一種用于抗腫瘤的siRNA及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于腫瘤治療的siRNA及其應用。經RT-QPCR、Western?Blot和MTT染色法檢測發(fā)現本發(fā)明的siRNA能通過特異性沉默人Pokemon基因，降低相應mRNA的表達水平，進而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為針對Pokemon基因治療腫瘤提供了可能，也為針對該基因的腫瘤分子靶向治療提供了良好的前景，具有重大價值。
【專利說明】—種用于抗腫瘤的siRNA及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于抗腫瘤的SiRNA及其應用,尤其涉及祀向人Pokemon基因的siRNA及其抗腫瘤作用，屬于基因工程領域。
【背景技術】
[0002]RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)啟動的序列特異的轉錄后基因沉默過程。在這一過程中，dsRNA被核酸內切酶切割成小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA), siRNA與相關蛋白質結合成RNA誘導沉默復合體(siRNA-1nduced silencing complex, RISC), RISC 識別并降解革巴信使 RNA(message RNA,mRNA)，終止其參與的翻譯過程，從而抑制基因表達。RNAi技術具有高度特異性、作用迅速、起效快等特點，可以有效減少毒副作用發(fā)生的可能，現已被證實在多種病毒感染性疾病和腫瘤的治療中具有極大的潛力。
[0003]Pokemon 基因，即 POK 紅系髓性致癌因子(POK erythroid myeloid Ontogenicfactor)，也被稱為LRF、0CZF或FB1-1，是轉錄抑制因子POK家族的一員，也是被發(fā)現的第一個對抑癌基因，可變讀框基因(alterative reading frame,ARF)的特異性轉錄有抑制作用的因子，現已被確認為原癌基因。該基因主要通過調節(jié)ARF-p53路徑，特異性抑制腫瘤抑制蛋白ARF及其激動劑，使細胞的增殖調控失效，從而導致腫瘤發(fā)生(Maeda T7Hobbs RM7PierPaolo Pandolf1.Cancer Res, 2005，65:8575-8578)。此外，Pokemon 還位于多種腫瘤抑制基因和原癌基因的上游，在腫瘤轉化分子網絡機制中能控制其他癌基因的活性，并對腫瘤細胞的一些重要特性產生影響，被視為“腫瘤總開關”。例如，有研究表明，Pokemon為癌基因LAZ-3 / BCL-6的潛在靶點，可與BCL-6協(xié)同作用促進淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展；還可以反饋性增高人類腫瘤中廣泛表達的凋亡抑制基因BCL-2的表達(Davies JM, Hawe N, KabarowskiJ, et al.0ocogene, 1999,18 (2):365)。Pokemon基因的編碼產物，POK蛋白也可以介導蛋白二聚體形成，通過募集組蛋白脫乙?；?HDACs)引起染色質結構改變，引起特定DNA基因的開關，從而行使轉錄抑制功能。
[0004]Pokemon基因在人類多發(fā)性腫瘤，如淋巴瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌和膀胱癌等中均有高度表達，而缺失此基因的細胞則不易發(fā)生惡性轉化。因此該基因有望成為腫瘤預防、診斷、治療和預后評價的新靶標，能夠特異性抑制Pokemon的藥物，極有可能成為一種強有力的抗癌劑。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明要提供的是一種能特異性抑制人Pokemon基因表達的siRNA,通過如下技術方案實現:
[0006]根據siRNA靶序列基本原則，針對人Pokemon基因(NM_015898)設計了 I條21個核苷酸的siRNA靶點序列，即s1-Pokemon，包括正義鏈和反義鏈，其堿基序列如下:
[0007]正義鏈 5’ -AAGCACUUUAAGGACGAGGdTdT-3’ (SEQ ID NO:1)；[0008]反義鏈5’ -CCUCGUCCUUAAAGUGCUUdTdT-3’ (SEQ ID NO:2)。
[0009]根據本發(fā)明的優(yōu)選實施例，所述干擾片段的3 ’端還添加了兩個呈單鏈懸掛結構的脫氧核糖核苷酸，以增強siRNA在體內和體外的穩(wěn)定性，防止降解。
[0010]根據本發(fā)明的優(yōu)選實施例，選擇目前較為常見的陽離子脂質體Lipofectamine2000作為轉染試劑。
[0011]根據體外實驗結果表明，本發(fā)明提供的SiRNA能夠抑制多種腫瘤細胞中人Pokemon基因的表達，可應用于制備抗腫瘤基因藥物。優(yōu)選實施例為人肝癌、乳腺癌和肺癌細胞。
[0012]本發(fā)明要提供的siRNA的應用，是指所提供的siRNA在制備對人Pokemon基因表達進行調節(jié)、調整或抑制的基因藥物，特別是治療人Pokemon基因過度表達所引起的疾病(如惡性腫瘤)的基因藥物中的應用。
[0013]上述基因藥物可通過靜脈或皮下給藥；所述藥物可通過局部給藥。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為RT-QPCR檢測人肝癌細胞株H印G2各實驗組Pokemon基因的mRNA表達水平的結果圖。
[0015]圖2為RT-QPCR檢測人肺癌細胞株A549各實驗組Pokemon基因的mRNA表達水平的結果圖。
[0016]圖3為RT-QPCR檢測人乳腺癌細胞株MCF-7各實驗組Pokemon基因的mRNA表達水平的結果圖。
[0017]圖4為Western Blot檢測上述三株細胞H印G2、A549、MCF_7中各實驗組蛋白表達水平的結果圖。
[0018]圖5為MTT法分析s1-Pokemon對人肝癌細胞株IfepG2細胞毒作用的結果圖。
[0019]圖6為MTT法分析s1-Pokemon對人肺癌細胞株A549細胞毒作用的結果圖。
[0020]圖7為MTT法分析s1-Pokemon對人乳腺癌細胞株MCF-7細胞毒作用的結果圖。
【具體實施方式】
[0021]以下通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。
[0022]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，均為市售廣品。
[0023]實施例1siRNA的合成
[0024]本發(fā)明所提供的s1-Pokemon是根據人Pokemon mRNA序列而設計,過程如下:從轉錄本(mRNA)的起始密碼(AUG)開始尋找，搜索“AA”二連序列，以其3’端相鄰19個堿基序列作為候選靶點，從中選擇GC含量不超過36.8%的siRNA序列，并通過GenBank數據庫的blast功能，將所選序列與人類基因組序列進行比對，排除和人的其他編碼序列同源的序列。在正義鏈3’端加2個dTdT的尾，指導siRNA形成RISC，也避免受核酸酶的降解。
[0025]本實施例選擇的s1-Pokemon對應人Pokemon基因mRNA中1759-1779核苷酸位點，堿基序列如下:[0026]正義鏈5’ -AAGCACUUUAAGGACGAGGdTdT-3’ (SEQ ID NO:1)；
[0027]反義鏈5’ -CCUCGUCCUUAAAGUGCUUdTdT-3’ (SEQ ID NO:2)。
[0028]本實施例選擇的陰性對照組(NC)堿基序列如下:
[0029]正義鏈5，-UUCUCCCGAACGUGUACGUdTdT-3’ (SEQ ID NO:3)；
[0030]反義鏈5，-ACGUACACGUUCGGGAGAAdTdT-3’ (SEQ ID NO:4)。
[0031]將上述設計序列委托百奧邁科生物技術有限公司通過化學法合成，本發(fā)明使用的siRNA雙鏈純度大于99%。
[0032]實施例2實時定量PCR (RT-QPCR)檢測mRNA表達水平
[0033]1、細胞培養(yǎng)
[0034]本實施例采用人肝癌細胞株H印G2、人肺癌細胞株A549和人乳腺癌細胞株MCF-7進行研究。以含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(Gibco公司)培養(yǎng)，所述的培養(yǎng)基中加入濃度為IOOU / mL青霉素和IOOyg / mL鏈霉素(Invitrogen公司)，于37?、體積分數5% CO2,相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0035]2、細胞轉染
[0036]以肝癌細胞HepG2為例，另兩種細胞株可采用相同方法處理。取處于對數生長期的細胞，按照24孔板接種密度為1.0 X IO5個/孔，提前一天接種細胞，待細胞匯合度約為50%時進行轉染。用Lipofectamine2000轉染試劑盒(Invitrogen公司)轉染到HepG2細胞內，方法按照產品說明，siRNA終濃度為ΙΟΟηΜ。轉染時以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，37°C轉染6h后，換成有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48h后收集細胞，進行后續(xù)的總RNA提取。
[0037]3、RT-QPCR 檢測 mRNA 表達水平
[0038](I)總RNA的提取:轉染48h后，采用RISO? RNA提取試劑(百奧邁科生物技術有限公司)，按其說明書進行提取細胞的總RNA，步驟如下:
[0039]I)棄去24孔板內培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍，加入250 μ L RISO試劑進行裂解。室溫下放置5min，使得核酸蛋白復合物完全分離，轉移到離心管中。
[0040]2) 12000g，4°C離心10min，小心吸取上清液，移入新的離心管中。得到的勻漿液中加入50 μ L氯仿，蓋緊管蓋，上下振蕩15s，得渾濁液，無分層現象，室溫靜置2-3min。
[0041]3) 12000g，4°C離心15min。離心后，樣品分為三層:無色上清水相、中間蛋白層及下層有機相，水相的體積約為所用RISO試劑的60%。小心吸取無色上清液至另一離心管。加入125 μ L異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置lOmin。
[0042]4) 12000g，4°C離心10min。棄去上清，加250 μ L70%乙醇，渦旋振蕩混勻。7500g，4°C離心5min。棄盡上清，超凈工作臺真空離心干燥，加入適量DEPC-H2O溶解RNA沉淀。
[0043](2) RT-QPCR 檢測 mRNA 表達水平
使用EzOmics? One-Step QPCR試劑盒(百奧邁科生物技術有限公司)，按操作說明進行檢測。PCR 條件為:反應體系 25yL，反應程序:1)95°C，10min，2)95°C，20s，3)55°C，20s，4) 72°C，30s，2)-4)，45個循環(huán)。同時以β-actin為內參，引物序列見表1，結果如圖1所示。
[0044]表1、RT-QPCR檢測用弓丨物序列
【權利要求】
1.一種用于抗腫瘤的SiRNA干擾片段，其特征在于，所述SiRNA的堿基序列如下: 正義鏈 5’-AAGCACUUUAAGGACGAGGdTdT-3’ (SEQ ID NO:1)； 反義鏈 5’-CCUCGUCCUUAAAGUGCUUdTdT-3’ (SEQ ID NO:2)。
2.權利要求1中所述的用于抗腫瘤的SiRNA，在制備對人Pokemon基因表達進行調節(jié)、調整或抑制的基因藥物中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，制備人Pokemon基因過度表達所引起疾病的基因藥物中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，制備人Pokemon基因所調控的下游基因過度表達引起疾病的基因藥物中的應用。
5.權利要求2~4中任一項所述的基因藥物，可用于腫瘤的預防、診斷、治療和預后評價。
6.如權利要求2~5任一項所述的基因藥物，其特征在于，可通過靜脈或皮下給藥。
7.如權利要求2~6任一項所述的基因藥物，其特征在于，可通過局部給藥。
【文檔編號】A61P35/00GK103937792SQ201410000101
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權日:2014年1月2日
【發(fā)明者】周建平, 王偉, 王雅哲, 丁楊, 鮑秀麗 申請人:中國藥科大學