一種流腦疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種流腦疫苗。該流腦疫苗由A群腦膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria?meningitidis）發(fā)酵得到的多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、乳糖和水組成。實驗證明，本發(fā)明方法制備的多糖中內(nèi)毒素含量非常低，為1EU/μg，由該多糖制成的疫苗中內(nèi)毒素含量非常低，為1EU/μg。本發(fā)明的疫苗安全、有效，接種后不良反應(yīng)更小，利于受眾接納，有利于國家預(yù)防免疫政策推廣。
【專利說明】一種流腦疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種四價流腦多糖疫苗及其制備方法及工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性腦脊髓膜炎，是由腦膜炎雙球菌感染腦膜或者腦脊髓膜引起的呼吸道傳染病，臨床表現(xiàn)主要有高燒、頭痛、噴射狀嘔吐、脖子發(fā)硬。也可引起敗血癥，皮膚出現(xiàn)紫色淤血、瘀斑，腦膜炎會引起腦部損傷而遺留聽力下降或耳聾、智力低下等后遺癥。病死率在5%~10%。流腦冬春季節(jié)病例高發(fā)，一般11~12月份病例開始增多，第二年的2~5月份為發(fā)病高峰期。該病是發(fā)病率高，危險性大，是嚴(yán)重危害兒童健康的傳染病。流行性腦脊髓膜炎(流腦)和敗血癥是由多種血清群的腦膜炎奈瑟菌引起的，本病在全球呈地方性流行，主要由A群、B群或C群腦膜炎球菌引起，但Y群也變得越來越重要，至少在美國部分地區(qū)如此。A群腦膜炎球菌是較大流行的主要致病血清群，特別是在所謂的非洲“流腦流行帶”，每隔7~14年就會出現(xiàn)一次較大流行，引起兒童和年輕成人超額發(fā)病率與死亡率。近年來，這些地區(qū)及沙特阿拉伯也出現(xiàn)過W135群導(dǎo)致的流腦爆發(fā)，一些西方國家則出現(xiàn)過C群引起的流腦爆發(fā)。即使是在醫(yī)療條件比較完善的地方，流腦病死率仍然很高(5%~15%)。一般來說，僅靠藥物預(yù)防措施來控制此病是不夠的。
[0003]目前主要采取注射流腦疫苗的方式來預(yù)防流行性腦脊髓膜炎。我國主要接種A群腦膜炎多糖疫苗和/或AC群腦膜炎多糖疫苗為主，研制多價疫苗和聯(lián)合疫苗是疫苗發(fā)展方向，但是疫苗中的非主要成分的疊加又會帶來副反應(yīng)大的問題，如何有效去除細(xì)菌內(nèi)毒素是其中最為突出的難題。細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性桿菌的細(xì)胞壁成分之一，是一種脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),LPS是腦膜炎球菌感染的主要致病物質(zhì),進(jìn)入人體能引起機體發(fā)熱，又稱為熱原質(zhì)。按照現(xiàn)有的腦膜炎多糖疫苗的細(xì)菌內(nèi)毒素藥典標(biāo)準(zhǔn)，大部分人接種疫苗只有非常輕微的發(fā)熱反應(yīng)，但是個別人會因此出現(xiàn)嚴(yán)重發(fā)熱反應(yīng)。因此，去除流腦多糖中的細(xì)菌內(nèi)毒素，減少疫苗不良反應(yīng)，是研制多價疫苗和聯(lián)合疫苗，提高疫苗品質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)。`

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個目的是提供一種四價流腦疫苗及其制備方法和工藝。
[0005]本發(fā)明所提供的流腦疫苗，由A群腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)發(fā)酵得到的多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、乳糖和水組成；
[0006]其中，A群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70yg/ml~130 μ g/ml，C群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70 μ g/ml~130 μ g/ml，Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70 μ g/ml~130 μ g/ml，W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70μ g/ml~130μ g/ml，乳糖在疫苗中的濃度為5mg/ml~10mg/ml。[0007]上述流腦疫苗可按照如下方法制備。
[0008]本發(fā)明所提供的流腦疫苗的制備方法，包括如下步驟:
[0009](1)分別發(fā)酵A群腦膜炎奈瑟氏球菌、C群腦膜炎奈瑟氏球菌、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌，得到的發(fā)酵液依次記作A菌發(fā)酵液、C菌發(fā)酵液、Y菌發(fā)酵液、Wl35菌發(fā)酵液；
[0010](2)分別從A菌發(fā)酵液、C菌發(fā)酵液、Y菌發(fā)酵液、Wl35菌發(fā)酵液中分離多糖，將得到的多糖依次記作A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖；
[0011](3)將A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分別用QS印haroseFF瓊脂糖凝膠進(jìn)行柱層析，收集洗脫峰，即分別得到由A群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖；
[0012](4)將由A群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、乳糖和水按照權(quán)利要求1中所述濃度進(jìn)行混合，即得到流腦疫苗。
[0013]上述制備方法中，所述步驟(3)中，用QS印haroseFF瓊脂糖凝膠進(jìn)行柱層析的方法中，上樣的樣品為分別將步驟(2)得到的A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分別用水溶解后得到的多糖濃度為10~20mg/ml的溶液， 洗脫液為生理鹽水，監(jiān)測波長為206nm，收集第一峰。
[0014]上述制備方法中，在所述柱層析之后，還包括如下超濾脫鹽步驟:將柱層析收集的樣品用截留分子量為IOOkD的膜包，用10~20倍體積水進(jìn)行洗濾脫鹽。
[0015]上述制備方法中，在所述超濾脫鹽步驟之后，還包括如下除菌步驟:將脫鹽樣品用
0.2μπι孔徑膜進(jìn)行除菌過濾。
[0016]上述制備方法中，所述步驟(2)中，從發(fā)酵液中分離多糖的方法包括如下步驟:
[0017]I)分別去除A菌發(fā)酵液、C菌發(fā)酵液、Y菌發(fā)酵液和W135菌發(fā)酵液中的菌體；
[0018]2)為如下a)和/或b):
[0019]a)、用十六烷基三甲基溴化銨分別沉淀去除菌體的A菌發(fā)酵液或去除菌體的C菌發(fā)酵液中的多糖，分別收集沉淀；
[0020]b)、先用截留分子量為30kD的超濾膜分別對去除菌體的Y菌發(fā)酵液或去除菌體的W135菌發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，得到Y(jié)菌濃縮液或W135菌濃縮液；再用十六烷基三甲基溴化銨分別沉淀Y菌濃縮液或W135菌濃縮液中的多糖，分別收集沉淀；
[0021]3)、用氯化鈣分別將步驟2)所得沉淀中的多糖與十六烷基三甲基溴化銨解離，得到解離液；
[0022]4)、用95%乙醇水溶液分別去除步驟3)的解離液中的雜質(zhì)，收集上清液；
[0023]5)、用95%乙醇水溶液分別從步驟4)的上清液中沉淀多糖，收集沉淀；
[0024]6)、依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌步驟5)所得沉淀；
[0025]7)、分別將步驟6)洗滌后沉淀進(jìn)行干燥；
[0026]8)、將步驟7)所得干燥后沉淀用1:10飽和中性醋酸鈉水溶液溶解，分別得到粗糖溶液，依次記作A菌粗糖溶液、C菌粗糖溶液、Y菌粗糖溶液、Wl35菌粗糖溶液；
[0027]9)、用酚分別對步驟8)所得粗糖溶液進(jìn)行提取，棄去中層及酚層，收集上層液；[0028]10)、用氯化鈣水溶液分別對步驟9)所得上層液進(jìn)行透析，收集透析后的溶液；
[0029]11)、用95%乙醇水溶液分別對步驟10)所得透析后的溶液進(jìn)行沉淀，收集沉淀；
[0030]12)、依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌步驟11)所得沉淀；
[0031]13)、分別將步驟12)洗滌后沉淀進(jìn)行干燥，分別得到A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖。
[0032]上述制備方法中，所述步驟2)的a)中，用十六烷基三甲基溴化銨分別沉淀去除菌體A菌發(fā)酵液或去除菌體C菌發(fā)酵液中多糖的方法包括如下步驟:分別向所述去除菌體的A菌發(fā)酵液或去除菌體的C菌發(fā)酵液中加入十六烷基三甲基溴化銨水溶液，使十六烷基三甲基溴化銨在混合液中的濃度為0.1%~0.3% (質(zhì)量百分含量)，在溫度為10~15°C的條件下攪拌反應(yīng)0.5~I小時，再靜置10~16小時，離心，收集沉淀；
[0033]上述制備方法中，所述步驟2)的b)中，用十六烷基三甲基溴化銨分別沉淀Y菌濃縮液或W135菌濃縮液中的多糖的方法包括如下步驟:分別向所述Y菌濃縮液或W135菌濃縮液中加入十六烷基三甲基溴化銨水溶液，使十六烷基三甲基溴化銨在混合溶液中的濃度為0.1%~0.3% (質(zhì)量百分含量)，在溫度為10~15°C的條件下攪拌反應(yīng)0.5~I小時，再靜置10~16小時，離心，收集沉淀；
[0034]上述制備方法中，所述步驟3)中，用氯化鈣解離的方法包括如下步驟:向所述沉淀中加入2mol/L氯化鈣水溶液,2mol/L氯化鈣水溶液與所述沉淀的配比為3~IOml:lg,再加入水，使氯化鈣在體系中的最終濃度為lmol/L，攪拌I~3小時，使多糖與十六烷基三
甲基溴化銨解離；
[0035]上述制備方法中，所述步驟4)中，用95%乙醇水溶液分別去除步驟3)的解離液中的雜質(zhì)的方法包括如下步驟:分別向解離液中加入95%乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的體積百分比為25%，混勻，在2~8°C靜置I~3小時，離心去沉淀，收集上清液；
[0036]上述制備方法中，所述步驟5)中，用95%乙醇水溶液分別從步驟4)的上清液中沉淀多糖的方法包括如下步驟:向上清液中加入95%乙醇水溶液，至乙醇在混合液中的體積百分比為80%，混勻，在2~8°C條件下靜置8~16小時，離心去上清，收集沉淀；
[0037]上述制備方法中，所述步驟8)中，所述1:10飽和中性醋酸鈉水溶液由飽和醋酸鈉水溶液和水組成，其中飽和醋酸鈉水溶液與水的體積比為1:9,1:10飽和中性醋酸鈉水溶液的PH值為7.0 ;各粗糖溶液中多糖的濃度均為10~25mg/ml ；
[0038]上述制備方法中，所述步驟9)中，用酚對粗糖溶液進(jìn)行提取的方法包括如下步驟:分別向各粗糖溶液中加入2倍體積的酚，混勻，離心分離，棄去中層及酚層，收集上層液；
[0039]上述制備方法中，所述步驟10)中，用氯化鈣水溶液透析的方法中，氯化鈣水溶液的濃度為0.lmol/L ；
[0040]上述制備方法中，所述步驟11)中，用95%乙醇水溶液沉淀的方法包括如下步驟:向透析后的溶液中加入95%乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的體積百分比為80%，混勻，在2~8°C條件下靜置8~16小時，離心去上清，收集沉淀。
[0041]上述制備方法中，所述發(fā)酵的方法包括如下發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟:將菌種分別以5 XlOVml的濃度接種于裝有流腦半綜合液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，37°C培養(yǎng)6~8小時，至對數(shù)生長后期，得到發(fā)酵液，將發(fā)酵罐中所有物質(zhì)記作發(fā)酵液。
[0042]上述制備方法中，所述發(fā)酵的方法中，在所述發(fā)酵罐培養(yǎng)之前，還包括如下步驟:[0043]I)制備生產(chǎn)菌種:
[0044]第一代培養(yǎng):將工作種子批菌種接種在10%羊血普通瓊脂培養(yǎng)基上，放37°C、8%二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)18小時；
[0045]第二代和第三代培養(yǎng):將第一代菌種接種于流腦半綜合培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12小時；
[0046]將第二代菌種接種于流腦半綜合培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12小時；
[0047]2)第四代菌種罐培養(yǎng)
[0048]將第三代菌種以5X 108/ml的濃度接種于裝有流腦半綜合液體培養(yǎng)基的菌種罐中，37°C培養(yǎng)3~4小時。
[0049]其中，所述10%羊血普通瓊脂培養(yǎng)基的組成及其在培養(yǎng)基中的濃度可為如下:胰蛋白胨，1% (質(zhì)量)；酵母浸粉，0.3% (質(zhì)量)；氯化鈉，0.5% (質(zhì)量)；牛肉浸膏，0.7% (質(zhì)量)；瓊脂粉，1.6% (質(zhì)量)；注射用水，加至總量；新鮮去纖維羊血，10% (體積)；葡萄糖水溶液(葡萄糖水溶液濃度為50%)，I % (體積)。
[0050]上述任一所述疫苗或任一所述疫苗的制備方法中，所述A群腦膜炎奈瑟氏球菌為A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌株A4，其在CMCC的編號為29201 ；
[0051]所述C群腦膜炎奈瑟氏球菌為C群腦膜炎奈瑟氏球菌菌株Cl I，其在CMCC的編號為 29205 ；
[0052]所述Y群腦膜炎奈瑟氏球菌為Y群腦膜炎奈瑟氏球菌菌株Y，其在CMCC的編號為29303 ；
[0053]所述W135群腦膜炎奈瑟氏球`菌為W135群腦膜炎奈瑟氏球菌菌株W135，其在CMCC的編號為29055。
[0054]上述任一所述疫苗或任一所述疫苗的制備方法中，所述水均為生理鹽水或無熱源注射用水。
[0055]實驗證明，本專利發(fā)明工藝制備的A群多糖、C群多糖、Y群多糖、W135群多糖中內(nèi)毒素含量均非常低，為IEU/μ g，大大低于國家要求小于IOEU/μ g。由該多糖制成的疫苗中內(nèi)毒素含量非常低，最高為lEU/yg。本發(fā)明的疫苗安全性很好，無明顯的全身反應(yīng)。
【具體實施方式】
[0056]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0057]本實施例中所使用的菌株為A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌株A4CMCC29201，C群腦膜炎奈瑟氏球菌菌株C11CMCC29205，Y群腦膜炎奈瑟氏球菌菌株YCMCC29303，W135群腦膜炎奈瑟氏球菌菌株W135CMCC29055，各菌株均購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)。
[0058]10%羊血普通瓊脂培養(yǎng)基的組成:
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種流腦疫苗，由A群腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)發(fā)酵得到的多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、乳糖和水組成； 其中，A群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70μ g/ml~130 μ g/ml，C群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70μ g/ml~130μ g/ml，Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70 μ g/ml~130 μ g/ml,W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖在疫苗中的濃度為70 μ g/ml~130 μ g/ml，乳糖在疫苗中的濃度為 5mg/ml ~10mg/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流腦疫苗，其特征在于:所述流腦疫苗按照如下權(quán)利要求3~9中任一所述方法制備。
3.一種制備權(quán)利要求1中所述流腦疫苗的方法，包括如下步驟: (O分別發(fā)酵A群腦膜炎奈瑟氏球菌、C群腦膜炎奈瑟氏球菌、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌，得到的發(fā)酵液依次記作A菌發(fā)酵液、C菌發(fā)酵液、Y菌發(fā)酵液、W135菌發(fā)酵液； (2)分別從A菌發(fā)酵液、C菌發(fā)酵液、Y菌發(fā)酵液、W135菌發(fā)酵液中分離多糖，將得到的多糖依次記作A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖； (3)將A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分別用QSepharose FF瓊脂糖凝膠進(jìn)行柱層析，收集洗脫峰，即分別得到由A群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖； (4)將由A群腦膜炎奈瑟氏`球菌發(fā)酵得到的多糖、C群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖和W135群腦膜炎奈瑟氏球菌發(fā)酵得到的多糖、乳糖和水按照權(quán)利要求1中所述濃度進(jìn)行混合，即得到流腦疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于:所述步驟(3)中,用QSepharoseFF瓊脂糖凝膠進(jìn)行柱層析的方法中，上樣的樣品為分別將步驟(2)得到的A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分別用水溶解后得到的多糖濃度為10~20mg/ml的溶液，洗脫液為生理鹽水，監(jiān)測波長為206nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，從發(fā)酵液中分離多糖的方法包括如下步驟: O分別去除A菌發(fā)酵液、C菌發(fā)酵液、Y菌發(fā)酵液和W135菌發(fā)酵液中的菌體； 2)為如下a)和/或b): a)、用十六烷基三甲基溴化銨分別沉淀去除菌體的A菌發(fā)酵液或去除菌體的C菌發(fā)酵液中的多糖，分別收集沉淀； b)、先用截留分子量為30kD的超濾膜分別對去除菌體的Y菌發(fā)酵液或去除菌體的Wl35菌發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，得到Y(jié)菌濃縮液或W135菌濃縮液；再用十六烷基三甲基溴化銨分別沉淀Y菌濃縮液或W135菌濃縮液中的多糖，分別收集沉淀； 3)、用氯化鈣分別將步驟2)所得沉淀中的多糖與十六烷基三甲基溴化銨解離，得到解離液； 4)、用95%乙醇水溶液分別去除步驟3)的解離液中的雜質(zhì)，收集上清液；5)、用95%乙醇水溶液分別從步驟4)的上清液中沉淀多糖，收集沉淀； 6)、依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌步驟5)所得沉淀； 7)、分別將步驟6)洗滌后沉淀進(jìn)行干燥； 8)、將步驟7)所得干燥后沉淀用1:10飽和中性醋酸鈉水溶液溶解，分別得到粗糖溶液，依次記作A菌粗糖溶液、C菌粗糖溶液、Y菌粗糖溶液、Wl35菌粗糖溶液； 9)、用酚分別對步驟8)所得粗糖溶液進(jìn)行提取，棄去中層及酚層，收集上層液； 10)、用氯化鈣水溶液分別對步驟9)所得上層液進(jìn)行透析，收集透析后的溶液； 11)、用95%乙醇水溶液分別對步驟10)所得透析后的溶液進(jìn)行沉淀，收集沉淀； 12)、依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌步驟11)所得沉淀； 13)、分別將步驟12)洗滌后沉淀進(jìn)行干燥，分別得到A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的方法，其特征在于: 所述步驟2)的a)中，用十六烷基三甲基溴化銨分別沉淀去除菌體的A菌發(fā)酵液或去除菌體的C菌發(fā)酵液中的多糖的方法包括如下步驟:分別向所述去除菌體的A菌發(fā)酵液或去除菌體的C菌發(fā)酵液中加入十六烷基三甲基溴化銨水溶液，使十六烷基三甲基溴化銨在混合液中的濃度為0.1%~0.3% (質(zhì)量百分含量)，在溫度為10~15°C的條件下攪拌反應(yīng).0.5~I小時，再靜置10~16小時，離心，收集沉淀； 所述步驟2)的b)中，用十六烷基三甲基溴化銨分別沉淀Y菌濃縮液或Wl35菌濃縮液中的多糖的方法包括如下步驟:分別向所述Y菌濃縮液或W135菌濃縮液中加入十六烷基三甲基溴化銨水溶液，使十六烷基三甲基溴化銨在混合溶液中的濃度為0.1%~0.3%(質(zhì)量百分含量)，在溫度為10~15°C的條件下攪拌反應(yīng)0.5~I小時,再靜置10~16小時,離心，收集沉淀； 所述步驟3)中，用氯化鈣解離的方法包括如下步驟:向所述沉淀中加入2mol/L氯化鈣水溶液，2mol/L氯化鈣水溶液與所述沉淀的配比為3~IOml: lg，再加入水，使氯化鈣在體系中的最終濃度為lmol/L，攪拌I~3小時，使多糖與十六烷基三甲基溴化銨解離； 所述步驟4)中，用95%乙醇水溶液分別去除步驟3)的解離液中的雜質(zhì)的方法包括如下步驟:分別向解離液中加入95%乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的體積百分比為25%，混勻，在2~8°C靜置I~3小時，離心去沉淀，收集上清液； 所述步驟5)中，用95%乙醇水溶液分別從步驟4)的上清液中沉淀多糖的方法包括如下步驟:向上清液中加入95%乙醇水溶液，至乙醇在混合液中的體積百分比為80%，混勻，在2~8°C條件下靜置8~16小時，離心去上清，收集沉淀； 所述步驟8)中，所述1:10飽和中性醋酸鈉水溶液由飽和醋酸鈉水溶液和水組成，其中飽和醋酸鈉水溶液與水的體積比為1:9，1:10飽和中性醋酸鈉水溶液的pH值為7.0 ;各粗糖溶液中多糖的濃度均為10~25mg/ml ； 所述步驟9)中，用酚對粗糖溶液進(jìn)行提取的方法包括如下步驟:分別向各粗糖溶液中加入2倍體積的酚，混勻，離心分離，棄去中層及酚層，收集上層液； 所述步驟10)中，用氯化鈣水溶液透析的方法中，氯化鈣水溶液的濃度為0.lmol/L ； 所述步驟11)中，用95%乙醇水溶液沉淀的方法包括如下步驟:向透析后的溶液中加入95%乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的體積百分比為80%，混勻，在2~8°C條件下靜置8~.16小時，離心去上清，收集沉淀。
7.根據(jù)權(quán)利要求3~6中任一所述的方法,其特征在于: 所述發(fā)酵的方法包括如下發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟: 將菌種分別以5X 108/ml的濃度接種于裝有流腦半綜合液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，37°C培養(yǎng)6~8小時，至對數(shù)生長后期，得到發(fā)酵液，將發(fā)酵罐中所有物質(zhì)記作發(fā)酵液。
8.根據(jù)權(quán)利要求3~7中任一所述的方法,其特征在于: 所述發(fā)酵的方法中，在所述發(fā)酵罐培養(yǎng)之前，還包括如下步驟: 1)制備生廣囷種: 第一代培養(yǎng):將工作種子批菌種接種在10 %羊血普通瓊脂培養(yǎng)基上，放37°C、8%二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)18小時； 第二代和第三代培養(yǎng):將第一代菌種接種于流腦半綜合培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12小時； 將第二代菌種接種于流腦半綜合培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12小時； 2)第四代菌種罐培養(yǎng) 將第三代菌種以5X 108/ml的濃度接種于裝有流腦半綜合液體培養(yǎng)基的菌種罐中，.37°C培養(yǎng)3~4小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗，或根據(jù)權(quán)利要求3~8中任一所述的方法，其特征在于:所述A群腦膜炎奈瑟氏球菌為A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌株A4，其在CMCC的編號為.29201 ； 所述C群腦膜炎奈瑟氏球菌為C群腦膜炎奈瑟氏球菌菌株C11，其在CMCC的編號為.29205 ； 所述Y群腦膜炎奈瑟氏球菌為Y群腦膜炎奈瑟氏球菌菌株Y，其在CMCC的編號為.29303 ； 所述W135群腦膜炎奈瑟氏 球菌為W135群腦膜炎奈瑟氏球菌菌株W135，其在CMCC的編號為29055。
【文檔編號】A61K39/095GK103721249SQ201410020295
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】崔曉峰, 馬小偉, 許項可, 潘若文, 安文琪, 范蓓 申請人:華蘭生物工程股份有限公司, 華蘭生物疫苗有限公司