包含與crm197載體蛋白偶聯(lián)的hiv gp41肽的免疫原性化合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及針對HIV病毒家族的疫苗領域。更特別地涉及一種包含同通式(I)肽的免疫原性化合物NH2-[Nt]y-P-W-N-X1-S-X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-W-[Ct]z-COOH(I)其共價連接到由CRM197蛋白組成的載體蛋白。本發(fā)明還涉及包含免疫原性化合物的組合物和這些組合物用于預防和/或治療HIV病毒感染的個體的病癥的用途。
【專利說明】包含與CRM197載體蛋白偶聯(lián)的HIVGP41肽的免疫原性化 合物

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及針對HIV病毒家族的疫苗領域。 技術背景
[0002] 約90%的人HIV感染是由HIV-1病毒引起的。1型人類免疫缺陷病毒（HIV-1)的 特點在于它是在病毒復制過程中發(fā)生的由基因突變的累積引起的以及還通過重組事件造 成的顯著的遺傳變異性。HIV-1病毒株的高突變活性可以解釋用于治療HIV的化療方法的 長期以來的失敗。較早結果表明，在抗逆轉錄病毒療法的不同療程后，甚至在多藥治療后 (HAART)，抗性病毒變種在患者體內(nèi)迅速出現(xiàn)。這些抗性病毒可以具體地改變他們蛋白質(zhì)的 構象和結構。通常造成HIV-1逃離目前治療的這種突變被保持連續(xù)幾代病毒且由于治療條 件的選擇而進行積累。
[0003] 用抗HIV-1藥物治療不能完全阻斷病毒的復制，它允許預先存在的抗性突變的選 擇和積累，以及新發(fā)生突變的選擇和積累，從而給該病毒帶來新的繼續(xù)傳播的機會?，F(xiàn)有的 抗逆轉錄病毒藥物（NRTI，NNRTI，蛋白酶抑制劑，融合抑制劑和其混合物，比如HAART)只能 在或多或少的長時間段上減緩HIV-1病毒的復制，直到抗性病毒株的出現(xiàn)和繁殖。HIV-1抗 性變種的廣泛傳播引起了嚴重的憂慮并需要利用其他抗HIV-1治療手段。
[0004] 此外，盡管HAART有明顯的臨床益處，但缺點在于：許多副作用（脂肪代謝障礙、乳 酸酸中毒、胰島素抵抗、慢性腎臟病、高脂血癥......），終身性治療，依從性高，病毒抵抗，HIV 感染的致病作用的持久性，認知和運動障礙，以及免疫激活。此外，隨著預期壽命的延長， 患者必須面對出現(xiàn)的副作用、耐藥性、代謝紊亂和與HIV-1感染相關的癌癥。
[0005] 此外，盡管有病毒抑制但治療的患者中的20%至30%有時會遭遇免疫失敗。也就 是說雖然抑制了病毒復制，但它們的CD4+T細胞計數(shù)下降。這表明盡管抑制了病毒復制，但 HIV-1感染CD4+T細胞的致病事件依然存在。因此，需要可以作為抗逆轉錄病毒治療補充 的，從而保護CD4+T細胞的安全并可普及的治療方法，且這是一個未滿足的醫(yī)療需求。
[0006] 除了那些利用化學抗逆轉錄病毒物質(zhì)的方法，各種抗HIV治療策略均已被考慮， 其中包括（i)抗HIV抗體的使用，（ii)基于破壞HIV顆粒的疫苗，（iii)基于HIV肽的疫苗 和（iv)DNA質(zhì)粒或基于病毒載體的疫苗，每種都有自己特定的缺點。
[0007]自從1983年HIV病毒被確定為艾滋病的原因，許多預防HIV感染和AIDS的疫苗 的候選物在人體試驗中進行測試，但鮮少成功。國際艾滋病疫苗行動組織，IAVI，保有這些 疫苗和試驗的數(shù)據(jù)庫（www.IAVI.org)。幾乎所有的這些試驗都是非常早期（I期）的對疫 苗安全性和初步免疫反應的試驗。只有一種疫苗（同一個基本gpl20疫苗的兩種制劑）已 在大規(guī)模III期臨床研究中試驗。在美國、加拿大和荷蘭于2003年完成的III期臨床試驗 中發(fā)現(xiàn)VaxGen的gpl20亞型B蛋白無效。在之后的2003年，AIDSVAX的第二次試驗在泰 國完成。兩個試驗都發(fā)現(xiàn)該候選疫苗均是無效的。過去難以制備可抗HIV的蛋白質(zhì)疫苗， 這可能是由于包膜蛋白中的高多樣性，所用的實驗室適應株的包膜和臨床分離株之間的差 異，疫苗中gpl20的單體性質(zhì)和病毒中的三聚體組織之間的差異，以及特別是由于僅誘導 抗體而沒有誘導細胞免疫。AIDSVAX蛋白（來自VAXGene)與用于遞送到金絲雀痘中的基因 (來自安萬特巴斯德的ALVAC)的結合也在III期臨床測試中以便得到進一步的信息，并且 期望開始第四次大規(guī)模試驗以測試默克的腺病毒為基礎的候選疫苗。細胞毒性T淋巴細胞 (CTL)被認為是包括HIV-I病毒在內(nèi)的病毒的免疫控制的關鍵組分，且相關的CTL免疫原 被考慮用于治療性疫苗。
[0008] 由于流行的HIV每年持續(xù)感染數(shù)以百萬計的人，因此增加了對有效疫苗的需求。 由于開發(fā)能夠引發(fā)廣泛的中和性抗HIV抗體的免疫原性產(chǎn)品的難度，深深阻礙了抗HIV疫 苗的開發(fā)。
[0009] 對于針對人類免疫缺陷病毒（HIV)的原發(fā)性分離物的廣泛中和抗體（NtAb)的誘 導仍然是一個主要的和未滿足的AIDS疫苗研究的目標。早期使用基于包膜的疫苗的嘗試 已經(jīng)探索出了僅對于實驗室適用的分離物有效的抗體。在這些情況下，保護已經(jīng)與針對 gpl20的V3高變區(qū)的高滴度NtAb相關。然而，產(chǎn)生的中和活動基本上是分離物特異性的且 針對HIV-1的最主要的原發(fā)性分離物極少有效。在III期臨床試驗中亞基gpl20疫苗不能 預防HIV-1收集物就強調(diào)了該任務的難度。
[0010] 然而，NtAb往往能夠在HIV感染個體中發(fā)現(xiàn)。所產(chǎn)生的反應在感染早期通常是窄 特異性的，中和在宿主中傳播的病毒，而不是同時期的病毒。在一些能夠在沒有抗病毒治療 下控制他們的感染的長期幸存者中的感染過程中這種反應擴大。然而，還尚未了解交叉中 和抗體反應的性質(zhì)和導致其發(fā)生的機理。
[0011]自然情況下，抗Env的NtAb在感染后的幾周內(nèi)產(chǎn)生，但這種早期的反應僅針對特 定的病毒亞型有效；然而，bNtAb(交叉反應性中和抗體）可在HIV的過程中形成。最近，幾 個主要的研究表明，大約25%的HIV感染者（感染至少1年）有bNtAb反應，1%"中和"精 英對絕大多數(shù)進化支有很強的活性。重要的是，這些結果證明了在疾病的過程中感染者的 免疫系統(tǒng)在體內(nèi)產(chǎn)生抗HIV-1的NtAb的可能性。他們還提示，在缺乏保護性bNtAb的滴度 的知識的情況下，廣譜反應性中和抗體活性似乎隨著時間而發(fā)展且被慢性抗原暴露加強。
[0012] 持續(xù)的低噪音的病毒復制帶來的結果是一個持續(xù)的Env的逃避NtAb的進化。這 種抗原進化提示可以把新的疫苗策略重點集中在更保守的區(qū)域的Env蛋白，提示疫苗免疫 原的設計可以模仿關鍵的高度保守的抗原表位。
[0013] 一個有效的抗HIV疫苗設計的主要障礙一直是bNtAb目標是病毒包膜蛋白（Env)， 其是高度可變的，而保守的元素似乎是免疫原性很低。這意味著在受體結合和融合的過程 中，動力學和特殊約束阻礙bNtAb接觸潛在的脆弱位點。事實上僅僅公開了很少的bNtAb。 例如，第一個被確定的bNtAb是bl2,其阻塞gpl20上的⑶4結合位點并防止病毒對⑶4+T 淋巴細胞⑶4結合。gp41亞基比gpl20更保守，gpl20通常在所有菌株中都涉及構象重排。 很少有引起針對gp41保守結構單元bNtAb的探索活動，其中gp41的保守單元被屏蔽，很難 接觸或是很短暫的；這些bNtAb包括2F5和4E10,其針對gp41的近膜胞外結構域（MPER)。 然而，盡管有許多年的研究，由于這些表位是構象表位，能夠引發(fā)這些bNtAb的NtAb免疫原 仍然是未知的。
[0014] 盡管在設計安全有效的針對HIV病毒感染的預防性和治療性疫苗的策略遇到很 大困難，但是在設想有前途的抗HIV的疫苗組合物方面已經(jīng)有很多的進步了。例如，在2012 年初，在美國、加拿大和澳大利亞進行了不少于576例抗HIV疫苗的臨床研究。值得一提的 是，有27例臨床研究完成了四期臨床研究。這些進展表明，隨著時間發(fā)展，抗HIV疫苗越來 越是預防和/或治療有感染HIV病毒風險或者已經(jīng)感染HIV病毒的個體的真實的和可靠的 醫(yī)療工具。所有這些在開發(fā)中的疫苗的目的都是減少病毒的復制。
[0015] 現(xiàn)有技術中公開的預防和治療性的抗HIV疫苗策略是培育抗HIVgp41包膜蛋白 高度保守的基序（它被稱為"3S"）的抗體?，F(xiàn)有技術證明，由與KLH載體蛋白偶聯(lián)的3S肽 以及不完全弗氏佐劑（IFA) -起組成的免疫原性組合物能夠誘導獼猴中的抗3S抗體。它還 表明抗3S抗體對免疫后的⑶4+T細胞下降的獼猴有保護作用。這些結果開辟了其他通過 免疫干預以控制HIV疾病發(fā)展的策略途徑。（Vieillardetal.，2008，PNAS，V〇1. 105(6): 2100-2104).
[0016] 這一策略的第一個目標是針對HIV-1致病性的病毒的決定族而不是病毒復制。
[0017] 現(xiàn)有技術仍然需要預防或治療由HIV病毒引起的感染的治療工具。
[0018]發(fā)明概沭
[0019] 本發(fā)明涉及一種包含如下通式（I)的肽的免疫原性化合物，
[0020] NH2- [Nt]y-P-ff-N-Xi-S-X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-ff- [Ct]z-C00H(I),
[0021] 其中：
[0022] -y是0或1的整數(shù)，
[0023] _z是0或1的整數(shù)，
[0024] _Nt由長度為1到100個氨基酸的肽組成，
[0025] -Ct由長度為1到100個氨基酸的肽組成，
[0026] 4是選自A(丙氨酸），T(蘇氨酸），S(絲氨酸）和N(天冬酰胺）的氨基酸，
[0027] _X2是選自W(色氨酸）和A(丙氨酸）的氨基酸，
[0028] _X3是選自K(賴氨酸）和R(精氨酸）的氨基酸，
[0029] _X4是選自S(絲氨酸）和T(蘇氨酸）的氨基酸，
[0030] _X5是選自L(亮氨酸），Y(酪氨酸）和Q(谷氨酰胺）的氨基酸，
[0031] _X6是選自D(天冬氨酸），N(天冬酰胺），E(谷氨酸），S(絲氨酸）、G(甘氨酸） 和K(賴氨酸）的氨基酸，
[0032] _X7是選自D(天冬氨酸），Q(谷氨酰胺），L(亮氨酸），A(丙氨酸），K(賴氨酸） 和E(谷氨酸）的氨基酸，
[0033] 通式（I)中的肽與由CRM197蛋白組成的載體蛋白共價連接。
[0034] 在一些實施方式中，免疫原性化合物含有SEQID N° 2[NH2-PWNASWSNKSLDDIW-C00H]的肽，其與由CRM197蛋白組成的載體蛋白共價連接。
[0035] 特別是，本發(fā)明涉及一種包含如下通式（V)的肽的免疫原性化合物
[0036] NH2-(Al)m-SEQIDN° 2-(A2)n-C00H(V),
[0037] 其中：
[0038] _m是0或1的整數(shù)，
[0039] _n是0或1的整數(shù)，
[0040] -Al是氨基酸殘基，和
[0041] -A2是氨基酸殘基，
[0042]通式⑴中的肽與由CRM197蛋白組成的載體蛋白共價連接。
[0043] 在根據(jù)本發(fā)明的免疫原性化合物的一些實施方案中，通式（I)的肽包含，或者由 SEQIDN° 5的肽組成。
[0044] 在根據(jù)本發(fā)明的免疫原性化合物的一些其他實施方案中，通式（I)的肽包含，或 者由SEQIDN° 6的肽組成。
[0045] 在一些實施方案中，所述免疫原性化合物直接或通過一個接頭部分共價結合到載 體蛋白的N-末端氨基酸殘基。
[0046] 因此，在一些實施方案中，所述免疫原性化合物通過接頭部分共價結合到載體蛋 白，優(yōu)選是包含兩個反應性琥珀酰亞胺基的接頭部分。
[0047] 本發(fā)明還涉及一種組合物，包含如上述定義的免疫原性化合物和一種或多種免疫 佐劑物質(zhì)的組合物。
[0048] 優(yōu)選地，所述一種或多種免疫佐劑物質(zhì)包含，或由氫氧化鋁（A1 (0H) 3)組成。
[0049] 本發(fā)明還涉及包含免疫原性化合物或如上述定義的組合物，和一種或多種藥學上 可接受的載體的疫苗組合物。
[0050] 本發(fā)明還涉及如上述定義的免疫原性化合物或組合物用于藥物，或用于預防和/ 或治療個體的由HIV病毒感染引起的病癥的用途。
[0051] 它還涉及如上述定義的免疫原性化合物或組合物用于制備預防和/或治療個體 的由HIV病毒感染引起的的病癥的疫苗組合物的用途。
[0052] 本發(fā)明還涉及用于預防和/或治療個體的由HIV病毒感染引起的病癥的方法，所 述方法包括將有效量的如上所定義的疫苗組合物給藥于有需要的個體。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053] 圖1說明當利用與KLH或CRM197偶聯(lián)的3S16Nter肽免疫時抗-3S-肽抗體的增 力口。每個符號都代表由一個小鼠獲得的結果。每一個條代表由相應鼠庫獲得的結果的幾 何平均值。橫坐標：所用的組合物種類；縱坐標：以任意單位（AU)表示的抗-3SIgG滴度。 一個任意單位對應終濃度為lng/yL的小鼠單克隆抗-3S抗體15C8f2的溶液產(chǎn)生的信號。 圖1A:第一次注射后第21天的結果；圖1B:第一次注射后第35天的結果；圖1C:第一次注 射后第49天的結果。
[0054] 圖2說明最優(yōu)3S-肽-CRM197免疫偶聯(lián)物（3S藥物物質(zhì)）在小鼠體內(nèi)的疫苗劑 量范圍。橫坐標：免疫偶聯(lián)物的劑量，表示為抗原等效量（分別為〇( "佐劑"），0.02i!g， 0.21^，11^，21^和41^)?？v坐標：抗-3516財抓1§6滴度，表示為1/中點稀釋度）。中 點稀釋度是給出最大信號的一半的抗血清的稀釋度。X軸表示接種有增加的劑量的表示為 微克（Ug)的3S藥物的3S16Nter肽等價物的小鼠的不同組。每個符號代表一個小鼠。來 自接種有CRM197-3S免疫偶聯(lián)物的小鼠的血清的池用于ELISA分析的標準化。報告由非參 數(shù)Mann-Whitney檢驗計算的統(tǒng)計學意義。
[0055] * :0? 5 >p> 0? 1 ;** :0? 1 >p> 0? 01 ;***:p< 0? 01。
[0056] 圖3說明大鼠的最佳3S-肽-CRM197疫苗的劑量范圍。橫坐標：免疫偶聯(lián)物的劑 量（3S藥物），表示為與載體結合的肽的量，不考慮載體和連接物的重量（肽等價物）（分別 為0("佐劑"），0.021^，0.21^，11^，21^和41^)?？v坐標：抗-33 16財61'186滴度， 表示為1/中點稀釋度。中點稀釋度是給出最大信號的一半的抗血清的稀釋度。X軸表示 接種有增加劑量的以微克（yg)表示的3S藥物的肽等價物的大鼠的不同組。每個符號代 表一個大鼠。來自接種有20iig和50iig的用氫氧化鋁配制的CRM197-3S免疫偶聯(lián)物的大 鼠的血清池用于ELISA的標準化。報告由非參數(shù)Mann-Whitney檢驗計算的統(tǒng)計學意義。
[0057] * :0? 5 >p> 0? 1 ;林：0? 1 >p> 0? 01 ;***:p< 0? 01
[0058] 圖4和5說明使動物，包括靈長類動物，免疫之后獲得的抗_3S16Nter抗體的能 力，其中抗_3S16Nter與在此所述的載體蛋白（KLH或CRM197)偶聯(lián)。
[0059] 圖示4說明對照孔的PE平均熒光。
[0060] 表示在⑶4+T細胞表面上NKp44L密度的所測得的PE熒光平均值已經(jīng)通過細胞熒 光測量儀對第4到第1號孔的細胞進行測量。Y軸代表X-平均熒光。X軸表示不同的測試 條件。有（3S)或無（_)3S16Nter肽，無（-)或有來自3S16NterIgG陰性（兔neg)或陽性 (兔P〇s)兔1/50稀釋度的血清。重復測試對照和報告標準偏差（誤差線）。
[0061] 圖5說明測試項目孔的X-平均熒光。
[0062] 表示在⑶4+T細胞表面上NKp44L密度的所測得的PE熒光平均值已經(jīng)通過細胞熒 光測量儀對第16號到第45號孔的細胞進行測量。Y軸代表X-平均熒光。X軸表示不同的測 試條件。所有的孔都在3S16Nter肽存在下進行測試。測試來自接種有含佐劑的CRM197-3S 16Mter免疫偶聯(lián)物（R122d49)的大鼠的血清。每個稀釋度測試三次，報告標準偏差（誤差 線）。在1/50稀釋度下測試抗-3S16NterIgG陰性血清（陰性對照）。在1/100、1/400、 1/1600和1/6400稀釋度下測試抗-3S16NterIgG陽性血清。
[0063] 圖6說明當用與CRM197偶聯(lián)的m3S16Nter肽免疫時產(chǎn)生抗-3S-肽抗體。每個符 號都代表由一個小鼠獲得的結果以及對六個小鼠進行了免疫。小鼠分別在第〇、14、28、169 和212天進行注射，如相應的箭頭所示。橫坐標：在第一次注射免疫偶聯(lián)物后的時間段，表 示為天數(shù)。縱坐標：表示為1/中點的抗-3S抗體滴度。
[0064] 發(fā)明詳沭
[0065]本發(fā)明主要提供用于制備組合物，特別是抗HIV的疫苗組合物的新型免疫原性化 合物。
[0066] 本發(fā)明人在設計具有誘導針對3S肽的高的和有效的抗體反應能力的免疫原性化 合物方面進行了深入的研究工作。
[0067] 如在此所使用的，在本說明書中將3S肽總地定義為具有式（I)的肽，描述如下。3S 肽包含SEQIDN° 5(NH2-CPWNASWSNKSLDDIW-C00H)的3S肽，其在本領域是已知的。
[0068] 如在此所使用的，抗-3S抗體由針對式（I)的肽的抗體組成并包含針對SEQID N° 5的3S肽的抗體。
[0069]SEQIDN° 5 的 3S肽在本發(fā)明之前已經(jīng)由Vieillard等（Vieillardetal., 2008，PNAS，V〇1. 105(6) :2100-2104)確定為抗-HIV的候選抗原。需要提醒的是Vieillard 等已經(jīng)通過利用由與熟知的KLH載體蛋白共價連接的SEQIDN° 5的3S肽構成的免疫偶 聯(lián)化合物誘導了抗-3S抗體。
[0070] 這里需要提醒的是，KLH幾乎是目前唯一的以抗原蛋白載體偶聯(lián)物的形式用 于包含免疫原性物質(zhì)的疫苗組合物的載體蛋白。此外，KLH已廣泛用于產(chǎn)生抗體（Lee， Huang，Lasanthi，Jayathilaka，LateefandGupta,2010.Productionofantipeptide antibodies,MethodsinMolecularBiology,657 ：93-108,S.D.Schwartzbachand T.Osafune(eds.),Springer；Ragupathi,GathuruandLivington,2005,Antibody inducingpolyvalentcancervaccines,CancerTreatRes,123 :157-150 ;Harris andMarkl,1999,Keyholelimpethemocyanin(KLH)：abiomedicalreview,Micron, 30-597-623)〇
[0071]令人驚奇的是，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由Vieillard等人使用的KLH常規(guī)載體蛋白不 適合用于設計產(chǎn)生有效的抗-3S抗體反應的免疫原性化合物，其目的是誘導針對個體的由 HIV家族病毒，特別是HIV-1病毒感染引起的免疫疾病的保護作用。特別地，本發(fā)明人意外 地發(fā)現(xiàn)了，3S肽接枝的KLH分子（KLH-3S)形成聚集體，其導致包含不同表觀分子量的相關 實體的異質(zhì)性的最終的免疫原性化合物。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了包含KLH-3S偶聯(lián)物的免疫 原性化合物不能以獲得可用作藥物的化學定義的產(chǎn)品為目的可重復地制造，特別是用于人 類使用的藥物。
[0072] 非常令人驚奇的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了有效的抗-3S抗體反應可以通過使用特異性 免疫原性化合物獲得，所述化合物由抗原載體偶聯(lián)物組成，其中所述載體分子由CRM197蛋 白組成。特別地，發(fā)現(xiàn)了通過使用CRM197載體蛋白，與其中抗原肽共價結合到傳統(tǒng)的KLH 載體蛋白的免疫原性化合物相比，抗-3S抗體提高了約100倍。
[0073]CRM197蛋白由熟知的白喉毒素的無毒突變體構成，該突變體是由Uchida等人最 初描述的（1973，J.Biol.Chem.，Vol.248 :3838-3844)。CRM197突變體蛋白最初被描述為突 變tox97基因的轉譯產(chǎn)物，其中G-A的轉變導致野生型白喉毒素的52位上的甘氨酸（G) 殘基被谷氨酸殘基（E)取代。
[0074] 根據(jù)本 申請人:的知識，直到現(xiàn)在CRM197已很難用作制備免疫原性化合物，特別是 肽偶聯(lián)物的載體分子。根據(jù)本 申請人:的知識，CRM197已專門作為寡糖抗原的載體物質(zhì)，即 用于產(chǎn)生針對本領域熟知具有一種非常特定的免疫學特性的非蛋白結構的抗體。更確切地 說，看來，CRM197已專門作為以下物質(zhì)的載體分子：（i)來自肺炎鏈球菌的莢膜抗原的寡糖 (oligoside), (ii)來自腦膜炎奈氏球菌的寡糖和（iii)用于乙型流感嗜血桿菌的莢膜多 糖。
[0075] 本發(fā)明涉及包含如下通式（I)的肽的免疫原性化合物
[0076]NH2- [Nt]y-P-ff-N-X1-S-X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X7-I-ff- [Ct]z-C00H(I),
[0077]其中：
[0078] _y是0或1的整數(shù)，
[0079] _z是0或1的整數(shù)，
[0080] _Nt由長度為1到100個氨基酸的肽組成，
[0081] -ct由長度為1到100個氨基酸的肽組成，
[0082]4是選自A(丙氨酸），T(蘇氨酸），S(絲氨酸）和N(天冬酰胺）的氨基酸，
[0083] _X2是選自W(色氨酸）和A(丙氨酸）的氨基酸，
[0084] _X3是選自K(賴氨酸）和R(精氨酸）的氨基酸，
[0085] _X4是選自S(絲氨酸）和T(蘇氨酸）的氨基酸，
[0086]_X5是選自L(亮氨酸），Y(酪氨酸）和Q(谷氨酰胺）的氨基酸，
[0087] _X6是選自D(天冬氨酸），N(天冬酰胺），E(谷氨酸），S(絲氨酸）、G(甘氨酸） 和K(賴氨酸）的氨基酸，
[0088] _X7是選自D(天冬氨酸），Q(谷氨酰胺），L(亮氨酸），A(丙氨酸），K(賴氨酸） 和E(谷氨酸）的氨基酸，
[0089] 通式（I)中的肽與由CRM197蛋白構成的載體蛋白共價連接。
[0090] 為本描述的目的，通式（I)的免疫原性化合物在此也可稱為NH2-[Nt]y-SEQID N。l-[Ct]z-C00H(I)
[0091] 在通式（I)的免疫原性化合物的一些實施方案中，Xi優(yōu)選為A，
[0092] 在通式⑴的免疫原性化合物的一些實施方案中，X2優(yōu)選為W，
[0093] 在通式⑴的免疫原性化合物的一些實施方案中，X3優(yōu)選為K，
[0094] 在通式⑴的免疫原性化合物的一些實施方案中，X4優(yōu)選為S，
[0095] 在通式⑴的免疫原性化合物的一些實施方案中，X5優(yōu)選為L，
[0096] 在通式（I)的免疫原性化合物的一些實施方案中，X6優(yōu)選為D，和
[0097] 在通式⑴的免疫原性化合物的一些實施方案中，X7優(yōu)選為D，
[0098] 在通式⑴的免疫原性化合物的一些實施方案中，一個或多個選自由XpX2、X3、X4、 X5、&和17組成的組的氨基酸都分別具有優(yōu)選的上述特定含義。在一些實施方案中，選自 由XpX2、X3、X4、X5、\和X7組成的組的氨基酸的1、2、3、4、5、6或7都分別具有優(yōu)選的上述 特定含義。
[0099] 在選自由XpX2、X3、X4、X5、\和X7構成的組的七個氨基酸都分別具有優(yōu)選的上述 特定含義的實施方案中，所述免疫原性肽由通式（Ila)的肽組成：
[0100] NH2-[Nt]y-P-ff-N-A-S-ff-S-N-K-S-L-D-D-I-ff-[Ct]z-C00H(Ila),
[0101] 這也可稱為：
[0102] NH2-[Nt]y-SEQIDN° 2-[Ct]z-C00H(Ila)。
[0103] 在選自選自由HHXjPX7組成的組的六個氨基酸都分別具有優(yōu)選的上述 特定含義以及其中氨基酸X2是指A(丙氨酸）的實施方案中，所述免疫原性肽由通式（lib) 的肽組成：
[0104] NH2- [Nt]y-P-ff-N-A-S-A-S-N-K-S-L-D-D-I-ff- [Ct]z-C00H(Ilb),
[0105] 這也可稱為：
[0106]NH2-[Nt]y-SEQIDN° 6-[Ct]z-C00H(lib)。
[0107] 帶有從1到100氨基酸殘基長度的Nt肽包含具有1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12， 13,14,15,16,17,18,19,20, 21，22, 23,24, 25,26,27,28,29, 30,31，32,33,34, 35,36,37， 38, 39,40,41，42,43,44, 45, 46,47, 48,49,50,51，52,53,54, 55,56,57,58,59,60,61，62， 63, 64, 65,66,67,68,69,70, 71，72, 73,74, 75,76,77,78,79, 80,81，82,83,84, 85,86,87， 88,89,90,91，92,93,94,95,96,97,98,99 和 100 的氨基酸殘基長度的肽，
[0108] 在一些實施方案中，Nt肽具有10個氨基酸殘基的長度或更少，其包含5個氨基酸 殘基或更少的氨基酸長度。
[0109] 在一些實施方案中，Nt肽的N-末端殘基由C(半胱氨酸）殘基組成。
[0110] 在一些實施方案中，Nt肽具有如下通式（III):
[0111] 具有SEQIDN。3 的NHfC-YfT-YfV-ail)，其中：
[0112] 4是選自T(蘇氨酸）和P(脯氨酸）的氨基酸，
[0113] _Y2是選自A(丙氨酸），T(蘇氨酸）和N(天冬酰胺）的氨基酸，
[0114] 在一些其它實施方案中，Nt肽由半胱氨酸殘基（也被稱為"C"）組成。
[0115] 帶有從1到100氨基酸殘基長度的Ct肽包含具有1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12， 13,14,15,16,17,18,19,20, 21，22, 23,24, 25,26,27,28,29, 30,31，32,33,34, 35,36,37， 38, 39,40,41，42,43,44, 45, 46,47, 48,49,50,51，52,53,54, 55,56,57,58,59,60,61，62， 63, 64, 65,66,67,68,69,70, 71，72, 73,74, 75,76,77,78,79, 80,81，82,83,84, 85,86,87， 88,89,90,91，92,93,94,95,96,97,98,99 和 100 氨基酸殘基長度的肽，
[0116] 在一些實施方案中，Ct肽具有10個氨基酸殘基的長度或更少，其包含5個氨基酸 殘基或更少的氨基酸長度。
[0117] 在一些實施方案中，Ct肽的C-末端殘基由C(半胱氨酸殘基）組成。
[0118] 在一些實施方案中，Nt肽具有通式（IV):
[0119]具有SEQIDN° 4 的-Y3-Y4-M-T-W-C00H(III)，其中：
[0120] _Y3是選自D(天冬氨酸），Q(谷氨酰胺），E(谷氨酸）和N(天冬酰胺）的氨基酸，
[0121]-Y4是選自N(天冬酰胺），H(組氨酸），S(絲氨酸）和K(賴氨酸）的氨基酸，
[0122] 在一些其它實施方案中，Ct肽由一個半胱氨酸殘基（也被稱為"C"）組成。
[0123] 在其它的一些實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性化合物中缺少Ct肽。
[0124] 在根據(jù)本發(fā)明的免疫原性化合物的一些【具體實施方式】中，所述肽具有如下通式 (V)。
[0125] 因此，本發(fā)明涉及包含通式（V)的肽的免疫原性化合物
[0126]NH2-(Al)m-SEQIDN° l-(A2)n_C00H (V)，
[0127]其中：
[0128] _m是0或1的整數(shù)，
[0129] _n是0或1的整數(shù)，
[0130] -A1是氨基酸殘基，并且
[0131] -A2是氨基酸殘基，
[0132] 通式⑴中的肽與由CRM197蛋白組成的載體蛋白共價連接。
[0133] 在通式（V)的肽的一些實施方案中，m等于l，n等于0和A1是半胱氨酸（C)殘基。
[0134] 本發(fā)明還涉及一種包含如下通式（Via)的肽的免疫原性化合物
[0135]NH2-(Al)m-SEQIDN° 2-(A2)n-C00H(VIa),
[0136]其中：
[0137] _m是0或1的整數(shù)，
[0138] _n是0或1的整數(shù)，
[0139] -A1是氨基酸殘基，并且
[0140] -A2是氨基酸殘基，
[0141] 通式（Via)中的肽與由CRM197蛋白組成的載體蛋白共價連接。
[0142] 本發(fā)明還涉及一種包含如下通式（VIb)的肽的免疫原性化合物
[0143]NH2-(Al)m-SEQIDN° 6-(A2)n-C00H (VIb),
[0144]其中：
[0145]_m是0或1的整數(shù)，
[0146] _n是0或1的整數(shù)，
[0147] -A1是氨基酸殘基，并且
[0148] -A2是氨基酸殘基，
[0149] 通式（VIb)中的肽與由CRM197蛋白組成的載體蛋白共價連接。
[0150] 在通式（Via)或（VIb)的肽的一些實施方案中，m等于l，n等于0和A1是半胱氨 酸（C)殘基。
[0151] 顯然地，通式（V)、（Via)或（VIb)的肽根據(jù)本發(fā)明的通式（I)的肽的具體實施方 案。因此，參照通式（I)的肽描述的本發(fā)明的免疫原性化合物的每個實施方案包含通式（I) 的肽由通式（V)的肽或通式（Via)或（VIb)的肽構成的相同實施方案，除非另有指明。
[0152] 也顯然地，通式（Via)或（VIb)的肽是根據(jù)本發(fā)明的通式（V)的肽的具體實施方 案。因此，參照通式（I)或（V)的肽描述的本發(fā)明的免疫原性化合物的每個實施方案包含 其中通式⑴肽或通式（V)的肽由通式（Via)或（VIb)的肽構成的相同實施方案，除非另 有指明。
[0153] 如在此所使用的，氨基酸殘基包括丙氨酸（也被稱為"A"或"Ala"），精氨酸（也 被稱為（"R"或"Arg"），天冬酰胺（也被稱為"N"或"Asn"），天冬氨酸（也被稱為"D" 或"Asp"），半胱氨酸（也被稱為"C"或"Cys"），谷氨酰胺（也被稱為"Q"或"Gin"），谷 氨酸（又稱為（"E"或"Glu)，甘氨酸（也被稱為"G"或"Gly"），組氨酸（也被稱為"H" 或"His"），異亮氨酸（也被稱為"I"或" 11e"），亮氨酸（也被稱為"L"或"Leu"），賴氨酸 (也被稱為"K"或"Lys"），蛋氨酸（又稱為"M"或"Met"），苯丙氨酸（也被稱為（"F"或 "Phe"），脯氨酸（也被稱為"P"或"Pro"），絲氨酸（也被稱為"S"或"Ser"），蘇氨酸（也 被稱為"T"或"Thr"），色氨酸（也被稱為"W"或"Trp"），酪氨酸（也被稱為"Y"或"Tyr"） 和纈氨酸（也被稱為"V"或"Val"）。
[0154] 如上文所述，CRM197是用于向免疫系統(tǒng)細胞提供蛋白抗原的的非常規(guī)載體分子。 CRM197對于本領域技術人員是可容易得到的。特別地，CRM197可以商品名CRM197(rDNA) 由CompanyPfenexInc(SanDiego,美國）商購。在此CRM197 定義為具有SEQIDN。8 的蛋白。
[0155] 通式（I)的肽，包括在此描述的通式（V)和通式（Via)或（VIb)的【具體實施方式】， 可以由已知的克隆技術或通過化學合成制備。
[0156] 例如，DNA編碼通式（I)的肽是利用克隆技術制備的，并將其插入可自主復制載體 以制備重組DNA。將重組DNA引入適當?shù)乃拗?，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、放線菌、酵母菌、 絲狀真菌、植物細胞、昆蟲細胞和動物細胞，以獲得轉化子。從轉化子的培養(yǎng)產(chǎn)物可獲得含 有通式（I)的肽的肽?；蛘?，制備編碼通式（I)的肽的DNA，并通過利用小麥胚芽和來自大 腸桿菌的細胞提取物無細胞蛋白合成系統(tǒng)以合成本發(fā)明的肽。在通式（I)的肽與載體蛋白 連接的一些實施方案中，可以通過重組DNA技術合成由含有通式（I)的肽和期望的載體蛋 白的融合蛋白組成的免疫原性產(chǎn)品。
[0157] 此外，使用常規(guī)的化學合成方法，如"固相法"或"液相法"，通過脫水/縮合依次連 接和擴展氨基酸從而合成通式（I)的肽。
[0158] 為了制備如上述定義的免疫原性化合物，可以使用任何合適的偶聯(lián)反應，利用必 要時的任何適合的連接部分，這是本領域眾所周知的。
[0159] 在通式（V)、（Via)或（VIb)的肽的某些實施方案中，當整數(shù)m和/或n(是）等于 〇時，氨基酸殘基A1和/或A2是不在的。
[0160] 在通式（V)、（Via)或（VIB)的肽的一些實施方案中，A1存在（即整數(shù)m= 1)和 A2不存在（即整數(shù)n= 0)。
[0161] 在通式（V)、（Via)或（VIb)的肽的一些實施方案中，A1不在（即整數(shù)m= 0)和 A2存在（即整數(shù)n= 1)。
[0162] 在通式（V)、（Via)或（VIb)的肽的一些優(yōu)選的實施方案中，A1和/或A2,當存在 時，由（S)的半胱氨酸殘基組成。
[0163] 在通式（V)、（Via)或（VIb)的肽的一些優(yōu)選的實施方案中，A1存在并由N-末端 的半胱氨酸殘基組成以及A2不存在，即整數(shù)n等于0。在這些優(yōu)選的實施方案中，肽或通 式（V)、或（Via)由SEQIDN° 5的肽組成。在這些優(yōu)選的實施方案中，通式（V)或（VIb) 的肽由SEQIDN° 7的肽組成。
[0164] 從技術的角度來看，通式（I)的肽，包括通式（V)或式（VI)的肽，可直接或通過連 接部分共價連接到CRM197,通過它們的N-末端氨基酸殘基或通過它們的C-末端氨基酸殘 基。在這些一般實施方案中，共價鍵可以包括來自通式（I)的肽的所述氨基酸殘基的可用 的氨基和羧基?；蛘?，共價鍵可包括位于來自通式（I)的肽的所述氨基酸殘基的 側鏈上的可用的氨基、羧基或硫醇基。
[0165] 然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如上述定義的其中通式⑴的肽通過其C-末端與CRM197共價連 接的免疫原性化合物并不是最佳的，因為這樣的免疫原性肽具有形成聚集體的傾向，這可 能表示其在獲得化學定義的和容易復制的藥物組合物方面的明顯缺點。
[0166] 因此，在上述定義的免疫原性化合物的一些優(yōu)選的實施方案中，通式（I)的肽通 過其N-末端共價結合CRM197。
[0167] 此外，在上述定義的免疫原性化合物中，通式（I)的肽最優(yōu)選通過適當?shù)慕宇^ (linker)與CRM197共價連接。在此發(fā)現(xiàn)接頭橋接通式（I)的肽和CRM197的接頭的存在在 分子中引入了一定的柔性，使得通式（I)的肽中包含的與存在于免疫系統(tǒng)的，即主要是T細 胞和B細胞，細胞表面的相應受體相關的表位具有較好的可利用性。
[0168] 因此，在上述定義的免疫原性化合物的一些優(yōu)選的實施方案中，通式（I)的肽通 過連接部分共價結合到CRM197。
[0169] 在一些優(yōu)選的實施方案中，通式（I)的肽共價結合到CRM197的N-末端，通過連接 部分。
[0170] 所述連接部分是通過使連接部分同時與CRM197和通式（I)肽接頭反應而獲得。
[0171] 在優(yōu)選實施方案中，接頭分別具有兩種不同的反應性基團，（i)琥珀酰亞胺基和 (ii)馬來酰亞胺基團。每個反應性基團可用于分別與⑴CRM197和（ii)通式⑴的肽的 氣基或疏基反應。
[0172] 這種接頭種類是本領域眾所周知的且易于商購得到。
[0173] 然而，在此發(fā)現(xiàn)了這些異雙功能接頭不是最佳的，特別是當尋求制備一種疫苗 組合物時。具體來說，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了異雙功能接頭如MBS(間-馬來酰亞胺基苯甲酰 基-N-輕基玻拍醜亞胺酯（m-MaleimidoBenzoyl-N-hydroxySuccinimidyl酯））的使用導 致最終產(chǎn)品很難溶于水。免疫原性化合物的低水溶性在制造疫苗組合物方面可能是實質(zhì)上 的技術缺陷，原因在于易于給藥的疫苗組合物的最終劑型通常由水基鹽水體溶液或懸浮液 組成，其最終可能還包含一種或多種藥學上可接受的水溶性溶劑。如在這里的實施例說明 的，其中CRM197通過MBS共價連接到通式（I)的肽的免疫偶聯(lián)物保持免疫原性，即當被體 內(nèi)注射時能夠產(chǎn)生相關的抗-3S抗體，盡管由于其形成聚集體的傾向而不能夠被用作疫苗 組合物的活性成分。
[0174] 令人驚奇的是，本發(fā)明人已經(jīng)確定有限的的接頭家族是最適合制造在此定義的免 疫原性化合物的。從適合作為疫苗組合物的免疫原性活性成分的角度看，所述免疫原性化 合物應是完全水溶性的并因此應均勻地分布在液體組合物的整個體積中。所述有限的接頭 家族包括，或甚至分別由命名為SMPB和磺基SMPB的接頭組成。
[0175] 因此，在上述定義的免疫原性化合物的一些優(yōu)選的實施方案中，所述接 頭選自SMPB(琥拍酰亞胺基4-[對-馬來酰亞胺苯基]丁酸酯（succinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrate))和磺基-SMPB(磺基琥拍酰亞胺基4-[對-馬來酰亞胺 苯基]丁酸酉旨（sulfosuccinimidyl4-[p_maleimidophenyl]butyrate))。
[0176] 將兩種蛋白與一般的接頭，特別是與選自SMPB和磺基-SMPB的接頭偶聯(lián)的方法是 本領域眾所周知。具體來說，這樣的方法在由PierceCompany(Illinois，Etats_Unis)公 開在公眾可得的印刷品中。
[0177]SMPB和磺基-SMPB由包含N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)酯基和馬來酰亞胺基的異雙 功能接頭組成。使用SMPB或磺基-SMPB的偶聯(lián)通常是由兩步過程進行。在第一步驟中，含 胺蛋白（如CRM197)與過量幾倍摩爾的交聯(lián)劑在pH7-9反應形成酰胺鍵，接著去除過量的 未反應接頭，通常通過脫鹽或滲析。在第二步驟中，添加含有巰基（例如通式（I)的肽）分 子以與已經(jīng)連接到第一蛋白的馬來酰亞胺基團（例如，已共價連接到CRM197的連接鏈的自 由馬來酰亞胺基團）在pH6. 5-7. 5反應形成穩(wěn)定的硫醚鍵。
[0178] 使用SMPB或磺基-SMPB作為將通式⑴的肽的共價連接到CRM197載體蛋白的接 頭得到如下通式（VII)的偶聯(lián)物：

【權利要求】
1. 一種包含如下通式（I)肽的免疫原性化合物， NH2- [Nt] y-P-ff-N-XrS- -X2-S-N-X3-X4-X5-X6-X 7-I-ff- [Ct] z-COOH (I), 其中： -y是〇或1的整數(shù)， -z是0或1的整數(shù)， -Nt由長度為1到100個氨基酸的肽組成， -Ct由長度為1到100個氨基酸的肽組成， -?是選自A (丙氨酸）、T (蘇氨酸）、S (絲氨酸）和N(天冬酰胺）的氨基酸， _X2是選自W(色氨酸）和A (丙氨酸）的氨基酸， _X3是選自K (賴氨酸）和R(精氨酸）的氨基酸， _X4是選自S (絲氨酸）和T (蘇氨酸）的氨基酸， _X5是選自L (亮氨酸）、Y (酪氨酸）和Q (谷氨酰胺）的氨基酸， _X6是選自D(天冬氨酸）、N(天冬酰胺）、E(谷氨酸）、S(絲氨酸）、G(甘氨酸）和K(賴 氨酸）的氨基酸， _X7是選自D(天冬氨酸）、Q(谷氨酰胺）、L(亮氨酸）、A(丙氨酸）、K(賴氨酸）和E(谷 氨酸）的氨基酸， 通式⑴中的肽與由CRM197蛋白組成的載體蛋白共價連接。
2. 根據(jù)權利要求1所述的免疫原性化合物包含選自以下通式（Via)和（VIb)的肽： NH2-(Al)m-SEQ IDN° 2-(A2)n-COOH(VIa), NH2-(Al)m-SEQ IDN° 6-(A2)n-COOH(VIb), 其中： -m是0或1自的整數(shù)， -n是0或1的整數(shù)， -A1是氨基酸殘基，并且 -A2是氨基酸殘基， 通式（Via)或（VIb)中的肽與由CRM197蛋白組成的的載體蛋白共價連接。
3. 根據(jù)權利要求1到2的任一項所述的免疫原性化合物，選自SEQ ID N° 5和SEQ ID N° 7。
4. 根據(jù)權利要求1到3的任一項所述的免疫原性化合物，其通過其N-末端氨基酸殘基 共價結合到CRM197蛋白。
5. 根據(jù)權利要求1到4的任一項所述的免疫原性化合物，其通過接頭部分共價結合到 CRM197 蛋白。
6. 根據(jù)權利要求5所述的免疫原性化合物，其中所述接頭部分是具有兩個反應性基團 的接頭與CRM197和通式⑴肽的反應產(chǎn)物。
7. 根據(jù)權利要求6所述的免疫原性化合物，其中所述接頭部分由琥珀酰亞胺基 4_ [對-馬來酰亞胺基苯基]丁酸酯（SMPB)和磺基-SMPB組成。
8. 含有權利要求1到7的任一項所述的免疫原性化合物和一種或多種免疫佐劑物質(zhì)的 組合物。
9. 根據(jù)權利要求8所述的組合物，其適于形成即用型疫苗組合物，包含表示為抗原性 肽當量的每個劑量單位為0. 01 y g到200 i! g，優(yōu)選0. 05 i! g到50 i! g，最優(yōu)選從0. 1 i! g到 20 U g量的所述抗原性化合物。
10. 根據(jù)權利要求8到9的任一項所述的組合物，其中所述免疫佐劑物質(zhì)由氫氧化鋁 (Al(OH)3)組成。
11. 根據(jù)權利要求10所述的組合物，其適于形成即用型疫苗組合物，包含表示為Al3+離 子含量的終濃度為〇. 1到5mg/ml，優(yōu)選0. 05到2mg/ml，并且最優(yōu)選是約lmg/ml的氫氧化 錯。
12. 根據(jù)權利要求9到11的任一項所述的組合物，其適于形成即用型疫苗組合物，包含 終濃度為〇. 1至50mM的磷酸鈉，優(yōu)選0. 5至15mM的磷酸鈉，最優(yōu)選約ImM的磷酸鈉。
13. 根據(jù)權利要求9到12的任一項所述的組合物，它是液體形式或固體形式，包括凍干 形式。
14. 包含權利要求1到6的任一項所述的免疫原性化合物，或根據(jù)權利要求8到13的 任一項所述的組合物，和一種或多種藥學上可接受的載體的疫苗組合物。
15. 根據(jù)權利要求1到7的任一項所述化合物，或根據(jù)權利要求8到13的任一項所述 的組合物，或根據(jù)權利要求14所述的疫苗組合物，用作藥物的用途。
16. 根據(jù)權利要求1到7的任一項所述的免疫原性化合物，或根據(jù)權利要求8到13的 任一項所述的組合物，或根據(jù)權利要求14所述的的疫苗組合物，用于預防和/或治療HIV 病毒感染的個體的病癥。
【文檔編號】A61P31/18GK104507496SQ201380041048
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年5月30日 優(yōu)先權日:2012年5月31日
【發(fā)明者】若埃爾·克魯澤, 拉斐爾·何崇方, 多米尼克·德方丹 申請人:伊納維爾瓦克斯公司