一種具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用的中藥提取物和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用的馬甲子提取物及其作為制備治療免疫功能異常疾病藥物的用途。所述中藥提取物為馬甲子葉、馬甲子根、馬甲子莖葉或馬甲子全株植物的甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚或類似溶媒提取物，主要含有萜類、黃酮類、生物堿類、香豆素類（包括上述物質(zhì)的苷類和單體）、多糖類、纖維素等，其制劑包括片劑、膠囊劑、貼膏劑、顆粒劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、凝膠劑、涂膜劑、搽劑、洗劑和噴霧劑。馬甲子提取物及其制劑具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，可作為制備治療免疫功能低下或自身免疫性疾病藥物的應用。
【專利說明】—種具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用的中藥提取物和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及的是一種具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用的中藥提取物和用途，具體是馬甲子提取物及其制劑用于制備免疫功能低下及自身免疫性疾病藥物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]人體的免疫功能是機體抵抗細菌、病毒入侵，清除體內(nèi)損傷變性及衰老的細胞，清除體內(nèi)代謝廢物，維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定的重要機能。免疫功能紊亂是多種疾病的始動因素，也可在多種疾病病程中產(chǎn)生并加重病情。
[0003]免疫功能低下根據(jù)發(fā)病原因不同，可將免疫功能低下分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。原發(fā)性是先天發(fā)育不全所致，大多數(shù)與遺傳有關(guān)，多發(fā)生于兒童；繼發(fā)性則由病毒、細菌、真菌等感染或藥物、腫瘤、疲勞、失眠、營養(yǎng)不良、壓力過大等原因引起，可見于各種年齡的人群，多數(shù)病后體弱，易發(fā)感染性疾病者屬繼發(fā)性免疫力低下。目前具有免疫增強功效的藥物較多，如胸腺肽制劑、白介素_2、特異性免疫核糖核酸及轉(zhuǎn)移因子、干擾素、左旋咪唑等，一些中藥如人參、黃芪等也被認為有免疫增強作用。
[0004]免疫功能異常則常可引發(fā)或見于自身免疫性疾病，如類風濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、硬皮病、甲狀腺機能亢進、青少年糖尿病、原發(fā)性血小板紫癜、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性肝病等，通常為難治性或致死性疾病。目前常用免疫抑制劑治療，如腎上腺皮質(zhì)激素、環(huán)孢菌素、雷公藤多苷、抗白介素-2單克隆抗體等。這些藥物通常具有明顯的毒副作用，安全窗較窄。
[0005]由于免疫低下患者本身的易感性，他們也容易收到細菌或病毒感染而產(chǎn)生自身免疫性疾病，進而表現(xiàn)為免疫 功能低下和某些免疫功能異?？哼M并存的狀況，例如，紅斑狼瘡即表現(xiàn)為體液免疫亢進而細胞免疫低下。某些藥物被認為具有免疫功能雙向調(diào)節(jié)作用，如CN1241413公開了一種雙向免疫調(diào)節(jié)劑的生產(chǎn)方法，CN1110303 C公開了一種具有抗病毒作用的植物提取物雙向免疫調(diào)節(jié)劑，CN101224300 A公開了一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的重組大腸桿菌外膜蛋白?？傮w來說，此類藥物與單純的免疫增強或抑制劑相比數(shù)量較少而需求較多。
[0006]馬甲子(Paliurus ramosissimus (Lour.) Poir)為落葉灌木,是一種常見藥用植物，據(jù)報道枝葉根花果均藥用。性味苦、平，無毒。能除寒活血，發(fā)表解熱，消腫，治跌打損傷及心腹疼痛。收載于《中藥大辭典》及一些地方藥物志。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種制備治療免疫功能低下或(和)自身免疫性疾病的藥物及其制備方法，具體是馬甲子提取物用于制備治療免疫功能低下相關(guān)疾病或(和)自身免疫性疾病的藥物。免疫功能低下相關(guān)疾病或(和)自身免疫性疾病包括:感冒易感、體虛、艾滋病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、硬皮病、甲狀腺機能亢進、青少年糖尿病、原發(fā)性血小板紫癜、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性肝病
坐寸O
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種用于制備治療免疫功能低下相關(guān)疾病或(和)自身免疫性疾病藥物的馬甲子提取物，其特征在于，取馬甲子全株植物或其中任一部位，加入馬甲子體積的1-20倍的甲醇或乙醇提取，或者將甲醇或乙醇提取物進一步用乙酸乙酯或石油醚提??；提取液濃縮后干燥，制得馬甲子提取物。
[0009]所述的馬甲子提取物，馬甲子為鮮品、冷凍干燥品或甲醇、乙醇、異丙醇等封存處理的樣品；提取方法包括浸潰、回流或滲漉；干燥方法包括減壓干燥、冷凍干燥、噴霧干燥或微波干燥。
[0010]所述的馬甲子提取物，成分包括萜類、黃酮類、生物堿類、香豆素類、多糖類、纖維素類以及萜類、黃酮類、生物堿類、香豆素類的苷類和單體。
[0011]所述的馬甲子提取物的制劑，包括馬甲子提取物的片劑、膠囊劑、貼膏劑、顆粒劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、凝膠劑、涂膜劑、搽劑、洗劑和噴霧劑。
[0012]所述的馬甲子提取物的應用，應用于制備治療免疫功能低下相關(guān)疾病或(和)自身免疫性疾病的藥物，包括單獨使用馬甲子提取物或以馬甲子提取物為主要活性成分的藥物組合物在制備治療免疫功能低下相關(guān)疾病或(和)自身免疫性疾病藥物中的用途。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0014]一、馬甲子提取物的制備方法 1、全株乙醇提取物的制備
取馬甲子全株1kg，加入8倍量的95%乙醇浸潰I天后,然后進行粉碎,再加入10倍量的95%乙醇浸潰2天提取，收集提取液，50°C減壓回收乙醇至無醇味，干燥即得馬甲子乙醇提取物。
[0015]2、莖葉乙醇、石油醚和乙酸乙酯提取物的制備
取馬甲子莖葉1kg，加入10倍量的95%乙醇浸潰I天后，然后進行粉碎，再加入10倍量的95%乙醇回流提取，收集提取液，60°C減壓回收乙醇至無醇味，干燥即得馬甲子乙醇提取物。將馬甲子乙醇提取物加水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到馬甲子石油醚提取物和乙酸乙酯提取物。
[0016]3、全株石油醚和乙酸乙酯提取物的制備
取馬甲子全株1kg，加入10倍量的甲醇浸潰I天后，然后進行粉碎，再加入8倍量的甲醇浸潰2天，收集提取液，40°C下減壓回收甲醇，干燥即得馬甲子甲醇提取物，將馬甲子甲醇提取物加水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到馬甲子石油醚提取物和乙酸乙酯提取物。
[0017]二、馬甲子提取物的成分研究
樣品供試液的配制:取全株乙醇提取物提取物樣品lg，溶于25ml無水乙醇中，離心。取上清液2ml，無水乙醇稀釋5倍，至終濃度為0.008g/ml。
[0018]1、三萜類成分的檢識1.1 L-B反應
將樣品溶于乙酸酐中，加濃硫酸一乙酸酐(1:20)數(shù)滴，可產(chǎn)生黃一紅一紫一藍等顏色變化，最后褪色，表明含有三萜類化合物。
[0019]1.2 Kahlenberg 反應
將樣品的氯仿或醇溶液點于濾紙上，噴20%五氯化銻的氯仿溶液(或三氯化銻飽和的氯仿溶液)，干燥后60 - 70°C加熱，顯藍色，表明含有三萜類化合物。
[0020]1.3 R-H 反應
將樣品供試液滴在濾紙上，噴出25%三氯乙酸乙醇溶液，加熱至100°C，顯紅色，逐漸變?yōu)樽仙?，表明含有三萜類化合物?br> [0021]1.4 Salkowki 反應
將樣品溶于氯仿，加入濃硫酸后，在硫酸層呈現(xiàn)紅色或藍色，氯仿層有綠色熒光出現(xiàn)，表明含有三萜類化合物。
[0022]1.5 Tschugaeff 反應
將樣品溶于冰乙酸中，加乙酰氯數(shù)滴及氯化鋅結(jié)晶數(shù)粒，稍加熱，則呈現(xiàn)淡紅色或紫紅色，表明含有三萜類化合物。
[0023]2、黃酮類成分的檢識
2.1鹽酸一鎂粉還原反應(還原反應顯色)
取少量樣品溶于ImL乙醇中，加入少許鎂粉及濃鹽酸，振蕩片刻，觀察反應顏色呈紫紅色，表明含有黃酮類化合物。
[0024]2.2三氯化鋁反應(金屬離子的絡合反應顯色)
用玻璃棒蘸取樣品供試液涂于濾紙上，吹干，噴I %的三氯化鋁乙醇溶液，吹干，觀察現(xiàn)象。置紫外燈下顯鮮黃色，表明含有黃酮類化合物。
[0025]2.3三氯化鐵反應(金屬離子的絡合反應顯色)
用玻璃棒蘸取供試液涂于濾紙上，吹干，在紫外燈下觀察熒光后，噴3 %的三氯化鐵乙醇溶液，吹干，出現(xiàn)暗藍色熒光斑點，再經(jīng)氨熏后轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣珶晒獍唿c，表明含有黃酮類化合物。
[0026]2.4堿性試劑顯色
用玻璃棒蘸取供試液涂于濾紙上，干燥后，噴以氫氧化鈉水溶液或暴露于氨蒸汽中，在日光燈下觀察時，氨蒸汽能使樣品色點轉(zhuǎn)變?yōu)榱咙S色，表明含有黃酮類化合物。
[0027]3、生物堿類成分的檢識
3.1改良碘化秘鉀(Dragendorff)法
①次硝酸鉍0.85g溶于IOml冰醋酸與40ml水中碘化鉀8g溶于20ml水中。試液
①與試液②等量混合置棕色瓶內(nèi)保存作貯備液。用前將Iml貯備液、4ml冰醋酸與12ml水混合。將樣品供試液加入上述試劑中，呈紅棕色溶液，加蒸餾水一搖即有沉淀產(chǎn)生，表明含有生物堿類化合物。
[0028]3.2 碘-碘化鉀(Wagner)法
碘Ig與碘化鉀IOg溶于50ml水,加2ml乙酸,加水至100ml。取上述試劑適量,加入Iml樣品供試液即顯棕 褐色，表明含有生物堿類化合物。
[0029]3.3 娃鶴酸(Bertrand)法5g娃鶴酸溶于100ml水中，加濃鹽酸少量調(diào)至pH = 2左右。取上述試劑適量，加入Iml樣品供試液即顯棕褐色，表明含有生物堿類化合物。
[0030]4、香豆素類成分的檢識
4.1異羥肟酸鐵反應
①a.鹽酸羥胺20g溶于50ml水，用乙醇稀釋至200ml，冷處保存；b.氫氧化鉀50g溶于少許水中，加500ml乙醇。②氯化鐵(FeC13*6H20)10g溶于20ml 36%鹽酸溶液中，加乙醚200ml搖勻，置密閉容器內(nèi)保存。使用時將試液①a.與①b.按1:2混合，濾去沉淀，濾液放冰箱保存。用玻璃棒蘸取樣品供試液涂于濾紙上，先噴ab混合試液，稍干，再噴試液
②，即顯紅色，表明含有香豆素類化合物。
[0031]4.2重氮化試劑反應
①對硝基苯胺0.35g,溶于濃鹽酸5ml中，加水至50ml ;②亞硝酸鈉5g,加水50ml。取①、②液等量在冰水浴中混合后使用。取少量樣品供試液滴加重氮化試劑，即顯橙紅色，表明含有香豆素類化合物。
[0032]5、成分定量分析 取馬甲子莖葉石油醚提取物0.lg，三份，加入IOml容量瓶內(nèi)，加乙酸乙酯至刻度，再從中精密吸取4ml溶液加入IOml容量瓶內(nèi)，揮干溶劑后，加入5%香草醛-冰醋酸0.4ml、高氯酸1.6 ml，混勻，并由乙酸乙酯稀釋至刻度，置70°C恒溫水浴中加熱15min，冷卻至室溫，并轉(zhuǎn)移至IOml容量瓶中加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，在540nm波長處測定吸收度，計算供試品溶液中總?cè)坪?含三萜以美洲茶酸計)。經(jīng)計算Ig馬甲子提取物中三萜類成分含23mg。
[0033]取馬甲子莖葉石油醚提取物0.1g,三份，精密稱定，置50ml量瓶中，加乙醇適量，超聲溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取lml，置IOml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在510nm波長處測定吸光度，計算供試品溶液中總黃酮含量(含黃酮量以蘆丁計)。經(jīng)計算Ig馬甲子提取物中總黃酮含103mg。
[0034]取馬甲子莖葉石油醚提取物0.lg，三份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，以18 %氨水2 ml潤濕I h，加乙醚2氯仿2乙醇(25: 8: 2.5)混合溶劑30 ml，超聲提取20 min，傾出上清液至小錐形瓶中，再加入上述混合溶劑30 ml，冷浸放置半小時，再超聲震蕩提取20min，濾過，以相同溶劑15 ml分3次洗滌殘渣和濾紙，合并濾液于錐形瓶中，于60 °〇水浴上蒸干，準確加入10 ml氯仿使其全部溶解，再準確吸取5 mL轉(zhuǎn)移至小分液漏斗中，加
6mL氯仿,2 ml緩沖液(pH=5.0,0.2 M鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液)。用I mmol.L-1溴磨香草酚藍溶液滴定，并不斷震搖；接近終點時，分出氯仿層，再加入新鮮氯仿5 ml，繼續(xù)滴定并不斷震搖，靜置分層，至水層略顯黃色即為終點。計算總生物堿(含生物堿以馬甲子堿B計)。經(jīng)計算Ig馬甲子提取物中生物堿含21mg。
[0035]取馬甲子莖葉石油醚提取物0.1g,三份，精密稱定，置50ml量瓶中，加乙醇適量，超聲溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取Iml，置IOml量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在340nm波長處測定測定吸光度，計算供試品溶液中總香豆素含量(含香豆素量以傘形花內(nèi)酯計)。經(jīng)計算Ig馬甲子提取物中總香豆素含10.2mg。
[0036]取馬甲子莖葉乙酸乙酯提取物0.lg，三份，加入IOml容量瓶內(nèi)，加乙酸乙酯至刻度，再從中精密吸取4ml溶液加入IOml容量瓶內(nèi)，揮干溶劑后，加入5%香草醛-冰醋酸0.4ml、高氯酸1.6 ml，混勻，并由乙酸乙酯稀釋至刻度，置70°C恒溫水浴中加熱15min，冷卻至室溫，并轉(zhuǎn)移至IOml容量瓶中加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，在540nm波長處測定吸收度，計算供試品溶液中總?cè)坪?含三萜以美洲茶酸計)。經(jīng)計算Ig馬甲子提取物中三萜類成分含108mg。
[0037]取馬甲子莖葉乙酸乙酯提取物0.lg，三份，精密稱定，置50ml量瓶中，加乙醇適量，超聲溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取Iml，置IOml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在510nm波長處測定吸光度，計算供試品溶液中總黃酮含量(含黃酮量 以蘆丁計)。經(jīng)計算Ig馬甲子提取物中總黃酮含497mg。
[0038]取馬甲子全株乙酸乙酯提取物0.lg，三份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，以18 %氨水2 ml潤濕I h，加乙醚2氯仿2乙醇(25: 8: 2.5)混合溶劑30 ml，超聲提取20 min,傾出上清液至小錐形瓶中，再加入上述混合溶劑30 ml，冷浸放置半小時，再超聲震蕩提取20 min，濾過，以相同溶劑15 ml分3次洗滌殘渣和濾紙，合并濾液于錐形瓶中，于60 V水浴上蒸干，準確加入10 ml氯仿使其全部溶解，再準確吸取5 mL轉(zhuǎn)移至小分液漏斗中，加6 mL氯仿，2 ml緩沖液(pH=5.0,0.2 M鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液)。用I mmol -L-1溴麝香草酚藍溶液滴定，并不斷震搖；接近終點時，分出氯仿層，再加入新鮮氯仿5 ml，繼續(xù)滴定并不斷震搖，靜置分層，至水層略顯黃色即為終點。計算總生物堿(含生物堿以馬甲子堿B計)。經(jīng)計算Ig馬甲子提取物中生物堿含107mg。
[0039]取馬甲子全株乙酸乙酯提取物0.1g,三份，精密稱定，置50ml量瓶中，加乙醇適量，超聲溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取1ml，置IOml量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在340nm波長處測定測定吸光度，計算供試品溶液中總香豆素含量(含香豆素量以傘形花內(nèi)酯計)。經(jīng)計算Ig馬甲子提取物中總香豆素含186mg0
[0040]三、馬甲子制劑的制備 1、片劑的制備
取馬甲子全株乙醇提取物300 g，加入適宜輔料，如:100 g微晶纖維素，57.5g乳糖，20g交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等，壓片制成片劑。
[0041]2、膠囊劑的制備
取馬甲子莖葉乙酸乙酯提取物，加入適宜輔料，如:乳糖、可壓性淀粉、羧甲基淀粉、微晶纖維素、等制成膠囊劑。
[0042]3、顆粒劑的制備
取馬甲子全株甲醇提取物，加入適宜輔料，如:乳糖、淀粉、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、微粉硅膠等制成顆粒劑。
[0043]4、軟膏劑的制備
取馬甲子莖葉石油醚提取物，加入適宜輔料，如:十八醇、單硬脂酸甘油脂、甘油、硬脂酸等制成軟膏劑。
[0044]5、栓劑的制備
取馬甲子全株乙醇提物物，加入適宜輔料，如:混合脂肪酸甘油酯、PEG、蜂蠟等制成栓劑。
[0045]四、體外細胞學研究1.馬甲子提取物對小鼠脾淋巴細胞體外增殖的影響 1.1.小鼠脾淋巴細胞的制備
無菌取昆明小鼠脾臟，置于盛有適量RPMI1640培養(yǎng)基的平皿中，除去結(jié)締組織，用注射器針芯研磨，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，轉(zhuǎn)移至離心管中，用RPMI1640洗滌后，收集細胞，加入Iml紅細胞裂解液。4° C下放置5-10min后，1500r/min離心5 min，棄取上清，用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次，最后將細胞懸浮于lml RPMI1640完全培養(yǎng)基中。經(jīng)臺盼藍染色測定存活率，結(jié)果顯示脾細胞存活率大于95%。將上述脾細胞懸液適當稀釋，調(diào)整細胞密度為2 X IO6個/ml備用。
[0046]馬甲子提取物對小鼠脾淋巴細胞體外增殖的影響
將2X IO6個/ml的脾細胞懸液，按照每孔100 μ I加入96孔板中。設置空白組、對照組以及馬甲子提取物組。對照組每孔再加入100 μ I的RPMI1640完全培養(yǎng)基；馬甲子提取物組中，每孔再加入100 μ I含有不同濃度馬甲子提取物的RPMI1640完全培養(yǎng)基溶液；另設空白組，只含有培養(yǎng)基。將上述96孔板置于5%C02、37°C孵箱中培養(yǎng)60h。取出細胞板，將孔內(nèi)液體吸出，用PBS洗滌3次后，加入100 μ?培養(yǎng)基和20 μ IMTT液(5 mg.ml —O，再次置于37°C、體積分數(shù)為5% CO2的濕度環(huán)境下培養(yǎng)4h后，取出細胞培養(yǎng)板，小心吸出上清液，加入150 μ I 二甲基亞砜，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振搖lOmin，使結(jié)晶物甲瓚充分溶解后，于酶聯(lián)免疫檢測儀上490nm比色，記錄結(jié)果，按照公式(I)計算馬甲子提取物對小鼠脾細胞體外平均存活率。
[0047]備活率(%)=.1.麵畫X100%...................⑴
結(jié)果顯示，馬甲子提取物濃度為0.004 mg/ml、0.02 mg/ml、0.2 mg/ml時，小鼠脾細胞的平均存活率為117.85%、107.21%以`及77.46%。結(jié)果表明低濃度馬甲子提取物能促進小鼠脾細胞體外增殖，而高濃度馬甲子提取物則對脾細胞的增殖具有抑制作用。
[0048]馬甲子提取物對ConA誘導的脾細胞體外增殖的影響
將2X IO6個/ml的脾細胞懸液，按照每孔100 μ I加入96孔板中。設置空白組、對照組、ConA組以及馬甲子提取物組。對照組每孔再加入100 μ I的RPMI1640完全培養(yǎng)基；ConA組每孔再加入100 μ I含有25 μ g/ml ConA的RPMI1640完全培養(yǎng)基溶液；馬甲子提取物組中，每孔再加入100 μ I含有不同濃度馬甲子提取物的RPMI1640完全培養(yǎng)基溶液(溶液中同時含有25μ g/ml ConA);另設空白組，只含有培養(yǎng)基。將上述96孔板置于5%C02、37°C孵箱中培養(yǎng)60h。取出細胞板，將孔內(nèi)液體吸出，用PBS洗滌3次后，加入100 μ I培養(yǎng)基和20μ IMTT液(5 mg.ml — 1X再次置于37°C、體積分數(shù)為5% CO2的濕度環(huán)境下培養(yǎng)4h后，取出細胞培養(yǎng)板，小心吸出上清液，加入150 μ I 二甲基亞砜，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振搖lOmin，使結(jié)晶物甲瓚充分溶解后，于酶聯(lián)免疫檢測儀上490nm比色，記錄結(jié)果，按照公式(I)計算ConA組和馬甲子提取物組對小鼠脾細胞體外平均存活率；再按照公式(2)計算馬甲子提取物對ConA誘導的小鼠脾細胞體外增殖的增殖率。
[0049]相對增值率(%)=(’^Slx5w4) X 100%........................(2)
ChA對照組
結(jié)果顯示，馬甲子提取物濃度為0.004 mg/ml、0.02 mg/ml、0.2 mg/ml時,相對于ConA組的相對增值率分別為15.11%、5.69%和-14.35%，說明馬甲子提取物低濃度時對ConA誘導的小鼠脾細胞體外增殖有促進作用，而高濃度時則表現(xiàn)出抑制作用。
[0050]3.馬甲子提取物對LPS誘導的脾細胞體外增殖的影響
將2X IO6個/ml的脾細胞懸液，按照每孔100 μ I加入96孔板中。設置空白組、對照組、LPS組以及馬甲子提取物組。對照組每孔再加入100 μ I的RPMI1640完全培養(yǎng)基；LPS組每孔再加入100 μ I含有20 μ g/ml LPS的RPMI1640完全培養(yǎng)基溶液；馬甲子提取物組中，每孔再加入100 μ I含有不同濃度馬甲子提取物的RPMI1640完全培養(yǎng)基溶液(溶液中同時含有20 μ g/ml LPS);另設空白組，只含有培養(yǎng)基。將上述96孔板置于5%C02、37°C孵箱中培養(yǎng)60h。取出細胞板，將孔內(nèi)液體吸出，用PBS洗滌3次后，加入100 μ I培養(yǎng)基和20μ IMTT液(5 mg.ml — O，再次置于37°C、體積分數(shù)為5% CO2的濕度環(huán)境下培養(yǎng)4h后，取出細胞培養(yǎng)板，小心吸出上清液，加入150 μ I 二甲基亞砜，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振搖lOmin，使結(jié)晶物甲瓚充分溶解后，于酶聯(lián)免疫檢測儀上490nm比色，記錄結(jié)果，按照公式(I)計算LPS組和馬甲子提取物組對小鼠脾細胞體外平均存活率；再按照公式(2)計算馬甲子提取物對LPS誘導的小鼠脾細胞體外增殖的增殖率。
[0051]結(jié)果顯示，馬甲子提取物濃度為0.004 mg/ml、0.02 mg/ml、0.2 mg/ml時,相對于LPS組的相對增值率分別為34.37%、20.48%和-15.60%,說明馬甲子提取物低濃度時對LPS誘導的小鼠脾細胞體外增殖有促進作用，而高濃度時則表現(xiàn)出抑制作用，這與上述馬甲子提取物對ConA誘導的脾細胞體外增殖具雙向免疫調(diào)節(jié)的結(jié)論是一致的。
[0052]五、藥理學驗證
1、乙醇、甲醇、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物對免疫低下小鼠非特異性免疫功能的影響(腹腔巨噬細胞吞噬法)
KM小鼠80只，按體重分層隨機均分為8組，分別為混懸劑對照組(0.5%西黃芪膠)、模型對照組(0.5%西黃芪膠)、 陽性對照組(云芝多糖)、乙酸乙酯提取物小劑量組、乙酸乙酯提取物大劑量組、乙醇提取物組、甲醇提取物組、石油醚提取物組。灌胃給予試驗藥物或混懸劑，每日I次，連續(xù)14d。除混懸劑對照組外，給藥第8、10、12d按25mg/kg腹腔注射給予環(huán)磷酰胺生理鹽水溶液，造成免疫低下。第13d、14d分別腹腔注射6%淀粉溶液；至第14d末次給藥后lh，腹腔注射5%雞紅細胞生理鹽水懸液lml，30min后，頸椎脫曰處死動物，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2ml，并輕揉腹部。Imin后剪開腹部，吸取腹腔洗液1ml，平均分滴于2片載玻片上，放入濕盒內(nèi)，37°C溫育30min。后于生理鹽水中漂洗，晾干，并以1:1丙酮-甲醇溶液固定，4% (v/v) Giemsa-PBS染色3min,蒸懼水漂洗晾干,鏡檢,計算吞曬百分率。
[0053]表1馬甲子乙醇、甲醇、石油醚提取物及乙酸乙酯提取物對免疫低下小鼠腹腔巨
【權(quán)利要求】
1.一種具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用的馬甲子提取物，其特征在于，所述提取物作為制備治療免疫功能異常疾病藥物的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬甲子提取物，其特征是，將馬甲子葉、馬甲子根、馬甲子莖葉或馬甲子全株植物的鮮品、冷凍干燥品直接用有機溶媒提取純化，或?qū)ⅠR甲子鮮品用有機溶媒預處理后再提取純化；有機溶媒包括甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、石油醚；所述提取方法包括浸潰、回流或滲漉；所述干燥方法包括減壓干燥、冷凍干燥、噴霧干燥或微波干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬甲子提取物，其特征是，成分包括萜類、黃酮類、生物堿類、香豆素類、多糖類和纖維素類以及萜、黃酮、生物堿、香豆素的苷類和單體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬甲子提取物的制劑，其特征是，包括片劑、膠囊劑、貼膏劑、顆粒劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、凝膠劑、涂膜劑、搽劑、洗劑和噴霧劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬甲子提取物的應用，其特征是，在制備免疫功能低下或(和)自身免疫性疾病藥物的應用，包括單獨使用馬甲子提取物或以馬甲子提取物為主要活性成分的藥物組合物在制備治療免疫功能低下或(和)自身免疫性疾病藥物中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述免疫功能異常的免疫功能低下，包括感冒易感、體虛、腫瘤、艾滋病等。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述免疫功能異常的自身免疫性疾病，包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、硬皮病、甲狀腺機能亢 進、青少年糖尿病、原發(fā)性血小板紫癜、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性肝病等。
【文檔編號】A61P5/16GK103735654SQ201410030860
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】徐超群, 李東曉, 袁志翔, 舒光明, 阮佳, 詹雁, 胡竟一, 譚鐳, 余悅, 白筱璐 申請人:四川省中醫(yī)藥科學院