通過干細(xì)胞營養(yǎng)物進(jìn)行的器官的形成和復(fù)壯以及酒精損傷的器官的再生的制作方法
【專利摘要】營養(yǎng)干細(xì)胞以進(jìn)行器官再生和預(yù)防酒精相關(guān)性疾病例如胎兒酒精綜合征（FAS）和肝硬化的機(jī)制。已發(fā)現(xiàn)這些干細(xì)胞營養(yǎng)物正面影響皮膚、肝臟、大腦神經(jīng)元、胰腺和胃腸道。膽固醇補(bǔ)充在暴露于酒精的斑馬魚胚胎中預(yù)防胎兒酒精譜系缺陷（FASD）。通過使用斑馬魚模型，發(fā)現(xiàn)酒精通過破壞至關(guān)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子sonic hedgehog(Shh)的依賴于膽固醇的激活來干擾胚胎發(fā)育。對暴露于酒精的胚胎補(bǔ)充膽固醇恢復(fù)了所述分子通路的功能性并且預(yù)防了FASD樣缺陷的發(fā)生。通過脂質(zhì)化學(xué)分析和拉曼光譜法鑒定了用于診斷酒精相關(guān)性疾病的新型生物標(biāo)記物。
【專利說明】通過干細(xì)胞營養(yǎng)物進(jìn)行的器官的形成和復(fù)壯以及酒精損傷 的器官的再生
[0001] 本申請是申請日為2007年12月10日、申請?zhí)枮?00780051025. 2、發(fā)明名稱為"通 過干細(xì)胞營養(yǎng)物進(jìn)行的器官的形成和復(fù)壯以及酒精損傷的器官的再生"的發(fā)明專利申請的 分案申請。
[0002] 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明總地說來涉及通過干細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行的器官的形成和復(fù)壯 (rejuvenation)以及酒精損傷的器官再生中的突破。已發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)干細(xì)胞進(jìn)行器官再生和預(yù) 防酒精相關(guān)性疾病例如胎兒酒精綜合征（FAS)和肝硬化的新機(jī)制。已發(fā)現(xiàn)這些干細(xì)胞營養(yǎng) 物正面影響皮膚、肝、大腦神經(jīng)元、胰腺和胃腸道。
[0004] 相關(guān)領(lǐng)域的描述
[0005] 孕婦對酒精的消耗可引起胎兒酒精譜系缺陷（fetal alcohol spectrum defect, FASD)，是一種先天性疾病，其特征在于一系列發(fā)育性缺陷，包括神經(jīng)的、顱面的、心臟的和 四肢的畸形以及全身性（generalized)生長遲緩。FASD仍然是重大的臨床挑戰(zhàn)和重要的社 會問題。盡管在描繪促成酒精誘導(dǎo)的出生缺陷的機(jī)制中已取得巨大進(jìn)步，但我們的知識空 白仍然存在；例如，為什么酒精優(yōu)先在特定器官中誘導(dǎo)一系列缺陷以及為什么缺陷譜是可 重現(xiàn)的和可預(yù)測的。
[0006] 酒精相關(guān)性先天缺陷（alcohol related birth defect)僅在美國每天就產(chǎn)生大 約1〇〇個智力低于平均IQ的嬰兒和許多具有畸形器官的嬰兒。在美國用于這些兒童的護(hù) 理的費(fèi)用維持在撥予衛(wèi)生保健系統(tǒng)的據(jù)估100億美元的年度費(fèi)用。胎兒酒精綜合征是用于 描述一系列影響神經(jīng)和心血管系統(tǒng)的發(fā)育性缺陷的術(shù)語。該綜合征還可導(dǎo)致生長遲緩、面 部異常（facial abnormality)和降低的心理機(jī)能（lowered mental functioning)。
[0007] 對于胎兒酒精綜合癥的嚴(yán)重度是至關(guān)重要的是消耗的酒精的量、消耗的持續(xù)時間 和妊娠的時機(jī)（timing of the pregnancy)。例如，懷有一個月大胎兒的母親消耗的酒精可 改變大腦的發(fā)育；在4至6周，可改變面部結(jié)構(gòu)、心臟和視力。2至3個月進(jìn)入胚胎發(fā)育，酒 精消耗可導(dǎo)致額外指或趾（digit)的生長。消耗的酒精的量同樣重要。在錯誤的時間既使 消耗相當(dāng)于一份12盎司啤酒的量可破壞信號傳導(dǎo)通路并導(dǎo)致缺陷。增加胎兒暴露的酒精 量導(dǎo)致的綜合征嚴(yán)重度的增加。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 胎兒酒精綜合征
[0010] 申請人:已發(fā)現(xiàn)膽固醇的補(bǔ)充在暴露于酒精的斑馬魚胚胎中預(yù)防了胎兒酒精譜系 缺陷。通過使用斑馬魚模型， 申請人:已發(fā)現(xiàn)酒精通過破壞稱為sonic hedgehog(Shh)的至 關(guān)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的依賴于膽固醇的激活來干擾胚胎發(fā)育。對暴露于酒精的胚胎補(bǔ)充 膽固醇恢復(fù)了分子通路的功能性和預(yù)防了此類缺陷的發(fā)生。斑馬魚中的酒精相關(guān)性缺陷由 最低限度的酒精暴露（相當(dāng)于120磅的婦女飲用一瓶12盎司的啤灑）引起。所述發(fā)現(xiàn)表 明即使是少量的酒精對于孕婦也可能是不安全的，并且也顯示膽固醇的補(bǔ)充是預(yù)防胎兒酒 精缺陷的有效方法。
[0011] 少量的酒精可干擾胎兒的生長，但加入的膽固醇可幫助預(yù)防大批由于酒精暴露導(dǎo) 致的神經(jīng)和身體缺陷。膽固醇對胎兒發(fā)育（fetal development)是如此重要以至于不具有 足夠高的生理膽固醇水平的孕婦，即使在不消耗酒精的情況下亦處于產(chǎn)生具有發(fā)育問題的 嬰兒的增加的風(fēng)險中。酒精（即使以少量）阻止了膽固醇協(xié)調(diào)胚胎中參與調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)和 器官發(fā)育的復(fù)雜的一系列事件的能力。鼓舞人心的是，給暴露于酒精的斑馬魚胚胎補(bǔ)充膽 固醇可恢復(fù)正常發(fā)育。
[0012] 酒精干擾指導(dǎo)胎兒發(fā)育的精確地協(xié)調(diào)的生物化學(xué)信號傳導(dǎo)通路。膽固醇是控制 組織發(fā)育的模式的單個通路所必需的，并且其易于受到酒精作用的影響。對胎兒酒精綜合 征的分子基礎(chǔ)的該新的深入了解可具有深遠(yuǎn)的含意并且提出新的產(chǎn)前保健，所述產(chǎn)前保健 可預(yù)防在懷孕期間由酒精消耗引起的發(fā)育性缺陷
[0013] 成體器官的復(fù)壯
[0014] 給酗酒者補(bǔ)充膽固醇可幫助減緩或預(yù)防酒精性肝病，甚至慢性酒精誘導(dǎo)的肝硬化 (其特征在于瘢痕組織替換肝組織，從而導(dǎo)致肝功能的累進(jìn)喪失）的發(fā)生。該發(fā)現(xiàn)為確保孕 婦不應(yīng)當(dāng)使她們的膽固醇降得太低的當(dāng)前實(shí)踐提供了進(jìn)一步的支持。最近的研究發(fā)現(xiàn)，月艮 用稱為他汀類藥物的降膽固醇藥的婦女處于生育出具有發(fā)育問題的嬰兒的更大風(fēng)險中。
[0015] 該新概念，干細(xì)胞營養(yǎng)物和相關(guān)技術(shù)，對于即將來臨的數(shù)年中引領(lǐng)基于成體干細(xì) 胞的醫(yī)療保健和臨床實(shí)踐也是具有重大意義的。用于成人保健的該公開的技術(shù)將在抗衰 老、器官和組織的再生以及酒精相關(guān)性疾病的預(yù)防中具有重大影響。
[0016] 干細(xì)胞營養(yǎng)物是具有處方和非處方適用性的食品。因而市場通常是：
[0017] 維生素補(bǔ)充劑
[0018] 目標(biāo)為特定器官的補(bǔ)充劑
[0019] 營養(yǎng)食品添加劑
[0020] 具有多種遞送方法的處方藥物
[0021] 用于經(jīng)歷懷孕的婦女的補(bǔ)充劑
[0022] 結(jié)合意在示例性和說明性但非限定范圍的系統(tǒng)、工具和方法描述和舉例說明下列 實(shí)施方案和其方面。在不同的實(shí)施方案中，已減少或消除一個或多個上述問題，然而其他實(shí) 施方案涉及其他的改進(jìn)。除了上述示例性方面和實(shí)施方案外，通過參考附圖和通過研究下 列描述，另外的方面和實(shí)施方案將變得明了。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 附圖的幾個示圖的概述
[0024] 圖1圖解例證酒精對胚胎的存活和表型的劑量依賴性作用。
[0025] 圖2顯示誘導(dǎo)與Hh-抑制的和膽固醇不足的胚胎的表型譜相似的表型譜的胎兒酒 精暴露的作用的復(fù)印。
[0026] 圖3顯示酒精暴露通過減少Shh的翻譯后膽固醇修飾來抑制Hh-信號傳導(dǎo)。
[0027] 圖4圖解證明酒精暴露降低胚胎中的膽固醇水平。
[0028] 圖5顯示膽固醇補(bǔ)充劑拯救酒精誘導(dǎo)的胚胎缺陷
[0029] 圖6顯示窖蛋白-1和Shh在從大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC8B分離的蛋白質(zhì)裂解物中 分布的Western印跡分析。
[0030] 圖7顯示證明由酒精暴露引起的窖蛋白-1中的Shh減少的免疫沉淀測定法。
[0031] 圖8顯示證明窖蛋白-1和Shh在肝星狀細(xì)胞中的共定位的免疫組織化學(xué)的復(fù)印。
[0032] 圖9顯示酒精擾亂Shh與窖蛋白-1在脂質(zhì)筏（lipid raft)中的共定位以及Shh 在高爾基基細(xì)胞器中的積累的Western印跡分析。
[0033] 圖10顯示酒精破壞Shh進(jìn)入ER區(qū)室和在高爾基細(xì)胞器中積累的免疫組織化學(xué)分 析。
[0034] 圖11證明酒精暴露破壞Shh分泌入細(xì)胞外基質(zhì)。
[0035] 圖12顯示在轉(zhuǎn)基因斑馬魚的肝中特異性表達(dá)的GFP的融合熒光圖像。
[0036] 圖13顯示thru細(xì)胞流式計(jì)量術(shù)用于從LFABP-GFP肝分離GFP/Ptc+細(xì)胞。
[0037] 圖14顯示FGF/HGF肝誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)的GFP/Ptc+細(xì)胞。
[0038] 圖15顯示GFP-P/Ptc+細(xì)胞整合入膽小管（bile ductular)上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞并 且開始在預(yù)先損傷的肝中表達(dá)GFP。
[0039] 圖16顯示酒精破壞Shh蛋白在脂質(zhì)筏中的共定位。
[0040] 圖17顯示酒精暴露在胚胎中破壞游離膽固醇/膽固醇平衡和轉(zhuǎn)運(yùn)。
[0041] 圖18顯示表征酒精和膽固醇的特征（signature)的拉曼位移光譜分析。
[0042] 圖19顯示肝星狀細(xì)胞中的hedgehog活性。
[0043] 圖20是膽固醇衍生物組分預(yù)防發(fā)育性缺陷的圖解例證。
[0044] 圖21顯示證明膽固醇和膽固醇樣分子預(yù)防酒精誘導(dǎo)的胚胎發(fā)育性缺陷的復(fù)印。
[0045] 參照附圖的圖片舉例說明示例性實(shí)施方案。本文中公開的實(shí)施方案和圖片在被認(rèn) 為是舉例說明性的而非限定性的。
[0046] 發(fā)明詳述
[0047] 胚兒酒精綜合癥的膽固醇治療
[0048] 在本申請中，在原腸胚形成過程中，斑馬魚胚胎對低水平酒精的暴露阻止了通過 膽固醇進(jìn)行的Sonic hedgehog的共價修飾。這導(dǎo)致受損的Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和導(dǎo)致與FASD極 相似的永久性發(fā)育缺陷的劑量依賴性譜。此外，用膽固醇補(bǔ)充暴露于酒精的胚胎拯救了 Shh 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的損失，并且預(yù)防胚胎發(fā)生FASD樣形態(tài)缺陷?？偟恼f來，至關(guān)重要的形態(tài)發(fā)生素 (morphogen)中的簡單的翻譯后修飾缺陷可促成環(huán)境誘導(dǎo)的復(fù)雜先天性綜合征。對FASD發(fā) 病機(jī)理的該深入了解可提出用于預(yù)防這些常見的先天性缺陷的新策略。
[0049] 翻譯后的蛋白質(zhì)修飾在促進(jìn)基因表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控中起著重要的作用。通過 磷酸化、乙?；蚣谆a(chǎn)生的蛋白質(zhì)修飾在胚胎發(fā)生過程中幫助控制事件的適當(dāng)時機(jī) (timing)和順序；因而，這些蛋白質(zhì)的缺陷修飾可以是許多類型的先天性疾病發(fā)生的重要 原因就不令人驚奇了。不斷積累的證據(jù)表明翻譯后脂質(zhì)修飾對于調(diào)控蛋白質(zhì)功能的重要 性。一個實(shí)例是Sonic hedgehog(Shh)的膽固醇和palinitoyl修飾，所述修飾指導(dǎo)該蛋白 質(zhì)的生物發(fā)生、細(xì)胞運(yùn)輸和功能性\
[0050] Shh是通過激活Hedgehog (Hh)信號通路在細(xì)胞增殖、分化和胚模式形成 (embryonic patterning)中起著中心作用的高度保守的胚胎形態(tài)發(fā)生素2'3。451^^的Shh 前體蛋白通過自動加工（auto-processing),然后通過將膽固醇共價連接至N末端蛋白水 解產(chǎn)物來經(jīng)歷修飾4。該成熟的經(jīng)膽固醇修飾的蛋白質(zhì)（19kDa)可被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜以進(jìn)行 分泌5。分泌后，經(jīng)膽固醇修飾的Shh配體可立即通過結(jié)合至其受體Patched(Ptc)而起始 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)合后，Ptc解除對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smoothened(Smo)6的抑制，然后通過將它們與 負(fù)調(diào)節(jié)劑Fused的抑制劑解偶聯(lián)來激活Gli轉(zhuǎn)錄因子7。Gli隨后被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并且調(diào) 控靶基因包括Ptc8、Glil9其本身和NkX2. 2的表達(dá)1(1。
[0051] 在胚胎發(fā)生過程中，Shh在亨森氏結(jié)（Hensen's node)、神經(jīng)管的底板、心臟間充質(zhì) (cardiac mesenchyme)、早期消化道內(nèi)胚層、肢芽的后部以及在整個脊索中特異性表達(dá)。因 為其為形態(tài)發(fā)生素，因此Shh也影響其產(chǎn)生位置遠(yuǎn)側(cè)的組織的發(fā)育。Shh顯然是腹神經(jīng)管n'12、前-后肢軸（anterior-posterior limb axis)13和腹體節(jié)14的模型形成的至關(guān)重要的誘 導(dǎo)信號。在人中，一個由Shh或Hh信號傳導(dǎo)的其他組分的突變引起的嚴(yán)重表型是前腦無裂 畸形（HPE)15,是一種其中胎兒前腦（前腦）不能分開以使形成兩側(cè)大腦半球的病癥。HPE也 是人胚胎中和FASD的動物模型中的數(shù)個胎兒酒精譜系缺陷（FASD) 15^2tl中的一個極端表現(xiàn)。 類似地，神經(jīng)管的底板中Shh的產(chǎn)生調(diào)控位于基板上面的神經(jīng)組分包括運(yùn)動神經(jīng)元的祖細(xì) 胞的發(fā)育12'21。FASD患者展示延遲的運(yùn)動發(fā)育和受損的精細(xì)運(yùn)動技巧（fine-motor skill) 和大運(yùn)動技巧22。在具有FASD的人中多至89%觀察到不同程度的運(yùn)動遲緩?25。事實(shí)上， FASD的診斷標(biāo)準(zhǔn)包括受損的精細(xì)運(yùn)動技巧26。Shh也在神經(jīng)嵴形態(tài)發(fā)生中具有已證明的作 用27,并且FASD通常包括神經(jīng)嵴源性結(jié)構(gòu)中的缺陷。很清楚，受酒精暴露影響的組織和正 確發(fā)育依賴于Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的那些組織之間存在明顯的交疊。
[0052] 通過膽固醇產(chǎn)生的Shh的翻譯后修飾4是個受到密切調(diào)控的過程，該過程是正在 發(fā)育的胚胎中成熟Shh配體的轉(zhuǎn)運(yùn)和濃度梯度的建立所必需的28。固醇和脂肪酸修飾的Shh 蛋白形成可溶性的多聚體，其被包裝在微囊中用于長距離轉(zhuǎn)運(yùn)29。最近的工作已證明取決于 此類修飾的存在或不存在，Shh蛋白質(zhì)的活性和功能發(fā)生顯著的變化5。經(jīng)膽固醇修飾的 Still配體在胚胎發(fā)生的許多方面中所起的作用可解釋被干擾的膽固醇生物合成在動物發(fā) 育中的一些致畸效應(yīng)3°。相似的先天性缺陷發(fā)生在于懷孕期飲用酒精的婦女的后代中。
[0053] 胎兒對酒精的暴露的畸形形成后果是高度可變的，包括一系列稱為FASD的形態(tài) 缺陷31。FASD的表型異常包括神經(jīng)、顱面、心臟和肢體畸形，以及全身性生長缺陷和精神發(fā) 育遲緩（mental retardation) 32。提出的由胎兒酒精暴露引起的出生缺陷譜系背后的機(jī)制 包括：細(xì)胞凋亡33、細(xì)胞粘附缺陷34、自由基的積累35、生長因子的失調(diào) 38以及改變的視黃酸 (retinoic acid)的生物合成37。一些簡單和基本問題已通過這些假說很好地解釋，例如，一 次或至多數(shù)次社交性飲酒怎樣引起胎兒缺陷，酒精優(yōu)先性地誘導(dǎo)靶向一些器官和組織而不 是其他器官和組織的缺陷的原因，或FASD中看到的缺陷模式是可預(yù)測的和可重現(xiàn)的原因。
[0054] 酒精還可削弱脊索前板遷移38和破壞Spernann's 0rganizer39(在形成原腸胚 中控制胚層的模式形成的信號傳導(dǎo)中心）的形成和功能；調(diào)控軸模式形成（axis pattern formation)的特定機(jī)制需要高度進(jìn)化保守的遺傳通路，所述遺傳通路牽涉轉(zhuǎn)錄調(diào)控線路和 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路4°。組織原（organizer)中包含的含有Shh的小囊泡起始在發(fā)育過程中在胚 胎模式形成中起著關(guān)鍵作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路41。因此，在原腸胚形成過程中抑制Shh信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)的遺傳或環(huán)境因子可破壞胚胎的正確模式形成。有趣的是，在原腸胚形成38過程中暴露 于酒精的胚胎具有與在Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)42中具有缺陷的胚胎中發(fā)現(xiàn)的缺陷相似的缺陷。相似的 表型在胚胎中發(fā)生，所述胚胎在固醇的動態(tài)平衡中具有遺傳缺陷例如Smith-Lemli-Opitz 綜合征43 (SLOS)，或暴露于降膽固醇劑44'45。這些觀察表明FASD可由Shh的膽固醇修飾的 依賴于酒精的抑制引起。
[0055] 許多遺傳病癥可導(dǎo)致膽固醇的生物合成、貯存以及運(yùn)輸?shù)漠惓Ｕ{(diào)控。然而，乙醇的 攝入可能遠(yuǎn)非是破壞膽固醇動態(tài)平衡的一般機(jī)制。乙醇引起HMG-CoA還原酶活性的抑制， 這導(dǎo)致細(xì)胞中游離膽固醇減少，以及循環(huán)膽固醇水平降低46_48。被灌注的大鼠肝的急性乙 醇暴露導(dǎo)致肝勻漿和微粒體中膽固醇耗盡49。乙醇特異性抑制肝ACAT活性，這可導(dǎo)致用于 LDLS中的轉(zhuǎn)運(yùn)的膽固醇酯減少5°。因此，來自胚胎學(xué)、毒理學(xué)和分子生物學(xué)的證據(jù)表明FASD 背后的畸形形成機(jī)制將酒精、膽固醇動態(tài)平衡、Shh信號傳到和功能性Shh的膽固醇修飾聯(lián) 系在一起。
[0056] 幾個動物模型已用于研究FASD。對于酒精和發(fā)育研究，與昆蟲和嚙齒目動物模型 相比，斑馬魚模型提供了許多有利方面：斑馬魚尺寸很小，它們具有大量的后代，并且它們 具有快速的胚胎發(fā)生。該模型已廣泛用于發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、基因功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和高通 量藥物篩選的研究中。所有這些特征使其成為描述酒精誘導(dǎo)的出生缺陷的分子基礎(chǔ)的理想 模型。
[0057] 經(jīng)顯示，在斑馬魚胚胎的早期發(fā)育過程中短暫的酒精暴露引起Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的劑 量相關(guān)性抑制并且產(chǎn)生一系列永久性FASD樣缺陷。酒精誘導(dǎo)的對Hh通路活性的抑制伴隨 著膽固醇動態(tài)平衡的酒精破壞和Shh配體的膽固醇-修飾減少。用膽固醇補(bǔ)充暴露于酒精 的胚胎拯救了 Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的喪失，并且預(yù)防胚胎發(fā)生FASD樣形態(tài)缺陷。
[0058] 材料和方法
[0059] 酒精、環(huán)杷明（cyclopamine)和 AY-9944 處理
[0060] 根據(jù)之前的報導(dǎo)改變胚胎酒精暴露38。將具有絨毛膜的胚胎暴露于胚胎培養(yǎng)中 的6個不同濃度的酒精（例如，0、0.25、0.5、1.0、1.5和2.0%卜，1))。將密封在皮氏培 養(yǎng)皿中的胚胎在dome期（即，受精后（hpf)4.25小時或30%的外包期（epiboly stage)) 開始時暴露于酒精6小時，并且在28. 5°C下進(jìn)行溫育。接著立即進(jìn)行酒精暴露，收獲胚胎 以進(jìn)行Hh通路活性、膽固醇含量或組織酒精濃度的分析。將剩余的胚胎進(jìn)行洗滌，并在 無酒精的配眼鏡中溫育。然后在受精后1、2或4天收獲胚胎以進(jìn)行存活和表型分析。環(huán) 杷明（11-去氧介芬胺（deoxojervine))是通過作為smoothened蛋白的拮抗劑來抑制 Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的天然化學(xué)物質(zhì)。AY9944,反式-1，4雙-(2-二氯芐基氨甲基）二氫 氯化環(huán)己烷通過抑制7-脫氫膽固醇還原酶阻止膽固醇合成。以與酒精相同的方式施用 AY_9944(7.5iiM，Sigma-Ald;rich)和環(huán)把明（10.0iiM，Calbiochenn)。處理后，洗漆胚胎， 然后將其在正常培養(yǎng)基中溫育多至受精后第4天。
[0061] 阿辛藍(lán)（alcian blue)染色和免疫組織化學(xué)
[0062] 如之前所述進(jìn)行骨豁結(jié)構(gòu)的染色51。使用下列一抗（Hybridoma Bank, 1:10) :MF20 進(jìn)行免疫組織化學(xué)用來染色心肌和面肌，S46用于鑒定心室肌以及F59用于鑒定體節(jié)中的 慢肌祖細(xì)胞（slow muscle progenitor)。二抗是綴合Alexa568的山羊抗小鼠 IgG2g和綴 合Alexa488的山羊抗小鼠 IgG2g(l:400, Molecular Probes)。固定胚胎并且對成像。
[0063] 膽固醇含量的測量
[0064] 在酒精暴露后，以一式兩份重復(fù)用氯仿-甲醇（2:1)從胚胎（n彡14)提取脂質(zhì)。 然后通過Arnplex Red Cholesterol Assay試劑盒（Invitrogen)測量膽固醇含量。
[0065] 組織酒精濃度的測量
[0066] 在酒精暴露后，以一式三份重復(fù)將各處理組的胚胎（n = 38)集中在一起。使用 Alcohol Test試劑盒（Diagnostic Chemicals Limited)測定經(jīng)處理的胚胎中的組織酒精 濃度。
[0067] RT-PCR和實(shí)時定量分析
[0068] 使用RNeasy試劑盒（Qiagen)從胚胎（n = 10)提取總RNA。使用之前描述的引物 (信息列于下表）進(jìn)行RT-PCR52。
[0069] 引物信息表
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 在胚胎的以及成體的組織和器官中檢測酒精或降膽固醇組分和與其相關(guān)的損傷存 在的方法，其包括測定在組織和器官中由于酒精和降膽固醇組分而引起的對Shh蛋白發(fā)生 的缺陷的水平。
2. 檢測酒精損傷的胚胎和/或成體的Shh蛋白以及hedgehog通路的活性的方法，其包 括： 膽固醇-hedgehog蛋白修飾的缺陷、Shh/窖蛋白-1結(jié)合能力、Shh細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、質(zhì)膜和 脂質(zhì)筏結(jié)合、分泌、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、梯度的建立以及hedgehog通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膽固醇特征標(biāo)志 和其拉曼光譜的檢測和分析。
3. 用于在子宮內(nèi)暴露于酒精的受試者中減少與胎兒酒精綜合征相關(guān)的病癥的方法，該 方法包括：以足以減少與胎兒酒精綜合征相關(guān)的病癥的量對受試者施用膽固醇或膽固醇衍 生物。
4. 用于篩選和鑒定一種或多種試劑的方法，所述試劑是胎兒酒精綜合征和成體干細(xì)胞 衰老相關(guān)性缺陷的保護(hù)劑或治療劑，所述方法包括： 在對胚胎進(jìn)行短暫的酒精暴露之前、之后或同時對斑馬魚胚胎模型或大鼠肝星狀細(xì)胞 系施用所述試劑；和 檢測與對照相比經(jīng)酒精處理的胚胎中的一系列分子和細(xì)胞缺陷。
【文檔編號】A61K31/575GK104391125SQ201410024846
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2007年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2006年12月8日
【發(fā)明者】李尹雄 申請人:李尹雄