H9n2亞型禽流感與鴨腸炎病毒細菌人工染色體質粒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于動物基因工程【技術領域】，具體涉及一種H9N2亞型禽流感病毒與鴨腸炎病毒人工染色體質粒pBAC-C-KCE-HA9的構建。本發(fā)明的構建方法是：在鴨腸炎病毒人工染色體的質粒pBAC-C-KCE中插入H9N2亞型禽流感病毒ha基因的片段，該質粒的基因結構組成如圖15所示。將表達H9N2亞型禽流感病毒與鴨腸炎病毒人工染色體質粒pBAC-C-KCE-HA9的大腸桿菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNO：M2013740。
CCTCC NO：M2013377
2013.08.20

CCTCC NO：M2013740
2013.12.31

CCTCC NO：V201404
2014.01.02

CCTCC NO：V201403
2014.01.02

CCTCC NO：M2013378
2013.08.20
【專利說明】H9N2亞型禽流感與鴨腸炎病毒細菌人工染色體質粒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物基因工程【技術領域】，具體涉及一種H9N2亞型禽流感病毒與鴨腸 炎病毒細菌人工染色體質粒及構建。

【背景技術】
[0002] 鴨病毒性腸炎（Duck Virus Enteritis, DEV)又名鴨瘟（Duck Plague, DP)，是由鴨 腸炎病毒（Duck Enteritis Virus, DEV)引起的鴨、鵝等雁形目禽類的一種急性、接觸性傳 染病，各年齡的禽類均可發(fā)病。鴨病毒性腸炎在很多國家都有該病的報道，在我國也廣泛流 行。由于其傳播迅速，發(fā)病和死亡率高，達50-100%，成鴨甚至在90%以上，已經成為危害養(yǎng) 鴨業(yè)的主要疫病之一。近幾年，陸續(xù)有關于鴨腸炎病毒基因組的研究報道；2009年，鴨腸炎 病毒基因組序列已經公布并登陸在Genbank(Li Y et al.，2009)，為研究DEV的基因和蛋白 功能提供了有力的參考數據。其基因組大小約為150kb，編碼78個蛋白質，其中有67個蛋 白與α-皰疫病毒有同源性，1個蛋白與γ-皰疫病毒同源，5個與禽皰疫病毒同源。將皰 疹病毒的整個基因組克隆到BAC質粒中，然后在細菌中重組其他病毒的具有免疫源性的外 源基因，從而構建二價疫苗。
[0003] 對于皰疹病毒這樣的大基因組病毒（大于lOOkb)，體外操作的難度很大，常規(guī) 的體外酶切和連接的方法不適合。構建重組病毒的經典方法是將帶有目的基因的轉移 載體與病毒基因組共轉染哺乳動物細胞，經細胞內同源重組獲得重組病毒。由于存在野 生型病毒的干擾，一般需要經過多輪空斑純化才能篩選得到純的重組病毒（Domi A et al.，2005;Horsburgh B C et al.，1999)，這是一項極為繁瑣的工作，有時還會遇到重組病 毒傳代不穩(wěn)定的問題。為了克服這種方法的局限，研究人員嘗試在大腸桿菌中直接對病毒 基因組進行修飾。首先嘗試的是大腸桿菌Cosmid載體。由于病毒基因很大，而此載體容量 有限(約40kb)，必須將病毒基因組分成幾段，構成一套重疊的載體，經細胞內的多次同源重 組組裝成完整的病毒基因組，產生重組毒。Cosmid載體在大腸桿菌中不穩(wěn)定，共轉染的效率 低，此外，這些載體在細胞內要經過多次同源重組，其精確性很難保證，發(fā)生缺失突變的較 高，因而對分離到的重組病毒尚需進一步分析鑒定，不是一種很好的方法。
[0004] 在基因組學研究工作的需要下，研究人員開發(fā)了一系列適用于大片段克隆的載體 和宿主系統(tǒng)，如酵母人工染色體載體（YAC)、大腸桿菌的F因子衍生的細菌人工染色體載 體（BAC)和以噬菌體復制子為基礎的載體（PAC)。BAC載體可以克隆大至300kb的片段， 而且可以在大腸桿菌中穩(wěn)定的復制（McGeoch D J et al.，1994)。近年來，一系列大的雙 鏈病毒基因組陸續(xù)被 BAC 化（Adler H et al.，2000;Borst E M et al.，1999;Azab W et al.，2002; Smith B N et al.，2000)。這些BAC化的病毒基因組轉染細胞后，在細胞中能產 生感染性病毒粒子，這使得利用細菌的遺傳工具操作病毒成為可能。但是，由于某些未知 原因，位于基因組中BAC載體部分不太穩(wěn)定，BAC化的病毒基因組轉染細胞后，載體及其兩 側病毒基因組序列會發(fā)生不同程度的缺失。為了解決這個問題，BAC載體兩側各引入了一 個IoxP位點,該載體轉入表達Cre重組酶的動物細胞中,Cre酶會催化在兩個位點之間的 重組反應，從而使原核來源的載體骨架部分從病毒基因組上去除，僅留下34bp的IoxP的序 列，保證了基因組的保真性和完整性，盡可能的避免了原核來源對插入位置鄰近的病毒基 因表達的影響，這樣利用BAC克隆的細菌遺傳工具操作大基因組病毒更趨完善，該方法成 功的用于偽狂犬病毒的BAC克?。⊿mith G A et al.，2000)。同源重組和位點特異性重組 是廣泛被用于修飾BAC克隆的方法。RecA同源重組系統(tǒng)是最早為人們熟知的大腸桿菌同源 重組系統(tǒng)。然而，由RecA介導的同源重組所需同源區(qū)長達IOOObp左右，操作的難度大，相 對耗時費力，從而使其應用受到很大程度的限制。RecE/RecT同源重組系統(tǒng)可以催化同源 反應在20_25bp的同源區(qū)間發(fā)生，同源重組效率較高（Muyrers J P et al.，2000;Muyrers J P et al·，2000a)。Red-gam 系統(tǒng)與 RecE/RecT 類似，且重組效率更高（Muyrers J P et al.，2000b;Jamsai D et al.，2003)。至此，人們把這兩種重組技術結合起來（Red/ET)實 現了直接以PCR產物作為供體分子對目的序列的打靶修飾，可以有效地對BAC克隆上的任 意基因進行點突變、插入和缺失等修飾。位點特異性重組是由位點特異性重組酶介導特定 位點間的發(fā)生位點特異性重組。通用的系統(tǒng)有Pl噬菌體的Cre-IoxP系統(tǒng)（Smith G A et al·，2000)，入噬菌體的 Int-att 系統(tǒng)（Suzuki Y et al·，2005)，和酵母的 Flp-FRT 系統(tǒng) (Cherepanov P P et al·，1995)。位點特異性重組技術祀向性強、重組效率高，也是修飾 BAC克隆的有效工具。這整個過程都是在細菌體內進行的，在很大程度上能避免了離體操作 對大分子的損傷。2005年，Li M Z et al.開發(fā)了一個有效的方法，用于同源重組方法在體 內構建重組DNA分子一交配輔助遺傳整合克隆（MAGIC) (Li M Z et al.，2005)。
[0005]禽流感（Avian influenza, Al)是由 A型流感病毒（Avian influenza virus, AIV) 引起的病毒性烈性傳染病，是目前危害世界及我國養(yǎng)禽業(yè)最重要的疫病之一。禽流感 (Avian influenza，Al)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一種急性傳染病，又稱真性雞 瘟或歐洲雞瘟。1878年該病首次在意大利出現并不斷蔓延；2003年末至2004年初又在亞 洲地區(qū)發(fā)生大規(guī)模流行：而1997年和2004年分別發(fā)生在香港和越南的禽流感，突破了種 間障礙直接感染人并引起死亡。近年來禽流感頻繁爆發(fā)，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性打擊。僅 東南亞國家因銷毀感染家禽的損失就超過1000億美元，我國銷毀家禽數千萬羽，損失達幾 百億元。2005年爆發(fā)于青海湖的高致病性禽流感，已經嚴重威脅到野生遷徙鳥類的安全，并 迅速傳遍了歐洲，造成了巨大的危害。H5N1禽流感病毒造成全球553人感染，323人死亡， 死亡率達58. 4%，我國40人感染，26人死亡。高致病性禽流感已突破種間屏障可直接傳染 給人，嚴重危害著人類健康。H9亞型禽流感病毒最早由Hommee and Easterday(1970)從火 雞體內分離到。1994年，陳伯倫等從病蛋雞體內分離到H9亞型AIV。此后，H9亞型AIV在 我國廣泛存在，多呈低致病性感染，并呈逐漸蔓延之勢。至1997年，H9亞型AIV廣泛分布 于各大洲。韓國、愛爾蘭、意大利等國都有H9禽流感暴發(fā)的報道，說明其已在家禽中建立 了穩(wěn)定的種系。1998年從香港的家豬體內分離到2株H9亞型流感病毒，這是首次從哺乳動 物體內分離到H9亞型流感病毒。1999從香港患流感的女孩體內分離到兩株H9流感病毒， 對這兩株病毒的分析表明其所有的基因片段與AIV-A/Quail/Hong Kong/Gl/97(H9)高度同 源，是典型的禽源流感病毒，該毒株是香港人感染H5N1和H9亞型密切相關的分支代表株。 2000-2001年，對中國南方地區(qū)的水禽（主要是家鴨）進行流感病毒監(jiān)測發(fā)現約10%水禽 被H9感染，感染率是20世紀70年代的4倍。盡管還沒有充分的證據表明H9亞型流感病 毒能在人與人之間傳播，但其已經成為目前嚴重危害人類健康的重要傳染病之一。
[0006] 當前，疫苗免疫接種可能是防止禽流感疫情和鴨病毒性腸炎大范圍流行的最經濟 的方法。但是采用傳統(tǒng)方法構建H5與H9亞型禽流感疫苗株的操作比較困難，利用細菌人 工染色體技術等基因操作手段，構建含有流感病毒ha基因的重組鴨腸炎病毒活載體疫苗， 為禽類疫苗的研制提供了新的技術手段。


【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種H9N2亞型禽流感病毒與鴨腸 炎病毒細菌人工染色體質粒的構建。首先我們構建得到鴨腸炎病毒細菌人工染色體的質 粒，即鴨腸炎病毒（DEV)疫苗株（C-KCE)的細菌人工染色體質粒，在此基礎上提供一種表達 H9N2亞型禽流感病毒ha基因的重組鴨腸炎病毒細菌人工染色體質粒pBAC-C-KCE-HA9的構 建。本發(fā)明利用大腸桿(例如DH10B)以及雞胚成纖維細胞（CEF細胞)重新快速拯救出DEV。 進一步地，本發(fā)明利用質粒pRTHGAl，插入H9N2亞型禽流感病毒ha基因，利用交配輔助遺傳 整合克?。碝AGIC方法）重組，即可獲得含有H9N2亞型禽流感病毒ha基因的重組鴨腸炎 病毒細菌人工染色體質粒PBAC-C-KCE-HA9。
[0008] 實現本發(fā)明的主要技術方案和步驟如下所述：
[0009] (1)將鴨腸炎病毒（C-KCE)的全基因組（GenBank ID:KF263690)通過同源重組的 方法插入到BAC質粒上得到一種鴨腸炎病毒細菌人工染色體質粒pBAC-C-KCE。含有該質粒 的大腸桿菌 DH10B-1S2/BAC-C-KCE，Escherichia coli DH10B-1S2/BAC-C-KCE，于 2013 年 8 月20日送交中國.武漢.武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO: M2013377 ；
[0010] (2)將質粒PRThGA改造為pRTHGAl，即在pRTHGAl質粒上分別插入H5N1亞型禽流 感病毒 ha 基因 （temporary GenBank accession NO:KJ003987)和 H9N2 亞型禽流感病毒 ha 基因 （GenBank ID:DQ465400. 1)得到重組質粒pRTHGA-HA5 (其結構如圖11所示)和重組質 粒PRTHGA-HA9 (其結構如圖12所示）；
[0011] (3)運用MAGIC的方法分別將質粒PRTHGA-HA5和PRTHGA-HA9中的禽流感病毒 ha基因快速穩(wěn)定的插入鴨腸炎病毒細菌人工染色體質粒pBAC-C-KCE中，從而得到含有 禽流感病毒ha基因和鴨腸炎病毒基因的重組質粒pBAC-C-KCE-HA5和pBAC-C-KCE-HA9 (其中PBAC-C-KCE-HA5質粒的結構見圖16所示，其核苷酸序列全長為169, 784bp ; PBAC-C-KCE-HA9質粒的結構見圖17,其核苷酸序列全長為169,766bp)。含有重組質粒 PBAC-C-KCE-HA5 的大腸桿菌 DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA，Escherichia coli DHlOB-IS2/ BAC-C-KCE-HA，于2013年8月20日送交中國.武漢.武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中 心保藏，保藏編號為CCTCC N0:M2013378。含有重組質粒pBAC-C-KCE-HA9的大腸桿菌 DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9, Escherichia coli DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9,于 2013 年 12 月31日送交中國.武漢.武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO: M2013740。
[0012] (4)分別將重組質粒 pBAC-C-KCE-HA5 和 pBAC-C-KCE-HA9 轉染 CEF 細胞剔除 BAC 骨架后，即可分別獲得表達H5N1亞型禽流感病毒ha基因的重組鴨腸炎病毒活載體疫苗株 rDEV-HA5 (于2014年1月2日送交中國.武漢.武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏， 保藏號為CCTCC NO :V201404)和表達H9N2亞型禽流感病毒ha基因的重組鴨腸炎病毒活載 體疫苗株rDEV-HA9 (于2014年1月2日送交中國.武漢.武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏 中心保藏，保藏號為CCTCC NO :V201403)。
[0013] (5)利用步驟（4)所得的疫苗株分別制備H5N1亞型禽流感病毒與鴨腸炎病毒活載 體疫苗和H9N2亞型禽流感病毒與鴨腸炎病毒活載體疫苗。
[0014] 本發(fā)明制備的H5N1亞型和H9N2亞型禽流感病毒的重組的鴨腸炎病毒活載體疫苗 可以用在控制鴨群中H5N1亞型和H9N2亞型禽流感和鴨病毒性腸炎上，可以有效的控制鴨 群中H5N1亞型和H9N2亞型禽流感和鴨病毒性腸炎的問題。
[0015] 更詳細的技術方案參見《【具體實施方式】》。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0017] 1、利用本發(fā)明中的鴨腸炎病毒細菌人工染色體大大縮短了獲得重組病毒的周期。
[0018] 2、本發(fā)明中的鴨腸炎病毒細菌人工染色體重組外源基因后對載體進行了剔除，無 功能性外源序列插入，對基因組亦無影響，不存在遺傳物質發(fā)生跨物種轉移的可能。
[0019] 3、利用本發(fā)明中的重組病毒疫苗rDEV-HA5和rDEV-HA9可以達到同時預防鴨病毒 性腸炎和H5亞型流感或H9亞型流感的效果。由此類推，利用本發(fā)明中的鴨腸炎病毒細菌 人工染色體重組外源基因可以達到一針同時防兩病甚至多種疾病的目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 序列表SEQ ID NO :1是重組質粒pBlue-UL26-UL27的核苷酸序列，長度12545bp， 其中下劃線標記的序列分別為限制性內切酶SalI、PacI、NotI的核苷酸序列。其中，1-6401 位堿基是PBlue-lox載體的部分核苷酸序列，長度為6401bp ;6394-6401位堿基是限制性 內切酶NotI的核苷酸序列，長度為8bp ;6402-6435位堿基是LoxP的部分核苷酸序列，長 度為34bp ;6436-7679位堿基是UL26的核苷酸序列，長度為1244bp，7680-7687位堿基是 限制性內切酶PacI的核苷酸序列，長度為8bp ;7688-9519位堿基是amp復制子的核苷酸 序列，長度為1832bp ;9520-9527位堿基是限制性內切酶PacI的核苷酸序列，長度為8bp ; 9528-10694為堿基是UL27的核苷酸序列，長度為1167bp ; 10695-12503位堿基是紅色熒光 基因的核苷酸序列，長度為1809bp ;12504-12511位堿基是限制性內切酶Sail的核苷酸序 列，長度為8bp ;12512-12545位堿基是LoxP的部分核苷酸序列，長度為34bp。
[0021] 序列表 SEQ ID NO :2 是質粒 pCAGGS 的 chicken β-actin promotor 和 rabbit β-globin ployA的表達框和同源臂的核苷酸序列，長度為2380bp。
[0022] 序列表SEQ ID N0:3是Loxp序列，長度為644bp，從第485-518bp是切除BAC骨 架后僅留下一個34bpLoxp位點的序列。
[0023] 序列表SEQ ID NO :4是序列表SEQ ID NO :3中切除BAC骨架后僅留下一個Loxp 位點的序列，序列長度為34bp。
[0024] 序列表SEQ ID NO :5是pRTHGAl的序列，序列長度為4263bp，斜線部分分別為限 制性內切酶位點Small和Xhol。其中，在酶切位點Small和XhoI之間插入禽流感病毒毒 株A/Duck/Hubei/xn/2007 (H5N1)的HA序列（核苷酸長度為1704bp)即可得到重組質粒 PRTHGA-HA5 (核苷酸序列長度為5961bp);在酶切位點Small和XhoI之間插入禽流感病毒 毒株A/Duck/HuBei/Wl/2004(H9N2)的HA序列（核苷酸長度為1685bp)即可得到重組質粒 PRTHGA-HA5 (核苷酸序列長度為5943bp)。
[0025] 圖I :是本發(fā)明的轉移載體pBlue-UL27-UL26的構建流程圖。
[0026] 圖2:是本發(fā)明的構建轉移載體pBlue-UL27-UL26過程中pcDNA3. 1+質粒示意圖。
[0027] 圖3 :是本發(fā)明的轉移載體pBlue-UL27_UL26的基因結構組成示意圖。
[0028] 圖4 :是本發(fā)明的構建轉移載體pBlue-UL27_UL26過程中載體pBlue-lox示意圖。 圖中的CMV Promoter是CMV啟動子。
[0029] 圖5 :是本發(fā)明的轉移載體pBlue-UL27_UL26質粒示意圖。
[0030] 圖6 :是本發(fā)明的轉移載體pBlue-UL27-UL26重組到鴨腸炎病毒上在雞的成纖維 細胞上增殖的示意圖。其中：圖6A為轉移載體pBlue-UL27-UL26重組到鴨腸炎病毒上在雞 的成纖維細胞上單獨形成空斑的照片；
[0031] 圖6B為轉移載體pBlue-UL27-UL26重組到鴨腸炎病毒上，并且經過多次空斑純化 后在雞的成纖維細胞增殖的示意圖。
[0032] 圖7 :是本發(fā)明的鴨腸炎病毒細菌人工染色體質粒pBAC-C-KCE的基因組成示意 圖，是通過用鴨腸炎病毒C-KCE的全長核苷酸序列DEV替換轉移載體pBlue-UL27-UL26中 的 DNA 片段（126+127+311?/)得到。
[0033] 圖8 :是本發(fā)明鴨腸炎病毒細菌人工染色體質粒pBAC-C-KCE的示意圖，其中CMV. P是CMV啟動子，RFP是紅色熒光蛋白基因。
[0034] 圖9 :是本發(fā)明pRThGA載體改造成重組質粒pRTHGAl的示意圖。其中：圖9中左 上圖中的CMVPromoter是CMV啟動子；圖9中右上圖及下中圖中的Chicken beta-actin promoter 是 Chicken beta-actin 啟動子，CMV. IE enhancer 是 CMV. IE 增強子。
[0035] 圖10 :是本發(fā)明構建重組質粒PRTHGA-HA5和pRTHGA-HA9的流程圖。其是在質粒 pRTHGAl的限制性內切酶位點Small和XhoI之間分別插入H5亞型禽流感病毒和H9亞型禽 流感病毒的ha基因獲得。
[0036] 圖11 :是本發(fā)明構建的重組質粒pRTHGA-HA5的示意圖。其中，圖中的Chicken beta-actin promoter 是 Chicken beta-actin 的啟動子，CMV. IE enhancer 是 CMV. IE 增強 子；質粒帶有Amp (氨節(jié)青霉素）抗性。
[0037] 圖12 :是本發(fā)明構建的重組質粒pRTHGA-HA9的示意圖。
[0038] 圖13 :是本發(fā)明的rDEV-HA5疫苗株與rDEV-HA9疫苗株的構建流程圖。
[0039] 圖14 :是本發(fā)明構建的含有H5亞型禽流感病毒ha基因和鴨腸炎病毒基因的重組 質粒PBAC-C-KCE-HA5的基因組成示意圖。是將質粒pBAC-C-KCE的紅色熒光蛋白基因（RFP) 替換為H5亞型禽流感病毒的ha基因而獲得。
[0040] 圖15 :是本發(fā)明構建的含有H9亞型禽流感病毒ha基因和鴨腸炎病毒基因的重組 質粒PBAC-C-KCE-HA9的基因組成示意圖。是將質粒pBAC-C-KCE的紅色熒光蛋白基因（RFP) 替換為H9亞型禽流感病毒的ha基因而獲得。
[0041] 圖16 :是本發(fā)明構建的含有H5亞型禽流感病毒ha基因和鴨腸炎病毒基因的重組 質粒PBAC-C-KCE-HA5的示意圖，其核苷酸序列全長為169,784bp。
[0042] 圖17 :是本發(fā)明構建的含有H9亞型禽流感病毒ha基因和鴨腸炎病毒基因的重組 質粒PBAC-C-KCE-HA9的示意圖，其核苷酸序列全長為169,766bp。
[0043] 圖18中的上圖中rDEV-HA5重組毒株與抗HA的單抗發(fā)生反應產生明顯的條帶呈 陽性，而DEV毒株則呈陰性，證明rDEV-HA5重組毒株構建成功。圖18的中圖中rDEV-HA9 重組毒株與抗HA的單抗發(fā)生反應產生明顯的條帶呈陽性，而DEV毒株則呈陰性，證明 rDEV-HA9重組毒株構建成功。圖18的下圖中rDEV-HA重組毒株與DEV毒株與內參GAPDH 的單抗都發(fā)生反應產生明顯的條帶呈陽性，證明該實驗有效。
[0044] 圖19 :是本發(fā)明中雛鴨免疫rDEV_HA5疫苗前后對高致病性禽流感病毒H5N1 (XN) 的HI抗體效價的監(jiān)測示意圖。
[0045] 圖20 :是本發(fā)明中雛鴨免疫rDEV-HA5疫苗前后對鴨腸炎病毒血清抗體的ELISA 監(jiān)測示意圖。
[0046] 圖21 :是本發(fā)明中rDEV-HA5疫苗對H5亞型高致病性禽流感病毒的保護率示意 圖。
[0047] 圖22 :是本發(fā)明中rDEV-HA5疫苗對鴨腸炎病毒的保護率示意圖。
[0048] 圖23 :是本發(fā)明中雛鴨免疫rDEV-HA9疫苗前后對禽流感病毒H9N2 (Wl)的HI抗 體效價的監(jiān)測示意圖。
[0049] 圖24 :是本發(fā)明中雛鴨免疫rDEV-HA9疫苗前后對鴨腸炎病毒血清抗體的ELISA 監(jiān)測示意圖。
[0050] 圖25 :是本發(fā)明中rDEV-HA9疫苗對H9亞型禽流感病毒的保護率示意圖。
[0051] 圖26 :是本發(fā)明中rDEV-HA9疫苗對鴨腸炎病毒的保護率示意圖。

【具體實施方式】
[0052] 實施例IBAC同源臂的構建和多拷貝的形成
[0053] 1、鴨病毒性腸炎（DEV)病毒基因組的提取
[0054] 將凍存的鴨腸炎病毒疫苗株C-KCE (該生物材料已經發(fā)表，參見文獻16 (Chen et al. Wei Zou et al.Construction of a full-length infectious bacterial artificial chromosome clone of duck enteritis virus vaccine strain. Virology Journal2013, 10:328)其基因組DNA序列已提交，見GenBank ID:KF263690。該毒株是華中 農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室于2010年在中國湖北省咸寧市某鴨場采集病料。
[0055] 該毒株的分離、制備方法如下：將從湖北省咸寧市某鴨場采集到的鴨場病料鴨場 病料加入0. 9%的生理鹽水后進行勻漿并將離心后的上清接種雞胚，盲傳三代后收集雞胚 尿囊液得到鴨腸炎病毒疫苗株C-KCE)的病變細胞連續(xù)凍融3次，4°C 8000rpm離心20min 沉淀細胞碎片。收集上清，30% (w/w)鹿糖溶液墊底，4? 16000rpm離心60min沉淀病毒粒 子。棄掉上清，加入雙蒸水將病毒粒子懸浮。加入蛋白酶K至終濃度500 μ g/rnL，十二烷基 硫酸鈉（SDS)至終濃度1%。置56°C水浴I h。將消化后產物用等體積的V(苯酚）：V(氯 仿）=體積比為1 :1和氯仿各抽提一次，16000rpm離心15min。取上清液向其中加入有加 入等體積的異丙醇輕輕混勻，-20°C沉淀核酸2h。4°C 16000rpm離心20min沉淀DNA，70% 冷乙醇洗滌一次，回收核酸沉淀，重懸于TER(含有RNA酶的TE)室溫作用10min，充分消化 RNA，消化完畢后用作模板使用。
[0056] 2.在UL26和UL27 (UL26和UL27是鴨腸炎病毒的部分基因組序列， GenBank:EU082088. 2)之間插入BAC載體：UL26兩端引入NotI和PacI的酶切位點（上下游 引物分別為UL26-F和UL26-R，引物具體序列見表1)，UL27上游引入Pac I的酶切位點（上 下游引物分別為UL27-F和UL27-R，引物具體序列見表1)。以C-KCE的基因組為模板將同源 臂用PCR擴增下來。以pcDNA3. 1(如圖2所示，該質粒由湖北大學生命科學學院馬立新教授 贈送)為模板擴增amp復制子，并且在兩端引入Pac I的酶切位點(上下游引物分別為Amp-F 和Amp-R，引物具體序列見表1)。以pRTRA質粒（由湖北大學生命科學學院馬立新教授贈送） 為模板擴增RFP基因，并在下游引入Sal I的酶切位點(上下游引物分別為RFP-F和RFP-R， 引物具體序列見表 1)。PCR 擴增體系：Easy-TaqO. 25μ L ;10xbuffer2. 5μ L，dNTP2y L，模 板 2 μ L，上下游引物（UL26-F 和 UL26-R，或 UL27-F 和 UL27-R，或 Amp-F 和 Amp-R，或 RFP-F 和RFP-R)各1 μ L，CldH2O補齊25μ L，混勻后按以下程序進行反應：95°C預變性5min，94°C 變性30s，按各引物退火溫度，40s，延伸lmin，30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0057] 采用重疊 PCR 方法（PCR 擴增體系：Easy-TaqO. 25 μ L ;10xbuffer2. 5 μ L， dNTP2 μ L，模板 2 μ L，三對上下游引物（UL26-F 和 UL26-R，UL27-F 和 UL27-R，RFP-F 和 RFP-R)各1 μ L，CldH2O補齊25 μ L，混勻后按以下程序進行反應：95°C預變性5min，94°C變性 30s，52°C退火，40s，72°C延伸5min，30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin)將三者連接在一起，然 后克隆到Sal I，Not I酶切的pBlue-lox載體(如圖4所示，由湖北大學生命科學學院馬立 新教授贈送）上，獲得重組pBlue質粒。將amp復制子克隆到PacI酶切的重組pBlue質粒 中得到帶有amp復制子的轉移載體pBlue-UL27-UL26 (長度為12,545bp，構建流程見圖1， 其基因結構組成見圖3,質粒圖見圖5)。
[0058] 表IPCR及重疊 PCR引物
[0059]

【權利要求】
1. 一種鴨腸炎病毒人工染色體的重組質粒DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9,其特征在于：在 鴨腸炎病毒人工染色體質粒pBAC-C-KCE中插入H9N2亞型禽流感病毒ha基因的片段，得到 重組的質粒DH10B-1S 2/BAC-C-KCE-HA9 ;所述質粒pBAC-C-KCE的基因結構組成如圖7所示； 所述質粒PBAC-C-KCE-HA9的基因結構組成如圖15所示。
2. -種包含H9N2亞型禽流感病毒與鴨腸炎病毒人工染色體的重組質粒 PBAC-C-KCE-HA9的大腸桿菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏編號為 CCTCC NO :M2013740。
3. 權利要求1所述的重組質粒DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9的制備方法，其特征在于該 質粒是通過如下步驟制備得到的： (1) 將登錄號為GenBank ID:KF263690的鴨腸炎病毒C-KCE的全基因組，通過同源重組 的方法插入到BAC質粒上得到一種鴨腸炎病毒細菌人工染色體質粒pBAC-C-KCE，含有該質 粒的大腸桿菌DH10B-1S 2/BAC-C-KCE保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO ：M2013377 ； (2) 將質粒？1?11^4改造為？1?1'邪41，即在？1?1'邪41質粒上插入!19吧亞型禽流感病毒11& 基因，其登錄號為GenBank ID:DQ465400. 1，得到重組質粒pRTHGA-HA9,其基因結構組成如 圖15所示； (3) 運用MAGIC的方法分別將質粒pRTHGA-HA9中的禽流感病毒ha基因插入鴨腸炎病 毒細菌人工染色體質粒pBAC-C-KCE中，得到含有禽流感病毒ha基因和鴨腸炎病毒基因的 重組質粒PBAC-C-KCE-HA9,其結構如圖17所示；含有該重組質粒pBAC-C-KCE-HA9的大腸 桿菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCCN0 : M2013740。
4. 權利要求1所述的質粒在制備H9N2亞型禽流感病毒與鴨腸炎病毒活載體疫苗中的 應用。
【文檔編號】A61K39/245GK104293820SQ201410030951
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年1月22日 優(yōu)先權日:2013年8月26日
【發(fā)明者】金梅林, 鄒忠, 李淑云 申請人:華中農業(yè)大學