hALR基因微環(huán)真核表達載體在降低肝臟膠原蛋白合成方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因治療【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及人肝再生增強因子基因（hALR）微環(huán)真核表達載體在降低肝臟膠原蛋白合成方面的應(yīng)用。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，將人肝再生增強因子基因（hALR）微環(huán)真核表達載體通過水動力轉(zhuǎn)染方法，可靶向性地將人肝再生增強因子基因?qū)敫渭毎麅?nèi)，并使其在肝臟中有效表達，從而有效抑制降低肝臟膠原蛋白合成。因此，人肝再生增強因子基因微環(huán)真核表達載體在制備降低肝臟膠原蛋白合成的藥物方面具有很大的應(yīng)用前景。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因治療【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及人肝再生增強因子基因（hALR)微環(huán)真核 表達載體在降低肝臟膠原蛋白合成方面的應(yīng)用。 hALR基因微環(huán)真核表達載體在降低肝臟膠原蛋白合成方 面的應(yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 肝纖維化、肝硬化等慢性肝病均存在以肝臟膠原蛋白合成為主的病理變化，所以， 抑制肝臟膠原蛋白合成，成為治療和預(yù)防肝纖維化、肝硬化等慢性肝病的有效方式。有大 量文獻表明肝再生增強因子（augmenter of liver regeneration, ALR)能減少肝臟纖維化 時膠原蛋白的產(chǎn)生，因此，肝再生增強因子成為了基因治療肝纖維化的靶標(biāo)基因?，F(xiàn)有技 術(shù)中以肝再生增強因子為靶標(biāo)來治療肝纖維化的方法主要有以下幾種：（1)通過外源物質(zhì) 增加動物體內(nèi)肝再生增強因子基因的表達量，從而通過降低肝臟膠原蛋白合成來治療肝纖 維化。如彭彥輝等發(fā)表的文獻"中藥方劑對肝纖維化大鼠肝臟ALR基因表達的影響"證明： 其文獻中記載的中藥方劑可顯著升高肝纖維化大鼠肝組織ALR mRNA表達，從而抑制肝纖維 化。（2)借助常規(guī)表達載體將肝再生增強因子基因?qū)雱游锛毎?，使肝再生增強因子基因?細胞內(nèi)高表達，從而通過降低肝臟膠原蛋白合成來治療肝纖維化。但是，通過常規(guī)表達載體 來介導(dǎo)肝再生增強因子基因的效率很低，而且，常規(guī)載體在基因治療中可能會引起嚴(yán)重的 生物安全問題。如病毒載體中的病毒基因會整合到宿主基因組，病毒載體中的病毒基因編 碼蛋白具有免疫原性等；傳統(tǒng)質(zhì)粒載體中含有細菌復(fù)制序列、抗性基因未甲基化的CpG基 因序列和一些可能隱藏的表達信號，這些序列在質(zhì)粒是必須的，但在基因治療中可能引起 嚴(yán)重的生物安全問題。除此之外，抗性基因會通過水平基因轉(zhuǎn)移的方式在宿主體內(nèi)傳播；隱 藏在真核表達信號上游的抗性基因還會導(dǎo)致哺乳動物細胞中基因的表達發(fā)生改變；甚至細 菌序列的存在也會導(dǎo)致目的基因的沉默。這些因素都嚴(yán)重影響基因治療的效果。
[0003] 微環(huán)DNA( minicircle DNA，MC)是1997年發(fā)展起來的除細菌序列和僅編碼外源 基因的小超螺旋高效載體。具有安全性能好，同時轉(zhuǎn)染效率高、表達時間持久的優(yōu)點。微環(huán) DNA載體僅由外源基因的表達盒構(gòu)成，不含有來自細菌質(zhì)粒的骨架結(jié)構(gòu)，在生物安全性、 轉(zhuǎn)染效率、生物活性方面都優(yōu)于傳統(tǒng)質(zhì)粒載體。相關(guān)文獻報道，體內(nèi)、外試驗證明微環(huán)DNA 載體的表達效率是親本質(zhì)粒載體的幾十至幾百倍。
[0004] 目前，國內(nèi)外尚無用微環(huán)載體來介導(dǎo)人肝再生增強因子（human augmenter of liver regeneration, hALR)基因的相關(guān)報道。因為，微環(huán)質(zhì)粒種類紛雜，微環(huán)質(zhì)粒與宿主 工程菌的匹配度是很難選擇的，而且，微環(huán)質(zhì)粒中攜帶的目的基因能否與宿主工程菌相兼 容也是很難控制的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中利用肝再生增強因子進行基因 治療存在的缺陷，提供一種人肝再生增強因子基因微環(huán)真核表達載體及其構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)： 一種人肝再生增強因子基因微環(huán)真核表達載體，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。 本發(fā)明選取微環(huán)質(zhì)粒ZY781作為表達載體，將人肝再生增強因子序列通過酶切連接技術(shù)連 接到質(zhì)粒ZY781中，得到攜帶人肝再生增強因子的微環(huán)DNA親本質(zhì)粒，將獲得的攜帶人肝再 生增強因子的微環(huán)DNA親本質(zhì)粒轉(zhuǎn)入工程菌萬.coB ZYCY10P3S2T中，通過工程菌自身重組 酶的作用下制備出高純度的人肝再生增強因子基因微環(huán)真核表達載體。
[0007] 本發(fā)明之所以選擇微環(huán)質(zhì)粒ZY781作為表達載體是經(jīng)過優(yōu)化篩選的?，F(xiàn)有技術(shù)微 環(huán)質(zhì)粒種類紛雜，微環(huán)質(zhì)粒與宿主工程菌的匹配度是很難選擇的，而且，微環(huán)質(zhì)粒中攜帶的 目的基因能否與宿主工程菌相兼容也是很難控制的。另外，本發(fā)明通過合理優(yōu)化重組工程 菌凡cWi ZYCY10P3S2T的發(fā)酵條件，高效率制備得到高純度的人肝再生增強因子基因微環(huán) 真核表達載體。
[0008] 所述重組工程菌的優(yōu)化發(fā)酵及誘導(dǎo)條件為：將重組工程菌種子液按照0. 1?0. 3% 的接種量接種到含50 Pg /ml卡那霉素的TB培養(yǎng)液中，37°C，250 rpm/min，培養(yǎng)15h;然 后向培養(yǎng)液中加入1.2倍體積的誘導(dǎo)液，32°C，250 rpm/min培養(yǎng)6h ;所述誘導(dǎo)液為含有3% (v/v) IN NaOH 和 0· 3% (v/v) 20% L-Arabinose 的 LB 液體培養(yǎng)基。
[0009] 所述重組工程菌種子液的制備方法為將重組工程菌接種到TB培養(yǎng)液中，37°C， 250 rpm/min，培養(yǎng)15?18h得0D600值為4?5的重組工程菌種子液。
[0010] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，將人肝再生增強因子基因（hALR)微環(huán)真核表達載體通過水動力 轉(zhuǎn)染方法，可靶向性地將人肝再生增強因子基因?qū)敫渭毎麅?nèi)，并使其在肝臟中有效表達， 從而有效抑制降低肝臟膠原蛋白合成。因此，人肝再生增強因子基因微環(huán)真核表達載體在 制備降低肝臟膠原蛋白合成的藥物方面具有很大的應(yīng)用前景，例如可以使用該載體制備出 hALR蛋白作為藥物使用，也可以用于基因治療，即直接將基因打到動物體內(nèi)進行基因治療。
[0011] 說明書附圖 圖 1. PCDNA3. 1 (+) -hALR 質(zhì)粒圖譜。
[0012] 圖2· ZY781空載體結(jié)構(gòu)圖。
[0013] 圖3. hALR基因表達序列圖。
[0014] 圖4.hALR基因表達序列酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；其中，l、Marker :DL5000bp ;6、Marker :DL2000bp ;2、3、4、5 :hALR 基因表達序列酶切樣品。
[0015] 圖5.酶切、連接、轉(zhuǎn)化技術(shù)將hALR微環(huán)親本質(zhì)粒導(dǎo)入工程菌過程圖。
[0016] 圖 6. ZY78l-CMV_hALR 質(zhì)粒圖譜。
[0017] 圖L轉(zhuǎn)化結(jié)果酶切電泳鑒定圖；Marker :DL15000bp ;2、3、4、5 :NdeI酶切結(jié)果； 6、7、8 :KpnI 酶切結(jié)果 9、Marker :DL2000bp。
[0018] 圖8. hALR基因微環(huán)真核表達載體制備流程圖。
[0019] 圖9.1^1^基因微環(huán)真核表達載體電泳鑒定圖；1:1&^1?^01^1500(^? ;2:親本質(zhì) 粒ΚρηΙ酶切結(jié)果；3、5:微環(huán)Kpnl、EcoRI酶切結(jié)果；4、6:對照pcDNA3. 1 (+)-hALR載體 KpnI、EcoRI 酶切結(jié)果：9:Marker DL5000bp。
[0020] 圖10. hALR基因微環(huán)真核表達載體結(jié)構(gòu)圖。
[0021] 圖11.采用新老制備條件制備出的hALR微環(huán)真核表達載體純度比較；左圖：文獻 制備條件制備的MLR微環(huán)質(zhì)粒；右圖：新制備條件制備的hALR微環(huán)真核表達載體；左圖： 1、 2 :maker ;3 :親本質(zhì)粒ΚρηΙ酶切結(jié)果；4、5 :hALR微環(huán)真核表達載體ΚρηΙ酶切結(jié)果；右 圖：1、2、7 :maker ;3 :親本質(zhì)粒ΚρηΙ酶切結(jié)果；4、5、6 :hALR微環(huán)真核表達載體ΚρηΙ酶切結(jié) 果。
[0022] 圖12.大鼠肝臟外觀裸視觀察結(jié)果。
[0023] 圖13.大鼠肝功能指標(biāo)。
[0024] 圖14.各組肝臟病理切片HE染色圖 圖15.各組肝臟切片膠原染色圖。
[0025] 圖16.各組肝組織膠原蛋白I mRNA檢測。
[0026] 圖17. pMC-CMV-hALR和pcDNA3. 1 (+)-hALR在體內(nèi)表達比較圖；1.健康對照組； 2. 為生理鹽水對照組；3.模型對照組；4、5. pcDNA3. 1 (+) -hALR治療組48小時和7天ALR 表達情況；6、7 :PMC-CMV-hALR治療組48小時和7天ALR表達情況。

【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā) 明采用的試劑、設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑和設(shè)備。
[0028] pcDNA3. 1 (+)-hALR質(zhì)粒（6013bp)是由解放軍458醫(yī)院全軍肝病中心構(gòu)建并保藏， 其結(jié)構(gòu)圖如圖1所示必cWi ZYCY10P3S2T和ZY781空載體由斯坦福大學(xué)陳志英教授惠贈， ZY781空載體結(jié)構(gòu)圖如圖2所示。
[0029] 實施例1 S1.人肝再生增強因子基因序列的獲得：以解放軍458醫(yī)院全軍肝病中心構(gòu)建并保藏 pcDNA3. 1 (+) -hALR質(zhì)粒(質(zhì)粒序列如SEQ ID N0 :2所示)為模版，設(shè)計擴增人肝再生增強因 子基因序列的正向和反向引物： 正向引物 F :5' -GACTGAAGATCTATGTACGGGCCAGATATA-3' 反向引物 R:5' -ATACCGCTCGAGGGTTCTTTCCGCCTCAGA-3' PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序如下：

【權(quán)利要求】
1. hALR微環(huán)真核表達載體在制備降低肝臟膠原蛋白合成藥物中的應(yīng)用，所述hALR微 環(huán)真核表達載體的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述降低肝臟膠原蛋白合成藥物能治療肝 纖維化或肝硬化。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用的具體步驟為：
51. 擴增得到人肝再生增強因子基因表達序列；
52. 將人肝再生增強因子基因表達序列通過酶切連接技術(shù)轉(zhuǎn)入質(zhì)粒ZY781中；得到攜 帶人肝再生增強因子的微環(huán)DNA親本質(zhì)粒；
53. 將攜帶人肝再生增強因子的微環(huán)DNA親本質(zhì)粒轉(zhuǎn)入工程菌萬.coB ZYCY10P3S2T中 得重組工程菌，優(yōu)化重組工程菌發(fā)酵及誘導(dǎo)條件，通過工程菌自身重組酶的作用下制備出 高純度的人肝再生增強因子微環(huán)真核表達載體；
54. 將人肝再生增強因子微環(huán)真核表達載體通過水動力轉(zhuǎn)染方法，靶向性地將人肝再 生增強因子基因?qū)敫渭毎麅?nèi)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于，S3所述重組工程菌的優(yōu)化發(fā)酵及誘導(dǎo)條 件為：將重組工程菌種子液按照〇. 1?〇. 3%的接種量接種到含50 Pg /ml卡那霉素的TB 培養(yǎng)液中，37°C，250 rpm/min，培養(yǎng)15?18h ;然后向培養(yǎng)液中加入1. 2倍體積的誘導(dǎo) 液，32°C，250 rpm/min 培養(yǎng) 6h;所述誘導(dǎo)液為含有 3% (v/v)lN NaOH 和 0.3% (v/v)20% L-Arabinose的LB液體培養(yǎng)基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述重組工程菌種子液的制備方法為將重 組工程菌接種到含50 Pg /ml卡那霉素的TB培養(yǎng)液中，37°C，250 rpm/min，培養(yǎng)15?18h 得〇D6QQ值為4?5的重組工程菌種子液。
【文檔編號】A61K48/00GK104096239SQ201410011707
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】孔祥平, 武昕, 劉光澤, 張海松, 吳慶洲 申請人:中國人民解放軍第四五八醫(yī)院