包含鍶化合物的纖維蛋白組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含鍶化合物的纖維蛋白組合物。本發(fā)明一般地涉及用于骨愈合和骨再生的組合物，其為粘彈性水凝膠凝膠或液體制劑形式，其包含纖維蛋白原、凝血酶和無機(jī)組分，所述無機(jī)組分包括含鍶(Sr)化合物和/或可能包括另一種金屬諸如含鈣的化合物。含鍶化合物可以結(jié)晶粒子形式被溶于凝血酶溶液中或被加入到凝結(jié)中。當(dāng)混合各組分時，發(fā)生膠凝，從而形成基質(zhì)。該組合物還可包含用作增塑劑的含碘化合物。
【專利說明】包含鍶化合物的纖維蛋白組合物
[0001]本申請為國際申請PCT/US2008/060720于2009年10月23日進(jìn)入中國國家階段、申請?zhí)枮?00880013518.1、發(fā)明名稱為“包含鍶化合物的纖維蛋白組合物”的分案申請。
[0002]本專利申請要求被并入本文作為參考的2007年4月23日提交的美國臨時專利申請N0.60/925, 716的優(yōu)先權(quán)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明一般地涉及用于骨愈合和骨再生的組合物，特別地涉及粘彈性水凝膠凝膠或液體制劑，其包含纖維蛋白原、凝血酶和無機(jī)組分，所述無機(jī)組分包括含鍶(Sr)的化合物和/或可能包括另一種金屬諸如鈣。含鍶化合物可以結(jié)晶粒子形式被溶于凝血酶溶液中或被加入到組合物中。當(dāng)混合各組分時，發(fā)生膠凝，從而形成基質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0004]目前在骨愈合和再生中的實(shí)踐是對骨空隙填充骨移植物(自體移植物或同種異體移植物)、骨水泥諸如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或可注射型或可移植型的鈣鹽空隙填充劑。自體移植物是用于這一應(yīng)用的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是存在與供體組織受限、創(chuàng)傷、感染和罹病有關(guān)的問題。同種異體移植物存在許多問題，包括疾病傳播和產(chǎn)生免疫性的風(fēng)險。自體移植物和同種異體移植物二者都由于二次重建而表現(xiàn)出生物學(xué)性質(zhì)或機(jī)械性質(zhì)喪失。正是這些限制使得在骨移植物的可供選擇的材料方面迅速產(chǎn)生興趣(Parikh SN.2002 ;J.Postgrad.Med.48:142-148)。
[0005]PMMA是不可再吸收的聚合物材料。在其聚合期間，未反應(yīng)的單體、催化劑和低分子量低聚物被截留在該聚合物中。這些化學(xué)品具有從所述材料浸出的可能性，導(dǎo)致局部的細(xì)胞毒性和免疫學(xué)應(yīng)答。PMMA聚合是高度放熱的，可能引起熱壞死。這一放熱還限制了 PMMA被并入任何藥理學(xué)試劑或化療劑的能力。PMMA從缺損處滲漏可以導(dǎo)致非常嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括鄰近結(jié)構(gòu)受壓(要求進(jìn)一步手術(shù))和/或栓塞。
[0006]處于納米水平(10_9m)的骨基質(zhì)由其中包埋有微小的鈣鹽結(jié)晶的膠原纖維組成。為了模擬骨的天然組成，鈣鹽經(jīng)常被用于骨的修復(fù)。有許多已知的基于鈣鹽的“可注射型空隙填充劑”。與鈣鹽骨水泥有關(guān)的一個主要并發(fā)癥是它們要求在體內(nèi)固化，這通常通過化學(xué)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。因此，有可能損害被并入到該填充劑中的生物學(xué)物質(zhì)諸如細(xì)胞和藥理學(xué)試劑。另外，如果填充劑“流動性”太強(qiáng)，則其可從缺損處泄漏到鄰接空間內(nèi)，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)受壓并可能發(fā)生栓塞。從與關(guān)節(jié)鄰近的缺損處的滲漏可能削弱關(guān)節(jié)的功能。
[0007]鈣磷酸(CP)鹽羥基磷灰石(HA結(jié)構(gòu)Caltl (PO4) 6 (OH) 2)最接近于骨的礦物相并且可在實(shí)驗(yàn)室中容易地被合成。還可能制備其中其它的陽離子(例如鎂、鈉和鍶)或陰離子(氯離子、氟離子和碳酸根)被置換進(jìn)入結(jié)晶中的HA。與本發(fā)明有關(guān)的是，用鍶(Sr2+)離子置換CP結(jié)晶中的鈣(Ca2+)離子。鍶和鈣二者都屬于堿土元素，并且彼此相似，因?yàn)轶w內(nèi)超過99%的總的鈣和鍶集中于骨內(nèi)。鍶是唯一被鑒定的與骨強(qiáng)度具有積極關(guān)系的元素，即，骨的機(jī)械強(qiáng)度隨著鍶含量的增加而增加。鍶的可能的治療效果已被知曉有一段時間了。然而，在文獻(xiàn)中暗示了這一治療可能性由于常態(tài)穩(wěn)定的Sr2+(84Sr、86Sr、87Sr和88Sr)及其放射性同位素(85Sr、86mSr、87Sr 和 88Sr)的混亂而被忽視。Dahl 等人,Bone ;28 (4),第 446-453 頁。最近，鍶的治療效果已經(jīng)突顯，并且有研究顯示了鍶鹽在體外(甚至在低劑量下)和體內(nèi)刺激骨形成并抑制骨吸收，這通過在嚙齒類和骨質(zhì)疏松患者中的骨組織形態(tài)計量學(xué)進(jìn)行評價得到。Ferraro 等人，1983;Calcif Tissue Int.35:258-60。
[0008]鍶的強(qiáng)大的同化代謝和抗吸收效果已經(jīng)導(dǎo)致開發(fā)新型的抗骨質(zhì)疏松藥物。口服活性藥物(活性成分雷奈酸鍶)已顯示降低椎骨骨折的風(fēng)險并增加骨的礦物密度。MeunierPJ等人，2004;N Engl J Med.350 (5):459-68。該藥物由與兩個鍶原子結(jié)合的一分子雷奈酸組成。雷奈酸基團(tuán)被選擇作為載體是因?yàn)槠湓谖改c道中被充分耐受。在內(nèi)臟中，鍶離子從雷奈酸基團(tuán)中被釋放，導(dǎo)致鍶被內(nèi)臟粘膜所吸收。當(dāng)被吸收時，鍶對骨組織表現(xiàn)出強(qiáng)的親合性，并且被并入羥基磷灰石的最外層的水合層中。更小的量與骨結(jié)晶成為一體，其中鍶:鈣原子的比不超過1:10，從而使得結(jié)晶的形成和物理化學(xué)性質(zhì)都不由于鍶的存在而發(fā)生改變。雷奈酸鍶被提議是使骨形成與骨吸收相脫離的首選藥物治療。在體外，雷奈酸鍶增加膠原蛋白和非膠原蛋白的蛋白質(zhì)合成，增強(qiáng)前成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞分化，降低破骨細(xì)胞作用和增加破骨細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡。在動物模型中，骨密度的增加與生物力學(xué)骨強(qiáng)度的增加密切相關(guān)。在大鼠模型中，雷奈酸鍶增加骨質(zhì)量并改善微體系結(jié)構(gòu)和骨幾何學(xué)，導(dǎo)致骨抗性增加。在切除卵巢的大鼠(用于骨質(zhì)疏松癥的模型)中，雷奈酸鍶降低骨吸收，但是保持高度的骨形成。骨強(qiáng)度的所有的決定因素都受到雷奈酸鍶治療的積極影響(骨質(zhì)量，大小，微體系結(jié)構(gòu)，和固有的骨組織質(zhì)量)。骨機(jī)械性質(zhì)增加的特征為最大負(fù)荷增加，而且斷裂能顯著改善，這基本上是由于可塑能(plastic energy)增加所致。Kendler, 2006;Curr.0steopor.Rep.4(I):34-9 ；Marie,2006;Curr.0pin.Rheum.18Suppll: SI1-5 ；Ammann, 2006，Bone.38 (2Suppll): 15_8。盡管不完全了解銀的作用方式，但是成骨作用的增加被認(rèn)為與在1，25 (OH) 2維生素D的循環(huán)水平中或在甲狀旁腺激素效果中的改變無關(guān)。在許多絕經(jīng)后女性中，銀已經(jīng)顯示出在所有部位具有抗骨折效力。Close等人,2006;Expert OpinPharmacother7(12):1603-15。
[0009]局部施用含鍶骨水泥形式的鍶還被其它研究人員所考察:Wong，Ch1-Tak, 2004, 〃Osteoconduction and osseointegration of a strontium-containing hydroxyapatitebioactive bone cement:1n vitro and in vivo investigations.Publisher!Universityof Hong Kong" (Pokfulam Road, Hong Kong) ;Zhao 等人，2004; J Biomed Mater Res B ApplBiomater.69(1):79-86。非吸收性Sr-HA骨水泥主要由含鍶羥基磷灰石(Sr-HA)填充劑和雙酚A 二縮水甘油基醚二甲基丙烯酸酯(BIS-GMA)樹脂組成。有人提出該材料可被用于椎骨成型術(shù)，因?yàn)槠淇梢酝ㄟ^注射被遞送并且比PMMA具有更好的物理/機(jī)械性質(zhì)。含鍶羥基磷灰石(Sr-HA)骨水泥在體外和體內(nèi)都被證明具有生物活性。在體外，其似乎比非摻雜型羥基磷灰石(HA)骨水泥在細(xì)胞粘附(Sa0S-2)和骨礦化方面更有效。在體內(nèi)，Sr-HA骨水泥與天然骨結(jié)合。
[0010]在美國專利5，736，132和5，549，904中，其二者都作為參考被并入本文，據(jù)說補(bǔ)充有轉(zhuǎn)谷酰胺酶的粘附性組織粘合劑優(yōu)選包含處在約0.5mM到約IOOmM范圍內(nèi)的二價金屬離子諸如鈣和鍶，pH為約7.0 到約8.5。其要求保護(hù)補(bǔ)充有轉(zhuǎn)谷酰胺酶的粘合劑，其可被用于在關(guān)節(jié)折斷、軟骨缺損、淺表軟骨缺損、全厚缺損，骨軟骨脫離，半月板撕破，韌帶撕破，腱撕破，肌肉病變，肌-腱連接病變，軟骨移植，骨移植，韌帶移植，腱移植，軟骨移植，軟骨-骨移植，皮膚移植物固定和血管、膜片血管移植物和微血管血管吻合術(shù)中的組織的治療。該專利的主要發(fā)明點(diǎn)在于在粘合劑中引入轉(zhuǎn)谷酰胺酶。
[0011]相比之下，本發(fā)明并不引入轉(zhuǎn)谷酰胺酶并且計劃用于注射進(jìn)骨缺損或空隙內(nèi)，用于局部遞送鍶和幫助新骨的形成。文獻(xiàn)數(shù)據(jù)顯示了元素鍶能刺激骨形成并同時抑制骨吸收。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明提供了組合物，其可被注射進(jìn)骨缺損或空隙內(nèi)或進(jìn)入小梁骨組織的骨髓隙內(nèi)，在那里該組合物暫時代替骨髓，以幫助新骨的形成。有數(shù)據(jù)顯示了元素鍶能刺激骨形成并同時抑制骨吸收。
[0013]在一個方面，本發(fā)明提供了用于骨愈合和骨生長的組合物，其中該組合物包含纖維蛋白、凝血酶和含鍶化合物。該組合物還可包含含鈣化合物。優(yōu)選地，該組合物是可注射型組合物，其為可注射型凝膠、可注射型灰泥(putty)、可注射型糊劑(paste)或可注射型液體的形式。
[0014]在其它實(shí)施方案中，該組合物可包含一種或多種增塑劑。在一些實(shí)施方案中，增塑劑是含碘化合物。用作本文中的增塑劑的示例性的含碘化合物包括但不限于選自以下的化合物:泛影酯、碘的可(iodecol)、碘克沙醇、碘拉醇、碘谷胺(iogulamide)、碘海醇、碘美普爾、碘帕醇、碘普胺、碘曲倫(iotrol)、碘佛醇、碘克沙酸(ioxagulate)和甲泛葡胺及其混合物，和多元醇。在其它的實(shí)施方案中，增塑劑是聚乙二醇，多元醇，甘油或選自單糖、二糖、三糖、多糖及其組合的糖。在其它的實(shí)施方案中，增塑效果通過調(diào)節(jié)低分子量化合物諸如特別是氯化鈉和離液劑 的組成來完成。
[0015]該組合物可為凝膠或液體形式。在某些方面，該組合物可作為液體或凝膠(在膠凝階段之前或期間)被遞送進(jìn)入或作為預(yù)形成的凝膠被遞送進(jìn)入組織缺損內(nèi)。
[0016]在本發(fā)明的其它方面，該組合物包含一種或多種選自以下的細(xì)胞外蛋白質(zhì):基質(zhì)蛋白諸如粘連蛋白、細(xì)胞相關(guān)蛋白或血漿由來蛋白諸如凝血因子XIII和蛋白酶。
[0017]在其它的實(shí)施方案中，該組合物還可包含凝固誘導(dǎo)劑諸如魚精蛋白，蛇毒，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，F(xiàn)XIIa或生理學(xué)可接受的堿性緩沖液系統(tǒng)。
[0018]在特定實(shí)施方案中，該組合物為使得該組合物在愈合過程期間被組織再吸收和替換。
[0019]在本發(fā)明組合物中使用的含鍶化合物可為選自以下之一:氯化鍶、雷奈酸鍶、乙酸鍶、谷氨酸鍶、天冬氨酸鍶、丙二酸鍶、馬來酸鍶、抗壞血酸鍶、蘇糖酸鍶、乳酸鍶、磷酸鍶、鍶磷灰石、丙酮酸鍶、α-酮戊二酸鍶和琥珀酸鍶。這些化合物僅僅是示例性的含鍶化合物，并且其它的含鍶化合物可容易地被用在本發(fā)明的組合物中。
[0020]該組合物可以是這樣的組合物，其還包含選自以下的鍶共配體:擬鈣劑(calcimimetics)、骨鈣蛋白、氨基酸諸如L-精氨酸以及精氨酸模擬物(arginomimetics)和精氨酸類似物。
[0021]在本文所述的組合物中，含鍶化合物和/或含鈣化合物可為(微)粒子或固體形式。在示例性的實(shí)施方案中，含鍶或含鈣(微)的粒子形式具有的粒徑為100納米到500微米。在其它實(shí)施方案中，含鍶或含鈣的組分可采取多孔性或非孔性的固體形式，其具有例如0.5到50毫米的大小。優(yōu)選地，粒徑為0.5到5毫米。
[0022]在特定實(shí)施方案中，含鈣化合物是鈣磷酸鹽。鈣磷酸鹽可選自:磷酸三鈣，α-磷酸三鈣，β -磷酸三鈣，磷酸鈣的多晶型物，羥基磷灰石，碳酸鈣，硫酸鈣及其組合。
[0023]在某些實(shí)施方案中，涵蓋了一些鈣被鍶所置換以提供鈣鹽和鍶鹽的混合物。
[0024]在特定實(shí)施方案中，鍶鹽:鈣鹽的比或百分?jǐn)?shù)為25%到100%。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還可包含選自以下的蛋白質(zhì)或其組合:骨形態(tài)發(fā)生蛋白，甲狀旁腺激素(PTH)，降鈣素，雙膦酸鹽，表皮生長因子，胰島素樣生長因子和TGF生長因子?？墒褂萌魏尉哂泄巧L促進(jìn)效果或骨增強(qiáng)效果的蛋白質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，含鍶化合物通過將鍶加入到生物活性玻璃中以產(chǎn)生含鍶的生物活性玻璃材料被制得。
[0025]在某些其它的實(shí)施方案中，該組合物是其中當(dāng)混合各種組分時組合物發(fā)生膠凝的組合物。
[0026]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括通過將包括本發(fā)明的含鍶組合物的組合物注射進(jìn)活受試者的松質(zhì)骨內(nèi)來治療所述受試者的患病的、受損的或有缺陷的骨。有利地，這種組合物被注射進(jìn) 受試者的松質(zhì)骨引起愈合速率比施用不含鍶的類似組合物所觀察到的愈合速率更快。
[0027]本文還涵蓋了修復(fù)具有缺損的骨的方法，包括:(a)機(jī)械固定骨或其部分；和(b)用實(shí)現(xiàn)修復(fù)所述缺損的量的本發(fā)明的組合物填充所述缺損。在示例性的實(shí)施方案中，所述缺損是骨折并且所述修復(fù)是所述骨折的骨愈合。在本發(fā)明的特定方面，施用所述組合物引起愈合速率比不施用所述組合物所觀察到的愈合速率更快。優(yōu)選地，施用所述組合物引起愈合速率比施用不含鍶的類似組合物所觀察到的愈合速率更快。
[0028]本文還涵蓋了在骨缺損部位處促進(jìn)新骨生長的方法，包括使所述缺損部位接觸本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，所述骨生長的速率在所述組合物中存在鍶的條件下比在存在不含鍶的類似組合物的條件下所觀察到的骨生長速率更快。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1表示在包含鍶的凝固物上生長的人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞(SaOS-2)的細(xì)胞增殖。使用的符號是Ca/Sr。所述值是在最終凝固物中的濃度。為了在最終的凝固物中實(shí)現(xiàn)這些濃度，在緩沖液中的濃度加倍。
[0030]圖2表示在包含鍶的凝固物上生長的人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞(SaOS-2)的DNA試驗(yàn)。使用的符號是Ca/Sr。所述值是在緩沖液中的濃度。該值在最終的凝固物中減半。
[0031]圖3表示在包含鍶的凝固物上生長的人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞(SaOS-2)在30分鐘內(nèi)的堿性磷酸酶生成。所述值是在最終凝固物中的濃度。為了達(dá)到這一濃度，在緩沖液中的濃度加倍。
[0032]圖4表示當(dāng)凝血酶緩沖液由鈣、鈣/鍶或單獨(dú)的鍶組成時凝固物的濁度分析。使用的符號是Ca/Sr。所述值是在緩沖液中的濃度。該值在最終的凝固物中減半。
[0033]圖5表示在包含12.5mM Sr或Ca的介質(zhì)中生長的凝固物的存活百分?jǐn)?shù)(通過MTS增殖試驗(yàn)測得)。
[0034]圖6表示在纖維蛋白凝固物上和在包含鍶粒子的纖維蛋白凝固物上培養(yǎng)的NHOst細(xì)胞的染色。在纖維蛋白凝固物上培養(yǎng)14天(上方圖)或在包含鍶粒子的纖維蛋白凝固物上培養(yǎng)14天(下方圖)的NHOst細(xì)胞的活染色(左方圖)和死染色(右方圖)。
[0035]圖7表示與NHOst細(xì)胞一起培養(yǎng)的纖維蛋白凝固物的橫截面。細(xì)胞染色綠色(活)和紅色(死)。上方圖是纖維蛋白凝固物。下方圖是包含粒子的纖維蛋白凝固物。
[0036]圖8顯示了完全閉合的鉆孔(兩側(cè)閉合)的圖解表示法。
[0037]圖9表示在材料中存在纖維蛋白的條件下的兔股骨髁的μ CT。
[0038]圖10表示骨形成的圖解表示法(評價等級:1:低的骨形成；2:中等的骨形成；3:高的骨形成)。
[0039]圖11表示使用80%Sr材料的兔股骨髁的μ CT。
[0040]圖12表示用纖維蛋白處理的兔股骨髁缺損的組織染色薄切片。
[0041]圖13表示用含Sr80%的纖維蛋白凝固物處理的兔股骨髁缺損的組織學(xué)污染薄切片。
[0042]圖14表示SrCl2對PTH生物活性的影響。
[0043]發(fā)明詳述
[0044]本發(fā)明涉及凝血酶、纖維蛋白組合物和/或?yàn)椴蝗芑蚩扇苄问降逆J和/或可包含鍶或可不包含鍶的無 機(jī)粒子和/或纖維蛋白增塑劑。用于骨愈合和骨再生。凝血酶的量或無機(jī)粒子含量的改變，允許隨著所述應(yīng)用或靶組織的不同來控制膠凝時間。可使用纖維蛋白增塑劑或改性劑來增強(qiáng)制劑的機(jī)械性質(zhì)或進(jìn)一步延遲凝固時間。增塑劑的實(shí)例包括含碘造影劑，諸如泛影酯，碘的可，碘克沙醇，碘拉醇，碘谷胺，碘海醇，碘美普爾，碘帕醇，碘普胺，碘曲倫，碘佛醇，碘克沙酸和甲泛葡胺，及其混合物，和多元醇。
[0045]使用侵入性最低的技術(shù)，該組合物可在膠凝階段之前或期間作為液體被遞送進(jìn)入或作為預(yù)形成的凝膠被遞送進(jìn)入組織缺損內(nèi)。該制劑計劃在愈合過程期間被組織再吸收和替換。
[0046]纖維蛋白原溶液是具有5-200毫克/毫升、優(yōu)選50-100毫克/毫升的纖維蛋白原的含水溶液。纖維蛋白原溶液還可包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(例如粘連蛋白，細(xì)胞相關(guān)蛋白，其它血漿由來的蛋白質(zhì)[例如凝血因子XIII和蛋白酶])。纖維蛋白原溶液還可包括纖維蛋白單體、衍生物和纖維蛋白I。
[0047]凝血酶組分還可包含本領(lǐng)域已知的另外的化合物以及鍶化合物。關(guān)于凝血酶的使用量沒有特別限制。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，凝血酶在所述凝血酶組分(b)中的量為使得其在最終凝固的組合物中以至少約lIU/ml到最高30IU/ml的量存在。
[0048]代替本發(fā)明的凝血酶或者除了本發(fā)明的凝血酶之外，用于組分(a)的其它的膠凝誘導(dǎo)劑或凝固誘導(dǎo)劑為諸如魚精蛋白，蛇毒，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，F(xiàn)XIIa，生理學(xué)可接受的堿性緩沖液系統(tǒng)。
[0049]凝血酶緩沖液是包含與其它物質(zhì)在一起的二價陽離子的含水溶液。在緩沖液中二價陽離子的濃度可以5-50mM。優(yōu)選地，該二價陽離子選自鈣和鍶并且它們的比可為0:1到0.975:0.025。二價鍶離子可以氯化鍶形式或任何其它的水溶性鍶鹽諸如雷奈酸鍶、谷氨酸、天冬氨酸鍶、丙二酸鍶、馬來酸鍶、抗壞血酸鍶、蘇糖酸鍶、乳酸鍶、丙酮酸鍶、α -酮戊二酸鍶或琥珀酸鍶的形式被加入。凝血酶緩沖液還可包含用于新鑒定的鍶的分子靶標(biāo)的共配體(a G-prote in-coup led receptor calcium-sensing receptor, Pi 等人，J.Biol.Chem.2005)。共配體選自擬鈣劑、骨鈣蛋白和氨基酸。優(yōu)選，L-精氨酸、精氨酸模擬物或精氨酸類似物。含鍶的凝血酶緩沖液還可與含鍶的無機(jī)粒子組合使用。
[0050]粒子組分具有的粒徑為納米到小于3000微米的范圍，并且當(dāng)施用時應(yīng)當(dāng)不溶。優(yōu)選地，粒徑為100納米到50毫米，更優(yōu)選為0.5毫米到50毫米。粒子可以是任何的當(dāng)施用時不溶的鍶螯合物，或者是當(dāng)施用時同樣不溶的被鍶置換的鈣鹽。用于置換的鈣鹽可選自磷酸鈣，磷酸三鈣，α-磷酸三鈣，磷酸三鈣，磷酸鈣的多晶型物，羥基磷灰石，碳酸鈣，硫酸鈣及其組合。粒子的鈣的鍶置換可為0.25-100%。為獲得最終凝膠進(jìn)行的混合可以在18-37 0C，優(yōu)選37 °C的溫度下完成。
[0051]纖維蛋白原溶液是具有5-200毫克/毫升、優(yōu)選50-100毫克/毫升的纖維蛋白原的含水溶液。纖維蛋白原溶液還可包括纖維蛋白單體、衍生物和纖維蛋白I。纖維蛋白原溶液還可包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，例如粘連蛋白，細(xì)胞相關(guān)蛋白，其它血楽.由來的蛋白質(zhì)諸如凝血因子XIII (FXIII)和蛋白酶。
[0052]凝血酶溶液是在最終的凝固(或膠凝)組合物中具有最終濃度最低為0.lIU/ml的含水溶液。該溶液還可經(jīng)過緩沖并包含氨基酸、蛋白質(zhì)或添加劑(例如L-精氨酸、甘露醇和白蛋白)。
[0053]凝血酶緩沖液是包含與其它物質(zhì)在一起的二價陽離子的含水溶液。在緩沖液中二價陽離子的濃度可為5-50mM。優(yōu)選地，二價陽離子選自鈣和鍶并且(鈣:鍶)摩爾比為1:0到 0.975:0.025。
[0054]粒子可以是任何的當(dāng)施用時不溶的鍶螯合物，或者是當(dāng)施用時同樣不溶的被鍶置換的鈣鹽。用于置換的鈣鹽可選自磷酸鈣，磷酸三鈣，α-磷酸三鈣，磷酸三鈣，磷酸鈣的多晶型物，羥基磷灰石，碳酸鈣，硫酸鈣及其組合。粒子的鍶置換作為被置換的粒子的比可為 0.25-100%。
[0055]組合物中粒子的含量為2-100%、優(yōu)選30_50%(重量/體積)的可凝固蛋白質(zhì)。粒子組分具有的粒徑根據(jù)應(yīng)用的需要為亞微米到小于3000微米的范圍。為獲得最終的凝膠進(jìn)行的勻漿化可在18-37°C，優(yōu)選37°C的溫度完成。
[0056]本發(fā)明的組合物幫助骨修復(fù)的效力還可通過并入生物活性分子得以改善。這些生物活性分子作為游離分子或作為藥物粉末，可被化學(xué)連接于基質(zhì)上，被吸附到粒子組分上或被截留在纖維蛋白基質(zhì)中。這些分子可用于刺激骨代謝(合成代謝和/或分解代謝)。已被鑒定的適當(dāng)?shù)姆肿影ü切螒B(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，甲狀旁腺激素(PTH)，降鈣素，雙膦酸鹽，表皮生長因子，胰島素樣生長因子和TGF超家族生長因子。適當(dāng)?shù)姆肿舆€可包括其它與骨合成代謝/分解代謝循環(huán)無關(guān)、但與骨修復(fù)/重建過程平行發(fā)生的生理學(xué)過程相關(guān)的因子，諸如還可并入血管生成刺激物(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子[PDGF]。當(dāng)鍶的作用方式被認(rèn)為與合成代謝劑1，25 (OH) 2維生素D和甲狀旁腺分開時具有特別的意義。
[0057]增塑劑還可與纖維蛋白或凝血酶混合以增強(qiáng)制劑的機(jī)械性質(zhì)或進(jìn)一步延遲凝固時間。增塑劑的實(shí)例選自:水溶性的含碘造影劑，聚乙二醇，多元醇諸如甘油，單糖、二糖、三糖和多糖，及其任意組合。適當(dāng)?shù)暮庠煊皠┰诿绹鴮＠暾圲S20050119746 (Lidgren和Nilson, 2004)中被詳述，該文獻(xiàn)作為參考被并入本文，其實(shí)例是泛影酯(葡甲胺)，碘的可，碘克沙醇，碘拉醇，碘谷胺，碘海醇，碘美普爾，碘帕醇，碘普胺，碘曲倫，碘佛醇，碘克沙酸和甲泛葡胺。優(yōu)選地，造影劑是非離子型的，具有低的重量克分子滲透壓濃度，并且允許纖維蛋白發(fā)生組裝，例如碘克沙醇。
[0058]本發(fā)明的組合物可用于骨愈合方法和這種方法中所使用的試劑盒。還考慮了所述組合物可用于促進(jìn)骨生長或愈合，特別是長骨的生長或愈合。具體地說，本發(fā)明涉及包含凝血酶、纖維蛋白和鍶的骨修復(fù)組合物。鍶在組合物中的存在導(dǎo)致與不含鍶的所述組合物相比，增強(qiáng)骨愈合和/或骨生成。
[0059]本發(fā)明的組合物可用于修復(fù)和再生長骨，諸如股骨、脛骨、肱骨、撓骨、尺骨等等。
[0060]使用本發(fā)明的組合物，有可能修復(fù)或部分地修復(fù)具有缺損的骨的機(jī)械、建筑和結(jié)構(gòu)能力，同時提供結(jié)構(gòu)面區(qū)域，該結(jié)構(gòu)面區(qū)域可以充當(dāng)用于操控骨愈合和再生的生物學(xué)過程的適當(dāng)?shù)幕住?br> [0061]如實(shí)施例所示，本發(fā)明的組合物加速了牽涉骨修復(fù)的細(xì)胞和生物過程。
[0062]在下文中使用的措詞“長骨”是指具有一定長度的骨，其長度為直徑的至少兩倍。典型地，措詞“長骨”是肢端骨，即，脛骨，腓骨，股骨，肱骨，撓骨，尺骨，腕骨，掌骨，指骨，跗骨和跖骨。更具體地說，本文使用的措詞“長骨”是指四種主要的肢端骨，即，脛骨，股骨，肱骨和撓骨。
[0063]可通過采用本發(fā)明的組合物進(jìn)行補(bǔ)救的“骨缺損”可為任何的骨異常，包括但不限于，由于傷害、切骨、手術(shù)、骨折、畸形愈合、不連性骨折、骨骼變形、老化或疾病所產(chǎn)生的空隙、空穴、構(gòu)造中斷、骨折或任何結(jié)構(gòu)改變。本發(fā)明的組合物提供了重要的治療潛力。當(dāng)松質(zhì)骨患病時，例如，因?yàn)楣琴|(zhì)疏松癥、無血管形成性壞死或癌而患病時，周圍的皮層骨變得更傾向于發(fā)生壓縮性骨折或塌陷性骨折。這是因?yàn)樗少|(zhì)骨不再為周圍的皮層骨提供內(nèi)部支撐所導(dǎo)致。本發(fā)明的組合物可用于強(qiáng)化在諸如骨質(zhì)疏松癥、骨壞死或無血管形成性壞死以及其它的牽涉骨感染、骨愈合不充分或由于重癥創(chuàng)傷而骨折的骨疾病中的骨。
[0064]本發(fā)明的另一個方面提供了用于修復(fù)具有缺損的骨的試劑盒。該試劑盒包括用于固定骨或其部分的機(jī)械固定裝置和本發(fā)明的組合物。固定裝置的實(shí)例包括但不限于，凸緣，棒條，狹條，絲線，釘，螺釘，縫線以及各種鑄件、套筒等，其是典型的外部固定裝置。因此，本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選包括外部機(jī)械固定裝置。
[0065]本發(fā)明的另一個方面提供了治療骨缺損諸如骨折、空穴、空隙等的方法，包括使它們接觸本發(fā)明的組合物。在一些實(shí)施方案中，所述方法可包括在使缺損接觸本發(fā)明的組合物的步驟之前或之后機(jī)械固定骨或其部分。
[0066]有利地，本發(fā)明的組合物可作為可注射型組合物使用，該組合物被遞送進(jìn)骨質(zhì)(骨)缺損或空隙內(nèi)或進(jìn)入小梁骨組織的骨髓隙內(nèi)，在那里所述組合物暫時代替骨髓和/或幫助新骨形成。所述組合物可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)被注射進(jìn)小梁骨組織或任何其它的骨組織內(nèi)。所述技術(shù)以及用于實(shí)施這種技術(shù)的示例性實(shí)例在例如美國專利公報20080065091、美國專利公報20080058828、美國專利公報20070073307、美國專利4，969，888和5，108, 404中討論(其每一個專利文獻(xiàn)作為參考被并入本文)。典型地，使用類似于家用填縫槍的注射裝置將組合物注射進(jìn)骨內(nèi)。典型的骨水泥注射裝置具有手槍形主體，其支持包含骨水泥的藥筒。觸發(fā)器開動簧壓式撞頭，該撞頭推動一定體積的、處在粘性條件下的骨水泥通過適當(dāng)?shù)膰娮觳⑦M(jìn)入作為治療靶標(biāo)的骨的內(nèi)部。根據(jù)美國專利4，969，888和5，108，404的教導(dǎo)，可首先通過將骨內(nèi)部的松質(zhì)骨壓實(shí)而形成空穴，再向該空穴中注射骨水泥。
[0067]將Sr并入本發(fā)明的可注射型組合物中的附加優(yōu)點(diǎn)是其使得允許采用諸如熒光技術(shù)的技術(shù)監(jiān)控遞送和愈合過程，因?yàn)殒J的已知的作為放射遮光劑的性質(zhì)。因此，在本發(fā)明的組合物中使用Sr提供了治療功能和診斷功能，而不僅僅提供單獨(dú)的成像功能。
[0068]本發(fā)明的組合物可以可注射型凝膠、可注射型糊劑、糊劑、灰泥或可水合的凍干形式被使用。本文使用的術(shù)語“凝膠”是指膠狀的、濃稠的、柔軟的、部分液體性物質(zhì)。本發(fā)明的凝膠可被擠出通過至少13量規(guī)的注射器針頭。本申請中使用的“糊劑”是指柔軟的、潮濕的、具有介于液體和固體之間的稠度的物質(zhì)。本發(fā)明的糊劑的固體性低于灰泥的固體性，但是高于凝膠的固體性，并且在一些實(shí)施方案中可為可注射的。
[0069]術(shù)語“灰泥”是指面團(tuán)狀的/粘土樣的本發(fā)明的組織修復(fù)組合物。在施用期間，所述物質(zhì)可經(jīng)過攪打或揉捏以達(dá)到面團(tuán)的稠度，并被成型為與植入部位的形狀密切相似的形狀。
[0070]“可注射”是指在植入部位處在壓力下可被引入(使用注射器被引入)的本發(fā)明的組合物的能力。本發(fā)明的可注射型組合物例如可被引入到體內(nèi)的部件之間或進(jìn)入有限的空間(即，特別地被引入到骨碎片之間或進(jìn)入在假體裝置和骨之間的接觸面內(nèi))。
[0071]“注射器”是指任何可被用來注射或撤走本發(fā)明的可流動的組織修復(fù)組合物(特別地包括某些凝膠劑和糊劑在內(nèi))的裝置。
[0072]所述組合物被諸如注射進(jìn)受試者的皮層骨或小梁骨內(nèi)(受試者優(yōu)選是人，猿，羊，牛，馬，豬受試者)。本申請使用的“皮層骨”是指骨的圍繞髓腔的軸的密質(zhì)骨。皮層骨是由被羥基磷灰石增強(qiáng)的三鏈螺旋膠原纖維組成的高致密結(jié)構(gòu)。皮層骨是復(fù)合結(jié)構(gòu)并且是人體中長骨的負(fù)擔(dān)主要負(fù)荷的部分。羥基磷灰石組分是骨的高抗壓強(qiáng)度的原因，同時膠原纖維組分部分地是扭轉(zhuǎn)強(qiáng)度和抗張強(qiáng)度的原因。本發(fā)明的組合物可被引入到這種骨部分內(nèi)以賦予有益的骨愈合或骨加強(qiáng)效果。
[0073]小梁骨與皮層骨具有類似的組成并且是“松質(zhì)骨”的主要構(gòu)成部分，并且是指成熟骨，其包括礦化的、規(guī)則排列的平行膠原纖維，其與在成熟的長骨軸的板骨內(nèi)的組構(gòu)不同。松質(zhì)骨一般在被皮層骨所包圍的長骨末端被發(fā)現(xiàn)。松質(zhì)骨具有與填滿骨髓的空隙形成格子的骨針。其也被稱為小梁骨或海綿骨。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物被遞送到小梁骨。
[0074]本發(fā)明的骨固定方法還可包括在骨固定或接觸本發(fā)明的組合物之前的缺損改造步驟。這種改造或骨重排可以采用例如鉆或研磨器或任何其它可用于缺損改造的裝置來進(jìn)行。
[0075]用于固定骨的裝置將根據(jù)要修復(fù)的缺損的類型以及骨的類型和方位的不同而異。典型地，固定裝置是外部固定裝置。優(yōu)選地，外部固定裝置，諸如，例如，鑄件(cast)，是在本發(fā)明方法中被使用的唯一的固定裝置，并伴有本發(fā)明組合物的注射。然而，在一些情況下，可能有必要采用侵入性更大的、還采用內(nèi)部固定裝置的手術(shù)過程。
[0076]可以監(jiān)控修復(fù)并且可及時地除去用于固定骨的裝置。在缺損部位的骨再生可通過在術(shù)后立即獲得的和在術(shù)后給定間隔所獲得的軟組織X線(7.5mA ；0.5秒)進(jìn)行評價。在供試動物中的骨再生還可在實(shí)驗(yàn)終止時通過評價一般形態(tài)學(xué)、計算機(jī)化形態(tài)學(xué)(CT)掃描(65-80kV ；20秒)和三維(3-D)CT掃描(Marconi，M.times.8，000)來測定。可進(jìn)行組織學(xué)研究以測定組織的骨染色。
[0077]在本發(fā)明的方法中，所述組合物還可與可被用于骨修復(fù)的細(xì)胞諸如例如骨祖細(xì)胞聯(lián)合使用。骨祖細(xì)胞，如本領(lǐng)域已知的，包括骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨性亞集落，以成骨細(xì)胞作為特征。被本發(fā)明方法所采用的骨祖細(xì)胞可包括成骨性成骨細(xì)胞本身和/或形成骨祖細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞。骨祖細(xì)胞可采用已知的過程被分離。這些細(xì)胞優(yōu)選為自體同源的并包括例如人胚胎干細(xì)胞，鼠或人骨祖細(xì)胞，鼠或人骨祖細(xì)胞骨髓由來的細(xì)胞，鼠或人骨祖細(xì)胞胚胎由來的細(xì)胞，和鼠或人胚胎細(xì)胞。這些細(xì)胞可進(jìn)一步充當(dāng)細(xì)胞分泌生長因子，諸如Robinson和NevO(2001)所述的，其在上文中被定義。
[0078]本發(fā)明的組合物還可包含各種活性治療劑，其可包括骨生長增強(qiáng)劑、骨祖細(xì)胞或其組合。該組合物可包含至少一種藥物，諸如維生素、抗生素、抗炎藥等。
[0079]在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)將鍶并入含鈣的鹽中以制備被鍶置換的鈣化合物。另外，可將鍶并入被常規(guī)性用于組織修復(fù)中的生物活性玻璃中。“生物活性玻璃”是任何的顯示生物活性特征的玻璃，其典型地是無定形固體，其不具有固有的粘性并且其當(dāng)暴露于適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)和體外環(huán)境(諸如模擬的體液或三-羥基甲基氨基甲烷緩沖液)下時能夠與硬組織和軟組織二者都形成內(nèi)聚性結(jié)合。內(nèi)聚性結(jié)合通過在生物活性玻璃上通過從本體生物玻璃材料釋放離子物質(zhì)而形成羥基碳酸磷灰石的表層來實(shí)現(xiàn)。在手術(shù)和矯形治療以及在牙科領(lǐng)域中存在許多關(guān)于生物活性玻璃的應(yīng)用，并且已被描述在例如歐洲專利1405647和歐洲專利申請1655042以及國際申請W096/21628，W091/17777,W091/12032和美國專利公報20080066495中(其各自作為參考被并入本文)。
【具體實(shí)施方式】
[0080]在本發(fā)明的一個實(shí) 施方案中，含鍶化合物被用作在凝血酶稀釋緩沖液中的二價離子。凝血酶溶液使用稀釋緩沖液被制得。纖維蛋白原溶液和含鍶的凝血酶溶液經(jīng)混合以形成凝膠。
[0081]在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，含鍶化合物作為鹽粒子被加入到制劑中。凝血酶溶液和鹽粒子混合以制備改性的凝血酶溶液。纖維蛋白原溶液和經(jīng)改性的凝血酶溶液經(jīng)混合以形成凝膠。
[0082]實(shí)施例1:溶于所述緩沖溶液中的含鍶化合物
[0083]在重蒸餾水中制備了一系列緩沖液。對于這些緩沖液，在凝血酶緩沖液中的二價陽離子是Ca或Ca+Sr的混合物，從而使得陽離子濃度被保持在40mM不變(參見下表中的氯化鍶)。在凝血酶緩沖液中將凝血酶稀釋到4IU的濃度。
[0084]
【權(quán)利要求】
1.用于治療受試者的患病的、受損的或有缺陷的骨的、包含纖維蛋白、凝血酶和一定量的鍶的組合物。
2.用于治療受試者的患病的、受損的或有缺陷的骨的、包含纖維蛋白、凝血酶和一定量的鍶的組合物，其中一定量的鍶作為水溶性鍶鹽的二價鍶離子存在，并且其中所述二價鍶離子在組合物中以2.5mM到25mM的濃度存在。
3.用于治療受試者的患病的、受損的或有缺陷的骨的、包含纖維蛋白、凝血酶和一定量的鍶的組合物，其中一定量的鍶作為鍶螯合物或作為被鍶置換的鈣鹽存在，并且其中鍶存在于當(dāng)施用時不溶的粒子中。
4.用于治療受試者的患病的、受損的或有缺陷的骨的、包含纖維蛋白、凝血酶和一定量的鍶的組合物，其中一定量的鍶作為鍶螯合物存在，并且其中鍶存在于當(dāng)施用時不溶的粒子中。
5.用于治療受試者的患病的、受損的或有缺陷的骨的、包含纖維蛋白、凝血酶和一定量的鍶的組合物，其中一定量的鍶作為被鍶置換的鈣鹽存在，并且其中鍶存在于當(dāng)施用時不溶的粒子中。
6.用于治療受試者的患病的、受損的或有缺陷的骨的、包含纖維蛋白、凝血酶和一定量的鍶的組合物，其中一定量的鍶作為鍶螯合物或作為被鍶置換的鈣鹽存在，并且其中鍶存在于當(dāng)施用時不溶的粒子中，其中所述粒子包含25%被鍶置換的粒子。
7.用于治療受試者的患病的、受損的或有缺陷的骨的、包含纖維蛋白、凝血酶和一定量的鍶的組合物，其中一定量的鍶作為鍶螯合物或作為被鍶置換的鈣鹽存在，并且其中鍶存在于當(dāng)施用時不溶的粒子中，其中粒子在組合物中以30-50%(重量/體積)的組合的含纖維蛋白和凝血酶存在。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的組合物，還包含一定量的甲狀旁腺激素(PTH)。
9.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物是凝膠、灰泥、糊劑或液體形式。
10.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的組合物，還包含增塑劑。
【文檔編號】A61L27/54GK103785058SQ201410019473
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2008年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2007年4月23日
【發(fā)明者】約翰·J·巴里, 安德烈亞斯·格斯?fàn)? 杰拉爾德·西默 申請人:巴克斯特國際公司, 巴克斯特醫(yī)療保健股份有限公司