熊膽粉在制備抑制細菌分裂的產品中的新用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了熊膽粉在制備抑制細菌分裂的產品中的一種新用途。本發(fā)明提供了熊膽或熊膽粉在制備抑制細菌分裂的產品中的應用。本發(fā)明還保護熊膽或熊膽粉在制備抑制細菌自溶的產品中的應用。本發(fā)明還保護熊膽或熊膽粉在制備通過抑制細菌自溶而抑制所述細菌分裂的產品中的應用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了熊膽或熊膽粉具有抑制細菌自溶、抑制細菌分裂的作用，即熊膽或熊膽粉是通過抑制細菌自溶而抑制所述細菌分裂，并且本發(fā)明證明了細菌分裂可以作為抗細菌藥物的新靶點。本發(fā)明對于抗細菌以及抗細菌藥物的研發(fā)具有重大價值。
【專利說明】熊膽粉在制備抑制細菌分裂的產品中的新用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及熊膽粉在制備抑制細菌分裂的產品中的一種新用途。
【背景技術】
[0002]細菌耐藥性問題日益嚴重，越來越多的致病菌對現(xiàn)有抗生素產生了耐藥性。開發(fā)新靶點的抗生素迫在眉睫。細胞分裂是細菌繁殖的基本過程，可以作為一個具有潛力的藥物作用全新靶點。
[0003]熊膽為傳統(tǒng)名貴中藥，用于治療驚風抽搐、目赤、咽喉腫痛等病癥。熊膽具有鎮(zhèn)靜、抗驚、解熱、解痙、利膽、抑菌等作用，對心血管病具有治療作用。熊膽粉成份比較復雜，主要含熊去氧膽酸，其次為鵝去氧膽酸、去氧膽酸和膽酸，還含有膽色素、粘蛋白、氨基酸(谷氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸和賴氨酸等十八種氨基酸)、膽固醇、磷脂、無機鹽、微量元素、水份等。
【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供熊膽粉在制備抑制細菌分裂的產品中的一種新用途。[0005]本發(fā)明提供了熊膽或熊膽粉在制備抑制細菌分裂的產品中的應用。所述細菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCCs Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述熊膽粉具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產的熊膽粉。
[0006]本發(fā)明還保護熊膽或熊膽粉在制備抑制細菌自溶的產品中的應用。所述細菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCC" Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述熊膽粉具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產的熊膽粉。
[0007]本發(fā)明還保護熊膽或熊膽粉在制備通過抑制細菌自溶而抑制所述細菌分裂的產品中的應用。所述細菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCiT Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述熊膽或熊膽粉具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產的熊膽粉。
[0008]本發(fā)明還保護一種抑制細菌分裂的產品，其活性成分為熊膽或熊膽粉。所述細菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCC? Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述熊膽粉具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產的熊膽粉。
[0009]本發(fā)明還保護一種抑制細菌自溶的產品，其活性成分為熊膽或熊膽粉。所述細菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCT Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述熊膽粉具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產的熊膽粉。
[0010]本發(fā)明還保護一種通過抑制細菌自溶而抑制所述細菌分裂的產品，其活性成分為熊膽或熊膽粉。所述細菌可為金黃色葡萄球菌，具體可為ATCCsi Number為25923的金黃色葡萄球菌。所述熊膽粉具體可為上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產的熊膽粉。
[0011]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了熊膽或熊膽粉具有抑制細菌自溶、抑制細菌分裂的作用，即熊膽或熊膽粉是通過抑制細菌自溶而抑制所述細菌分裂，并且本發(fā)明證明了細菌分裂可以作為抗細菌藥物的新靶點。本發(fā)明對于抗細菌以及抗細菌藥物的研發(fā)具有重大價值。本發(fā)明對于公共健康事業(yè)具有重大價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為實施例1的結果。
[0013]圖2為實施例2的結果。
[0014]圖3為實施例3的結果。
【具體實施方式】
[0015]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。掃描電子顯微鏡:HITACHI，S3400N。透射電子鏡顯微鏡:HITACHI，H-7650。金黃色
葡萄球菌(Staphylococcus aureus):ATCCS Number為 25923。
[0016]LB培養(yǎng)基:取胰蛋白胨IOg(英國OXOID公司)、酵母提取物5g(英國OXOID公司)、NaCllOg (北京市慶盛達化工技術有限公司)，溶于去離子水并用去離子水定容至1L。基礎培養(yǎng)液為含0.25g/100mL葡萄糖(國藥集團化學試劑有限公司)的LB培養(yǎng)基。
[0017]熊膽粉:上海凱寶藥業(yè)股份有限公司；稱取熊膽粉4.535g，加入注射用水100ml，用10%Na0H水溶液調pH=9.0±0.5，充分溶解后，用注射用水定容至500ml，然后用0.22 μ m的微孔濾膜過濾并收集濾液，灌裝(每支30mL)、密封、滅菌(10(TC，流通蒸汽滅菌45min)，即為熊膽粉原液；實施例中，將熊膽粉原液用基礎培養(yǎng)液稀釋至8倍體積或16倍體積，得到含1134μ g/ml熊膽粉的基礎培養(yǎng)液或含567μ g/ml熊膽粉的基礎培養(yǎng)液。
[0018]青霉素鈉注射液，又稱注射用青霉素鈉:華北制藥股份有限公司，批號X1108105 ；使用時，將青霉素鈉注射液冷凍干燥得到干粉；實施例中，將干粉溶于基礎培養(yǎng)液，青霉素鈉的濃度以每毫升培養(yǎng)液中含有的干粉微克數(shù)計。
[0019]實施例1、通過掃描電鏡觀察熊膽粉對細菌分裂的影響
[0020]取6孔板，每個孔內加入一個洗凈消毒的玻璃片(0.5X0.5cm)，本實施例中對玻璃片進行的操作都是在六孔板的各孔中進行的，依次進行如下步驟:
[0021]1、將玻璃片浸入OD6tltol=0.05金黃色葡萄球菌菌液，37°C靜置24h (在玻璃片的上表面生成成熟的細菌生物膜)。
[0022]2、將玻璃片分成3組，每組設置5個重復處理，分別進行如下處理:
[0023]第一組(對照組):浸入基礎培養(yǎng)液，37°C靜置24h ；
[0024]第二組(青霉素鈉組):浸入含20 μ g/ml青霉素鈉的基礎培養(yǎng)液，37°C靜置24h ；
[0025]第三組(熊膽粉組):浸入含567 μ g/ml熊膽粉的基礎培養(yǎng)液，37°C靜置24h。
[0026]4、前固定:將玻璃片浸入4%戊二醛溶液，4°C固定l_2h，然后用PBS緩沖液漂洗1-3 次(5min/次)。
[0027]5、后固定:將玻璃片浸入1%鋨酸溶液，4°C固定l_2h，然后用PBS緩沖液漂洗1_3次(5min/ 次)。 [0028]6、脫水:取玻璃片，依次用30%乙醇溶液、50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、85%乙醇溶液和95%乙醇溶液洗滌I次(15-20min/次)，然后用乙醇洗滌2次(15_20min/次)。
[0029]7、叔丁醇置換:將玻璃片浸入叔丁醇，_20°C靜置30min。
[0030]8、冷凍干燥:取玻璃片，用真空冷凍干燥儀冷凍干燥3_4h。
[0031]9、噴金:取玻璃片，用導電膠粘在樣品臺上，噴金后用掃描電鏡觀察并拍照。
[0032]步驟2至步驟9中，均保持細菌生物膜向上。 [0033]照片見圖1 (右圖為左圖方框內部分的放大圖)。對照組的細菌生物膜中，細菌飽滿、大小均勻、表面平滑，細菌分裂完好，細菌相互聚結、疏密有秩。青霉素鈉組的細菌生物膜中，細菌形狀各異、大小不一，與對照組相比細菌表面結構較稀疏、細胞外基質表層粗糙、但細菌依然分裂完好。與對照組相比，熊膽粉組的細菌生物膜中，細菌表面較為平滑、大小不均，細胞外基質明顯減少，篩網(wǎng)狀結構不明顯，很多細菌不能完成正常的分裂過程，出現(xiàn)兩、三個甚至四個子細胞團(如圖中箭頭所示)。各組中，5個重復處理的結果一致。結果表明，熊膽粉能夠阻止細菌的分裂。
[0034]實施例2、通過透射電鏡觀察熊膽粉對細菌分裂的影響
[0035]1、分組處理如下(每組設置5個重復處理):
[0036]第一組(對照組):取離心管，加入10毫升基礎培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其初始濃度為7X 107CFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0037]第二組(青霉素鈉組):取離心管，加入10毫升含20 μ g/ml青霉素鈉的基礎培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其初始濃度為7X 10TCFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0038]第三組(熊膽粉組):取離心管，加入10毫升含567 μ g/ml熊膽粉的基礎培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其初始濃度為7X 10TCFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0039]2、完成步驟I后，3000rpm離心IOmin,棄上清。
[0040]3、前固定:完成步驟2后，加入4%戊二醛溶液并4°C固定l_2h，然后用PBS緩沖液漂洗1-3次(5min/次)。
[0041]4、后固定:完成步驟3后，加入1%鋨酸溶液并4°C固定l_2h，然后用PBS緩沖液漂洗 1-3 次(5min/次)。
[0042]5、脫水:完成步驟4后，依次用30%乙醇溶液、50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、85%乙醇溶液和95%乙醇溶液洗滌I次(15-20min/次)，然后用乙醇洗滌2次(15_20min/次)。
[0043]6、浸透
[0044]完成步驟5后，按如下步驟進行浸透:
[0045]①丙酮:包埋劑=2:1 (體積比)，室溫、2h ；
[0046]②丙酮:包埋劑=1:1 (體積比)，室溫、2h ；
[0047]③包埋劑，室溫、2h。
[0048]7、包埋
[0049]取步驟6得到的組織塊，包埋在多孔橡膠包埋模板中每孔頂端，置烤箱(370C 12h — 45°C 12h — 60°C 24h)，形成包埋塊。
[0050]8、取步驟7得到的包埋塊，用超薄切片機切片。
[0051]9、取步驟8得到的切片，先用醋酸鈾室溫染色20min，然后去離子水漂洗4次(每次Is),然后用檸檬酸鉛室溫染色20min，然后去離子水漂洗4次(每次Is)，晾干后用透射電鏡觀察并拍照。[0052]照片見圖2。對照組中，細菌形態(tài)完整，處于分裂期，細胞壁層次分明，外表面平整，有少量顆粒物質黏附于細胞壁，細胞質與細胞壁密度差較大，分界清晰，細菌內二分裂處細胞壁界限分明，細菌與細菌之間有顆粒物質分布。青霉素鈉組中，細菌處于分裂期，細胞壁表面平整，與對照組相比細胞壁層次較不清晰且局部(箭頭所指)界限不清，有顆粒物質分布于細胞壁上及細菌之間。熊膽粉組中，細菌處于分裂期，形態(tài)完整，舊細胞壁表面較為光滑、無顆粒物，細胞壁和細胞質的電子密度大致相同且明顯小于對照組，細胞質電子密度較為均一，新生細胞壁不成形、層次不清晰，兩個子細胞之間沒有明顯的界限。各組中，5個重復處理的結果一致。結果表明，熊膽粉能夠阻止細菌的分裂。
[0053]實施例3、自溶曲線的測定
[0054]本實施例中，用triton x_100誘導細菌自溶，通過測定OD值，檢測了熊膽粉對細菌數(shù)量的影響。
[0055]1、分組處理如下(每組設置5個重復處理):
[0056]第一組(對照組):取離心管，加入10毫升基礎培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其初始濃度為7X 107CFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0057]第二組(青霉素鈉組):取離心管，加入10毫升含20 μ g/ml青霉素鈉的基礎培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其初始濃度為7X 10TCFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0058]第三組(熊膽粉組):取離心管，加入10毫升含1134μ g/ml熊膽粉的基礎培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其初始濃度為7X 10TCFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0059]第四組(熊膽粉組):取離心管，加入10毫升含567 μ g/ml熊膽粉的基礎培養(yǎng)液，然后接種金黃色葡萄球菌并使其`初始濃度為7X 10TCFU/mL，37°C靜置培養(yǎng)24h。
[0060]2、完成步驟I后，3000rpm離心IOmin,棄上清,每個重復處理得到的沉淀用5毫升含0.05% (體積比)triton χ-100的PBS緩沖液重懸。
[0061]3、取步驟2得到的菌液，吸取200 μ I到微孔板中，采用酶標儀測595nm的初始吸光度(初始OD值)，每小時測定595nm的OD值，以時間為橫坐標、以相對OD值(每個時間點的OD值與初始OD值的比)為縱坐標做自溶曲線。
[0062]自溶曲線見圖3。青霉素鈉組、兩個熊膽粉組的相對OD值均大于對照組，即自溶率均小于對照組。結果表明，熊膽粉能抑制細菌自溶。
[0063]綜合實施例2、實施例3和實施例4的結果，可以得出如下結論:熊膽粉抑制了細菌自溶素的分泌或阻止了自溶素和細胞壁的結合，從而導致細菌的自溶率下降，細菌無法進行正常的二分裂，出現(xiàn)兩、三個甚至四個子細胞團；因此可以推斷，熊膽粉是蛋白抑制類藥物。
【權利要求】
1.熊膽或熊膽粉在制備抑制細菌分裂的產品中的應用。
2.熊膽或熊膽粉在制備抑制細菌自溶的產品中的應用。
3.熊膽或熊膽粉在制備通過抑制細菌自溶而抑制所述細菌分裂的產品中的應用。
4.如權利要求1至3中任一所述的應用，其特征在于:所述細菌為金黃色葡萄球菌。
5.一種抑制細菌分裂的產品，其活性成分為熊膽或熊膽粉。
6.一種抑制細菌自溶的產品，其活性成分為熊膽或熊膽粉。
7.—種通過抑制細菌自溶而抑制所述細菌分裂的產品，其活性成分為熊膽或熊膽粉。
8.如權利要求5至7中任一所述的產品，其特征在于:所述細菌為金黃色葡萄球菌。
【文檔編號】A61K35/413GK103705540SQ201410005138
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權日:2014年1月6日
【發(fā)明者】王毅, 劉沖, 劉紹勇, 劉宜善, 王國明, 王藝竹, 于友華, 李連達 申請人:上海凱寶藥業(yè)股份有限公司