P·W·伯曼(圣克魯茲,CA)辰野葛文(GwenTatsuno)(圣克魯茲,CA)俞斌(BinYu)(圣克魯茲,CA)J·莫拉萊斯(圣克魯茲,CA)K·梅薩(圣克魯茲,CA)發(fā)明人地址：加利福尼亞(CA)圣克魯茲圣克魯茲大街1156號加利福尼亞大學(xué)(U.C.)95064USA受讓人/申請人：加利福尼亞大學(xué)董事會技術(shù)轉(zhuǎn)移辦公室加利福尼亞奧克蘭富蘭克林大街1111號5樓94607USA本申請代理人：BELL&ASSOCIATES舊金山西部門戶大道#12158號(58WestPortalAvenue#121)加利福尼亞94127.Info@bell-iplaw.com,PTO客戶No.039843優(yōu)先權(quán)申請相關(guān)性本國際申請要求申請?zhí)枮?1/699,680、申請日為2012年9月11日、名稱為“具有被廣譜中和抗體識別的多糖依賴抗原表位的HIV-1包膜蛋白和片段”的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)，通過引用的方式，整體包含在本文中。政府支持的聲明本申請受到[尚無政府支持]
技術(shù)領(lǐng)域：
：具有抗HIV感染免疫保護(hù)效應(yīng)的疫苗。
背景技術(shù)：
：：HIV-1疫苗開發(fā)的一個重要目標(biāo)在于發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)廣譜中和抗體(bNAbs)的免疫原。經(jīng)過25年以上的努力，目前還沒有開發(fā)出能夠誘導(dǎo)該類型抗體的疫苗。在過去的十年中，未能夠誘導(dǎo)bNAbs的原因歸結(jié)為我們沒有成功地精確復(fù)制在病毒表面構(gòu)成病毒刺突的三聚包膜蛋白(gp120和gp41)。在過去的幾年中，已有數(shù)據(jù)表明廣譜中和抗體識別HIV-1包膜蛋白中的聚糖依賴表位，而gp120不是只由氨基酸組成的表位。最近，已經(jīng)解開了數(shù)個結(jié)合于HIV-1包膜蛋白的廣譜中和抗體3D結(jié)構(gòu)。這表明，多達(dá)77％的經(jīng)所選廣譜中和單克隆抗體(bN-Mabs)識別的結(jié)合表面由糖類構(gòu)成的。此外，這些研究表明，通過原型PG9MAb(16)識別的表位定位于gp120的V1/V2結(jié)構(gòu)域并依賴甘露糖-5而結(jié)合。類似地，通過原型MAbPGT128(15)識別的另一個表位定位于V3loop的干部(stem，莖部)并依賴甘露糖-9來結(jié)合。即使bN-Mabs與單體gp120有結(jié)合，它們也是很少的，但它們卻展示出與細(xì)胞或病毒表面三聚物包膜的有力結(jié)合，所以，這些抗體被認(rèn)為識別于糖類和包膜三聚物四級結(jié)構(gòu)依賴的表位(8,15)。對個體發(fā)生的PG9-樣抗體的研究(3)證實(shí)PG9種系前體(germlineprecursor)和PG9-樣抗體均不能與大多數(shù)單體gp120蛋白結(jié)合。然而，一個顯著的例外是來自HIV-1A244株的gp120。我們實(shí)驗(yàn)室早在1990年代初對該病毒序列進(jìn)行了測定(7)，并對該蛋白進(jìn)行了多年的研究。該蛋白確實(shí)是AIDSVAXB/E疫苗的一個主要元件，該疫苗由基因泰克(Genentech)開發(fā)然后許可給VaxGen(1,2)。該疫苗在泰國(1998-2003)實(shí)施的3期臨床(VAX003)試驗(yàn)中沒能提供保護(hù)作用(11)。然而，在涉及16000多名志愿者、結(jié)束于2009年的RV144試驗(yàn)中(12)，當(dāng)該疫苗與另一個疫苗vCP1521聯(lián)合使用時，則達(dá)到了適度的但是有效的保護(hù)(31.4％有效性)作用。發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的單體gp120都會與PG9結(jié)合，只要它在156和160位具有糖基化位點(diǎn)，且未被糖基化或僅部分糖基化，以及約在166-173位氨基酸區(qū)域具有適宜的氨基酸。本發(fā)明人具有來自數(shù)個分離的和新合成的構(gòu)建物數(shù)據(jù)表明了該情況屬實(shí)。HIV科學(xué)家們目前的共識是，由于四級(結(jié)構(gòu))相互作用，gp120與三聚體結(jié)合地更好。本發(fā)明人表明這是不正確的——如果在GNT1(-)細(xì)胞中產(chǎn)生，幾乎任何gp120都將結(jié)合。我們的數(shù)據(jù)表明，PG9與三聚體結(jié)合地更好，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)形成的三聚體屏蔽了156和160位與糖處理酶(glycoprocessingenzymes)的相互作用，導(dǎo)致在156和160位的不完全糖基化。大多數(shù)單體蛋白不會被屏蔽于這些酶，并因此獲得完全成熟的不被PG9識別的復(fù)合類糖類。因此，PG9與三聚體的優(yōu)先結(jié)合歸結(jié)于由三聚反應(yīng)導(dǎo)致的不完全的糖基化，而不是基于四級相互作用的表位的存在。本發(fā)明基于的理論是，對PG9-樣表位免疫反應(yīng)的最佳改進(jìn)方式是開發(fā)小而合適的糖基化糖蛋白片段，或具有本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的PG9結(jié)合所需的糖類結(jié)構(gòu)的“支架”(scaffolds)，及其與其它Env蛋白或其它支架的組合來制備多價雞尾酒疫苗。本發(fā)明包括HIVgp120V1/V2抗原(支架)的小型糖基化片段，其具有PG9結(jié)合所需的糖類結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還包括將此類支架和其它Env蛋白或其它支架聯(lián)合來制備多價雞尾酒疫苗。本發(fā)明包含一疫苗，其包含V1/V2糖蛋白片段支架，其在一細(xì)胞系中制備，例如HIV-1的A244株，或在其它的實(shí)施方式中，兩個或多個HIV株，其中糖基化限定于甘露糖-5的糖基化，并且其中所述的支架在V1/V2結(jié)構(gòu)域具有被PG9MAb(單克隆抗體)識別的表位。所述V1/V2支架可以在細(xì)胞系中產(chǎn)生的任何HIV-1毒株中表達(dá)，其中糖基化限定于甘露糖-5的糖基化，并且其中所述的支架在V1/V2結(jié)構(gòu)域具有被PG9MAb識別的表位。所述疫苗可以包括源自產(chǎn)生于細(xì)胞系中的兩個或多個HIV-1株的V1/V2支架，其中糖基化限定于甘露糖-5，并且其中所述的支架在V1/V2結(jié)構(gòu)域具有被PG9MAb識別的表位。在不同的實(shí)施方式中，所述支架可以偶聯(lián)于免疫原性載體蛋白。在另一實(shí)施方式中，疫苗可以包括gp120和V1/V2支架的混合物，其中兩個組分均產(chǎn)生于甘露糖-5被包含在V1/V2結(jié)構(gòu)域中的條件下，并且兩個組分均能夠結(jié)合至PG9MAb。此外，一個或兩個組分來源于HIV-1的A244株。其中，使用兩個或多個免疫原性組分，例如gp120和所述V1/V2支架的混合物，各組分可以同時施用于對象并且兩個組分可以包含在同一制劑中并在同一時間進(jìn)行免疫。可選地，各組分可以分別制成制劑，可以在不同的時間進(jìn)行免疫(基礎(chǔ)/強(qiáng)化方案)。另一個實(shí)施方式中，包含源自經(jīng)突變的MN-rgp120的包膜基因，所述MN-rgp120突變成在289、301、332位和任選的334位含有N-連接的糖基化位點(diǎn)，當(dāng)表達(dá)于標(biāo)準(zhǔn)(normal)293細(xì)胞中時，具有能夠被PG9和PGT128MAb識別的表位。(MN-rgp120是一重組gp120，其為在RV144試驗(yàn)中的AIDSVAXB/E疫苗的一個主要的成分)。在另一實(shí)施方式中，所述疫苗制劑是基于重組gp120的，其來自于源于經(jīng)突變的MN-rgp120的包膜基因，所述經(jīng)突變的MN-rgp120在289、301、332和/或334位含有N-連接的糖基化位點(diǎn)，當(dāng)表達(dá)于標(biāo)準(zhǔn)293細(xì)胞中時具有能夠被PG9和PGT128MAb識別的表位。相關(guān)的實(shí)施方式中，進(jìn)一步包括V1/V2支架，所述支架的產(chǎn)生條件中V1/V2結(jié)構(gòu)域含有甘露糖-5，并且兩個組分均能夠結(jié)合至PG9MAb。在可選的實(shí)施方式中，所述疫苗包括一混合物，該混合物包括gp120和V1/V2支架，gp120來自源于經(jīng)突變的MN-rgp120的包膜基因，所述經(jīng)突變的MN-rgp120在289、301、332和/或334位含有N-連接的糖基化位點(diǎn)，當(dāng)表達(dá)于標(biāo)準(zhǔn)293細(xì)胞中時，具有能夠被PG9和PGT128MAb識別的表位；源自HIV-1A244株的V1/V2支架能夠結(jié)合于PG9Mabs，其產(chǎn)生的條件中V1/V2結(jié)構(gòu)域含有甘露糖-5，并且兩個組分均能夠結(jié)合至PG9MAb并且同時、或可選地、序貫地，以基礎(chǔ)/加強(qiáng)(Prime/boost)方案施用。在另一優(yōu)選例中，將具有PG9和PGT128表位的單體gp120(例如MNgp120糖基化突變體UCSC468)免疫一對象，然后采用結(jié)合PG9的V1/V2片段以及結(jié)合PGT128的V3片段進(jìn)行加強(qiáng)。某實(shí)施例中包括一組合物，所述組合物含有在156和160位具有糖基化位點(diǎn)的單體gp120.在多個實(shí)施例中，gp120產(chǎn)自GNT1(-)細(xì)胞。附圖說明圖1PH9結(jié)合至包膜蛋白的ELISA圖2結(jié)合至gp120片段的PG9圖3A244和V1/V2支架的PAGE和圓二色譜分析圖4PG9和PGT128變體與MN-rgp120的結(jié)合圖5在含和不含幾夫堿(Kifunensine)的條件下，GP120在293F細(xì)胞中的表達(dá)圖6V3支架圖7GP120片段圖圖8PG9結(jié)合至V1/V2支架-間接ELISA形式圖9PG9結(jié)合至V1/V2支架-分化支(Clade)B和對照圖10PG9結(jié)合至V1/V2支架-分化支C圖11能夠較好地結(jié)合PG9MAb的兩個A244V1/V2支架序列圖12a-e顯示了與PG9結(jié)合的V1/V2支架的多核苷酸序列(以FASTA形式)圖13a-f顯示了V1/V2支架蛋白的初級氨基酸序列。這包括具體的新合成序列(其中一些包括連接到信號序列的V1/V2結(jié)構(gòu)域)，其表現(xiàn)為穩(wěn)定性提高、結(jié)合能力提高，且兩個多糖結(jié)合的要求有所降低。圖14a-f中的圖表顯示了PG9結(jié)合至V1/V2支架(產(chǎn)生于293FreestyleTM細(xì)胞和293-GnT1-細(xì)胞)的ELISA數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)與圖12a-e和13a-f中具體的新合成序列相關(guān)。圖15a顯示了在293F株中表達(dá)的片段圖15b顯示了在Gnt1(-)株中表達(dá)的片段發(fā)明概要交叉引用：US臨時申請No.61/699,680，申請日2012年9月11，通過引用的方式全文合并于此，就像在臨時申請和本公開中涉及的所有文件那樣。術(shù)語“互補(bǔ)”和“互補(bǔ)性”指多核苷酸通過堿基配對的天然結(jié)合。例如，序列“5'A-G-T3'”結(jié)合到互補(bǔ)序列“3'T-C-A5'”。兩個單股分子間的互補(bǔ)性可以是“部分的”，例如只有一些核酸結(jié)合，或者可以是“完全的”，導(dǎo)致在單股分子之間存在整體互補(bǔ)性。核酸鏈間的互補(bǔ)性程度顯著影響核酸鏈間的雜交效率和強(qiáng)度。術(shù)語“反義的”是指包含一核酸序列的任何成分，其與特定的核酸序列的“正義鏈”是互補(bǔ)的。反義的分子可以通過任何方法制備，包括合成或轉(zhuǎn)錄。一旦導(dǎo)入到細(xì)胞中，所述互補(bǔ)的核苷酸與所述細(xì)胞產(chǎn)生的天然序列結(jié)合形成雙鏈并阻止其轉(zhuǎn)錄或翻譯。標(biāo)識“負(fù)”或“減號”能夠指反義鏈，標(biāo)識“正”或“加號”能夠指正義鏈。“保守氨基酸替換”是那些當(dāng)發(fā)生后，與原始蛋白的特性很少沖突的替換，例如，蛋白的結(jié)構(gòu)尤其是功能是保守的，且經(jīng)過此類替換并沒有顯著的改變。下表顯示了能夠替代蛋白中原始氨基酸的氨基酸，這些被視為保守性的氨基酸替代。術(shù)語“衍生物”指多肽序列或多核苷酸序列的化學(xué)修飾。多核苷酸序列的化學(xué)修飾包括，例如，通過烷基、?；?、羥基、或氨基基團(tuán)替換氫。衍生的多聚核苷酸編碼的多肽保留了天然分子的至少一種生物學(xué)或免疫學(xué)上的功能。衍生的多肽是通過糖基化、聚乙二醇化、或任何相似過程修飾的、保留了衍生它的多肽的至少一種生物學(xué)或免疫學(xué)上的功能?！捌巍笔悄感蛄歇?dú)特的一部分，其在序列上與母序列一致，但是長度上更短。片段可以包括至多所定義序列的完整長度減去一個核苷酸/氨基酸殘基。例如，片段可以具有至少5,10,15,20,25,30,40,50,60,75,100,150,250或至少500個連續(xù)的核苷酸或氨基酸殘基的長度。片段可以優(yōu)先的選自一個分子的特定區(qū)域。例如，一多肽片段可以包括一特定長度的連續(xù)氨基酸，其選自所示特定具體序列的初始250或500個氨基酸(或初始的25％或50％的多肽)。顯而易見地，這些長度是示例性的，本說明書支持任何長度，包括序列表、表格和附圖，可以包含在本實(shí)施方式中。應(yīng)用于多核苷酸序列的短語“同一性百分比”和“％同一性”，是指使用標(biāo)準(zhǔn)化算法比對的至少兩個多核苷酸序列之間的殘基匹配的百分比。在一個標(biāo)準(zhǔn)化的和可再現(xiàn)的方式中，這樣的算法可以在比對序列中插入缺口，以便優(yōu)化兩個序列間的匹配，并且因此實(shí)現(xiàn)兩個序列的更有意義的比較。核苷酸序列之間的同一性百分比可以通過將ClustalV算法的默認(rèn)參數(shù)并入MEGALIGN版本3.12e序列對比程序來確定。這個程序是LASERGENE軟件包的一部分，一套分子生物學(xué)分析程序(DNASTAR，威斯康星州麥迪遜-MadisonWI)。CLUSTALV描述于Higgins,D.G.和P.M.Sharp(1989)CABIOS5:151-153和Higgins,D.G.等.(1992)CABIOS8:189-191。對于多核苷酸的雙序列比對，默認(rèn)的參數(shù)設(shè)置如下：Ktuple＝2,gappenalty＝5,window＝4,和“diagonalssaved”＝4?！皐eighted”殘基重量表選為默認(rèn)。通過CLUSTALV，以匹配的多核苷酸序列對之間的“百分比相似度”報告百分比同一性?？蛇x地，一組常用的和免費(fèi)提供的序列比較算法是美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的基本局部比對搜索工具(BLAST)(Altschul,S.F.等.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。“BLAST2序列”工具可同時用于blastn和blastp(下面討論)。BLAST程序通常將間隙和其它參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)設(shè)置。例如，為了比較兩個核苷酸序列，可以使用具有“BLAST2序列”工具2.0.9版(5-07-1999)的BLASTN，設(shè)定為默認(rèn)參數(shù)。此類默認(rèn)參數(shù)可以是，例如，Matrix:BLOSUM62；Rewardformatch:1；Penaltyformismatch:-2；OpenGap:5andExtensionGap:2penalties；Gapxdrop-off:50；Expect:10；WordSize:11；.Filter:on。同一性百分比可以在整個具體序列的長度下進(jìn)行測量，例如，由特定SEQID編號所定義的，或者可以在更短的長度進(jìn)行測定，例如，從更長的具體序列所取的一個片段長度，例如，至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少70個、至少100個、或至少200個連續(xù)的核苷酸的片段。這樣的長度只是示例性的，并且應(yīng)該理解，本文中，表格、附圖或序列表中所示序列支持的任何片段長度，都可以用于描述測量該百分比同一性的長度。短語“同一性百分比”和“％同一性”，應(yīng)用于多肽序列時，是指使用標(biāo)準(zhǔn)化算法比對的至少兩個多肽序列之間的殘基匹配的百分比。多肽序列比對的方法是公知的。一些比對方法考慮到保守的氨基酸取代。這類保守取代，上文作了更詳細(xì)地解釋，通常在替代的部位保留了疏水性和酸度，從而保留所述多肽的結(jié)構(gòu)(以及功能)。通過將ClustalV算法的默認(rèn)參數(shù)并入MEGALIGN版本3.12e的序列對比程序(描述和引用如上)，可以確定多肽序列之間同一性百分比。對于使用CLUSTALV的多肽序列的雙序列比對，默認(rèn)的參數(shù)設(shè)置如下:Ktuple＝1,gappenalty＝3,window＝5,and“diagonalssaved”＝5。同一性百分比可以在整個具體多肽序列的長度下進(jìn)行測量，例如，由特定SEQID編號所定義的，或者可以在更短的長度下進(jìn)行測定，例如，從更長的具體多肽序列所取的一個片段長度，例如，至少15個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少70個、至少150個連續(xù)的殘基。這樣的長度只是示例性的，并且應(yīng)該理解，本文中，表格、附圖或序列表中所示序列支持的任何片段長度，可以用于描述測量該百分比同一性的長度。短語“核酸”和“核酸序列”指一核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、或其任何片段。這些短語也指基因組或合成來源的DNA或RNA，可以是單鏈或雙鏈的，可以代表正義或反義鏈，也指肽核酸(PNA)、或任何DNA樣或RNA樣材料?！翱刹僮鞯剡B接”是指這樣的情況：第一核酸序列被置于與第二核酸序列的功能性關(guān)系中。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則啟動子是可操作地連接于編碼序列的。通常，可操作連接的DNA序列可以是鄰近的或相連的，當(dāng)需要連接兩個蛋白編碼區(qū)時，在同一個閱讀框架內(nèi)。特定核酸序列的“變體”被定義為這樣一種核酸序列：通過BLASTN的“BLAST2序列”工具版本2.0.9(05-07-1999)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)測定時，其在核酸序列之一的一定長度內(nèi)，與特定核酸序列具有至少40％的序列同一性。這樣的一對核酸可以顯示為，例如，在一特定具體長度內(nèi)，具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％或以上的序列同一性。變體可被描述為，例如，一個“等位基因”(如上所定義)、“剪接”、“物種”或“多態(tài)”變體。剪接變體可與基準(zhǔn)分子具有顯著的同一性，但是由于mRNA加工過程中外顯子的選擇性剪接，其通常具有更多或更少數(shù)量的多核苷酸。相應(yīng)的多肽可以具有額外的功能結(jié)構(gòu)域或缺少在參照分子中存在的結(jié)構(gòu)域。物種變體是物種與物種之間不同的多核苷酸序列。所得的多肽一般相對各自具有顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體是在給定物種的個體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。多態(tài)變體也可包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNP)，其中所述多核苷酸序列由于1個核苷酸堿基而不同。SNP的存在可以指示，例如，特定的群體，疾病狀態(tài)或疾病易感性。特定多肽序列的“變體”被定義為這樣一種核酸序列：通過BLASTN的“BLAST2序列”工具版本2.0.9(05-07-1999)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)測定時，其在多肽序列之一的一定長度內(nèi)，具有至少40％的序列同一性的多肽序列。這樣一對的多肽可顯示為，例如，具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少98％或更高的序列同一性。發(fā)明詳述HIV疫苗研究的一個主要目標(biāo)是鑒別能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生有效抵抗HIV原代分離株的廣譜中和抗體(bNAbs)的抗原。申請人研究了HIV-1包膜糖蛋白，gp160、gp120和gp41的分子特征，特別是位于V1/V2結(jié)構(gòu)域的被PG9MAb識別的表位，其賦予病毒對中和反應(yīng)的靈敏度和抗性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果?；贏244-rgp120能夠結(jié)合到PG9的報道，本發(fā)明人分析了來自AIDSVAXB/E疫苗的A244和MN-rgp120的檔案樣本，看看它們是否是因?yàn)槿狈Y(jié)合PG9和PGT128MAb的表位和糖類而沒能提供保護(hù)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了A244-rgp120為弱結(jié)合和MN-rgp120為未結(jié)合。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，這兩種蛋白在糖基化方面是高度異質(zhì)的，其大多數(shù)糖類為復(fù)合的含唾液酸形式，并不結(jié)合任何MAb(17)。為了發(fā)現(xiàn)本發(fā)明人是否能夠提高gp120單體的結(jié)合，本發(fā)明在缺乏N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I(GnTI)(其使所有預(yù)測的(predicted,潛在的)N-連接糖基化位點(diǎn)(PNGS)都含有甘露糖-5聚糖)細(xì)胞系中，自3株病毒(MN,TRO11和A244)制備了單體gp120。當(dāng)在標(biāo)準(zhǔn)的293細(xì)胞中生長時，MN-rgp120和TRO11-rgp120均不能結(jié)合至PG9，并且A244-rgp120表現(xiàn)出與PG9的弱結(jié)合(圖1A和B)。然而，當(dāng)這些蛋白表達(dá)于GnTI細(xì)胞中時，所有的三種蛋白均能高親和度地結(jié)合至PG9。這些結(jié)果無疑證明了只要存在適合的糖基化，gp120單體能夠結(jié)合至PG9，并且對該抗體的結(jié)合不需要三聚化的包膜蛋白。該想法出版于我們的2012年P(guān)loSOne出版物(17)。關(guān)于V1/V2結(jié)構(gòu)域的糖基化的異質(zhì)性和本質(zhì)存在很大的爭論。我們的產(chǎn)自GNTI-細(xì)胞的蛋白展示了3個主要的結(jié)合，并且均歸因于在糖基化位點(diǎn)占位的不同。因此，當(dāng)使用可去除所有N-連接糖類的PNGase處理或使用可去除所有高甘露糖糖類(包括甘露糖-5聚糖)的EndoH處理進(jìn)行去糖基化后，所有的3條帶解離成單條帶。本發(fā)明人通過質(zhì)譜研究發(fā)現(xiàn)，3條帶歸因于糖基化位點(diǎn)占位的不同。這些研究表明所有的3條帶在156和160位具有為PG9結(jié)合所需的糖類。在我們實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的這些研究使用了LC-MS/MS。本發(fā)明人還進(jìn)行了在GNTI-細(xì)胞中表達(dá)的A244V1/V2片段的二硫化物繪圖研究。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，存在顯著的二硫化異質(zhì)性，在一些制備物中高達(dá)50％。本發(fā)明推測這將會影響PG9結(jié)合，但是還沒有研究。從V1/V2結(jié)構(gòu)域開發(fā)與聚糖-依賴bN-MAbs結(jié)合的支架.當(dāng)在GnTI-細(xì)胞中表達(dá)gp120能夠極大地提高與PG9樣抗體的結(jié)合，該生產(chǎn)方法導(dǎo)致了生物物理學(xué)和藥代動力學(xué)模式上的重大變化，其危及到RV144臨床試驗(yàn)中所獲得的保護(hù)性免疫。理想地，本發(fā)明人希望加強(qiáng)現(xiàn)存的AIDSVAXB/E的效率而不是從頭開始開發(fā)新的疫苗。見圖1。本發(fā)明人完成該項(xiàng)研究的一個方式是使用產(chǎn)自GnTI-細(xì)胞中的其它Env蛋白補(bǔ)充AIDSVAX疫苗。然而，抗體與gp120的反應(yīng)非常復(fù)雜，并且與GnTI-細(xì)胞產(chǎn)生的任何Env蛋白反應(yīng)的所有抗體中只有一小百分比，指向PG9表位。此外，在GnTI-細(xì)胞中，Env的產(chǎn)生將破壞其它重要的用于結(jié)合的中和表位，比如取決于甘露糖-9糖基化的被PGT128和2G12識別的那些(10,15)。因此，本發(fā)明人推論改善PG9樣表位免疫反應(yīng)的最好的方式將會是開發(fā)小而適當(dāng)?shù)木哂蠵G9結(jié)合所需糖類結(jié)構(gòu)的糖基化片段、或支架其，并將其與其它Env蛋白或其它支架聯(lián)合來制備多價雞尾酒疫苗。為了測定本發(fā)明人是否能夠鑒定可結(jié)合PG9樣抗體的支架，本發(fā)明人首先測試了自MN-rgp120的一系列g(shù)p120片段用于繪制小鼠MAb，至MN-rgp120的V2結(jié)構(gòu)域的圖譜(9)。這些片段以融合蛋白的形式表達(dá)，其具有信號序列和HSV糖蛋白(gD)的氨基-末端標(biāo)志表位。當(dāng)本發(fā)明人測試在標(biāo)準(zhǔn)293細(xì)胞中產(chǎn)生的片段時，PG9未能與任何片段結(jié)合。然而當(dāng)用GnTI-細(xì)胞生產(chǎn)這些片段時，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了三個與PG9結(jié)合的片段(7-15、4-27、和1-3)(圖2A)。最小的結(jié)合片段，1-3長度為265個氨基酸并含有V1-C3結(jié)構(gòu)域。因而，盡管GnTI-細(xì)胞中的生產(chǎn)改善了gp120片段與MN-rgp120的結(jié)合，該最小的片段仍然遠(yuǎn)大于理想的免疫原性支架。為了嘗試找到一個更小的片段，本發(fā)明人測試了來自A244-rgp120的一系列可比片段。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)A244-rgp120的一個106個氨基酸片段(圖2C)包含了完整的V1/V2結(jié)構(gòu)域，當(dāng)其在標(biāo)準(zhǔn)293細(xì)胞中表達(dá)時展現(xiàn)出弱PG9結(jié)合性(數(shù)據(jù)未示出)，當(dāng)在GnTI-293細(xì)胞中表達(dá)時則展現(xiàn)出高親和度結(jié)合(圖2B)。為了進(jìn)一步研究包含9PNGS的該片段特性，本發(fā)明人測定了其與三個PG9樣抗體的結(jié)合：CH01、CH03、和PG16(3,8,15)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)在GnTI-細(xì)胞而非在293細(xì)胞中表達(dá)時，CH01和CH03與A244-V1/V2支架依然結(jié)合地很好。然而，PG16則無論細(xì)胞類型如何均不與所述支架結(jié)合，證實(shí)了該抗體識別包括V2結(jié)構(gòu)域之外序列的表位(8,16)。A244-V1/V2支架的發(fā)現(xiàn)是一個重要進(jìn)展，因?yàn)樗峁┝艘粋€具有誘導(dǎo)PG9樣抗體潛力的免疫原。受到這些成功研究的鼓舞，本發(fā)明人試圖從其它類似蛋白生產(chǎn)V1/V2支架。接下來本發(fā)明人嘗試的是從CF01_AETH023Env(包含于RV144臨床試驗(yàn)中的vCP1521痘病毒載體)中所制備的支架。有趣的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該支架在GnTI-細(xì)胞中表達(dá)時，表現(xiàn)出與PG9MAb的良好結(jié)合，但是極少或不與CH01、CH03、或PGT145MAb結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。該結(jié)果證實(shí)的報告提示PG9、CH01和CH03MAb結(jié)合于不同的重疊表位(8)。我們目前的工作包含從其它分化支識別支架，本發(fā)明人可用其進(jìn)行下文所述的后續(xù)免疫研究。本發(fā)明人首先篩選出標(biāo)準(zhǔn)293細(xì)胞產(chǎn)生的與PG9結(jié)合的包膜蛋白，如用A244-rgp120觀察到的那樣，然后使用它們中最好的來制備本發(fā)明人于GnTI-293細(xì)胞中表達(dá)的V1/V2支架。本發(fā)明人從我們實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的一組C分化支病毒(13)中篩選的Env蛋白的研究結(jié)果顯示于圖1(C)?；谶@些結(jié)果，來自于ZA97010分離柱的所述Env基因表現(xiàn)出了產(chǎn)生V1/V2支架的潛力。本發(fā)明人同樣篩選了許多B分化支Env，并鑒別了數(shù)個能夠與PG9結(jié)合的。V1/V2支架的結(jié)構(gòu)特征。本發(fā)明人接下來意欲表征A244-V1/V2支架的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明人首先通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測了產(chǎn)自標(biāo)準(zhǔn)和GnTI-293細(xì)胞的支架的大小。這些研究的結(jié)果如圖3A所示。如預(yù)期的那樣，在標(biāo)準(zhǔn)293細(xì)胞中產(chǎn)生的所述V1/V2支架跑出了彌散模糊的38-55kDa的條帶。為了進(jìn)一步研究，本發(fā)明人使用PNGase處理了A244-V1/V2支架以去除所有N連接的糖類，或使用糖類內(nèi)切酶H(Endo-H)特異性針對高甘露糖糖類。使用PNGase處理產(chǎn)生了14kDa的單一條帶，使用Endo-H處理產(chǎn)生了約17kDa的單一條帶。這些結(jié)果證明，所述支架是高度糖基化的，以及在GnTI-細(xì)胞中產(chǎn)生的支架中可見到3個不同條帶是因?yàn)楦街腔瘮?shù)量的差異。鑒于在A244-rgp120的83個氨基酸V1/V2片段中具有9個PNGS(預(yù)測的N連接糖基化位點(diǎn))，使用EndoH處理之前和之后的糖蛋白支架大小存在顯著的不同是可以理解的。我們的結(jié)果表明，本發(fā)明人觀察到的變化很有可能歸因于使用的特定PNGS的差異。這時候，本發(fā)明人不知道PG9是否與3個條帶同樣地結(jié)合，但是使用免疫沉淀反應(yīng)研究可計劃解決該問題。另外，計劃使用質(zhì)譜研究來檢測是否所有的PNGS位點(diǎn)都被利用。因?yàn)閂1/V2結(jié)構(gòu)域是4-鏈反平行β折疊，當(dāng)使用圓二色譜(CD)測定時該片段應(yīng)具有獨(dú)特的吸收光譜。此類研究的結(jié)果如圖3B所示。本發(fā)明人在218nm處觀察到了清晰的吸收譜表明β折疊結(jié)構(gòu)的存在。當(dāng)本發(fā)明人檢測經(jīng)過還原和羧甲基化破壞了三級結(jié)構(gòu)后的相同蛋白的吸光度時，光譜改變?yōu)樘赜械臒o規(guī)則曲線(4)。因而，圓二色譜提供了一個證明A244-V1/V2片段中存在β折疊結(jié)構(gòu)的簡便方法。在PG9表位含有甘露糖-5聚糖和在PGT128表位含有甘露糖-9聚糖的機(jī)制。在gp120中發(fā)現(xiàn)了聚糖-依賴的表位是有趣的，本發(fā)明人想研究其機(jī)制，通過該機(jī)制HIV-1能夠在特異性的PG9和PGT128/2G12MAb識別的表位上，選擇性地在N連接的糖基化途徑中合并中間體(例如，甘露糖-5和甘露糖-9)。數(shù)個團(tuán)隊提示，在gp160定時形成的過程中，糖基化位點(diǎn)是被聚糖加工酶封閉的，，導(dǎo)致在所選位點(diǎn)的不完全糖基化(5,6)。然而，這不能解釋當(dāng)在標(biāo)準(zhǔn)293細(xì)胞中表達(dá)時，單體A244-rgp120表現(xiàn)出具有PG9結(jié)合所需的聚糖，而來自MN株的gp120則不能夠結(jié)合PG9。為了解釋該現(xiàn)象，本發(fā)明人比較了MN-rgp120和A244-rgp120的序列和結(jié)構(gòu)特征。本發(fā)明人注意到，MN-rgp120與A244gp120結(jié)構(gòu)不同在于V3干區(qū)的糖基化位點(diǎn)數(shù)目上，在，其中MN-rgp120具有2PNGS而A244-rgp120具有4PNGS(圖4A)。為了檢測在V3干區(qū)存在的糖基化位點(diǎn)是否影響V1/V2結(jié)構(gòu)域中PG9表位的糖基化類型，本發(fā)明人采用了定點(diǎn)誘變來體現(xiàn)存在于A244-rgp120的V3區(qū)的PNGS(預(yù)測的N連接的糖基化位點(diǎn))至缺乏這些位點(diǎn)的MN-rgp120結(jié)構(gòu)中(圖4A)。令人驚訝的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在第289、301、和332或334位添加兩或三個PNGS位點(diǎn)后，使在標(biāo)準(zhǔn)293細(xì)胞中生產(chǎn)的蛋白(UCSC467,、468、和469)現(xiàn)在也能夠結(jié)合到PG9(圖4B-C)。另外，插入這些糖基化位點(diǎn)同樣導(dǎo)致這些MN-gp120糖基化突變體有能力與在第301和332位需要甘露糖-9的PGT128MAb(圖4D)結(jié)合。因而，當(dāng)糖基化位點(diǎn)存在于V3干區(qū)(如在A244-rgp120或UCSC467、468、和469蛋白)，第156和160位受到空間保護(hù)并且難以被糖蛋白處理酶接近，導(dǎo)致聚糖結(jié)構(gòu)限于甘露糖-5形式。前期的研究表明，不完全的糖基化起因于由多肽鏈或N聚糖的密集群造成的(14)空間位阻。很可能的是這兩種類型的相互作用導(dǎo)致PG9和PGT128MAb結(jié)合所需的糖基化途徑中間體的摻入。這些結(jié)果表明，這些聚糖殼被認(rèn)為在HIV-1進(jìn)化中用于阻止中和抗體結(jié)合、同樣阻止糖類處理酶的接近。因此，這些PNGS(預(yù)測的N連接的糖基化位點(diǎn))有時相互干擾，導(dǎo)致中間結(jié)構(gòu)的摻入(例如，甘露糖-5和甘露糖-9)。開發(fā)上述的單體MN-rgp120糖基化突變體，能夠結(jié)合目前為止兩個最強(qiáng)的中和MAb(PG9和PGT128)，代表了一個主要的進(jìn)展，在開發(fā)改進(jìn)的gp120亞基疫苗方面尤為有用。最近進(jìn)一步的數(shù)據(jù)顯示，來自HIV-1108060分離株的gp120片段，當(dāng)在幾夫堿(kefunensine)存在下制備該片段時，能夠結(jié)合PGT128MAb(其在V2結(jié)構(gòu)域的干區(qū)識別甘露糖-9依賴的聚糖表位)。PGT128是已發(fā)現(xiàn)的最有效的天然單克隆抗體。幾夫堿是一種能夠?qū)連接的糖基化限制到甘露糖-9形式的藥物。在一個實(shí)施方式中，使用具有PG9和PGT128表位的單體gp120(如本發(fā)明人描述的MNgp120糖基化突變體(UCSC468)一樣)免疫一對象，和隨后使用結(jié)合了PG9的V1/V2片段和結(jié)合了PGT128的V3片段進(jìn)行增強(qiáng)。V1/V2片段可以是產(chǎn)自GNTI-細(xì)胞的A244-V1/V2，V3片段可以是數(shù)個產(chǎn)自生長在經(jīng)幾夫堿處理的細(xì)胞中的108060包膜蛋白中的一個。這些數(shù)據(jù)表明了使用多重片段了提供中和單克隆抗體。見圖5,6,和7。額外的數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)生長于GNTI-細(xì)胞中時，V1/V2支架可以從其它病毒株和其它分化支中制得。然而，PG9同這些支架的結(jié)合要弱于同A244-V1/V2片段的結(jié)合。因此，本發(fā)明人已經(jīng)從總計7種不同的包膜蛋白(A244、TH023、BAL、CAP45、ZM109、ZM197、和ZM53)中制備了支架。見圖8、9、和10，其顯示了PG9與V1/V2支架的結(jié)合。支架蛋白的序列。圖11顯示了能夠良好結(jié)合至PG9MAb的兩個A244V1/V2支架的實(shí)際序列。UCSC588構(gòu)建物具有g(shù)D信號序列(HSV糖蛋白D的氨基-末端標(biāo)記表位)和融合于V1/V2結(jié)構(gòu)域的標(biāo)記表位。UCSC596構(gòu)建物缺乏gD標(biāo)記，并在C-末端具有His標(biāo)簽。它也在gD信號序列末尾和V1/V2序列的開頭插入有源自成熟gp120N-末端的、11個氨基酸的小序列，插入于。該序列代表了共有序列，來自HIV-1的CRF01_AE分枝的病毒N-末端，并被設(shè)計為能夠在標(biāo)準(zhǔn)的信號肽酶裂解位點(diǎn)進(jìn)行裂解。見圖11。進(jìn)一步合成工程化的支架蛋白本發(fā)明人進(jìn)一步工程化合成支架蛋白。這些V1/V2結(jié)構(gòu)域支架均被表達(dá)為融合蛋白，具有信號序列和單純性皰疹病毒糖蛋白D的27個氨基酸標(biāo)記表位。除了標(biāo)記表位之外，工程化的蛋白具有3個氨基酸的肽接頭(LLE)。在大多數(shù)情況下，V1/V2序列以VPL開始。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)生長于GnTI-細(xì)胞中，這些片段均能夠結(jié)合PG9，但是當(dāng)生長于293細(xì)胞中時很難結(jié)合PG9。然而，ZM233片段表現(xiàn)的比較獨(dú)特，當(dāng)在293細(xì)胞中生產(chǎn)該支架時，能夠良好的結(jié)合至PG9。該特征提供了一個制備方面的巨大優(yōu)勢，由于該蛋白能夠生產(chǎn)自一些人類藥學(xué)生產(chǎn)可接受的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中。使用來自人組織纖溶酶原激活物和ICAM-1的信號序列，已經(jīng)成功的表達(dá)了這些合成的片段。制備合成工程化支架蛋白的方法gp160通過AIDS試劑計劃(AIDSReagentprogram)獲得質(zhì)粒DNA。ZM233(目錄號#1131；登記號#DQ388517；)；ZM109(目錄號#11314；AY424138；)；CAP45(目錄號#11316；登記號#DQ435682)；Bal.01(目錄號#11445；登記號#DQ318210)；ZM53(目錄號#11313；登記號#AY423984)；ZM197(目錄號#11309；登記號#DQ388515)V1/V2片段的構(gòu)建使用包含Kpn1和Not1的限制性位點(diǎn)引物，從gp160PCR擴(kuò)增V1/V2片段。使用相關(guān)的限制性內(nèi)切酶消化所述片段，并構(gòu)建表達(dá)載體(pRK)，該表達(dá)載體包含HSV信號序列、HSVgD“標(biāo)簽”(HSV糖基化蛋白D的氨基-末端標(biāo)記表位)、和用來隔開V1/V2片段起始部分的“標(biāo)簽”的一短肽接頭LLEVPL。所述片段自117位氨基酸開始(HXB2編號)并在207位氨基酸終止；在208位置放置了一個終止密碼子。所有的片段包含3個二硫鍵。表達(dá)在293FTM細(xì)胞(英杰公司-Invitrogen:#R790-07)或293-GnT1-細(xì)胞(ATCC:#CRL-3022)中表達(dá)所述V1/V2片段。使用聚乙烯亞胺(PEI)轉(zhuǎn)染。簡略地說，1x108293F或GnT1-細(xì)胞在1200rpm下離心10min。去除培養(yǎng)基，將細(xì)胞重懸于5ml含有0.1％普朗尼克酸的培養(yǎng)基中；加入250ug質(zhì)粒DNA和800ugPEI。37℃孵育3hr，將細(xì)胞液定容自終體積100ml。轉(zhuǎn)染3天后，收集細(xì)胞上清液，離心，使用0.45umPES濾膜過濾。ELISA數(shù)據(jù)使用間接ELISA檢測PG9與V1/V2片段的結(jié)合。簡要地說，在PBS溶液中，使用2ug/ml抗-gD抗體(34.1)包被MaxisorpELISA板(Nunc)，4℃過夜。第二天使用4×PBS+0.05％吐溫(Tween)-20沖洗板。使用PBS+1％BSA室溫封閉2hrs。加入細(xì)胞上清(100ul)1hr。加入10ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.1ug/ml、0.05ug/ml、0.01ug/ml、和0.001ug/ml的PG9。空白孔用來檢測背景吸收度。第二抗體為過氧化物酶偶聯(lián)的抗人Fc，用于檢測PG9。加入底物(OPD)10min，使用3MH2SO4終止反應(yīng)。所有的稀釋(除了包被)均使用PBS+1％BSA。每步孵育后均要洗滌。圖12a-e和13a-f以FASTA形式，顯示了結(jié)合PG9的野生型V1/V2支架，和合成支架蛋白。這些包括特異的新合成序列(其中一些包括連接有HSV信號序列的V1/V2結(jié)構(gòu)域)，表現(xiàn)出了增強(qiáng)的穩(wěn)定性，增強(qiáng)的結(jié)合力和降低的雙聚糖結(jié)合需求。圖14a-f顯示了圖12a-e和13a-f的特異的新合成序列的數(shù)據(jù)。圖14a-f的圖表顯示了PG9結(jié)合至V1/V2支架(產(chǎn)自293FreestyleTM細(xì)胞和293-GnT1-細(xì)胞)的ELISA數(shù)據(jù)。圖15a顯示了表達(dá)于293F株的片段和圖15b顯示了表達(dá)于Gnt1(-)株的片段。圖16是一個示意圖，顯示了檢測PG9與V1/V2片段結(jié)合的ELISA方法。該圖片也顯示了V1/V2片段初級結(jié)構(gòu)HSV信號序列連接到gD標(biāo)簽連接到肽接頭。同時顯示了抗體沿著多肽的不同位點(diǎn)與它們Fc區(qū)域的結(jié)合。結(jié)論。本發(fā)明中的一個重要結(jié)論是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了只要在156和160位具有糖基化位點(diǎn)，和在約166-173位氨基酸區(qū)域具有適宜的氨基酸，幾乎所有的gp120都將結(jié)合到PG9。本發(fā)明人來自數(shù)個其它分離株和新合成構(gòu)建物的數(shù)據(jù)證明了該結(jié)論的真實(shí)性。目前HIV科學(xué)家一致認(rèn)為，gp120三聚體結(jié)合的更好是因?yàn)樗募壪嗷プ饔?。本發(fā)明人證明了這是錯誤的，只要其產(chǎn)生于GNT1(-)細(xì)胞中，幾乎所有的gp120都將結(jié)合。我們的數(shù)據(jù)表明，PG9與三聚體結(jié)合的更好，是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)三聚體的形成屏蔽了156和160位與糖基化酶的相互作用，導(dǎo)致這些位置的不完全的糖基化。大多數(shù)單體蛋白沒有屏蔽于這些酶，并因此獲得了不能被PG9識別的完全成熟的糖類復(fù)合類型。因此，三聚化導(dǎo)致的不完全糖基化而非存在依賴于四級相互作用的表位是PG9結(jié)合三聚體的優(yōu)先原因。參考文獻(xiàn)1.Berman,P.W.1998.預(yù)防HIV1型感染的二價rgp120疫苗進(jìn)展。(Developmentofbivalentrgp120vaccinestopreventHIVtype1infection.)AIDSResHumRetroviruses14Suppl3:S277-89.2.Berman,P.W.,W.Huang,L.Riddle,A.M.Gray,T.Wrin,J.Vennari,A.Johnson,M.Klaussen,H.Prashad,C.Kohne,C.deWit,andT.J.Gregory.1999.能夠中和來自美國和泰國的CCR5-依賴的病毒的二價(B/E)疫苗進(jìn)展。(Developmentofbivalent(B/E)vaccinesabletoneutralizeCCR5-dependentvirusesfromtheUnitedStatesandThailand.)Virology265:1-9.3.Bonsignori,M.,K.K.Hwang,X.Chen,C.Y.Tsao,L.Morris,E.Gray,D.J.Marshall,J.A.Crump,S.H.Kapiga,N.E.Sam,F.Sinangil,M.Pancera,Y.Yongping,B.Zhang,J.Zhu,P.D.Kwong,S.O'Dell,J.R.Mascola,L.Wu,G.J.Nabel,S.Phogat,M.S.Seaman,J.F.Whitesides,M.A.Moody,G.Kelsoe,X.Yang,J.Sodroski,G.M.Shaw,D.C.Montefiori,T.B.Kepler,G.D.Tomaras,S.M.Alam,H.X.Liao,andB.F.Haynes.2011.HIV-1包膜蛋白V2/V3構(gòu)象表位特異性光譜中和抗體無性系分析及其推測未突變共同祖系。(AnalysisofaClonalLineageofHIV-1EnvelopeV2/V3ConformationalEpitope-SpecificBroadlyNeutralizingAntibodiesandTheirInferredUnmutatedCommonAncestors.)JVirol85:9998-10009.4.Kelly,S.M.,T.J.Jess,andN.C.Price.2005.如何通過圓二色譜研究蛋白。(Howtostudyproteinsbycirculardichroism.)BiochimBiophysActa1751:119-39.5.Kong,L.,J.-P.Julien,D.Calarese,C.N.Scanlan,H.-K.Lee,P.Rudd,C.-H.Wong,R.A.Dwek,D.R.Burton,andI.A.Wilson.2012.關(guān)于基于糖類的HIV疫苗。(TowardaCarbohydrate-BasedHIVVaccine.)InA.Klyosov(ed.),GlycobiologyandDrugDesign,vol.2012.AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.6.Kong,L.,andQ.J.Sattentau.2012.基于HIV-1抗體疫苗設(shè)計的抗原性和免疫原性。(AntigenicityandImmunogenicityinHIV-1Antibody-BasedVaccineDesign.)JAIDSClinicResS8:003doi:10.4172/2155-6113.S8-003.7.McCutchan,F.E.,P.A.Hegerich,T.P.B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