類脂質(zhì)體制劑，在本 文中稱為VesiVax?((MolecularExpress,Inc.)，可含有一種或多種額外組分如肽聚糖、 脂肽、脂多糖、單磷酰脂質(zhì)A、脂磷壁酸、雷西莫特、咪喹莫特、鞭毛蛋白、含有非甲基化CpG 基元的寡核苷酸、0 _半乳糖基神經(jīng)酰胺、胞壁酰二肽、全反式維甲酸、雙鏈病毒RNA、熱休 克蛋白質(zhì)、二十八烷基二甲基溴化銨、陽(yáng)離子表面活性劑、toll樣受體激動(dòng)劑、二肉豆蔻三 甲基銨丙烷和nod樣受體激動(dòng)劑。有利地，這些脂質(zhì)體制劑可用于遞送根據(jù)本發(fā)明的一種 或多種環(huán)狀嘌呤二核苷酸。
[0102] 此外，雖然以上論述的脂質(zhì)體制劑使用"類固醇衍生物"作為將免疫原性多肽或碳 水化合物連接至脂質(zhì)體的錨定物，但是類固醇可僅以未偶聯(lián)類固醇如膽固醇形式來(lái)提供。 [0103] 從脂質(zhì)混合物來(lái)制備脂質(zhì)體的合適方法在本領(lǐng)域中是熟知的。參見(jiàn)例如 Basu&Basu,LiposomeMethodsandProtocols(MethodsinMolecularBiology),Humana Press,2002；Gregoriadis,LiposomeTechnoloRy,第 3 版，InformaHealthcare,2006。優(yōu) 選方法包括其中描述的擠出、均質(zhì)化和超聲處理方法。制備用于本發(fā)明的脂質(zhì)體的示例性 方法，包括干燥脂質(zhì)混合物，隨后在水性媒介物中水化并且超聲處理以形成脂質(zhì)體，描述于 W02010/104833 中。
[0104] 在某些實(shí)施方案中，提供在特定平均大小范圍內(nèi)的脂質(zhì)體?？蛇x擇脂質(zhì)體大小，方 法是例如通過(guò)將包含脂質(zhì)體的水性媒介物經(jīng)由具有預(yù)選孔徑的膜擠出并且收集流經(jīng)膜的 材料。在優(yōu)選實(shí)施方案中，脂質(zhì)體選擇為基本上在50與500nm之間的直徑，更優(yōu)選地基本 上在50與200nm之間的直徑，并且最優(yōu)選地基本上在50與150nm之間的直徑。在這種情 況下，如本文使用術(shù)語(yǔ)"基本上"意指至少75 %、更優(yōu)選地80 %并且最優(yōu)選地至少90 %的脂 質(zhì)體在指定范圍內(nèi)。
[0105] 可適用本發(fā)明的其它脂質(zhì)和脂質(zhì)樣佐劑包括水包油（〇/w)乳液（參見(jiàn)，例如， Muderhwa等人，J.Pharmaceut.Sci. 88:1332-9,1999))、VesiVax?TLR(Molecular Express，Inc.)、毛地黃皂苷（參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利5, 698, 432)和吡喃葡萄糖基脂質(zhì)（參 見(jiàn)，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)20100310602)。
[0106] 化學(xué)治療劑
[0107] 在額外實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步涉及向受試者施用有效量的一種或多種化學(xué) 療法作為患者腫瘤的額外治療。在某些實(shí)施方案中，一種或多種化療治療劑選自醋酸阿比 特龍、六甲蜜胺、脫水長(zhǎng)春堿、奧里斯他?。╝uristatin)、貝沙羅?。╞exarotene)、比卡魯 胺、BMS184476、2, 3, 4, 5, 6-五氟-N- (3-氟基-4-甲氧基苯基）苯磺酰胺、博來(lái)霉素、N，N-二 甲基-L-纈氨酰基-L-纈氨酰基-N-甲基-L-纈氨?；?L-脯氨?；?1-L脯氨酸-叔-丁 酰胺、惡病質(zhì)素、西馬多丁、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、3'，4' -雙脫氫-4' -脫氧-8' -降長(zhǎng)春 花堿、多烯紫衫醇、多西他賽、環(huán)磷酰胺、卡鉑、卡莫司汀、順鉑、念珠藻素、環(huán)磷酰胺、阿糖胞 苷、達(dá)卡巴嗪OTIC)、更生霉素、柔紅霉素、地西他濱多拉司他汀、多柔比星（阿霉素）、依托 泊苷、5-氟尿嘧啶、非那雄胺、氟他胺、羥基脲和羥基脲紫杉烷、異環(huán)磷酰胺、利羅唑、氯尼達(dá) 明、洛莫司?。–CNU)、MDV3100、二氯甲基二乙胺（氮芥）、美法侖、米伏布林羥乙基磺酸鹽、 根霉素、sertenef、鏈佐星、絲裂霉素、甲氨蝶呤、紫杉烷類、尼魯米特、奧那司酮、紫杉醇、潑 尼莫司汀、丙卡巴肼、RPR109881、磷酸雌莫司汀、他莫西芬、他索納明、紫杉醇、維A酸、長(zhǎng)春 堿、長(zhǎng)春新堿、硫酸長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春氟寧。
[0108] 藥物組合物
[0109] 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"藥物"是指預(yù)定用于治愈、治療或預(yù)防疾病并且經(jīng)受美國(guó) 食品和藥物管理局（或其非美國(guó)的相應(yīng)部門(mén)）成為處方或非處方藥物產(chǎn)品的批準(zhǔn)過(guò)程 的化學(xué)物質(zhì)。配制并施用這類組合物的技術(shù)的詳細(xì)資料可見(jiàn)于Remington,TheScience andPracticeofPharmacy第 21 版（MackPublishingCo. ,Easton,PA)以及Nielloud 和Marti-Mestres,PharmaceuticalEmulsionsandSuspensions:第 2 版(Marcel Dekker,Inc,NewYork)〇
[0110] 出于本公開(kāi)目的，藥物組合物可通過(guò)包括口服、腸胃外、吸入噴霧、局部或經(jīng)直腸 的各種手段以含有藥學(xué)上可接受的載體、佐劑和媒介物的制劑形式來(lái)施用。如本文使用的 術(shù)語(yǔ)腸胃外包括但不限于使用各種輸注技術(shù)來(lái)皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)和 硬膜外注射。如本文使用的動(dòng)脈內(nèi)和靜脈內(nèi)注射包括經(jīng)由導(dǎo)管來(lái)施用。也涵蓋經(jīng)由冠狀動(dòng) 脈內(nèi)支架和冠狀動(dòng)脈內(nèi)儲(chǔ)集器來(lái)施用。如本文使用的術(shù)語(yǔ)口服包括但不限于口服攝取，或 通過(guò)舌下或口腔途徑來(lái)遞送。口腔施用包括流體飲料、能量棒以及小丸制劑。
[0111] 藥物組合物可呈適合于預(yù)定施用方法的任何形式。例如，當(dāng)欲用于口服時(shí)，可制 備諸如片劑、含片（troches)、錠劑（lozenges)、水性懸浮液或油性懸浮液、可分散粉末或 顆粒、乳狀液、硬或軟膠囊、糖漿或酏劑。可根據(jù)本領(lǐng)域已知的用于制造藥用組合物的任意 方法制備欲用于口服用途的組合物，而且這樣的組合物可包含一種或多種試劑（包括甜味 劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑）以提供口感合適的制備物。含有與適合于制造片劑的無(wú)毒藥 學(xué)上可接受的賦形劑摻合的藥物化合物的片劑是可接受的。這些賦形劑可為例如惰性稀釋 劑，如碳酸鈣或碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；制粒劑和崩解劑，如玉米淀粉或褐藻酸；粘 合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯樹(shù)膠；和潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。片劑可以是未經(jīng) 包衣或通過(guò)已知工藝進(jìn)行包衣的，所述工藝包括腸溶包衣、結(jié)腸包衣或微囊封以延緩胃腸 道內(nèi)的崩解和吸收且/或提供較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)作用。例如，可以單獨(dú)使用諸如單硬脂酸甘 油酯或二硬脂酸甘油酯這樣的延時(shí)材料或?qū)⑵渫炓黄鹗褂谩?br> [0112] 用于口服使用的制劑也可作為硬明膠膠囊存在，其中所述藥物化合物與惰性固體 稀釋劑（例如磷酸鈣或高嶺土）混合，或作為軟明膠膠囊存在，其中所述活性成分與水或油 介質(zhì)（例如花生油、液體石蠟或橄欖油）混合。
[0113] 藥物組合物可配制成與適合于制造水性懸浮液的賦形劑摻合的水性懸浮液。此種 賦形劑包括：混懸劑如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡 咯烷酮、黃蓍膠及阿拉伯樹(shù)膠；以及分散劑或濕潤(rùn)劑，如天然存在的磷脂（例如卵磷脂）、環(huán) 氧烷與脂肪酸的縮合產(chǎn)物（例如聚氧乙烯硬脂酸酯）、環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪族醇（例如十七 烷乙烯氧十六醇）的縮合產(chǎn)物、環(huán)氧乙烷與由脂肪酸和己糖醇酐衍生的部分酯的縮合產(chǎn)物 (例如聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯）。水性混懸液還可含有一種或多種防腐劑如對(duì)羥 基苯甲酸乙酯或?qū)αu基苯甲酸正丙酯、一種或多種著色劑、一種或多種調(diào)味劑以及一種或 多種甜味劑如蔗糖或糖精。
[0114] 可以通過(guò)將活性成分懸浮在植物油（例如，花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油）中 或礦物油如液體石蠟中來(lái)配制油性混懸液。油性混懸液可以包含增稠劑如蜂蠟、硬石蠟或 鯨蠟醇?？梢约尤胩鹞秳┤缟衔乃岬降哪切┨鹞秳?，及調(diào)味劑以提供可口的口服制劑。這 些組合物可通過(guò)添加抗氧化劑如抗壞血酸來(lái)保存。
[0115] 適合用于通過(guò)添加水來(lái)制備水性混懸液的可分散的粉劑和顆粒劑提供了與分散 劑或潤(rùn)濕劑、懸浮劑以及一種或多種防腐劑混合的活性成分。通過(guò)以上已經(jīng)提到的那些來(lái) 舉例說(shuō)明適合的分散劑或潤(rùn)濕劑和懸浮劑。還可以存在額外的賦形劑，例如甜味劑、調(diào)味劑 和著色劑。
[0116] 本發(fā)明的藥物組合物也可為水包油型乳液形式。所述油相可為植物油，諸如橄欖 油或花生油，可以是礦物油，諸如液體石蠟，或這些油類的混合物。適合的乳化劑包括天然 存在的樹(shù)膠，諸如阿拉伯樹(shù)膠和黃蓍膠；天然存在的磷脂，諸如大豆卵磷脂，由脂肪酸衍生 的酯類或偏酯類；己糖醇酐，諸如單油酸山梨醇酐酯；以及這些偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合物， 諸如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯。所述乳狀液還可包含甜味劑和調(diào)味劑。
[0117] 可以使用諸如甘油、山梨醇或蔗糖這樣的甜味劑來(lái)配制糖漿和酏劑。這些制劑還 可包含緩和劑、防腐劑、調(diào)味劑或著色劑。
[0118] 本公開(kāi)的藥物組合物可以是呈無(wú)菌可注射制劑的形式，例如，作為無(wú)菌可注射水 性或油性混懸液?？筛鶕?jù)已知技術(shù)，使用上述那些適合的分散劑或潤(rùn)濕劑以及懸浮劑來(lái)配 制所述懸浮液。所述無(wú)菌可注射制備物還可以是處于無(wú)毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑 之中的無(wú)菌可注射溶液或懸浮液，例如處于1，3-丙二醇中的溶液或制備為凍干粉末?？捎?媒介物和溶劑中可以使用的是水、林格氏溶液（Ringer'ssolution)和等滲氯化鈉溶液。另 夕卜，無(wú)菌的不揮發(fā)油可通常被用作為溶劑或懸浮介質(zhì)。出于這個(gè)目的，可以使用包括合成的 單甘油酯或二甘油酯的任何溫和的不揮發(fā)性油。另外，脂肪酸（例如油酸）可類似地用于 注射物的制備。
[0119] 可以與載體材料組合以生成單一劑型的活性成分的量將取決于所治療的宿主和 特定施用模式而改變。例如，意圖對(duì)人口服施用的延時(shí)釋放制劑可含有大約20至500mg的 與合適且適宜量的載體材料相混合的活性材料，所述載體材料可能在總組合物的約5%至 約95%之間變化。優(yōu)選地，制備提供便于施用的容易測(cè)量的量的藥物組合物。典型地，全 身施用的有效量是約0.lmg/kg至約100mg/kg并且取決于許多因素，包括例如受試者（例 如，哺乳動(dòng)物如人）的年齡和體重、需要治療的確切病狀和其嚴(yán)重性、施用途徑并且最終由 主治醫(yī)師或獸醫(yī)酌處。然而，應(yīng)了解，任何特定患者的具體劑量水平取決于各種因素，包括 所使用的具體化合物的活性，所治療的個(gè)體的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；施用 時(shí)間和途徑；排泄速率；以前施用的其它藥物；和經(jīng)歷治療的特定病狀的嚴(yán)重性，如已得到 本領(lǐng)域技術(shù)人員充分認(rèn)識(shí)。
[0120] 適于經(jīng)口施用的本文公開(kāi)的化合物的制劑可提供為如各自含有預(yù)定量的活性成 分的膠囊、扁囊劑或片劑的離散單位；粉末或顆粒；在水性液體或非水性液體中的溶液或 混懸液；或水包油液體乳劑或油包水液體乳劑。藥物組合物還可以作為大丸劑、藥糖劑或糊 劑施用。
[0121] 片劑可通過(guò)壓制或模制來(lái)制備，任選地含有一種或多種輔助成分。壓制的片劑可 通過(guò)在適合的機(jī)器中對(duì)自由流動(dòng)形式（如粉末或顆粒）的活性成分進(jìn)行壓制來(lái)制備，所述 活性成分任選與粘合劑（例如，聚維酮、明膠、羥丙乙基纖維素）、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐 劑、崩解劑（例如，羥乙酸淀粉鈉、交聯(lián)聚維酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉）表面活性劑或分散劑 混合。模塑的片劑可以通過(guò)在合適的機(jī)器中模塑用惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉末狀化合物的 混合物來(lái)制備。片劑可任選地包衣或刻痕并且可配制以便提供其中活性成分的緩慢或控制 釋放，使用例如不同比例的羥基丙基甲基纖維素來(lái)提供所需釋放特征。片劑可任選被提供 有腸溶或結(jié)腸包衣以在腸的部分而不是胃內(nèi)提供釋放。這對(duì)于式1化合物是尤其有利的， 當(dāng)這類化合物對(duì)酸水解敏感時(shí)。
[0122] 適于在口中局部施用的制劑包括錠劑，其在調(diào)味的基劑（通常是蔗糖和阿拉伯膠 或黃蓍膠）中包含活性成分；軟錠劑（pastille)，其在惰性基劑如明膠和甘油或蔗糖和阿 拉伯膠中包含活性成分；以及漱口劑，其在適合的液體載劑中包含活性成分。
[0123] 直腸施用的制劑可以具有包括例如可可脂或水楊酸鹽的合適基劑的栓劑形式呈 現(xiàn)。
[0124] 適于經(jīng)陰道施用的制劑可呈現(xiàn)為除活性成分之外還含有如本領(lǐng)域中已知為適當(dāng) 的載體的陰道栓（pessaries)、棉塞、霜?jiǎng)?、凝膠劑、糊劑、泡沫或噴霧制劑。
[0125] 用于腸胃外施用的制劑包括水性和非水性等張無(wú)菌注射溶液，其可含有抗氧化 劑、緩沖劑、抑菌劑和致使制劑與預(yù)定接受者的血液等張的溶質(zhì)；及水性和非水性無(wú)菌混懸 液，其可包括助懸劑和增稠劑。制劑可被包裝于單劑量或多劑量密封容器中，例如安瓿和小 瓶，并且可以儲(chǔ)存于冷凍干燥（凍干）的條件下，僅需在使用前即刻添加無(wú)菌液體載體（例 如水）以供注射。注射溶液及混懸液可從先前所述種類的無(wú)菌粉末、顆粒和片劑制備。
[0126] 如本文使用，藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于：醋酸鹽、吡啶、銨、哌嗪、二乙胺、 煙酰胺、甲酸鹽、尿素、鈉、鉀、鈣、鎂、鋅、鋰、肉桂酸鹽、甲氨基、甲磺酸鹽、苦味酸鹽、酒石酸 鹽、三乙氨基、二甲氨基和三（羥甲基）氨基甲烷。額外藥學(xué)上可接受的鹽是本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的。
[0127] 特定患者的有效量可取決于因素如所治療的病狀、患者的總體健康狀況、施用 途徑和劑量以及副作用的嚴(yán)重性來(lái)變化?？色@得治療和診斷方法的指導(dǎo)（參見(jiàn)，例如， Maynard等人(1996)AHandbookofSOPsforGoodClinicalPractice,Interpharm Press,BocaRaton,FL；Dent(2001)GoodLaboratoryandGoodClinicalPractice,Urch Publ.，London,UK) 〇
[0128] 有效量可以一個(gè)劑量給出，但是不限于一個(gè)劑量。因此，施用可為兩次、三次、四 次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、i^一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、 十七次、十八次、十九次、二十次或更多次施用藥物組合物。當(dāng)在本發(fā)明方法中存在藥物組 合物的一次以上施用時(shí)，施用可隔開(kāi)一分鐘、兩分鐘、三分鐘、四分鐘、五分鐘、六分鐘、七分 鐘、八分鐘、九分鐘、十分鐘或更多分鐘的時(shí)間間隔，約一小時(shí)、兩小時(shí)、三小時(shí)、四小時(shí)、五 小時(shí)、六小時(shí)、七小時(shí)、八小時(shí)、九小時(shí)、十小時(shí)、11小時(shí)、12小時(shí)、13小時(shí)、14小時(shí)、15小時(shí)、 16小時(shí)、17小時(shí)、18小時(shí)、19小時(shí)、20小時(shí)、21小時(shí)、22小時(shí)、23小時(shí)、24小時(shí)等的間隔。在 小時(shí)情況下，術(shù)語(yǔ)"約"意指加上或減去30分鐘內(nèi)的任何時(shí)間間隔。施用也可隔開(kāi)一天、兩 天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17 天、18天、19天、20天、21天和其組合的時(shí)間間隔。本發(fā)明不限于在時(shí)間上相等地隔開(kāi)的給 藥間隔，而是涵蓋不相等間隔的給藥間隔。
[0129] 例如一次/周、兩次/周、三次/周、四次/周、五次/周、六次/周、七次/周、每?jī)?周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次等的給藥排程可用于本發(fā)明。給藥排程涵蓋 例如一周、兩周、三周、四周、五周、六周、兩個(gè)月、三個(gè)月、四個(gè)月、五個(gè)月、六個(gè)月、七個(gè)月、 八個(gè)月、九個(gè)月、十個(gè)月、十一個(gè)月和十二個(gè)月的給藥總時(shí)間。
[0130] 提供上述給藥排程的循環(huán)。循環(huán)可約例如每七天；每14天；每21天；每28天；每 35天；42天海49天海56天海63天海70天等來(lái)重復(fù)。非給藥的間隔可在循環(huán)之間 出現(xiàn)，其中間隔可為約例如七天；14天；21天；28天；35天；42天；49天；56天；63天；70天 等。在這種情況下，術(shù)語(yǔ)"約"意指加上或減去一天、加上或減去兩天、加上或減去三天、加 上或減去四天、加上或減去五天、加上或減去六天或加上或減去七天。
[0131] 與額外治療劑共同施用的方法在本領(lǐng)域中是熟知的（Hardman等人（編） (2001)GoodmanandGilman?sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第 10 版，McGraw-Hill,NewYork,NY;PooleandPeterson(編）（2001)Pharmacotherapeutics forAdvancedPractice:APracticalApproach,Lippincott,Williams& Wilkins,Phila. ,PA；ChabnerandLongo(編）（2001)CancerChemotherapyandBiother apy,Lippincott,ffilliams&ffilkins,Phila. ,PA)〇
[0132] 如提及，本發(fā)明的組合物優(yōu)選地配制成腸胃外或腸內(nèi)遞送的藥物組合物。施用至 動(dòng)物的典型藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的媒介物如水溶液、無(wú)毒賦形劑包括鹽、防腐劑、 緩沖齊II等。參見(jiàn)仿"負(fù)口Remington,sPharmaceuticalSciences,第 15 版.，Easton編，Mack PublishingCo?，第 1405-1412 和 1461-1487 頁(yè)（1975):TheNationalFormularyXIV,第 14 版，AmericanPharmaceuticalAssociation,Washington,DC(1975)。非水性溶劑的實(shí) 例是丙二醇、聚乙二醇、植物油以及可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水 溶液、鹽水溶液、腸胃外媒介物如氯化鈉、林格氏葡萄糖等。靜脈內(nèi)媒介物包括流體和營(yíng)養(yǎng) 補(bǔ)充劑。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。藥物組合物的各種組分的 pH和精確濃度根據(jù)在本領(lǐng)域中的常規(guī)技能來(lái)調(diào)節(jié)。
[0133] 特定疫苗（同源增強(qiáng)）的反復(fù)施用已經(jīng)證明可有效增強(qiáng)體液響應(yīng)。這類方法在增 強(qiáng)細(xì)胞性免疫方面不太有效，因?yàn)橐郧皩?duì)于載體的免疫力傾向于削弱穩(wěn)定抗原呈遞和適當(dāng) 炎癥信號(hào)的產(chǎn)生。避免此問(wèn)題的一種方法是連續(xù)施用使用不同抗原遞送系統(tǒng)的疫苗（異源 增強(qiáng)）。在異源增強(qiáng)方案中，至少一個(gè)初免或增強(qiáng)遞送包括遞送本文所述的滅活腫瘤細(xì)胞/ 環(huán)狀嘌呤二核苷酸組合物。方案的異源支組可包括使用以下策略中的一種或多種來(lái)遞送抗 原：
[0134] 包含所感興趣的抗原的滅活細(xì)菌或病毒，其為使用一些變性條件來(lái)處理以使得其 在發(fā)動(dòng)病原侵入方面無(wú)效或低效率的顆粒；
[0135] 純化抗原，其通常為從病原體的細(xì)胞培養(yǎng)物純化的天然產(chǎn)生抗原或含有病原體的 組織樣品，或其重組型式；
[0136] 活病毒或細(xì)菌遞送載體，其重組工程化以在受試者的宿主細(xì)胞中表達(dá)且/或分泌 抗原。這些策略依賴于減弱（例如，經(jīng)由遺傳工程）病毒或細(xì)菌載體成為非病原性和無(wú)毒 的；
[0137] 抗原呈遞細(xì)胞（APC)載體，如樹(shù)突狀細(xì)胞（DC)載體，其包括負(fù)載有抗原，或轉(zhuǎn)染 有包括編碼抗原（例如，用于治療去勢(shì)難治性轉(zhuǎn)移性前列腺癌的_Pr〇veilge?!(Dendreon Corporation)的核酸的組合物的細(xì)胞；
[0138] 脂質(zhì)體抗原遞送媒介物；和
[0139] 裸DNA載體和裸RNA載體，其可通過(guò)基因槍、電穿孔、細(xì)菌膜影、微球、微粒、脂質(zhì) 體、聚陽(yáng)離子納米顆粒等來(lái)施用。
[0140] 初免疫苗和增強(qiáng)疫苗可通過(guò)以下途徑中的任何一個(gè)或組合來(lái)施用。在一方面，初 免疫苗和增強(qiáng)疫苗通過(guò)相同途徑來(lái)施用。在另一方面，初免疫苗和增強(qiáng)疫苗通過(guò)不同途徑 來(lái)施用。術(shù)語(yǔ)"不同途徑"涵蓋但是不限于身體上的不同位點(diǎn)，例如，口服、非口服、腸內(nèi)、腸 胃外、直腸、節(jié)點(diǎn)內(nèi)（淋巴結(jié)）、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈、皮下、肌肉內(nèi)、瘤內(nèi)、瘤周、瘤內(nèi)、輸注、粘膜、鼻 腔、腦脊髓空間或腦脊液等的位點(diǎn)，以及通過(guò)不同模式，例如，口服、靜脈內(nèi)和肌肉內(nèi)。
[0141] 有效量的初免或增強(qiáng)疫苗可以一個(gè)劑量給出，但是不限于一個(gè)劑量。因此，施用 可為兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、 十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次施用疫苗。當(dāng)存在疫苗的一次以 上施用時(shí)，施用可隔開(kāi)一分鐘、兩分鐘、三分鐘、四分鐘、五分鐘、六分鐘、七分鐘、八分鐘、九 分鐘、十分鐘或更多分鐘的時(shí)間間隔，約一小時(shí)、兩小時(shí)、三小時(shí)、四小時(shí)、五小時(shí)、六小時(shí)、 七小時(shí)、八小時(shí)、九小時(shí)、十小時(shí)、11小時(shí)、12小時(shí)、13小時(shí)、14小時(shí)、15小時(shí)、16小時(shí)、17小 時(shí)、18小時(shí)、19小時(shí)、20小時(shí)、21小時(shí)、22小時(shí)、23小時(shí)、24小時(shí)等的間隔。在小時(shí)情況下， 術(shù)語(yǔ)"約"意指加上或減去30分鐘內(nèi)的任何時(shí)間間隔。施用也可隔開(kāi)一天、兩天、三天、四 天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、 19天、20天、21天和其組合的時(shí)間間隔。本發(fā)明不限于在時(shí)間上相等地隔開(kāi)的給藥間隔，而 是涵蓋不相等間隔的給藥，例如由1天、4天、7天和25天施用組成的初免排程，僅提供非限 制性實(shí)例。
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[0191] 以下實(shí)施例用來(lái)示出本發(fā)明。這些實(shí)施例決非用來(lái)限制本發(fā)明范圍。
[0192] 實(shí)施例1
[0193] 刺激針對(duì)廣泛譜系TAA的免疫力的一種途徑是"GVAX"，其為基于經(jīng)過(guò)工程化以分 泌GM-CSF的同種異體人腫瘤細(xì)胞系的疫苗，所述GM-CSF是刺激DC募集、分化和成熟的主 要細(xì)胞因子。GVAX疫苗形成多種癌癥適應(yīng)癥中的多個(gè)臨床試驗(yàn)的基礎(chǔ)，并且已被證明是安 全、較好耐受、免疫原性的并且展示提供一些臨床益處。在患有mCRPC的男性中比較前列腺 GVAX免疫療法（G)與多西紫杉醇加上潑尼松（D+P)的3期臨床研宄由發(fā)起人提前終止，此 時(shí)早期非預(yù)定無(wú)效分析顯示試驗(yàn)具有滿足它的改善總體存活的預(yù)定義主要端點(diǎn)的< 30% 機(jī)會(huì)。然而，在研宄中的> 600個(gè)患者的連續(xù)隨訪和分析顯示在?21個(gè)月時(shí)，G支組的 Kaplan-Meier存活曲線超過(guò)D+P支組。此外，基于Halabi列線圖，如與化學(xué)療法相比，從 基線起預(yù)測(cè)存活時(shí)間多18個(gè)月的患者在用GVAX處理時(shí)具有2. 5個(gè)月存活益處，其中長(zhǎng)期 存活者的"尾區(qū)"為30%。這些結(jié)果示出GVAX前列腺免疫療法提供優(yōu)于化學(xué)療法的存活益 處，其相應(yīng)地展示如與安慰劑相比，?2個(gè)月存活益處。
[0194] 由于個(gè)別地使用的經(jīng)由MyD88-和TRIF-依賴性途徑來(lái)信號(hào)傳導(dǎo)的TLR靶向佐劑 通常是CD8T細(xì)胞免疫力的較差誘導(dǎo)劑，所以我們?cè)u(píng)估經(jīng)由胞質(zhì)STING受體來(lái)信號(hào)傳導(dǎo)的 ⑶N是否可促進(jìn)MHCI類-和II類-限制免疫力的初免。⑶N誘導(dǎo)對(duì)于疫苗重組蛋白Ag、 HIVGag或OVA具有特異性的Thl⑶4和⑶8T細(xì)胞的初免。Balb/c小鼠用與2%水包油佐 劑（Addavax,Invivogen) -起配制的5ygHIVGag蛋白質(zhì)和圖2中指示的劑量水平的CDN 以3周間隔在尾部基底（皮下）處皮下免疫接種兩次。
[0195] 如2A圖中展示，CDN-輔助HIVGag疫苗誘導(dǎo)多功能Ag-特異性ThlCD4T細(xì)胞響應(yīng)。 在增強(qiáng)后第5天，在用I-Ad限制HIVGag表位來(lái)刺激之后，通過(guò)IFN-y、IL-2和TNF-a陽(yáng) 性脾細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色來(lái)測(cè)量次級(jí)CD4T細(xì)胞響應(yīng)。條形圖代表個(gè)別小鼠。如4B 圖中展示，CDN-依賴性疫苗誘導(dǎo)T細(xì)胞響應(yīng)的程度通過(guò)CDN與VesiVax?,脂質(zhì)體的制劑來(lái) 增強(qiáng)。
[0196] 在5只C57BL/6小鼠的群組用圖2展示的疫苗組合物皮下免疫接種之后，PBMC中 的初級(jí)（1)和次級(jí)（2)OVA-特異性⑶4和⑶8T細(xì)胞響應(yīng)通過(guò)IFN-yELISP0T來(lái)測(cè)量，并且 結(jié)果描繪于圖2C中。5只C57BL/6小鼠的群組以3周間隔用圖中指示的疫苗，或用靜脈內(nèi) 給予的5xl06CFU的Lm-OVA來(lái)皮下免疫接種兩次。增強(qiáng)后4周，小鼠用5xlOsPFU的VV-0VA 激發(fā)，并且5天后，將卵巢收獲、加工并且VV-0VA通過(guò)噬菌斑測(cè)定來(lái)定量。
[0197] 如圖中展示，疫苗效力取決于制劑，并且我們的初始結(jié)果指示具有VesiVax?脂質(zhì) 體的制劑是最佳的，可能歸因于有效疫苗遞送至細(xì)胞溶質(zhì)中。值得注意的是，用CDN-輔助OVA免疫接種的小鼠通過(guò)用牛痘病毒激發(fā)而完全得到保護(hù)。通過(guò)與給予HBSS的陰性對(duì)照 組比較，此保護(hù)水平為>4對(duì)數(shù)。由⑶N-輔助疫苗給出的保護(hù)水平比MPL-輔助OVA(使用 50yg的人MPL劑量），或李斯特菌-OVA疫苗更好。
[0198] 圖7描繪在⑶N處理后的人樹(shù)突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)，如通過(guò)共刺激分子如⑶80和⑶86 的表達(dá)所評(píng)估。在此實(shí)驗(yàn)中，CD14+單核細(xì)胞從PBMC中分離并且在GM-CSF和IL-4存在下培 養(yǎng)。第 6 天，105 個(gè)DC用 100ng/MLLPS、20yMCDN(c-二-AMP)、369yg脂質(zhì)體（VesiVax?). 或脂質(zhì)體加上CDN處理，如圖中指示。所指示的共刺激分子在48小時(shí)后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢 測(cè)到。如提及，脂質(zhì)體大大改進(jìn)CDN誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的能力。
[0199] 實(shí)施例2.
[0200]B16黑素瘤腫瘤模型是侵略性的并且具有較差免疫原性，并且用經(jīng)過(guò)照射的 GM-CSF分泌性B16黑素瘤腫瘤細(xì)胞（B16-GM)進(jìn)行治療性疫苗接種并不有效，除非與免疫檢 查點(diǎn)如CTLA-4或H)-l的阻斷組合。在此實(shí)例中，我們證明在B16腫瘤細(xì)胞植入后7天施 用時(shí)，單一注射的STINGVAX(與毛地黃皂苷一起配制并且與經(jīng)過(guò)照射的B16-GM-起孵育的 CDN)顯著抑制已確立的可觸知B16腫瘤的生長(zhǎng)，此時(shí)腫瘤是可觸知的并且已確立的。
[0201] 5xl04個(gè)B16黑素瘤細(xì)胞接種于C57BL/6小鼠的足墊中并且當(dāng)腫瘤在第7天可觸 知時(shí)，將小鼠在對(duì)側(cè)大腿中用圖3指示的疫苗皮下注射一次。以下量的疫苗組分用于每次 注射：經(jīng)過(guò)照射的B16GM-CSF(GVAX)，1. 5xl06個(gè)細(xì)胞；僅CDN，20ng;毛地黃皂苷，10yg/mL。 如下制備STINGVAX:將經(jīng)過(guò)照射的B16GM-CSF與⑶N和毛地黃皂苷一起在20°C下孵育30分 鐘，用PBS洗滌3x，并且所得組合物在再懸浮于200yLPBS中之后注射。關(guān)于配制信息，還 參見(jiàn)Woodward等人2010年5月27日在ScienceExpressDOI: 10. 1126/science. 1189801 上的在線支持材料。每日測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)。相比于無(wú)藥方組，生長(zhǎng)被STINGVAX顯著抑制 (P〈0. 01)。如3A圖中展示，腫瘤抑制取決于B16-GM與⑶N的組合，因?yàn)槿缗c未經(jīng)處理的對(duì) 照小鼠相比，用單獨(dú)組分處理對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)沒(méi)有影響。另外，與B16-GM處理小鼠相比，對(duì)于 P15E，一種在B16腫瘤上表達(dá)的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒特異性Ag，具有特異性的⑶8T細(xì)胞響應(yīng) 在經(jīng)STINGVAX處理的荷瘤小鼠中得到增強(qiáng)（數(shù)據(jù)未展示）。
[0202] 根據(jù)這些數(shù)據(jù)，認(rèn)為STING-靶向⑶N并且經(jīng)過(guò)照射的GM-分泌腫瘤細(xì)胞疫苗之 間的協(xié)同作用要求IFN-0的CDN依賴性誘導(dǎo)應(yīng)導(dǎo)致GM-CSF分化的DC的活化，由此提供 強(qiáng)的"信號(hào)3"，其導(dǎo)致更有效的抗腫瘤T細(xì)胞響應(yīng)。出于這個(gè)原因，我們確定是否CDN可在 TRAMP-GM細(xì)胞中直接誘導(dǎo)IFN-0的產(chǎn)生。如3B圖中展示，在與毛地黃皂苷一起配制時(shí)， ⑶N有效地誘導(dǎo)IFN-0在TRAMP-GM和主要巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，但是不誘導(dǎo)在來(lái)自缺乏功能 性STING蛋白質(zhì)的goldentickeUgt)小鼠的巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。
[0203] 圖4展示由STING-靶向的⑶N/GVAX組合展示的治療益處的劑量依賴性。在此實(shí) 驗(yàn)中，5xl04個(gè)B16黑素瘤細(xì)胞接種于C57BL/6小鼠的足墊中。一旦在第6天腫瘤可觸知， GVAX(B16GM-CSF(GVAX)、1.5xl06個(gè)細(xì)胞）或 2、20 或 200ngCDN/ 動(dòng)物的CDN/GVAX組合皮 下注射至對(duì)側(cè)大腿中。在組合治療的情況下，⑶N在20°C下與10yg/mL的毛地黃皂苷一起 配制30分鐘并且隨后用PBS洗滌4x以移除未并入的⑶N，然后如上所述注射。每日以總 計(jì)20只動(dòng)物/治療組測(cè)量腫瘤體積。如圖中展示，抗腫瘤響應(yīng)隨著CDN濃度從2ng/動(dòng)物 增加至20ng/動(dòng)物而增加，但是通過(guò)將劑量增加至200ng/mL未觀察到進(jìn)一步增加。
[0204] 圖5提供⑶N/GVAX組合的協(xié)同抗腫瘤響應(yīng)的進(jìn)一步證據(jù)。在此圖中，B16黑素瘤 細(xì)胞從動(dòng)物中收獲并且將細(xì)胞固定至載玻片上以進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。對(duì)于熒光素標(biāo) 記的抗-⑶8抗體觀測(cè)CR8+T-細(xì)胞浸潤(rùn)至腫瘤中。DAPI用于將腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核復(fù)染色。 此圖中展示的四個(gè)圖是未經(jīng)處理的B16黑素瘤細(xì)胞（A)，以及用CDN(B)、GVAX(C)和CDN/ GVAX⑶處理的細(xì)胞。如展示，與單獨(dú)⑶N或GVAX相比，對(duì)于⑶N/GVAX觀察到⑶*+T-細(xì)胞 腫瘤浸潤(rùn)的大致上改善。
[0205] 類似地，圖6展示與單獨(dú)⑶N或GVAX相比，通過(guò)⑶N/GVAX實(shí)現(xiàn)成熟干擾素y-產(chǎn) 生脾臟DC(⑶llc+細(xì)胞）的改進(jìn)的誘導(dǎo)。在此實(shí)驗(yàn)中，如上所述處理小鼠，并且將來(lái)自2只 小鼠/組的脾臟收獲。將總脾細(xì)胞收獲并且用抗-⑶11c和抗-IFNa偶聯(lián)物染色。處理（未 經(jīng)處理的B16、⑶N、⑶N+毛地黃皂苷、GVAX和⑶N/GVAX+毛地黃皂苷）在圖中指示。
[0206] 實(shí)施例3.
[0207] 圖9描繪"STINGVAX"的協(xié)同作用機(jī)制，其為與表達(dá)同種異體腫瘤細(xì)胞的經(jīng)過(guò)照射 的GM-CSF-起共配制的STING-活化環(huán)狀嘌呤二核苷酸（GVAX;STING+GVAX=STINGVAX)。 GVAX腫瘤細(xì)胞疫苗將多個(gè)腫瘤相關(guān)聯(lián)抗原無(wú)偏性呈遞至免疫系統(tǒng)。由GVAX產(chǎn)生的GM-CSF 將樹(shù)突狀細(xì)胞（DC)募集至注射位點(diǎn)。CDN活化所募集的DC，進(jìn)而活化或初免有效抗原特異 性⑶4和⑶8T細(xì)胞，這些T細(xì)胞展開(kāi)行動(dòng)并且殺滅腫瘤，產(chǎn)生臨床益處。STINGVAX可增強(qiáng)腫 瘤響應(yīng)，方法是充當(dāng)GM-CSF募集的DC的儲(chǔ)庫(kù)，或經(jīng)由自分泌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)表達(dá)TBK-1/IRF-3 依賴性IFN- 0和NF-kB促炎癥性細(xì)胞因子，其在組合下活化GM-CSF募集的DC。
[0208] 增加STINGVAX的抗腫瘤功效的機(jī)制被認(rèn)為歸因于先天性免疫的活化，所述先天 性免疫通過(guò)⑶N直接結(jié)合至STING來(lái)介導(dǎo)，觸發(fā)此受體中的構(gòu)象變化，導(dǎo)致經(jīng)由TBK-1/ IRF-3軸和1型干擾素（IFN)(包括IFN-a和IFN- 0 )的活化來(lái)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。由GVAX腫 瘤細(xì)胞疫苗產(chǎn)生的GM-CSF將樹(shù)突狀細(xì)胞（DC)募集至注射位點(diǎn)。CDN活化募集的DC，進(jìn)而 活化或初免有效的抗原特異性CD4和CD8T細(xì)胞，所述T細(xì)胞展開(kāi)行動(dòng)并且殺滅腫瘤，產(chǎn)生 臨床益處。
[0209] 為了確定作為活化先天性免疫的CDN效力的標(biāo)志的IFN-a水平，將從十五個(gè)獨(dú)立 人供體中分離的1x106個(gè)原代人PBMC利用Effectene轉(zhuǎn)染試劑（Qiagen)、在37°C、5%C02 下在具有 50yMc-二-GMP(CDG)、1yg/mL干擾素刺激DNA(ISD)或 4yg/mLPoly(I:C)的 96孔U底板中孵育30分鐘以將分子轉(zhuǎn)移至PBMC中。ISD(干擾素刺激DNA)是與TLR無(wú) 關(guān)的（Stetston,D.B?等人Immunity24, 93 - 103, 2006年1月）并且經(jīng)由cGAS來(lái)信號(hào)傳 導(dǎo)，因此是STING依賴性的，而Poly(I:C)可經(jīng)由TLR3和RIG-I途徑來(lái)信號(hào)傳導(dǎo)，因此是 與STING無(wú)關(guān)的。30分鐘之后，將細(xì)胞洗滌并且置換為含有10%FBS的RPMI培養(yǎng)基并且 在37°C，5%C02下孵育。24小時(shí)孵育之后，IFN-a水平通過(guò)流式細(xì)胞儀珠粒陣列（CBA，BD Biosciences)來(lái)確定（圖8)。這些結(jié)果證明環(huán)狀-二-GMP在從多個(gè)獨(dú)立供體制備的人白 細(xì)胞中活化先天性免疫，因而支持STINGVAX的作用機(jī)制。
[0210] 本領(lǐng)域技術(shù)人員易于了解，本發(fā)明充分適于執(zhí)行目標(biāo)并且獲得所提到的以及其中 固有的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本文中提供的實(shí)施例代表優(yōu)選實(shí)施方案，為示例性的，并且并非旨在作 為本發(fā)明的范圍的限制。
[0211] 將理解，本發(fā)明在其應(yīng)用中不限于構(gòu)造的細(xì)節(jié)和以下描述中所闡述或在附圖中示 出的組件的布置。本發(fā)明能夠進(jìn)行除描述的那些之外的實(shí)施方案，并且能夠以多種方式實(shí) 踐和實(shí)行。另外，將理解，本文中使用的用語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)，以及抽象概念是出于描述目的，并且不 應(yīng)被視為限制。
[0212] 這樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，可容易地將本公開(kāi)所基于的概念用作用于實(shí)行本 發(fā)明的若干目的的其它結(jié)構(gòu)、方法和系統(tǒng)的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)。因此，重要的是，在這類等同構(gòu)造不 脫離本發(fā)明的精神和范圍的限度內(nèi)，權(quán)利要求書(shū)被認(rèn)為是包括所述等同構(gòu)造的。
[0213] 雖然本發(fā)明以使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠制得并使用它的足夠細(xì)節(jié)來(lái)描述并例示， 但是各種替代方案、變化和改進(jìn)應(yīng)是顯而易知的，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。本文中提 供的實(shí)施例代表優(yōu)選實(shí)施方案，為示例性的，并且并非旨在作為本發(fā)明的范圍的限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員可想到這些方法和組合物的改變和其它用途。這些都涵蓋在由權(quán)利要求的范圍 所界定的本發(fā)明的精神范圍內(nèi)。
[0214] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于顯而易見(jiàn)的是，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下可 對(duì)本文中所公開(kāi)的發(fā)明進(jìn)行可變的替換和修改。
[0215] 說(shuō)明書(shū)中提到的所有專利和公布指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的水平。 所有專利和公布在本文中以引用的方式并入，其程度等同于仿佛特定且個(gè)別地指示每一單 獨(dú)的公布以引用的方式并入。
[0216] 本文中適當(dāng)?shù)卣f(shuō)明性地描述的發(fā)明可在缺少在本文中并未具體公開(kāi)的任何一個(gè) 或多個(gè)元件、一個(gè)或多個(gè)限制的情況下實(shí)踐。因此，例如，在本文中的每一個(gè)例子中，術(shù)語(yǔ) "包括"、"主要由……組成"和"由……組成"中的任何術(shù)語(yǔ)可由其它兩個(gè)術(shù)語(yǔ)中的任何一個(gè) 代替。已使用的術(shù)語(yǔ)和措辭是用作描述而非限制的術(shù)語(yǔ)，并且在使用這類術(shù)語(yǔ)和措辭時(shí)并 非旨在排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是應(yīng)認(rèn)識(shí)到，各種修改在本發(fā) 明要求的范圍內(nèi)是可能的。因此，應(yīng)理解，盡管本發(fā)明已由優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征具體公 開(kāi)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用本文中公開(kāi)的概念的修改和變化，并且應(yīng)理解，所述修改和 變化被視為在如由所附權(quán)利要求書(shū)定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0217] 在以上權(quán)利要求書(shū)內(nèi)闡述其它實(shí)施方案。
【權(quán)利要求】
1. 一種組合物，其包括： 環(huán)狀嘌呤二核苷酸，其結(jié)合至STING并且誘導(dǎo)STING依賴性TBK1活化；和 滅活腫瘤細(xì)胞，其表達(dá)并分泌刺激樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)、募集和/或成熟的一種或多種細(xì) 胞因子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述滅活腫瘤細(xì)胞表達(dá)并分泌GM-CSF。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述滅活腫瘤細(xì)胞表達(dá)并分泌CCL20。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述滅活腫瘤細(xì)胞表達(dá)并分泌CCL3。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述滅活腫瘤細(xì)胞表達(dá)并分泌IL-12p70。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述滅活腫瘤細(xì)胞表達(dá)并分泌FLT-3配體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的組合物，其進(jìn)一步包括CTLA-4拮抗劑和TLR-4 激動(dòng)劑中的一種或多種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述腫瘤細(xì)胞通過(guò)輻射處理來(lái)滅 活。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述環(huán)狀嘌呤二核苷酸選自由以 下組成的組：c-二-AMP、c-二-GMP、c-二-MP、c-AMP-GMP、c-AMP-MP 和 c-GMP-MP 或其 組合。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述環(huán)狀嘌呤二核苷酸與一種 或多種脂質(zhì)一起配制。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述一種或多種脂質(zhì)包括毛地黃皂苷。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述一種或多種脂質(zhì)形成脂質(zhì)體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的組合物，其進(jìn)一步包括一種或多種佐劑。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述一種或多種佐劑包括CpG和/或單磷酰 脂質(zhì)A。
16. -種誘導(dǎo)對(duì)于個(gè)體的癌癥的免疫響應(yīng)的方法，其包括： 將根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的組合物施用至所述個(gè)體，其中所述滅活腫瘤細(xì) 胞或不同腫瘤細(xì)胞的混合物與所述個(gè)體的癌癥是類型匹配的。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述滅活腫瘤細(xì)胞或不同腫瘤細(xì)胞的混合物是 一種或多種同種異體腫瘤細(xì)胞系。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述滅活腫瘤細(xì)胞是自體腫瘤細(xì)胞。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞選自由以下組成的 組：結(jié)直腸癌細(xì)胞、呼吸-消化道鱗狀癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、肉 瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、子宮癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì) 胞、黑素瘤細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和腎癌細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】A61P37/04GK104507538SQ201380037917
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2013年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月8日
【發(fā)明者】T·W·杜本斯蓋, M·L·L·梁, D·M·帕多爾, Y·J·金 申請(qǐng)人:艾杜羅生物科技公司, 約翰·霍普金斯大學(xué)