共同阻斷pd-1和tim-3信號通路在抗胃癌治療中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及共同阻斷PD-1和TIM-3信號通路在抗胃癌治療中的用途，具體涉及PD-1信號通路的阻斷劑和TIM-3信號通路的阻斷劑及其與現(xiàn)有抗胃癌治療藥物在制備抗胃癌的藥物組合物中的用途，該阻斷劑或其與現(xiàn)有胃癌治療藥物的組合通過增強T細(xì)胞殺傷胃癌細(xì)胞的作用起到抗胃癌治療作用。本發(fā)明的組合物對胃癌有顯著的治療效果，且具有毒副作用小、能與現(xiàn)有胃癌治療藥物協(xié)同的優(yōu)點。
【專利說明】共同阻斷PD-1和TIM-3信號通路在抗胃癌治療中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種治療胃癌的新方法，即共同阻斷ro-Ι和--Μ-3信號通路；同時證明了該方法與現(xiàn)有抗胃癌治療藥物合用具有協(xié)同效果。據(jù)此，本發(fā)明提供了 ro-Ι信號通路阻斷劑和TIM-3信號通路阻斷劑或其與現(xiàn)有抗胃癌治療藥物的聯(lián)用在胃癌治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在多種小鼠腫瘤模型中有大約半數(shù)的腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞(Tumor InfiltrationLymphocytes, TILs)共表達--Μ-3與Η)_1，并且表現(xiàn)出功能的耗竭，喪失增殖和分泌IL-2、TNF-α和IFN-Y這些細(xì)胞因子的能力。共同阻斷Η)_1和--Μ-3信號通路，被發(fā)現(xiàn)與單獨阻斷I3D-1或--Μ-3信號通路相比，能更有效地抑制腫瘤生長。在人類癌癥中，--Μ-3在Η)_I-的NY-ES0-1特異性的CD8+T細(xì)胞上高表達，TIM-3+/PD-l+雙陽性的NY-ES0-1特異性CD8+T細(xì)胞比HM-37PD-1+和HM-37PD-1_的NY-ES0-1特異性CD8+T細(xì)胞功能更加紊亂，分泌更少的IL-2、TNF和IFN- Y，阻斷--Μ-3信號通路能夠增強NY-ES0-1特異性⑶8+T細(xì)胞增值和分泌細(xì)胞因子的能力，共同阻斷ro-1信號通路則具有顯著的協(xié)同作用。
[0003]先前的一些研究只是對結(jié)腸腺肉瘤(MC38和CT26)和纖維肉瘤(WTMCA2)這3種小鼠腫瘤模型進行了研究；在人類腫瘤中的研究，也是針對在黑色素瘤患者中NY-ES0-1特異性的CD8+T細(xì)胞的研究。缺乏對人類其他癌癥尤其是全球發(fā)病率第四，死亡率第二的癌癥——胃癌的研究，中國胃癌發(fā)病率占全世界的42%，平均每3分鐘就有一個中國人死于胃癌。面對中國嚴(yán)峻的胃癌形勢，我們希望能夠通過共同阻斷免疫抑制信號通路的免疫治療途徑來治療胃癌。
[0004]在癌癥病人體內(nèi)。免疫系統(tǒng)是一個整體的存在。通過對整體⑶3+、⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的研究得出的結(jié)果將更全面真實的體現(xiàn)病人在接受ro-Ι和TIM-3信號通路阻斷后能否獲得有效的療效。在黑色素瘤病人中的研究，只是研究了 ro-Ι和--Μ-3在NY-ES0-1特異性的⑶8+T細(xì)胞上的表達水平，以及阻斷ro-Ι和--Μ-3信號通路后對NY-ES0-1特異性的⑶8+T細(xì)胞活性的影響。先前的研究缺乏整體性的研究ro-Ι和TIM-3在癌癥病人外周PBMC和TIL中⑶3+、⑶4+和⑶8+T細(xì)胞中表達水平的研究，以及缺乏在共同阻斷I3D-1和TIM-3信號通路后對⑶4+和⑶8+T細(xì)胞活性的影響的評價。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種共同阻斷Η)-1和--Μ-3信號通路在抗胃癌治療中的用途。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0007]PD-1信號通路的阻斷劑和TIM-3信號通路的阻斷劑在制備抗胃癌的藥物組合物中的用途。
[0008]進一步地,所述藥物組合物包括:[0009]DPD-1信號通路的阻斷劑和TIM-3信號通路的阻斷劑；
[0010]2)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑；
[0011]和3)任選的,其它抗胃癌藥物。
[0012]進一步地，所述藥物組合物與其它抗胃癌藥物聯(lián)合使用。
[0013]進一步地，所述藥物組合物包括其它抗胃癌藥物。
[0014]進一步地，所述ro-1信號通路的阻斷劑為抗ro-1單克隆抗體，所述--μ-3信號通路的阻斷劑為抗ΤΙΜ-3單克隆抗體。
[0015]進一步地，所述其它抗胃癌藥物為烷化劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗癌藥、激素中的一種或多種。
[0016]進一步地，所述其它抗胃癌藥物為順鉬、表柔比星、氟尿嘧啶中的一種或多種。
[0017]本發(fā)明進一步提供了一種藥物組合物，包括:i)ro-1信號通路的阻斷劑和TIM-3信號通路的阻斷劑；2)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑；和3)任選的，其它抗胃癌藥物。
[0018]本發(fā)明更進一步提供了一種藥盒，包括:i)含有ro-1信號通路的阻斷劑和TIM-3信號通路的阻斷劑的容 器；ii)含有其它抗胃癌藥物的容器；和任選的iii)使用說明書。
[0019]本發(fā)明還提供了一種治療胃癌的方法，所述方法包括將本發(fā)明的藥物組合物或藥盒給予需要該治療的對象，或?qū)o-Ι和TIM-3信號通路的阻斷劑與其它抗胃癌藥物聯(lián)合給予需要該治療的對象。
[0020]本發(fā)明的有益效果是:共同阻斷ro-1和TIM-3信號通路能夠有效增強T細(xì)胞殺傷胃癌細(xì)胞的作用，從而為胃癌的臨床免疫治療提供了有力依據(jù)，并為為臨床用藥和胃癌防治提供了新的有效途徑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明的實施例1的操作流程圖。
[0022]圖2A、圖2B、圖2C、圖2D為本發(fā)明的實施例1的胃癌病人外周血單核細(xì)胞(PBMC)，癌旁胃粘膜(AGM)和腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞(TILs)的代表性示意圖和整合示意圖。
[0023]其中，整合的數(shù)據(jù)展示CTLA-4 (C)和TIGIT (D)在⑶3+，⑶4+和⑶8+T細(xì)胞群中的表達水平。
[0024]圖3為本發(fā)明的實施例1的正常人外周血單核細(xì)胞(NDMC)，胃癌病人外周血單核細(xì)胞(PBMC)，癌旁胃粘膜(AGM)和腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞(TIL)的代表性示意圖。
[0025]其中，數(shù)據(jù)展示ro-Ι和--Μ-3在⑶3+，⑶4+和⑶8+T細(xì)胞群中的表達水平。
[0026]圖4顯示了實施例1中，分別來自15個胃癌病人的腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞，癌旁胃粘膜和外周血單核細(xì)胞(TIL，AGM和PBMC)，以及9個正常人外周血單核細(xì)胞(NDMC)PD-i、, --Μ-3+，PD-l+/TIM-3+, PD-l+/TM-3' Ρ?-i'/ΤΙΜ-3+ 和 PD-17TIM-3-所占 CD3+T 細(xì)胞的百分率。
[0027]圖5顯示了實施例1中，分別來自15個胃癌病人的腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞，癌旁胃粘膜和外周血單核細(xì)胞(TIL，AGM和PBMC)，以及9個正常人外周血單核細(xì)胞(NDMC)的PD-i+, --Μ-3+，PD-l+/TIM-3+, PD-l+/TM-3' Ρ?-i、/ΤΙΜ-3+ 和 PD-17TIM-3-所占 CD4+T 細(xì)胞的百分率。[0028]圖6顯示了實施例1中，分別來自15個胃癌病人的腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞，癌旁胃粘膜和外周血單核細(xì)胞(TIL，AGM和PBMC)，以及9個正常人外周血單核細(xì)胞(NDMC) Η)_I'，--Μ-3+，PD-l+TIM-3+, PD-l+TIM-3_, Ρ?-ΤΙΜ-3+ 和 PD_rilM-3-所占 CD8+T 細(xì)胞的百分率。[0029]圖7顯示了實施例1中，在15個胃癌患者的TIL，AGM和PBMC中，CD3+ (A和B)，CD4+ (C和D)和CD8+ (E和F)T細(xì)胞中表達I3D-1和--Μ-3的平均熒光強度(MFI)。p值是用Wilcoxon符號秩和檢驗計算得到的。
[0030]圖8A、圖8B、圖8C、圖8D顯示了實施例1中，在用抗Tim-3 ( α --Μ-3)和/或抗PD-1 ( a PD-1)單抗或同型對照(IgG)阻斷后，CD4+ (Α和C)和CD8+ (B和D) TIL中細(xì)胞因子的表達。
[0031]圖9顯示了實施例1中，用抗Tim-3 ( α --Μ-3)和/或抗PD-1 (aPD_l)單抗阻斷增強TIL對AGS的細(xì)胞毒性。AGS-GFP與TIL以1:6的形式共培養(yǎng)4h，AGS死亡率用7-AAD染色的細(xì)胞流式方法檢測。
【具體實施方式】
[0032]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0033]本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過研究和試驗，發(fā)現(xiàn)共同阻斷ro-Ι和--Μ-3信號通路能夠有效增強T細(xì)胞殺傷胃癌細(xì)胞的作用，PD-1信號通路的阻斷劑和TIM-3信號通路的阻斷劑同時使用可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖、促進胃癌細(xì)胞凋亡，從而達到治療胃癌的效果，并發(fā)現(xiàn)該類藥物與現(xiàn)有抗胃癌治療藥物合用具有顯著的協(xié)同治療胃癌的效果。
[0034]PD-1信號通路的陽斷劑和--Μ-3信號通路的陽斷劑
[0035]本文中，術(shù)語“ro-1信號通路”是指表達于激活τ細(xì)胞表面的ro-1受體與其配體PDLl (B7-H1, CD274)或PDL2(B7-DC，CD273)接觸后，通過磷酸化SHP2等信號通路抑制T細(xì)胞激活；術(shù)語“--Μ-3信號通路”是指--Μ-3會在IFN- Y分泌的T細(xì)胞表面表達上調(diào)，與其配體galectin-9結(jié)合后，使Bat_3從--Μ-3受體上解離，從而抑制T細(xì)胞IFN- Y的分泌和增殖，甚至導(dǎo)致T細(xì)胞死亡。
[0036]本文中，術(shù)語“PD-1信號通路的阻斷劑”是指可用于阻斷ro-1信號通路的活性物質(zhì)，術(shù)語“TIM-3信號通路的阻斷劑”是指可用于阻斷--Μ-3信號通路的活性物質(zhì)。術(shù)語“阻斷劑”是指部分或全部阻止或抑制某一作用的物質(zhì)。
[0037]本發(fā)明的阻斷劑可為本領(lǐng)域中已知的活性物質(zhì)，包括:ro-l單克隆抗體、--Μ-3單克隆抗體、CTLA-4單克隆抗體、LAG3單克隆抗體，但不限于上述活性物質(zhì)。
[0038]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述阻斷劑優(yōu)選為抗體，更優(yōu)選為單克隆抗體。所述抗體可通過本領(lǐng)域中已知的方法獲得。
[0039]本發(fā)明的阻斷劑能明顯發(fā)揮的抑制胃癌細(xì)胞增殖、促進胃癌細(xì)胞凋亡的作用，與現(xiàn)有抗胃癌治療的藥物合用具有顯著的協(xié)同效果。
[0040]其它抗胃癌藥物
[0041]本發(fā)明的阻斷劑不僅本身能明顯發(fā)揮的抑制胃癌細(xì)胞增殖、促進胃癌細(xì)胞凋亡的作用，其還可與現(xiàn)有抗胃癌藥物合用產(chǎn)生顯著的協(xié)同效果。[0042]所述其它抗胃癌藥物包括:烷化劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗癌藥、激素。優(yōu)選為順鉬、表柔比星、氟尿嘧啶。
[0043]藥物組合物和藥盒
[0044]本發(fā)明提供的藥物組合物包括:Η)-1信號通路的阻斷劑和TIM-3信號通路的阻斷劑、藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑、其它抗胃癌藥物。
[0045]該藥物組合物可有效用于胃癌的治療。如組合物中存在其它抗胃癌藥物，則其與PD-1信號通路的阻斷劑、TIM-3信號通路的阻斷劑三者的摩爾比為(8 - 40):1:1。
[0046]本文中，術(shù)語“藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體”是指用于保健品或藥物制劑的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。適用的載體是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，本發(fā)明優(yōu)選稀釋劑，具體可選生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)。
[0047]本發(fā)明的組合物為液態(tài)的溶液劑。
[0048]本發(fā)明還提供了一種用于胃癌治療的藥盒，包括:容納有ro-1信號通路的阻斷劑和TIM-3信號通路的阻斷劑的容器、容納有其它抗胃癌藥物的容器、任選的使用說明書。
[0049]在本發(fā)明的實施方式中，在給予ro-Ι信號通路的阻斷劑、TIM-3信號通路的阻斷劑之前、之后或同時給予其它抗胃癌藥物，以產(chǎn)生協(xié)同治療效果。
[0050]施用方式
[0051]本發(fā)明的藥物是通過以下哪種給藥方式:胃腸外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)、瘤內(nèi)、局部給藥，或者其他的給藥方式，優(yōu)選靜脈注射或靜脈滴注。本發(fā)明組合物的施用量，按活性物質(zhì)重量計，通常為每天約0.001-5mg阻斷劑/kg體重,較佳地約0.01-1/kg體重,優(yōu)選0.01-0.5mg/kg 體重。
[0052]本發(fā)明的優(yōu)點
[0053]本發(fā)明具有如下的優(yōu)點:共同阻斷ro-Ι和--Μ-3信號通路能夠有效增強T細(xì)胞殺傷胃癌細(xì)胞的作用，從而為胃癌的臨床免疫治療提供了有力依據(jù)，并為為臨床用藥和胃癌防治提供了新的有效途徑。
[0054]實施例:共同阻斷PD-1和TIM-3信號通路對體外培養(yǎng)胃癌癌細(xì)胞的殺傷作用
[0055](一)材料
[0056]1.標(biāo)本及細(xì)胞系
[0057]1)胃癌組織、癌旁組織和胃癌病人外周血(由蘇州大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院提供)；
[0058]2)正常人外周血(由蘇州大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院提供)；
[0059]3)胃癌細(xì)胞系(AGS來自蘇州大學(xué)唐中英血液學(xué)研究中心)。
[0060]2.主要試劑與材料
[0061]1) RPMI1640，DMEM 高糖培養(yǎng)基(HyClone 公司)；
[0062]2)胎牛血清(FBS)、0.25% 胰酶(HyClone 公司)；
[0063]3)細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素-鏈霉素(HyClone公司)；
[0064]4) Ficoll-paque plus 淋巴細(xì)胞分離液(GE healthcare 公司)；
[0065]5) 7-AAD 染料(BD 公司)；
[0066]6) LIVE/DEAD固定死細(xì)胞染料試劑盒(invitrogen公司)；
[0067]7)固定及破膜溶液和破膜/清洗緩沖液(BD公司)；
[0068]8)高爾基體阻斷試劑(BD公司)；[0069]9) Trizol 裂解液(invitrogen 公司)；
[0070]10)病毒包裝質(zhì)粒ΔR, REV和包膜質(zhì)粒VSV-G ；
[0071]11) PersonGen人類T淋巴細(xì)胞活化與擴增試劑盒(博生吉公司)。
[0072]3.主要儀器與設(shè)備
[0073]1) FACS Aria III和 FACS Caliber 流式細(xì)胞儀(BD 公司)；
[0074]2)超凈工作臺(Thermo公司)；
[0075]3) CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)；
[0076]4)低速冷凍離心機(Thermo公司)；
[0077]5)高速離心機(Beckman Coulter 公司)；
[0078]4.主要抗體
[0079]1)鼠抗人 CD3-FITC，鼠抗人 CD4-FITC，鼠抗人 CD8-FITC，鼠抗人 CD4-APC，鼠抗A PD-1-APC,鼠抗人 PD-1-FITC，鼠抗人 --Μ-3-ΡΕ，鼠抗人 TIGIT-PerCP Cy5.5，鼠抗人CTLA-4-PerCP Cy5.5，鼠抗人CD8-PE Cy7，鼠抗人 IL-2-PE，鼠抗人 IFN-Y-PerCP Cy5.5，鼠抗人 TNF- a -APC,鼠抗人 CD3_PerCP Cy5.5，鼠抗人 CD8_PerCP Cy5.5 (BD 公司)；
[0080]2)鼠抗人ro-1單克隆抗體、鼠抗人⑶3單克隆抗體(博生吉公司)；
[0081]3)鼠抗人 --Μ-3 單克隆抗體 clone2E2 (Millipore 公司)；
[0082]4)正常小鼠IgG抗體(invitrogen公司)。
[0083](二)方法
[0084]按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法，在37°C、5%C02的環(huán)境培養(yǎng)人細(xì)胞。包括胃癌細(xì)胞系:AGS、AGS-GFP ;從胃癌病人的胃癌組織中提取的腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞(TIL);從胃癌病人或正常人外周血中提取的T淋巴細(xì)胞。AGS、AGS-GFP、TIL、T細(xì)胞用含10%FBS DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0085]圖1為本發(fā)明的實施例1的操作流程圖，如圖1所示，本實施例具體包括如下步驟:
[0086]1.建立GFP-1uc陽性AGS細(xì)胞系
[0087]1.1GFP-1uc 慢病毒制備
[0088]1.1.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
[0089]I)取100 μ L感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中；
[0090]2)向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入Ing目的質(zhì)粒(GFP-luc、ΔR、REV或VSV-G)，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，在冰浴中靜置30min ；
[0091]3)將離心管置于42°C水浴中放置60s，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2min ；
[0092]4)向離心管中加入900 μ I無菌SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后置于37°C搖床振蕩培養(yǎng) 45min (150rpm/min)；
[0093]5)將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100 μ I已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有氨芐抗生素(Ampici 11 in，Amp)的LB固體培養(yǎng)基上，倒置平板，37°C培養(yǎng)12h。
[0094]1.1.2質(zhì)粒提取
[0095]1)挑選上述LB平板上的單克隆置于3ml LB培養(yǎng)基(Amp)中，37°C搖床振蕩培養(yǎng)12h (250rpm/min)；
[0096]2)12h后，吸取Iml菌液至200ml LB培養(yǎng)基(Amp)中，37°C搖床振蕩培養(yǎng)18h_20h(250rpm/min)；
[0097]3)按照Axygen質(zhì)粒大量提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，用紫外分光光度計檢測質(zhì)粒濃度和純度，置于_20°C保存。
[0098]1.1.3慢病毒包裝
[0099]1)細(xì)胞培養(yǎng):取6X106個293T細(xì)胞接種于IOOmm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，過夜，待細(xì)胞匯合度達到90%時，更換6ml新鮮DMEM培養(yǎng)基；
[0100]2) 3h后進行包裝病毒，向EP管中加入450 μ I無菌水，加入下述質(zhì)粒，混勻；
[0101]
【權(quán)利要求】
1.PD-1信號通路的阻斷劑和TIM-3信號通路的阻斷劑在制備抗胃癌的藥物組合物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物包括: DPD-1信號通路的阻斷劑和TIM-3信號通路的阻斷劑； 2)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑； 和3)任選的，其它抗胃癌藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物與其它抗胃癌藥物聯(lián)合使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物包括其它抗胃癌藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的用途，其特征在于，所述ro-1信號通路的阻斷劑為抗ro-Ι單克隆抗體，所述TIM-3信號通路的阻斷劑為抗TIM-3單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項所述的用途，其特征在于，所述其它抗胃癌藥物為烷化劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗癌藥、激素中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項所述的用途，其特征在于，所述其它抗胃癌藥物為順鉬、表柔比星、氟尿嘧啶中的一種或多種。
8.一種藥物組合物，包括: DPD-1信號通路的阻斷劑和TIM-3信號通路的阻斷劑； 2)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體或賦形劑； 和3)任選的，其它抗胃癌藥物。
9.一種藥盒，包括: i)含有ro-Ι信號通路的阻斷劑和TIM-3信號通路的阻斷劑的容器； ii)含有其它抗胃癌藥物的容器； 和任選的iii)使用說明書。
【文檔編號】A61K45/00GK103721255SQ201410006645
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】楊林, 宗云輝 申請人:蘇州大學(xué)