一種用于膿毒癥治療的t-肽免疫調(diào)節(jié)劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于膿毒癥治療的T-肽免疫調(diào)節(jié)劑；所述調(diào)節(jié)劑的結(jié)構(gòu)為(Thr-Lys-Pro-Arg-AAN)4-(Lys-AAN)2-Lys-AAN，其中N為自然數(shù)，本發(fā)明通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，T-肽具有調(diào)節(jié)效應(yīng)性T細(xì)胞增殖、分泌功能，以及通過結(jié)合調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面分子神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1，Nrp-1)緩解調(diào)節(jié)性T細(xì)胞負(fù)向免疫調(diào)控作用。所述的T-肽能夠通過上述機(jī)制緩解膿毒癥引起的免疫抑制狀態(tài)，特別是細(xì)胞免疫抑制，進(jìn)而達(dá)到改善膿毒癥小鼠生存率以及膿毒癥癥狀的作用，可以用于膿毒癥的治療。
【專利說明】—種用于膿毒癥治療的T-肽免疫調(diào)節(jié)劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及T-肽及其應(yīng)用，更具體地，涉及T-肽在制備治療膿毒癥藥物中應(yīng)用，所述T-肽通過抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞負(fù)向免疫調(diào)控、緩解細(xì)胞免疫抑制機(jī)制，增加膿毒癥機(jī)體的生存率和改善膿毒癥癥狀。
【背景技術(shù)】
[0002]膿毒癥(sepsis)是由感染誘發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)綜合征。膿毒癥并非單純的失控性炎癥反應(yīng)，同時(shí)還存在著嚴(yán)重的、逐漸加重的免疫抑制，且以細(xì)胞免疫抑制最為突出。具體表現(xiàn)為不能清除病原體，容易造成二次感染以及潛伏病毒的復(fù)活等，甚至?xí)谀摱景Y患者痊愈后的一段時(shí)期存在，引起出院后生活質(zhì)量的下降以及死亡率的增加[Winters BD,Eberlein M，Leung J，et al.Long-term mortality and quality of life in sepsis:a systematic review.Crit Care Med，2010，38 (5):1276-1283]。大多數(shù)胺毒癥患者能夠幸存于過度的炎癥反應(yīng)，而最終死于院內(nèi)感染、條件致病菌感染、體內(nèi)潛伏病毒的復(fù)活和多器官衰竭等[Hotchkiss RS, Coopersmith CM，McDunn JE, et al.Tilting towardimmunosuppression:Nat Med，2009，15(4):496-497 ；Limaye APiKirby KA,Rubenfeld GD，et al.Cytomegalovirus rea ctivation in critically ill immunocompetent patients.JAMA, 2008, 300 (4):413-422]。分析膿毒癥患者死亡后脾臟病理改變發(fā)現(xiàn)，病程越長，B淋巴細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞丟 失越多；嚴(yán)重膿毒癥患者，效應(yīng)性T細(xì)胞針對特異性抗原，表現(xiàn)為無反應(yīng)性，即不能增殖和分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子。Heidecke等[Heidecke CD, Hensler T，Weighardt H，et al.Selective defects of T lymphocyte function in patients withlethal intraabdominal infection.Am J Surg，1999，178 (4):288-292]通過對嚴(yán)重胺毒癥患者的研究發(fā)現(xiàn)，患者不僅輔助性T細(xì)胞(Th) I類反應(yīng)降低，同時(shí)Th2類反應(yīng)也未見增加，并且與病死率密切相關(guān)。通過對膿毒癥患者的血液樣本檢測發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞存在著明顯的凋亡，19例膿毒癥患者中有15例淋巴細(xì)胞數(shù)的絕對值低于正常值下線[HotchkissRS，Swanson PE，F(xiàn)reeman BD,et al.Apoptotic cell death in pat ients with sepsis，shock，and multiple organ dysfunction.Crit Care Med，1999，27(7):1230-1251];胺毒癥誘導(dǎo)的免疫抑制是造成高死亡率和嚴(yán)重并發(fā)癥的根源[Boomer JS，To K，Chang KC，et al.1mmunosuppression in patients who die of sepsis and multiple orga nfailure.JAMA，2011，306 (23):2594-2605]。減少效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡、促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞增殖以及升高干擾素(IFN)-Y等促炎細(xì)胞因子水平可明顯改善膿毒癥動(dòng)物的生存率[Muenzer JT, Davis CG, Chang K，et al.Characterization and modulation of the immunosuppressive phase of sepsis.1nfect Immun，2010，78 (4):1582-1592] 0 促炎性和抗炎性反應(yīng)的水平，均與膿毒癥的嚴(yán)重性相關(guān)，白細(xì)胞介素(IL)-1O水平可以預(yù)測膿毒癥患者預(yù)后，調(diào)節(jié)IL-1O表達(dá)水平可影響動(dòng)物預(yù)后，但完全消除IL-1O則加重器官損害并增加死亡率[Kalech man Y，Gafter U，Gal R，et al.Ant1-1L-1Otherapeutic strategy using theimmunomodula tor ASlOl in protecting mice from sepsis-1nduced death !dependenceon timing of immuno modulating intervention.J Immunol，2002，169 (I):384-392]。因此，針對炎癥反應(yīng)亢進(jìn)的抗炎治療與針對免疫抑制的免疫調(diào)節(jié)治療并舉可作為膿毒癥治療的合理方案[姚詠明，黃立鋒，林洪遠(yuǎn).進(jìn)一步提高對膿毒癥免疫機(jī)制及調(diào)理策略的認(rèn)識(shí).創(chuàng)傷外科雜志，2007，9 (I):4-7]。
[0003]盡管⑶4+Q325+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)在⑶4+T淋巴細(xì)胞中的比例為5% -10%，但其在膿毒癥誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫抑制中發(fā)揮著重要的負(fù)向免疫調(diào)控作用。叉頭翼狀轉(zhuǎn)錄因子-3(Foxp3)特征性表達(dá)于Treg內(nèi)，在其增殖分化以及發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控中具有重要意義，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平與Treg活性明顯相關(guān)。Treg主要通過T淋巴細(xì)胞毒性相關(guān)抗原-4(CTLA-4)、膜相關(guān)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-P及糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(GITR)介導(dǎo)的細(xì)胞接觸機(jī)制和分泌TGF-β、IL-10和IL-35等抑制性細(xì)胞因子發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控作用[V ignali DA, Collison LW, Workman CJ.How regulatory Tcells work.Nat Rev Immunol，2008，8 (7):523-532] 0 在膿毒癥誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫抑制中，Treg表面分子CTLA-4、TGF-β以及特征性標(biāo)志物Foxp3表達(dá)明顯增強(qiáng)，細(xì)胞因子TGF-β和IL-10等分泌明顯升高，Treg發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控 的具體機(jī)制主要是抑制效應(yīng)性T細(xì)胞增殖、促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)Thl / Th2反應(yīng)功能性漂移，Treg發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控的本質(zhì)取決于其與效應(yīng)性T細(xì)胞的數(shù)目比例[Venet F，Chung CS，Monneret G，etal.Regulatory T cell populations in sepsis and trauma.J Leukoc Biol,2008,83(3):523—535 ；Saito K，Wagatsuma T，Toyama H，e t al.Sepsis is characterized by theincreases in percentages of circulating CD4+CD25+regul atory T cells and plasmalevels of soluble CD25.Tohoku J Exp Med，2008，216(I):61-68 ；Heuer JG，Zhang T，Zhao J，et al.Adoptive transfer of in vitro stimulated CD4+C D25+regulatory Tcells increases bacterial clearance and improves survival in polymicrobialsepsis.J Immunol，2005，174(11):7141-7146 ;Choileain NN，MacConmara M，Zan g Y，et al.Enhanced regulatory T cell activity is an element of the host responsetoinjur y.J Immunol，2006，176(I):225-236 ;MacConmara MP, Maung AA, Fujimi S，etal.1ncreased CD4+CD25+T regulatory cell activity in trauma patients depressesprotective Th I immunity.Ann Surg，2006，244(4):514-523]。
[0004]神經(jīng)纖毛蛋白-1 (neuropilin-1，Nrp-1)是一種跨膜糖蛋白，早期研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和腫瘤，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育、血管生成以及腫瘤生長的作用，因此歸于軸突導(dǎo)向分子(semaphorins，Semas)受體家族和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體家方矣[Roskoski R Jr.Vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling in tumorprogression.Crit Rev One ol Hematol，2007，62(3):179-213 ;Roskoski R Jr.VEGFreceptor protein-tyrosine kinases:stru cture and regulation.Biochem BiophysRes Commun，2008，375 (3):287-291 ；Barr MP, Byr ne AM，Duffy AM，et al.A peptidecorresponding to the neuropilin-1-binding site VEGFl65induces apoptosis ofneuropilin-1-expressing breast tumour cells.Br J Cancer，2005，82(2):328-333]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Nrp-1亦具有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，Nrp-1高表達(dá)于Treg，而Tregl / Th3和效應(yīng)性T細(xì)胞則低表達(dá)或不表達(dá)，Treg表面分子Nrp-1能夠輔助性增強(qiáng)其與樹突狀細(xì)胞之間的相互作用，同時(shí)亦有研究發(fā)現(xiàn)Nrp-1有助于Treg胸腺內(nèi)發(fā)育[Weiss JM, Bilate AM，Gobert M, et al.Neuropilinlis expressed on thymus-derived natural regulatoryT cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+T reg cells.J Exp Med.2012 ；209(10):1723-1742 ；Yadav M, Louvet C, Davini D, et al.Neuropilin-1distinguishesnatural and inducib Ie regulatory T cells among regulatory T cell subsets inviv0.J Exp Med，2012，209 (10):1713-1722]。小鼠 Nrp-1 能夠協(xié)同性激活 Treg 分泌的游離態(tài)無活性潛伏肽(LAP)-TGF-β，C D4+⑶25-Nrp-1-T淋巴細(xì)胞結(jié)合Nrp-1-Fc后能夠增強(qiáng)其結(jié)合 TGF-β 的能力[Glinka Y, Prud' homme GJ.Neuropilin-1is a receptorfor transforming growth factor beta-1, activates its I atent form, and promotesregulatory T cell activity.J Leukoc Biol, 2008,84 (I):302-310]。Glinka 等通過對小鼠黑色素瘤或乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)Nrp-1的小鼠腫瘤細(xì)胞，其細(xì)胞膜相關(guān)TGF-β亦明顯上調(diào)；而Nrp-1敲除明顯抑制腫瘤的生長，初步提示Nrp-1與細(xì)胞膜相關(guān)TGF-β具有協(xié)同效應(yīng)[Glinka Y, Stoilova S,Mohammed N, et al.Neuropilin-1exerts c o-receptorfunction for TGF-beta—lon the membrane of cancer cells and enhances responsesto both latent and active TGF-beta.Carcinogenesis, 2011, 32 (4):613-621];同時(shí)我們的研究也發(fā)現(xiàn)Treg表面分子Nrp-1能夠協(xié)同性促進(jìn)膜相關(guān)TGF- β的表達(dá)[高玉雷，姚詠明，柴艷芬，等.神經(jīng)纖毛蛋白-1與膜相關(guān)轉(zhuǎn)化性生長因子_β共表達(dá)對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制功能的影響.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2013，4 =205-209] ο [0005]由于膿毒癥發(fā)病率較高，如果不能有效治療嚴(yán)重時(shí)可危及患者的生命，所以臨床上迫切需要能有效治療膿毒癥的藥物。本發(fā)明提供了一種T-肽能有效治療膿毒癥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種多肽藥物，通過調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)，緩解膿毒癥引起的細(xì)胞免疫抑制，用于治療膿毒癥。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供一種多肽藥物，通過作用于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面分子Nrp-Ι，緩解調(diào)節(jié)性T細(xì)胞負(fù)向免疫調(diào)控作用。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供一種治療膿毒癥的多肽藥物，所述多肽藥物為T-肽，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為:(Thr-Lys-Pro-Arg-AAN)4-(Lys-AAN) 2-LyS-AAn,其中 N 為自然數(shù)。
[0009]本發(fā)明提供了一種治療膿毒癥的優(yōu)選T-肽，所述T-肽的結(jié)構(gòu)式為:(Thr-Lys-Pro-Arg) 4-(L ys) 2_Lys，所述 T-肽的制備方法按照專利號(hào)為 CN200610002074.4所述的方法制備。
[0010]本發(fā)明通過上述T-肽治療膿毒癥小鼠模型，結(jié)果顯示所述的T-肽能夠夠明顯增加小鼠膿毒癥模型的生存率，改善小鼠膿毒癥模型癥狀，特別是制模后分別于12h和24h皮下給予Img / kg T-肽2次組，較其他時(shí)間點(diǎn)開始給藥2次組效果更為明顯。
[0011]本發(fā)明通過體外實(shí)驗(yàn)研究了所述T-肽治療膿毒癥的機(jī)制，結(jié)果顯示所述的T-肽能夠直接作用于效應(yīng)性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。進(jìn)一步研究表明，所述的T-肽對效應(yīng)性T細(xì)胞增殖功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，低濃度能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，而中-高濃度主要表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡。
[0012]本發(fā)明通過體外實(shí)驗(yàn)研究表明，T-肽能夠隨著濃度的增加表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞IFN- Y分泌和抑制IL-4分泌，低濃度能夠?qū)FN- y /IL-4維持在抗-⑶3 /⑶28刺激水平，而中濃度能夠?qū)FN-Y / IL-4維持在正常細(xì)胞分泌水平。
[0013]本發(fā)明通過體外實(shí)驗(yàn)研究表明，T-肽對效應(yīng)性T細(xì)胞IL-2的分泌亦具有雙向調(diào)節(jié)作用，具體表現(xiàn)為低-中濃度能夠促進(jìn)正常細(xì)胞分泌IL-2，低濃度能夠在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)下進(jìn)一步促進(jìn)IL-2分泌。
[0014]以上所述的T-肽低濃度為1μ g / ml沖濃度為10μ g/ml ;高濃度為100 μ g /ml。綜合上述T-肽對效應(yīng)性T細(xì)胞的作用，體外實(shí)驗(yàn)使用T-肽干預(yù)效應(yīng)性T細(xì)胞的劑量優(yōu)選 1-10 μ g / ml O
[0015]本發(fā)明通過體外實(shí)驗(yàn)研究表明，所述的T-肽能夠直接抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性，具體表現(xiàn)為抑制特征性標(biāo)志物Foxp3和表面分CTLA-4的表達(dá)，促進(jìn)膜相關(guān)TGF- β和Nrp-1的表達(dá)，其中中-高濃度均已經(jīng)達(dá)到最大效應(yīng)；體外研究實(shí)驗(yàn)還表明，所述的T-肽能夠明顯抑制游離T GF-β的分泌，中-高濃度效應(yīng)無明顯差異，中濃度T肽自12h便已經(jīng)開始發(fā)揮作用，24h達(dá)到最大效應(yīng)，T肽對IL-10的分泌無明顯影響，綜合上述T肽對調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的作用可以看出中-高濃度效應(yīng)無明顯差異。其中以上所述的T肽低濃度為I μ g/ml ；中濃度為10 μ g/ml ;高濃度為IOOyg / ml。
[0016]本發(fā)明通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與效應(yīng)性T細(xì)胞共培養(yǎng)可以進(jìn)一步明確，T肽能夠明顯緩解調(diào)節(jié)性T細(xì)胞負(fù)向免疫調(diào)控作用，并且這一作用至少是通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面分子Nrp-1發(fā)揮作用。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合于相應(yīng)疾病的給藥、并且恰當(dāng)?shù)乇３諸-肽活性即可。比如，對于注射用給藥系統(tǒng)，劑型可以是凍干粉。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物還包含藥學(xué)可接受的輔助劑。具體地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學(xué)可接受的輔助劑，只要其適合于相應(yīng)的給藥體系、并且恰當(dāng)?shù)乇３諸-肽活性即可。
[0019]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0021]圖1:皮下給予T-肽治療膿毒癥小鼠7天內(nèi)的生存率結(jié)果:皮下給予0.25、1和4mg / kg T-肽對膿毒癥小鼠7天內(nèi)生存率的影響，Img / kg T-肽能夠明顯增加膿毒癥小鼠生存率；
[0022]圖2:不同時(shí)間點(diǎn)皮下給予Img / kg T-肽對膿毒癥小鼠生存率的影響結(jié)果:分別于膿毒癥小鼠制模后12h和24h給藥組能夠明顯增加小鼠生存率；
[0023]圖3:T-肽對效應(yīng)性T細(xì)胞增殖率的影響:在有或者無LPS誘導(dǎo)下，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，分別給予1、10和100 μ g / ml T-肽直接干預(yù)效應(yīng)性T細(xì)胞12、24和48h后,對效應(yīng)性T細(xì)胞增殖率的影響；
[0024]3-1:12h后對效應(yīng)性T細(xì)胞增殖率的影響；3_2:24h后對效應(yīng)性T細(xì)胞增殖率的影響；3-3:48h后對效應(yīng)性T細(xì)胞增殖率的影響；[0025]A:對照組；B:抗-CD3 / CD28 ；C:抗-CD3 / CD28+T-肽(I μ g / ml) ；D:抗-CD3 /CD28+T-肽(10 μ g / ml) ；E:抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g / ml) ；F:LPS ；G:LPS+抗-CD3 / CD28 ;H:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(I μ g / ml) ；1:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(10 μ g/ml) ;J:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g / ml)；
[0026]圖4:T-肽對效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡的影響:在有或者無LPS誘導(dǎo)下，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，分別給予1、10和IOOyg / ml T-肽直接干預(yù)效應(yīng)性T細(xì)胞24h后，對效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡的影響；
[0027]A:對照組；B:抗-CD3 / CD28 ；C:抗-CD3 / CD28+T-肽(I μ g / ml) ；D:抗-CD3 /CD28+T-肽(10 μ g/ml) ；E:抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g / ml) ；F:LPS ；G:LPS+抗-CD3 /CD28 ；H:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(I μ g / ml) ；1:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(10μ g /ml) ;J:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g / ml)；
[0028]圖5:T-肽對效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡影響的凋亡率流式細(xì)胞儀分析圖；
[0029]圖6:1'-肽對效應(yīng)性1'細(xì)胞分泌正^￥、11^-2和11^-4功能的影響:在有或者無LPS誘導(dǎo)下，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，分別給予1、10和IOOyg / mlT-肽直接干預(yù)效應(yīng)性T細(xì)胞24h后，對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IFN- Y、IL-2和IL-4功能的影響；
[0030]6-1:對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IFN- Y功能的影響；6_2:對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IL_2功能的影響；6_3:對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IL-4功能的影響； [0031]A:對照組；B:抗-CD3 / CD28 ；C:抗-CD3 / CD28+T-肽(I μ g / ml) ；D:抗-CD3 /CD28+T-肽(10 μ g / ml) ；E:抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g / ml) ；F:LPS ；G:LPS+抗-CD3 / CD28 ;H:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(I μ g / ml) ；1:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(10 μ g / ml) ;J:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g/ml)；
[0032]圖7:T-肽對效應(yīng)性T細(xì)胞IFN- Y /IL_4平衡的影響；
[0033]A:對照組；B:抗-CD3 / CD28 ；C:抗-CD3 / CD28+T-肽(I μ g / ml) ；D:抗-CD3 /CD28+T-肽(10 μ g/ml) ；E:抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g / ml) ；F:LPS ；G:LPS+抗-CD3 /CD28 ;H:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(I μ g / ml) ；1:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(10 μ g/ml) ;J:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g/ml)；
[0034]圖8:100 μ g / ml T-肽對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IFN- Y的影響:在有或者無LPS誘導(dǎo)下，使用抗-C D3 /⑶28為共刺激分子，給予IOOyg / ml T-肽直接干預(yù)效應(yīng)性T細(xì)胞12,24和48h后，對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IFN- Y的影響；
[0035]8-1:抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g/ml)對效應(yīng)性 T 細(xì)胞分泌 IFN- Y 的影響；8_2:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g / ml)對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IFN- Y的影響；
[0036]圖9:10 μ g / ml T-肽對對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IL_2的影響:在無LPS誘導(dǎo)下，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，給予10 μ g / ml T-肽直接干預(yù)效應(yīng)性T細(xì)胞12、24、48和72h后，對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IL-2的影響；
[0037]圖10:T-肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特征性標(biāo)志物Foxp3、表面分子CTLA-4、膜相關(guān)TGF- β和表面分子Nrp-1表達(dá)的影響:在有或者無LPS誘導(dǎo)下，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，分別給予1、10和100 μ g / ml T-肽直接干預(yù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞24h后，對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特征性標(biāo)志物Foxp3、表面分子CTLA-4、膜相關(guān)TGF-β和表面分子Nrp-1表達(dá)的影響；
[0038]10-1:對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特征性標(biāo)志物Foxp3表達(dá)的影響；10-2:對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面分子CT LA-4表達(dá)的影響；10-3:對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞膜相關(guān)TGF-β表達(dá)的影響；10_4:對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面分子Nrp-1表達(dá)的影響；
[0039]A:對照組；B:抗-CD3 / CD28 ；C:抗-CD3 / CD28+T-肽(I μ g / ml) ；D:抗-CD3 /CD28+T-肽(10 μ g/ml) ；E:抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g / ml) ；F:LPS ；G:LPS+抗-CD3 /CD28 ;H:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(lyg / ml) ;1:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(10 μ g /ml) ;J:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g / ml)；
[0040]圖11:Τ-肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特征性標(biāo)志物Foxp3表達(dá)率影響的流式分析圖；
[0041]圖12:T-肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面分子CTLA-4表達(dá)率影響的流式分析圖；
[0042]圖13:Τ-肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞膜相關(guān)TGF- β表達(dá)率影響的流式分析圖；
[0043]圖14:Τ-肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面分子Nrp-1表達(dá)率影響的流式分析圖；
[0044]圖15:Τ-肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌游離TGF- β和IL-10的影響:在有或者無LPS誘導(dǎo)下，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，分別給予1、10和IOOyg / ml T-肽直接干預(yù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞24h后，對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌游離TGF-β和IL-10的影響；
[0045]15-1:對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌游離TGF- β的影響；15_2:對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌IL-10的影響；
[0046]A:對照組；Β:抗-CD3 / CD28 ；C:抗-CD3 / CD28+T-肽(I μ g / ml) ；D:抗-CD3 /CD28+T-肽(10 μ g / ml) ；E:抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g / ml) ；F:LPS ；G:LPS+抗-CD3 / CD28 ；H:LPS+ 抗-CD3 / CD28+T-肽(I μ g/ml) ；I:LPS+ 抗-CD3 / CD28+T-肽(10 μ g/ml) ;J:LPS+抗-CD3 / CD28+T-肽(100 μ g / ml)；
[0047]圖16:10 μ g/ml T-肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌游離TGF- β的影響:在LPS誘導(dǎo)下，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，給予10 μ g/ml T-肽直接干預(yù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞12、24和48h后，對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌游離TGF- β的影響；
[0048]圖17:Τ-肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)性T細(xì)胞增殖功能的影響，以及抗-Nrp-1干預(yù):將調(diào)節(jié)性T細(xì)胞使用10 μ g/ml的抗-Nrp-1封閉Ih后，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，繼續(xù)予以IOyg / ml T-肽直接干預(yù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞24h，分別洗滌各組，使用抗-⑶3 /CD28為共刺激分子，各組與正常的效應(yīng)性T細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，觀察對效應(yīng)性T細(xì)胞增殖功能的影響；
[0049]A:對照組；B:抗-CD3 / CD28 ；C:抗-CD3 / CD28+Treg ；D:抗-CD3 /CD28+Treg+T-肽；E:抗-CD3 / CD28+Treg+ 抗-Nrp-1 ；F:抗-CD3 / CD28+Treg+抗-Nrp-1+T-肽；
[0050]圖18:T-肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡的影響，以及抗-Nrp-1干預(yù):將調(diào)節(jié)性T細(xì)胞使用10 μ g / ml的抗-Nrp-1封閉Ih后，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，繼續(xù)予以IOyg / ml T-肽直接干預(yù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞24h，分別洗滌各組，使用抗-⑶3 /CD28為共刺激分子，各組與正常的效應(yīng)性T細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，觀察對效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡的影響；
[0051] A:對照組；B:抗-CD3 / CD28 ;C:抗-CD 3 / CD28+Treg ;D:抗-CD 3 /CD28+Treg+T-肽；E:抗-CD3 / CD28+Treg+ 抗-Nrp-1 ；F:抗-CD3 / CD28+Treg+抗-Nrp-1+T-肽；
[0052]圖19:T-肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡的影響的流式分析圖；[0053]圖20:T-肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)節(jié)效應(yīng)性T細(xì)胞分泌功能的影響:將調(diào)節(jié)性T細(xì)胞使用10 μ g/ml的抗-Nrp-1封閉Ih后，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，繼續(xù)予以IOyg / ml T-肽直接干預(yù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞24h，分別洗滌各組，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，各組與正常的效應(yīng)性T細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，觀察對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IFN- Y、IL-2和IL-4的影響；
[0054]20-1:對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IFN- Y的影響；20_2:對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IL_2的影響；20-3:對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IL-4的影響；
[0055]A:對照組；B:抗-CD3 / CD28 ；C:抗-CD3 / CD28+Treg ；D:抗-CD3 /CD28+Treg+T-肽；E:抗-CD3 / CD28+Treg+ 抗-Nrp-1 ；F:抗-CD3 / CD28+Treg+抗-Nrp-1+T-肽；
[0056]圖21:在T-肽干預(yù)下調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對效應(yīng)性T細(xì)胞IFN- Y /IL_4平衡的影響；
[0057]A:對照組；B:抗-CD3 / CD28 ；C:抗-CD3 / CD28+Treg ；D:抗-CD3 /CD28+Treg+T-肽；E:抗-CD3 / CD28+Treg+ 抗-Nrp-1 ；F:抗-CD3 / CD28+Treg+抗-Nrp-1+T-肽；
【具體實(shí)施方式】
[0058]下面詳細(xì)描述本 發(fā)明的實(shí)施例。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明以下實(shí)施例所述的T-肽，選擇優(yōu)選的T-肽,其結(jié)構(gòu)為:(Thr-Lys-Pro-Arg)4-(Lys)2-Lys,所述T-肽的制備方法按照專利號(hào)為CN200610002074.4所述的方法制備。
[0059]實(shí)施例1:T肽對小鼠膿毒癥模型生存率的影響
[0060]1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑
[0061]雄性BALB / c小鼠，6_8w，20+2g,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所(動(dòng)物合格證號(hào):SCXK京2009-0007)。適應(yīng)性飼養(yǎng)I周，自由進(jìn)食水，室溫25 °C，晝夜節(jié)律為12h。
[0062]鹽酸氯胺酮注射液(上海第一生化藥業(yè)公司，中國):速眠新II注射液(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所研制，中國):0.9%生理鹽水(山東魯欣藥業(yè)集團(tuán)，中國)體積比為
2: 2.5: 4.5。T-肽:lmg /支，①將4mg T-肽溶于IOml 0.9%生理鹽水內(nèi)，充分混勻，用于4mg / kg組；②取①溶液2.5ml,定容到10ml,用于Img / kg組；③取②溶液2.5ml,定容到10ml，用于0.25mg / kg組。根據(jù)電子秤測量結(jié)果給予相應(yīng)體積的藥物，假傷組和盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)組給予相應(yīng)體積的生理鹽水。
[0063]2.給藥方法:
[0064]①麻醉藥物按照2ml / kg方式后肢外側(cè)肌肉麻醉。
[0065]②假傷組以及通過CLP制作的小鼠膿毒癥模型均于造模完成后按照40ml / kg給予0.9%生理鹽水，防止失血性休克發(fā)生。
[0066]③研究T-肽量效關(guān)系時(shí)，T-肽治療組分別于制模后以及制模后121!給予0.25、1和4mg/kg T-肽2次，采用頸背部皮下給藥方式，并且第一次給藥時(shí)應(yīng)該避開給予0.9%生理鹽水部位；研究T-肽時(shí)效關(guān)系時(shí)，T-肽起始給藥時(shí)間分別是制模后O、12和24h，12h后各組追加給藥I次，共給藥2次。
[0067]3.實(shí)驗(yàn)步驟:[0068]①量效分析:將126只雄性BALB / c小鼠分為:對照組、假傷組、CLP組以及T-肽(0.25、I和4mg / kg)組，各組21只。將CLP組與T-肽組按照2min /只的速度制作CLP模型，假傷組僅翻動(dòng)腸管。按照相應(yīng)體重給予藥物。放回鼠籠內(nèi)，給予充足食水，保持室溫25°C。每12h觀察一次小鼠生存情況。不同劑量T-肽對小鼠7天內(nèi)生存率的影響見圖1，Img / kg T-肽能夠明顯增加膿毒癥小鼠生存率。
[0069]②時(shí)效分析:將120只雄性BALB / c小鼠分為:對照組、假傷組、CLP組以及T肽(0,12和24h開始給藥)組，各組20只。將CLP組與T-肽組按照2min /只的速度制作CLP模型，假傷組僅翻動(dòng)腸管。按照相應(yīng)體重給予藥物。放回鼠籠內(nèi)，給予充足食水，保持室溫25°C。每12h觀察一次小鼠生存情況。不同時(shí)間點(diǎn)給予T-肽對小鼠7天內(nèi)生存率的影響見圖2，Img / kg T-肽于12h和24h各給藥I次組能夠明顯增加膿毒癥小鼠生存率。
[0070]4.結(jié)果評(píng)價(jià):
[0071]通過量效分析表明Img / kg T-肽較CLP組和其他給藥組能夠明顯改善小鼠膿毒癥模型生存率以及小鼠癥狀。進(jìn)一步對Img / kg給藥時(shí)間的研究發(fā)現(xiàn)，于CLP后12h開始給藥效果最佳。
[0072]實(shí)施例2:T肽對效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞活性的影響
[0073]1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑
[0074]雄性BALB/c小鼠，6-8w, 20 ± 2g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所(動(dòng)物合格證號(hào):SCXK京2009-0007)。適應(yīng)性飼養(yǎng)I周，自由進(jìn)食水，室溫25 °C，晝夜節(jié)律為12h。
[0075]Ohlmg /支，①將Img T-肽溶于含有10%胎牛血清(FBS，Hyclone公司，美國)RP M1-1640培養(yǎng)基(北京索萊寶公司，中國)內(nèi)，充分混勻，用于IOOyg / ml組；②?、偃芤?00μ 1，定容到1ml，用于IOyg / ml組；③?、谌芤?00μ 1，定容到1ml，用于1μ g /ml組。根據(jù)各組需要，使用含有10%胎牛血清RPM1-1640培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋到所需濃度。
[0076]純化的抗小鼠-⑶3 /⑶28:eBioscience公司，美國:根據(jù)需要將純化的抗小鼠-⑶3配制成5 μ g / ml，將純化的抗小鼠-⑶28配制成2 μ g / ml。
[0077]LPS(來源于大腸桿菌0111:B4):Sigma公司，美國:根據(jù)需要配置終體積為IOOng / ml 溶液。
[0078]CCK-8 (Cell counting kit-8, 500test):dojindo 公司，日本。
[0079]Annexin-V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(IOOtest,內(nèi)含 Iml Annexin-V-FITC、500 μ I PI (Propidium iodide)以及 binding buffer 和 PBS 各 80ml)北京寶賽生物技術(shù)有限公司，中國。小鼠CD4+CD25+Treg分離試劑盒(含有生物素-抗體雞尾酒、抗生物素磁珠、藻紅蛋白(Phy coerythrin, PE)-抗 CD25、抗 PE 磁珠):Miltenyi Biltec GmbH 公司，德國。
[0080]IFN- Y、IL-4和IL-2ELISA試劑盒:上海依科賽公司，中國。
[0081]2.實(shí)驗(yàn)步驟:
[0082]①斷頸處死小鼠，無菌條件下分離脾臟，使用小鼠CD4+CD25+Treg分離試劑盒分離小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞。②將效應(yīng)性T細(xì)胞按照I X IO6 / ml重懸于含有10%胎牛血清1?^1-1640培養(yǎng)基內(nèi)，按照2\105 /孔種植于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，終體積200 μ I。③將細(xì)胞分為對照組、抗⑶3 /⑶28組、T-肽(1、10和100μ g / ml)組，有或者無LPS (100ng /ml)誘導(dǎo)，各組重復(fù)孔5個(gè)。④培養(yǎng)24h后收集部分上清，用于檢測細(xì)胞因子IFN-Y、IL-4和IL-2，細(xì)胞用于檢測增值率和凋亡率。不同劑量T-肽對效應(yīng)性T細(xì)胞增值率、凋亡率以及分泌功能的影響見圖3-9:
[0083]T-肽對效應(yīng)性T細(xì)胞增殖功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，具體表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)細(xì)胞增殖，而中-高濃度抑制細(xì)胞增殖，這一作用從12h便已經(jīng)開始，能夠持續(xù)到24h(圖3)；
[0084]在有或者無LPS誘導(dǎo)下，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，分別給予1、10和IOOyg / m I T-肽直接干預(yù)效應(yīng)性T細(xì)胞24h后，對效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示中-高濃度T-肽能夠明顯誘導(dǎo)效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡，其凋亡率明顯增加(圖4、5)；
[0085]在有或者無LPS誘導(dǎo)下，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，分別給予1、10和100 μ g / m I T-肽直接干預(yù)效應(yīng)性T細(xì)胞24h后，對效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞分泌IFN- y、IL-2和IL-4功能的影響，結(jié)果顯示不同濃度的T-肽能夠促進(jìn)IFN-Y的分泌，抑制IL-4的分泌；T-肽對IL-2的分泌具有雙向調(diào)節(jié)作用，具體表現(xiàn)為低-中濃度能夠促進(jìn)正常細(xì)胞分泌IL-2，而高濃度能夠抑制IL-2分泌，在LPS誘導(dǎo)下，中-高濃度均能抑制IL-2分泌(圖6); [0086]中濃度的T肽能夠?qū)⑿?yīng)性T細(xì)胞IFN- Y /IL-4平衡維持在細(xì)胞正常水平(圖7);高濃度的T肽自12h便能夠明顯促進(jìn)IFN-Y的分泌，這一效應(yīng)能夠持續(xù)到48h(圖8)；
[0087]在無LPS誘導(dǎo)下，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，給予10 μ g / ml T-肽直接干預(yù)效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞12、24、48和72h后，對效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IL-2的影響；結(jié)果顯示中濃度能夠促進(jìn)正常細(xì)胞IL-2的分泌，這一作用自12h便已經(jīng)開始，能夠持續(xù)到72h(圖9)。
[0088]3.結(jié)果評(píng)價(jià):
[0089]T肽有促進(jìn)效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)IFN- Y、IL-2分泌，抑制IL-4分泌，維持IFN- Y / IL-4平衡的作用，其中低-中濃度效果較可，盡管中濃度有促進(jìn)效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞凋亡作用。其中所述T肽低濃度為Iyg / ml沖濃度為IOyg / ml ;高濃度為IOOyg /ml ο
[0090]實(shí)施例3:T肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性的影響
[0091]1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑
[0092]雄性BALB / c小鼠，6_8w，20±2g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所(動(dòng)物合格證號(hào):SCXK京2009-0007)。適應(yīng)性飼養(yǎng)I周，自由進(jìn)食水，室溫25 °C，晝夜節(jié)律為12h。
[0093]T-肽:lmg/支，①將Img T-肽溶于含有10%胎牛血清(FBS，Hyclone公司，美國)RP M1-1640培養(yǎng)基(北京索萊寶公司，中國)內(nèi)，充分混勻，用于100μ g/ml組；②?、偃芤?00μ 1，定容到1ml，用于IOyg / ml組；③?、谌芤?00μ 1，定容到1ml，用于1μ g /ml組。根據(jù)各組需要，使用含有10%胎牛血清RPM1-1640培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋到所需濃度。
[0094]純化的抗小鼠-⑶3 /⑶28:eBioscience公司，美國:根據(jù)需要將純化的抗小鼠-⑶3配制成5 μ g/ml，將純化的抗小鼠-⑶28配制成2 μ g/ml。
[0095]LPS(來源于大腸桿菌0111:B4):Sigma公司，美國:根據(jù)需要配置終體積為IOOng / ml 溶液。
[0096]小鼠⑶4+CD25+Treg分離試劑盒(含有生物素-抗體雞尾酒、抗生物素磁珠、藻紅蛋白(Phycoerythrin, PE)-抗 CD25、抗 PE 磁珠):Miltenyi Biltec GmbH 公司，德國。
[0097]APC-抗小鼠/大鼠Nrp-1:R&D Systems公司，美國；FITC_抗小鼠/大鼠Foxp3 ；eBioscience公司，美國;APC_抗小鼠TGF- β:R&D Systems公司，美國；FITC_抗小鼠CD 152 / CTLA-4: SouthemBiotech 公司，美國。[0098]TGF- β和IL-10ELISA試劑盒:上海依科賽公司，中國。
[0099]2.實(shí)驗(yàn)步驟:
[0100]①同于實(shí)施例2。②將調(diào)節(jié)性T細(xì)胞按照IX IO6 / ml重懸于含有10%胎牛血清RPM1-1640培養(yǎng)基內(nèi)，按照2 X IO5 /孔種植于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，終體積200 μ I。③將細(xì)胞分為對照組、抗 C D3 / CD28 組、T-肽(1、10 和 IOOyg / ml)組，有或者無 LPS (IOOng / ml)誘導(dǎo)，各組重復(fù)孔5個(gè)。④培養(yǎng)24h后收集部分上清，用于檢測細(xì)胞因子TGF-β和IL-10，細(xì)胞用于檢測表面分子CTLA-4、TGF-β、Nrp-1和特征性標(biāo)志物Foxp3。不同劑量T-肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性分子表達(dá)和分泌功能的影響見圖10-16:
[0101]在有或者無LPS誘導(dǎo)下，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，分別給予1、10和IOOyg / m I T-肽直接干預(yù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞24h后，對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面分CTLA-4、膜相關(guān)TGF-β、Nr p-1和特征性標(biāo)志物Foxp3表達(dá)的影響，結(jié)果顯示不同濃度的T肽能夠抑制CTLA-4、Foxp3的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)膜相關(guān)TGF-β、Nrp-1的表達(dá)，其中中-高濃度作用最強(qiáng)(圖 10-14)；
[0102]在有或者無LPS誘導(dǎo)下，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，分別給予1、10和IOOyg / m I T-肽直接干預(yù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞24h后，對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌游離TGF- β和IL-10的影響，結(jié)果顯示T-肽能夠抑制游離TGF-β的分泌，其中高濃度對正常細(xì)胞作用最強(qiáng)，中-高濃度對LPS誘導(dǎo)下的細(xì)胞效應(yīng)無明顯差異，而不同濃度T-肽對IL-10的分泌無明顯影響(圖15);
[0103]在LPS誘導(dǎo)下，使用抗-⑶3 /⑶28為共刺激分子，給予10 μ g/1 T-肽直接干預(yù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞12、24和48h后， 對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌游離TGF- β的影響，結(jié)果顯示T-肽自12h便能明顯抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌TGF-β，這一效應(yīng)能夠持續(xù)到24h(圖16)。
[0104]其中所述T肽低濃度為I μ g/ml沖濃度為IOyg / ml ;高濃度為IOOyg / ml。
[0105]3.結(jié)果評(píng)價(jià):
[0106]T-肽能夠明顯抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性特征性標(biāo)志物Foxp3和CTLA-4表達(dá)以及抑制其游離TGF- β分泌，同時(shí)能夠促進(jìn)表面分子Nrp-1和膜相關(guān)TGF- β表達(dá)，中-高濃度效應(yīng)較強(qiáng)，其中中濃度已經(jīng)明顯抑制其活性特征性標(biāo)志物的表達(dá)，然而并不能明顯影響IL-10的分泌。
[0107]實(shí)施例4:Τ肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞負(fù)向免疫調(diào)控作用的影響
[0108]1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑
[0109]雄性BALB / c小鼠，6_8w，20±2g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所(動(dòng)物合格證號(hào):SCXK京2009-0007)。適應(yīng)性飼養(yǎng)I周，自由進(jìn)食水，室溫25 °C，晝夜節(jié)律為12h。
[0110]T-肽:lmg /支，①將lmg T-肽溶于含有10%胎牛血清(FBS，Hyclone公司，美國)RP M1-1640培養(yǎng)基(北京索萊寶公司，中國)內(nèi)，充分混勻；②?、偃芤?00μ 1，定容到1ml，用于10μ g / ml組。
[0111]純化的抗小鼠-⑶3 /⑶28:eBioscience公司，美國:根據(jù)需要將純化的抗小鼠-⑶3配制成5 μ g/ml，將純化的抗小鼠-⑶28配制成2 μ g/ml。
[0112]純化的抗小鼠/大鼠Nrp-1:R & D Systems公司，美國:根據(jù)需要配置10 μ g/ml試劑。
[0113]CCK-8 (Cell counting kit-8, 500test):dojindo 公司，日本。[0114]Annexin-V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(lOOtest,內(nèi)含 Iml Annexin-V-FITC、500 μ I PI (Propidium iodide)以及 binding buffer 和 PBS 各 80ml)北京寶賽生物技術(shù)有限公司，中國。小鼠CD4+CD25+Treg分離試劑盒(含有生物素-抗體雞尾酒、抗生物素磁珠、藻紅蛋白(Phy coerythrin, PE)-抗 CD25、抗 PE 磁珠):Miltenyi Biltec GmbH 公司，德國。
[0115]IFN- Y、IL-4和IL-2ELISA試劑盒:上海依科賽公司，中國。
[0116]2.實(shí)驗(yàn)步驟:
[0117]①同于實(shí)施2部分。②將調(diào)節(jié)性T細(xì)胞按照IXlO6 / ml重懸于含有10%胎牛血清RPM1-1640培養(yǎng)基內(nèi)，使用IOyg/ ml抗-Nrp-1封閉lh，按照2 X IO5 /孔種植于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，終體積200 μ I。進(jìn)一步使用10 μ g / ml T-肽刺激24h，收集細(xì)胞，按照1:1與效應(yīng)性T細(xì)胞共培養(yǎng)24h。③將細(xì)胞分為對照組、抗⑶3 /⑶28組、抗⑶3 /⑶28+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞組、抗⑶3 /⑶28+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞+T-肽組各組重復(fù)孔5個(gè)。④培養(yǎng)24h后收集部分上清，用于檢測細(xì)胞因子IFN-Y、IL-4和IL-2，細(xì)胞用于檢測增值率和凋亡率。IOyg /ml T-肽對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞負(fù)向免疫調(diào)控作用的影響見圖17-21:
[0118]調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠明顯抑制效應(yīng)性T細(xì)胞增殖，而經(jīng)10 μ g / ml T-肽干預(yù)后，能夠明顯緩解這一抑制效應(yīng)；T-肽干預(yù)經(jīng)抗-Nrp-1封閉后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不能發(fā)揮這一作用(圖17);
[0119]調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠明顯促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡，而經(jīng)IOyg / ml -T肽干預(yù)后，能夠緩解這一促進(jìn)效應(yīng)；T-肽 干預(yù)經(jīng)抗-Nrp-1封閉后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不能發(fā)揮這一作用，但是較正常細(xì)胞仍有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能存在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞凋亡(圖18);
[0120]調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠明顯抑制效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IFN- Y和IL-2，而經(jīng)10 μ g / mlT-肽干預(yù)后，能夠緩解這一抑制效應(yīng)；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠進(jìn)一步促進(jìn)IL-4的分泌，而經(jīng)IOug / ml T-肽干預(yù)后，這一作用有所增強(qiáng)；T肽干預(yù)經(jīng)抗-Nrp-1封閉后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不能發(fā)揮上述調(diào)節(jié)作用(圖20):
[0121]經(jīng)IOyg / ml T-肽干預(yù)后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠恢復(fù)效應(yīng)性T細(xì)胞IFN-Y / IL-4平衡，而T-肽干預(yù)經(jīng)抗-Nrp-1封閉后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不能發(fā)揮這一作用(圖21)。
[0122]3.結(jié)果評(píng)價(jià):
[0123]T肽能夠緩解調(diào)節(jié)性T細(xì)胞負(fù)向免疫調(diào)控作用，是通過結(jié)合調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面分子Nrp-1發(fā)揮這一調(diào)節(jié)作用
[0124]在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
[0125]盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【權(quán)利要求】
1.一種T-肽在制備治療膿毒癥藥物中的應(yīng)用，其中所述的T-肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)為(Thr-Lys-Pro-Arg-AAN)4-(Lys-AAN)2-Lys-AAN,其中 N 為自然數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的T-肽其化學(xué)結(jié)構(gòu)為(Thr-Lys-Pro-Arg) 4_ (Lys) 2-Lys。
3.權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的T-肽在制備雙向調(diào)節(jié)效應(yīng)性T細(xì)胞增殖試劑中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的T-肽在制備促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IFN-Y試劑中應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的T-肽在制備抑制效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IL-4試劑中應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的T-肽在制備雙向調(diào)節(jié)效應(yīng)性T細(xì)胞分泌IL-2的試劑中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的T-肽在制備抑制效應(yīng)性T細(xì)胞活性試劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的T-肽在制備抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性試劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的T-肽在制備抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)Foxp3、CTLA-4和分泌TGF- β試劑中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的T-肽在制備促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面分子Nrp-1和膜相關(guān)TGF- β表達(dá)試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K38/16GK103961685SQ201410011963
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】姚詠明, 高玉雷, 祝筱梅, 韓蘇 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院