粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其制抗腎衰藥的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其在制備抗慢性腎衰藥物中的用途，特征是將菌種保藏編號為CCTCC?No:M?2011196的粒毛盤菌胞外多糖，經(jīng)氯乙酸羧甲基化修飾后得到的粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物，根據(jù)其具有顯著地抗慢性腎衰作用，按照藥劑學的常規(guī)制備方法，將有效量的粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物與藥用輔料制備成片劑、膠囊供臨床用。藥效學實驗證明，該胞外多糖及其羧甲基化衍生物不僅具有顯著的抗慢性腎衰作用，且無毒副作用，其制備方法簡單經(jīng)濟。
【專利說明】粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其制抗腎衰藥的用途
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于粒毛盤菌胞外多糖在醫(yī)藥領域中的應用，具體涉及菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其在制備抗腎衰藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)代醫(yī)學認為，腎臟是人體重要的排泄器官，其主要功能是過濾形成尿并排出代謝廢物，調(diào)節(jié)體內(nèi)的電解質(zhì)和酸堿平衡。慢性腎衰竭是由各種原發(fā)性腎臟疾病或繼發(fā)于其他疾病引起的腎臟進行性損傷，以代謝產(chǎn)物潴留、水和電解質(zhì)紊亂、酸堿平衡失調(diào)，全身各系統(tǒng)受損為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，已成為全球性的公共健康問題。血液透析及腎移植可以治療慢性腎衰竭終末期腎病，但是價格較為昂貴，難以普及，臨床上使用的藥物通常為海昆腎喜膠囊、尿毒清顆粒等，但長期服用易出現(xiàn)胃脘不適、納差、肝功能損傷等不良反應。因此研究新型無毒副作用的天然的保護慢性腎衰竭的藥物具有重要的意義。
[0003]真菌多糖是一類天然高分子化合物，由醛基和酮基通過糖苷鍵連接，具有控制細胞分裂分化、調(diào)節(jié)細胞生長和衰老的活性，可做為免疫增強劑和免疫激活劑，被稱為“生物反應調(diào)節(jié)物”。英國《碳水化合物聚合物》(Carbohydrate Polymers, 2009，78:658-665)中報道，多糖的分子結(jié)構(gòu)決定其活性，可對多糖進行硫酸化、磷酸化、羧甲基化、乙?；确肿有揎棧ㄟ^改變多糖在水溶液的鏈構(gòu)象來提高其活性，不同的取代基團、取代位置和取代度對多糖衍生物的活性有重要的影響。多糖羧甲基化修飾可以提高多糖原有活性，且能為多糖增添新的活性。
[0004]粒毛盤菌屬是一類腐生性真菌，在液態(tài)深層培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生大量的活性多糖，具有抗氧化、抑菌、降血糖、抗衰老、降脂利肝及抗腫瘤等活性。中國《食品科學》(2010，30(9):276-278)曾報道了對白術(shù)多糖的抗慢性腎衰竭活性的研究沖國專利申請?zhí)?01110184104.9公開了一株保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌YM281(本發(fā)明人課題組自定的編號代碼)多糖在制備降脂利肝藥物中的應用，顯示粒毛盤菌多糖具有顯著的降脂利肝作用；英國《碳水化合物聚合物》(Carbohydrate Polymers, 2013, 97, 690-694)公開了粒毛盤菌多糖磷酸化修飾及其抗腫瘤活性研究，結(jié)果表明經(jīng)磷酸化修飾后，粒毛盤菌多糖的抗腫瘤活性明顯增強。但目前國內(nèi)外未見有公開文獻提及粒毛盤菌胞外多糖的羧甲基化衍生物及其作為制備抗慢性腎衰藥物的應用方面的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種菌株保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其在制備抗腎衰藥中的用途，確立菌株保藏編號為CCTCC No:M2011196的粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物的抗慢性腎衰的藥理作用。
[0006]本發(fā)明的粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物，其特征在于是將菌株保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌發(fā)酵提取純化后得到的胞外多糖進行羧甲基化修飾，按:取Ig粒毛盤菌胞外多糖溶于50ml 2.0mol/L NaOH溶液中，在200-400r/min轉(zhuǎn)速攪拌下加入5g氯乙酸，于60°C繼續(xù)攪拌反應3h，冷卻至室溫，用冰乙酸中和至pH為7.0，過濾后將濾液用截留分子量為3500Da的透析袋透析36-48h，收集透析袋內(nèi)溶液加入其體積4~5倍的體積比濃度為95%的乙醇于4°C醇沉12-24h，收集沉淀后加入50mL蒸餾水復溶，冷凍干燥后，所得到的多糖羧甲基化衍生物CLEP-1b ;其基本結(jié)構(gòu)為(1→ 3)-，(1 →6)-β-D-匍聚糖，其中羧甲基基團-CH2COOH與其C-3羥基的O連接。
[0007]本發(fā)明的粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物在制備抗腎衰藥中的用途，其特征在于通過小鼠慢性腎衰的藥理實驗，確立菌株保藏編號為CCTCC Νο:Μ 2011196的粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物的抗慢性腎衰的藥理作用；該菌株保藏編號為CCTCC Νο:Μ 2011196的粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物可用于制備抗腎衰藥物:按藥劑學的常規(guī)制備方法加工成口服制劑，即，將有效量的菌株保藏編號為CCTCC Νο:Μ 2011196的粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物與藥用輔料混勻后制備成片劑或膠囊劑供臨床用。
[0008]本發(fā)明中采用氯乙酸對菌株保藏編號為CCTCC Νο:Μ 2011196的粒毛盤菌胞外多糖進行羧甲基化修飾，經(jīng)IR和13C NMR光譜結(jié)果驗證羧甲基化修飾成功，其基本結(jié)構(gòu)為(I→ 3) -，(I → 6) - β -D-葡聚糖，羧甲基基團-CH2COOH與其C-3羥基的O連接，通過改變分子結(jié)構(gòu)、取代基團和取代度，增強了其抗腎衰作用。經(jīng)藥效學實驗表明，粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物具有顯著地抗腎衰的作用，方法簡單且成本低廉，無毒副作用，克服了長期服用現(xiàn)有藥物出現(xiàn)的胃脘不適、納差、肝功能損傷等不良反應。
[0009]本發(fā)明的菌株保藏編號為CCTCC Νο:Μ 2011196粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物，經(jīng)藥效學實驗表明，能有效改善腺嘌呤所致慢性腎衰小鼠腎臟病理組織狀態(tài)，明顯的降低血清中肌酐和尿素氮含量，增加總蛋白及白蛋白含量，增強小鼠腎、肝勻漿液中S0D、GSH-PX、CAT和GSH的活性，降低MDA含量。因此可將粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物應用于制備片劑或膠囊劑型的抗慢性腎衰藥物。該方法簡單經(jīng)濟。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為粒毛盤菌CCTCC No:M 2011196胞外多糖的IR光譜圖；
[0011]圖2為粒毛盤菌CCTCC No:M 2011196胞外多糖羧甲基化衍生物的IR光譜圖；
[0012]圖3為粒毛盤菌CCTCC No:M 2011196胞外多糖的13C NMR光譜圖；
[0013]圖4為粒毛盤菌CCTCC No:M 2011196胞外多糖羧甲基化衍生物的13C NMR光譜圖；
[0014]圖5到圖11分別給出了經(jīng)粒毛盤菌多糖及其羧甲基化衍生物治療后慢性腎衰小鼠腎臟組織病理學檢查結(jié)果照片。其中圖5為正常組，圖6為模型組，圖7為陽性組，圖8為LEP-1b低劑量組，圖9為LEP-1b高劑量組，圖10為CLEP-1b低劑量組，圖11為CLEP-1b高劑量組小鼠腎臟組織病理學檢查的照片。
【具體實施方式】
[0015]實施例1:
[0016]一、粒毛盤菌YM281胞外多糖制備:
[0017]采用中國專利申請?zhí)?01110184104.9中所公布的方法，將菌種保藏編號為CCTCCNo:M2011196(YM281)的粒毛盤菌接種于5L發(fā)酵罐，培養(yǎng)基配方為:葡萄糖45g/L，酵母膏14g/L，甘氨酸6.0mg/L，MgSO4 WH2OlgA^KH2PO4Ig/!,裝料系數(shù)體積比為0.7，接種量為15%(體積比)，培養(yǎng)溫度為35°C，通氣量為l.0L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為180r/min，發(fā)酵時間為12天；將發(fā)酵液抽濾、濃縮后，加入其3倍體積的體積比濃度為95%的乙醇于4°C醇沉24h，將醇析液以5000r/min離心IOmin,去上清,所得沉淀用蒸懼水溶解,采用賽沃杰法(Sevag法)脫蛋白，加入樣液體積1/3的H2O2保溫(50°C)脫色處理后，使用3500Da的透析袋，先用自來水透析72h再用蒸餾水透析48h，_50°C冷凍干燥，即得菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌胞外多糖LEP-1b。
[0018]二、粒毛盤菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物制備:
[0019]參照日本《生物學與藥學通報》(Chemical and PharmaceuticalBulletin, 1988，36 (3): 1016-1025)中公布的羧甲基化修飾方法，對粒毛盤菌YM281胞外多糖進行羧甲基化修飾以形成羧甲基化衍生物:取菌株保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌發(fā)酵提取純化后得到的胞外多糖Ig LEP-1b溶于50ml 2.0mol/L NaOH溶液中，在200-400rpm轉(zhuǎn)速攪拌下加入5g氯乙酸，于60°C繼續(xù)攪拌反應3h，冷卻至室溫，用冰乙酸中和至PH為7.0,過濾后將濾液用截留分子量為3500Da的透析袋透析36_48h，收集透析袋內(nèi)溶液加入其體積4-5倍的體積比濃度為95%的乙醇于4°C醇沉12-24h，收集沉淀后加入50mL蒸餾水復溶，溶液冷凍干燥得到菌株保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌(YM281)胞外多糖羧甲基化衍生物，其羧甲基化產(chǎn)物得率為78.4%，羧甲基化取代度DS為
1.433。
[0020]三、粒毛盤菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物結(jié)構(gòu)鑒定:
[0021]分別取LEP-1b和CLEP-lb6mg與IOOmg KBr混合研磨后壓片，于4000-400^^1使用傅里葉變換光譜儀(NexuS670)進行紅外光譜掃描，圖1和圖2分別給出了粒毛盤菌YM281胞外多糖LEP-1b和粒毛盤菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物CLEP-1b的IR光譜圖。
[0022]由圖1中所示，LEP-1b的紅外光譜中3350CHT1處的吸收峰是O-H伸縮振動引起的，2930cm-1處的吸收峰是C-H伸縮振動引起的，1650cm-1處出現(xiàn)的吸收峰為結(jié)合水所產(chǎn)生的H-O-H彎曲振動峰，1050cm—1處的吸收峰是C-O-C不對稱伸縮振動引起的，表明LEP-1b具有典型的(I — 3) -，(I — 6) - β -D-葡聚糖的特征吸收峰。由圖2中所示，CLEP-1b中1650(^1處由結(jié)合水所產(chǎn)生的H-O-H彎曲振動吸收峰消失，1600cm_\l420cm_1和1330CHT1處出現(xiàn)的新吸收峰，分別是由羰基中C=O鍵的不對稱伸縮振動、C-O伸縮振動和次甲基的振動引起，表明LEP-1b羧甲基化修飾成功。
[0023]分別取LEP-1b 和 CLEP-1b 樣品各 20.0mg 分別溶于 Iml D20,90 °C 于 BrukerAvance AV500兆核磁共振儀上進行13C NMR核磁光譜分析。圖3和圖4分別給出了粒毛盤菌YM281胞外多糖LEP-1b和粒毛盤菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物的13C NMR光譜圖。如圖3中所示，LEP-1b的13C NMR圖譜中化學位移為102.817ppm的異頭碳信號是—3)-β-D-Glcp-(I —的C-1產(chǎn)生的，表明糖環(huán)構(gòu)型為吡喃型；C-2、C_3、C_4、C_5、C_6的化學位移分別為 70.637ppm、78.769ppm、67.481ppm、73.902ppm、63.352ppm。如圖 4 中所示，CLEP-1b的13C NMR圖譜中出現(xiàn)兩個新的吸收峰，化學位移為178.890ppm的吸收峰是C=O的特征吸收峰，化學位移為17.416ppm的吸收峰是次甲基的特征吸收峰，說明LEP-1b中引入了 -CH2COOH基團，化學位移為78.769ppm的C-3信號峰消失，說明羧甲基基團-CH2COOH與LEP-1b 的 C-3 羥基中 O 結(jié)合。除此之外，CLEP-1b 的 13C NMR 圖譜中 C-1、C-2、C-4、C-5、C_6的化學位移與LEP-1b相比均未發(fā)生變化。
[0024]上述IR和13C NMR光譜結(jié)果表明，LEP-1b羧甲基化修飾成功，羧甲基基團-CH2COOH與LEP-1b C-3羥基的O連接。
[0025]四、粒毛盤菌YM281胞外多糖及其羧甲基化衍生物對小鼠抗慢性腎衰作用的藥理實驗:
[0026](I)粒毛盤菌YM281胞外多糖及其羧甲基化衍生物生理鹽水溶液的制備:將上述粒毛盤菌YM281胞外多糖及其羧甲基化衍生物粉末用質(zhì)量百分濃度為0.9%的生理鹽水分別配置成100mg/mL和200mg/mL的水溶液,采取的給藥體積為0.25mL/每只小鼠。
[0027](2)動物:昆明雄性小鼠70只，體重20±2g。
[0028](3)試劑:腺嘌呤購自洛陽德勝化工有限公司(河南、中國)，海昆腎喜膠囊購自輝南長龍生化藥業(yè)股份有限公司(吉林、中國)，血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(江蘇、中國)、總蛋白(TP)和白蛋白試劑盒購自南京建成生物工程研究所(江蘇、中國)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GSH)和丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(江蘇、中國)。
[0029](4)方法:采用腺嘌呤灌胃法建立小鼠慢性腎衰竭模型。健康雄性昆明小鼠70只，適應性喂養(yǎng)一周后，隨機取出10只作為正常組(對照)，生理鹽水灌胃(10mL/kg)，其余小鼠用300mg/Kg.d腺嘌呤灌胃給藥，每天一次，連續(xù)21天，檢測小鼠血肌酐和尿素氮含量。小鼠血肌酐含量高于115mM/L和尿素氮含量高于8.05mM/L時表不建模成功。取建模成功小鼠隨機分成6組，每組10只，分別為:模型組(生理鹽水10mL/kg)、陽性組(海昆腎喜膠囊150mg/Kg)、LEP-1b 低劑`量組(100mg/Kg)、LEP-1b 高劑量組(200mg/kg)，CLEP-1b 低劑量組(100mg/Kg)、CLEP-1b 高劑量組(200mg/Kg)。連續(xù)給藥 28 天。
[0030](5)相關指標測定:
[0031]小鼠攝食量、體重和腎臟指數(shù)測定:
[0032]給藥過程中，每天測定攝食量，取平均值。末次給藥后，小鼠稱體重，脫頸椎處死，取雙側(cè)腎臟，稱質(zhì)量，計算腎臟指數(shù)。
[0033]腎臟指數(shù)=雙腎質(zhì)量/小鼠體重X 100%
[0034]腎臟組織病理學檢查:
[0035]取單側(cè)腎臟，置AFF固定液中固定，0.C.T.包埋劑包埋、切片，HE (Haematoxylinand Eosin)染色，光學顯微鏡下觀察拍照。
[0036]小鼠血液生化指標測定:
[0037]小鼠脫頸椎處死后眼球采血，所得血液室溫靜置半小時自然凝血，5000r/min離心5min，取血清4°C保存，用于測定小鼠血液生化指標，包括BUN、Scr、TP、ALB等。按試劑盒說明書方法檢測。
[0038]小鼠腎、肝組織勻漿的抗氧化物酶活等指標測定:
[0039]準確稱取小鼠腎組織、肝重量，按重量(g):體積(mL)=l:10的比例加入勻漿介質(zhì)(質(zhì)量分數(shù)為0.9%的生理鹽水)，冰水浴條件下機械勻漿，3000r/min離心lOmin，取上清得質(zhì)量分數(shù)為10%組織勻漿液，分別測定勻漿液中SOD、GSH-PX、CAT、GSH和MDA的含量。按照試劑盒說明書方法檢測。
[0040](6)藥理實驗結(jié)果:
[0041]表1給出了上述粒毛盤菌YM281胞外多糖及其羧甲基化衍生物對腎衰小鼠攝食量、體重和腎臟指數(shù)的影響。
[0042]表1 LEP-lb、CLEP-1b對腎衰小鼠攝食量、體重和腎臟指數(shù)的影響
【權(quán)利要求】
1.一種粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物，其特征在于是將菌株保藏編號為CCTCCNo:M2011196的粒毛盤菌發(fā)酵提取純化后得到的胞外多糖進行羧甲基化修飾，按:取Ig粒毛盤菌胞外多糖溶于50ml 2.0mol/L NaOH溶液中，在200-400r/min轉(zhuǎn)速攪拌下加入5g氯乙酸，于60°C繼續(xù)攪拌反應3h，冷卻至室溫，用冰乙酸中和至pH為7.0，過濾后將濾液用截留分子量為3500Da的透析袋透析36-48h，收集透析袋內(nèi)溶液加入其體積4~5倍的體積比濃度為95%的乙醇于4°C醇沉12-24h，收集沉淀后加入50mL蒸餾水復溶，冷凍干燥后，所得到的多糖羧甲基化衍生物CLEP-1b ;其基本結(jié)構(gòu)為(1 — 3)-，(I — 6)-β-D-葡聚糖，其中羧甲基基團-CH2COOH與其C-3羥基的O連接。
2.權(quán)利要求1所述粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物在制抗腎衰藥中的用途，其特征在于菌株保藏編號為CCTCC Νο:Μ 2011196的粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物用于制備抗慢性腎衰的藥物。
3.如權(quán)利要求2所述的粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物在制抗腎衰藥中的用途，特征在于所述制備抗慢性腎衰的藥物，是按照藥劑學的常規(guī)方法，將有效量的菌株保藏編號為CCTCC Νο:Μ 2011196的粒毛盤菌胞外多糖羧甲基化衍生物與藥用輔料混勻后制備成片劑或膠囊。
【文檔編號】A61K31/715GK103755827SQ201410020149
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】葉明 , 吳艷娜, 荊蓮艷 申請人:合肥工業(yè)大學