Irf9在支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄中的功能及其抑制劑的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種IRF9在支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄中的功能及其抑制劑的應(yīng)用，屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明以IRF9基因敲除小鼠和野生型C57小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)血管損傷模型，進(jìn)行了小鼠內(nèi)膜新生、血管壁細(xì)胞增殖水平和平滑肌細(xì)胞表型的檢測(cè)，結(jié)果表明與野生型C57小鼠對(duì)比，IRF9基因敲除小鼠表現(xiàn)出抑制內(nèi)膜新生及細(xì)胞增殖。這提示一種IRF9基因在支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄中的功能，主要體現(xiàn)在IRF9基因具有促進(jìn)內(nèi)膜新生及細(xì)胞增殖的功能。針對(duì)IRF9的上述功能，IRF9可作為藥物靶標(biāo)用于篩選治療血管狹窄疾病的藥物，IRF9的抑制劑可用于制備治療支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄的藥物。
【專利說(shuō)明】IRF9在支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄中的功能及其抑制劑的應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種IRF9在支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄中的功能及其抑制劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]在目前中國(guó)，隨著飲食結(jié)構(gòu)的變化和人口的老齡化進(jìn)程，動(dòng)脈粥樣硬化閉塞性病變呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)并成為我們國(guó)家主要的致死原因之一。目前對(duì)這類疾病尚無(wú)根治辦法，血管外科的治療手段包括球囊擴(kuò)張、支架置入及動(dòng)脈旁路等方式，但是血管重建后再狹窄極大地影響了治療效果。有關(guān)血管再狹窄的研究已進(jìn)行了多年，但是迄今為止還沒(méi)有明確。已有研究表明，在損傷形成的過(guò)程中，新生內(nèi)膜及中膜組織過(guò)度增生以及同時(shí)伴隨的細(xì)胞外基質(zhì)形成，是造成再狹窄的主要病理基礎(chǔ)。生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcell, EC)可以產(chǎn)生多種促進(jìn)與抑制血管平滑肌細(xì)胞(vascular smoothmuscel cell，VSMC)生長(zhǎng)的物質(zhì)，且兩者保持動(dòng)態(tài)平衡，維持VSMC處于相對(duì)靜化狀態(tài)。促進(jìn)VSMC生長(zhǎng)的物質(zhì)主要有血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF),內(nèi)皮素(endomthelin,ET),和血管緊張素U (angiotonin II,Ang II )等，而抑制VSMC增殖的物質(zhì)主要有批氮(nitrogen monoxidum, NO),前列腺環(huán)素(prostacyclin, PG12)等。在血管內(nèi)皮損傷后，促進(jìn)VSMC增殖的生長(zhǎng)因子增多而抑制VSMC增殖的因子減少，這種動(dòng)態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致VSMC大量的增殖。
[0004]血管的內(nèi)膜新生是血管在各種損傷因素刺激下發(fā)生的病理改變，是多種心血管系統(tǒng)疾病共有的病理過(guò)程。血管壁中的平滑肌細(xì)胞在這個(gè)過(guò)程中起著重要的作用，它的增殖、凋亡和表型改變?cè)趦?nèi)膜增生的過(guò)程中扮演著重要的角色。血管損傷后，血管平滑肌細(xì)胞由中膜向內(nèi)膜遷移，平滑肌細(xì)胞的增殖凋亡失平衡，表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，血管壁不適重塑，從而引起內(nèi)膜增生。近年來(lái)，對(duì)于內(nèi)膜增生過(guò)程中信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究越來(lái)越引起人們的關(guān)注。
[0005]對(duì)這類疾病目前尚無(wú)根治方法，血管外科的主要治療手段是閉塞段血管重建，包括球囊擴(kuò)張、支架置入以及動(dòng)脈旁路手術(shù)等，但是血管重建后再狹窄的發(fā)生率較高(30%~60%)，極大地影響了治療效果，迄今為止血管重建后再狹窄依然是一個(gè)臨床難題。
[0006]IRF9 (interferon regulatory factor 9, IRF9)又稱為 P48、ISGF3 y(IFN-stimulated gene factor 3 y ) ?目前有IRF-9的研究主要集中在抗病毒，IRF-9和HBV (乙型肝炎病毒)干擾素刺激應(yīng)答元件樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，其表達(dá)迅速上調(diào)可以增強(qiáng)IFN-a誘導(dǎo)的HBV mRNA水平的顯著抑制。最近有報(bào)道，小鼠在IRF9基因敲除(Knockout，K0)后，表現(xiàn)為增加小腸粘液和淋巴結(jié)里的T細(xì)胞及中性粒細(xì)胞數(shù)目，這提示IRF9與炎癥有著密切聯(lián)系。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種IRF9及其抑制劑在制備治療支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明以野生型C57小鼠與IRF9基因敲除小鼠(IRF9-K0小鼠)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)頸動(dòng)脈導(dǎo)絲損傷模型誘導(dǎo)獲得小鼠血管損傷模型(vascular injury, VI),進(jìn)行了血管損傷模型(VI)小鼠內(nèi)膜新生測(cè)定、血管壁細(xì)胞增殖水平的檢測(cè)和平滑肌細(xì)胞表型的檢測(cè)的研究，結(jié)果表明:與野生型C57小鼠對(duì)比，IRF9基因敲除小鼠表現(xiàn)出內(nèi)膜新生及細(xì)胞增殖明顯低于WT小鼠；IRF9基因敲除可以抑制細(xì)胞增殖核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)和細(xì)胞周期蛋白(Cyclin Dl)的表達(dá)，可抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和內(nèi)膜增生；IRF9基因敲除可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞分化特異性抗原(Smoothelin)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(SmoothMuscle Actin, SMA)和平滑肌 22 a (smooth muscle 22 alpha, SM22 a )的表達(dá),抑制骨橋蛋白(osteopontin,0PN)的表達(dá),可抑制平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成型的表型轉(zhuǎn)換,從而抑制內(nèi)膜增生。上述結(jié)果提示IRF9基因敲除會(huì)改善血管再狹窄的發(fā)生，IRF9基因能夠促進(jìn)支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄的發(fā)生。
[0009]一種IRF9基因的新功能，具體體現(xiàn)在IRF9具有在支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄中促進(jìn)內(nèi)膜新生及細(xì)胞增殖的功能。
[0010]針對(duì)IRF9具有促進(jìn)內(nèi)膜新生及細(xì)胞增殖的功能，提供IRF9作為藥物靶標(biāo)在篩選治療血管狹窄疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0011]針對(duì)IRF9具有促進(jìn)內(nèi)膜新生及細(xì)胞增殖的功能，提供IRF9作為藥物靶標(biāo)在篩選治療支架后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。
[0012]針對(duì)IRF9具有促進(jìn)內(nèi)膜新生及細(xì)胞增殖的功能，提供IRF9作為藥物靶標(biāo)在篩選治療內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。
[0013]針對(duì)IRF9具有促進(jìn)內(nèi)膜新生及細(xì)胞增殖的功能，提供IRF9的抑制劑在制備治療血管狹窄疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0014]一種治療血管狹窄疾病的藥物，包含IRF9的抑制劑。
[0015]針對(duì)IRF9的上述功能，提供IRF9的抑制劑在制備治療支架后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。
[0016]一種治療支架后再狹窄的藥物，包含IRF9的抑制劑。
[0017]針對(duì)IRF9的上述功能，提供IRF9的抑制劑在制備治療內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。
[0018]一種治療內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄的藥物，包含IRF9的抑制劑。
[0019]所述的IRF9的抑制劑優(yōu)選為IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA干擾載體、IRF9的抗體及其他能夠抑制IRF9表達(dá)的抑制劑中的一種。
[0020]在本發(fā)明研究中，野生型小鼠和IRF9-K0小鼠在血管損傷模型(VI)的誘導(dǎo)下均發(fā)生血管損傷，與野生型小鼠相比，IRF9-K0小鼠內(nèi)膜新生及細(xì)胞增殖受到抑制。這些結(jié)果提示，IRF9對(duì)促進(jìn)內(nèi)膜新生及細(xì)胞增殖具有強(qiáng)大的影響，具有促進(jìn)血管狹窄和支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄形成的能力。本發(fā)明證明了 IRF9基因在血管損傷疾病模型中有著重要的惡化作用。
[0021]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
(I)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)IRF9基因的新功能，即IRF9基因具有促進(jìn)支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄的作用。
[0022](2)基于IRF9在促進(jìn)支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄中的作用，IRF9的抑制劑可用于制備治療支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄的藥物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1是WT和IRF9-K0小鼠的HE染色及內(nèi)膜面積結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖；其中，A:HE染色圖(K0代表1RF9-K0小鼠)，B:柱狀圖。
[0024]圖2是WT和IRF9-K0小鼠術(shù)后14d、28d血管壁細(xì)胞增殖水平標(biāo)志物PCNA、CyclinDl表達(dá)的免疫熒光染色及結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖；其中，A:免疫熒光染色，B:柱狀圖。
[0025]圖3是WT和IRF9-K0小鼠術(shù)后14d、28d平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物Smoothelin、SMA、SM22a和OPN表達(dá)的免疫熒光染色及結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖；其中，A:免疫熒光染色，B:柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0027]實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng):
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬，性別，周齡及來(lái)源:C57BL/6小鼠(WT小鼠)和IRF9基因敲除小鼠(IRF9-K0小鼠)，雄性，8-10周齡，體重24-27g，C57BL/6小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司；IRF9基因敲除小鼠(IRF9-K0，C57BL/6J背景)購(gòu)自RIKEN BRC公司，BRC編號(hào):RBRC00916。
[0028]動(dòng)物飼養(yǎng)及環(huán)境條件:所有的實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級(jí)動(dòng)物房(許可證號(hào)=SYXK (鄂):2009-0053)。每12小時(shí)交替照明，溫度24±2°C，濕度40%-70%，小鼠自由飲水進(jìn)食。
[0029]實(shí)施例1小鼠血管損傷模型(VI)獲得
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:使用8-10周齡，體重24-27g的WT和IRF9-K0小鼠，共分為四組:WT血管損傷組；WT假手術(shù)組；IRF9-K0血管損傷組；IRF9-K0假手術(shù)組，每組各60只小鼠。分別在手術(shù)后7天、14天、28天每組各處死20只小鼠，取損傷節(jié)段血管進(jìn)行分析。
[0030]2.小鼠血管損傷模型操作流程:
I)用電子天平于動(dòng)態(tài)模式下準(zhǔn)確稱取小鼠體重(g)，用雙蒸水準(zhǔn)確配置3%戊巴比妥鈉溶液，輕輕搖動(dòng)使其充分溶解，采用80mg/kg體重劑量，計(jì)算所需戊巴比妥鈉溶液體積后用ImL注射器準(zhǔn)確抽取相應(yīng)體積溶液，行腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠充分麻醉倒(約3min)后，8%硫化鈉頸部脫毛。
[0031]2)分離頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈。
[0032]3)在頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈分叉處用8-0線結(jié)扎頸外動(dòng)脈，同時(shí)用血管夾(WPI，501784-G)暫時(shí)性阻斷頸內(nèi)動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈供血。
[0033]4)用顯微剪(WPI，501839)在頸外動(dòng)脈結(jié)扎線的上方橫向剪一個(gè)小口。經(jīng)此血管切口插入直徑 0.015 英寸的導(dǎo)絲(N0.C-SF-15-15, Cook, Bloomington, Indiana),旋轉(zhuǎn)導(dǎo)絲進(jìn)退5-6次。
[0034]5)在切口近心端結(jié)扎頸外動(dòng)脈，松開頸內(nèi)及頸總動(dòng)脈置留的血管夾，剪斷線頭，清理術(shù)野，縫合頸部切口(假手術(shù)除不進(jìn)行導(dǎo)絲插入和旋轉(zhuǎn)進(jìn)退以外，其他操作均相同)。
[0035]實(shí)施例2血管損傷模型(VI)小鼠內(nèi)膜新生測(cè)定
1.小鼠取材
I)麻醉小鼠，剪破心臟放血。
[0036]2)從頸動(dòng)脈近分叉處剪下頸動(dòng)脈，取0.5-0.6cm長(zhǎng)，保留頸外動(dòng)脈線結(jié)。
[0037]3)將頸動(dòng)脈放入PBS中，用顯微鑷輕柔排干管腔內(nèi)的殘血。
[0038]4)將血管放入裝有ImL 4%多聚甲醛的1.5mL EP管中固定。
[0039]2.病理學(xué)檢測(cè)
2.1制備石臘標(biāo)本切片
由實(shí)驗(yàn)室專業(yè)病理工作人員制備石蠟標(biāo)本切片，主要操作程序包括修剪心臟一包埋框處理一流水沖洗一脫水一透明一浸蠟一包埋一切片(3 ym)—攤片一晾干或烘烤后備用。
[0040]2.2蘇木精-伊紅( HE)染色
主要步驟為:55 °C烘烤30min — 二甲苯5min，3次一100%酒精I(xiàn)min — 95%酒精I(xiàn)min — 70%酒精I(xiàn)min —雙蒸水Imin —蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021) 5min —水洗Imin — 1%鹽酸酒精(取3mL濃鹽酸與297mL 70%酒精充分混合均勻)l_3s —水洗Imin — Scott液(碳酸氫鈉0.35g,硫酸鎂2g,蒸懼水100mL)lmin —水洗Imin —伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)3-5min —蒸餾水洗去浮色一70%酒精I(xiàn)s — 95%酒精I(xiàn)s — 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，顯微鏡拍照。
[0041]以血管內(nèi)彈力纖維和外彈力纖維為界，內(nèi)彈力板以內(nèi)為血管內(nèi)膜，外彈力板以外為血管外膜，內(nèi)外彈力板之間為血管中膜。用Image-Pro Plus 6.0軟件分別圈各血管管腔面積。
[0042]內(nèi)膜面積大小的計(jì)算參照公式如下:
新生內(nèi)膜面積=內(nèi)彈力板面積-管腔面積；
中膜面積=外彈力板面積_內(nèi)彈力板面積。
[0043]小鼠HE染色后的血管內(nèi)膜新生的結(jié)果如圖1。通過(guò)HE染色可以觀察到，假手術(shù)組(Sham組)血管壁結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，血管內(nèi)膜為單層內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)構(gòu)完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊。血管損傷組(VI組)血管壁結(jié)構(gòu)不完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞缺失，新生內(nèi)膜增生明顯，并伴有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；IRF9-K0組在術(shù)后14d新生內(nèi)膜面積明顯比WT小鼠要低，這種保護(hù)作用在術(shù)后28d更明顯。同樣，內(nèi)膜面積/中膜面積的比值在VI術(shù)后IRF9-K0組要低于WT組，這種作用在28d要更顯著。
[0044]實(shí)施例3血管壁細(xì)胞增殖水平的檢測(cè)
免疫突光染色檢測(cè)細(xì)胞增殖核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin Dl)的表達(dá)。所需一抗信息:PCNA (#2586; 1:100; mouse;Cell Signaling Technology), cyclin Dl (#2978; 1:25; rabbit; Cell SignalingTechnology);所需二抗信息:Alexa Fluor 568-conjugated goat ant1-rabbit IgG(A11011; Invitrogen, Carlsbad, CA), Alexa Fluor 568-conjugated goat ant1-mouseIgG (Al1004; Invitrogen, Carlsbad, 150 d, CA)。
[0045]主要步驟為:
1)烤片:將石蠟切片置于烤箱中30min以上。
[0046]2)脫蠟:二甲苯 5minX3。
[0047]3)水合:100% 乙醇 5minX2 ；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ；ddH20 浸洗 5minX2。
[0048]4)檸檬酸鹽組織抗原修復(fù)(高壓修復(fù)):取一定量的pH6.0檸檬酸鹽抗原修復(fù)工作液于修復(fù)盒中，修復(fù)工作液的量必須能足夠浸沒(méi)整張切片，將修復(fù)盒放入已加入適量自來(lái)水的高壓鍋中，大火加熱至沸騰，將脫蠟水合后的組織切片置于耐高溫染色架上，再將染色架緩慢放入修復(fù)盒中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，開始計(jì)時(shí)5min后，壓力鍋斷開電源，去閥開蓋，取出修復(fù)盒；室溫放置20min自然冷卻后取出切片。
[0049]5 ) ddH20 漂洗 5min X 2 次，PBS 漂洗 5min X 2 次。
[0050]6)組化筆劃圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封閉，于濕盒中37°C封閉60mino
[0051]7)棄封閉液,滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4°C孵育過(guò)夜,37°C復(fù)溫30min,棄去一抗，PBS 洗 IOminX 3 次。
[0052]8)滴加二抗，于濕盒中37°C孵育60min，棄去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0053]9) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0054]10)熒光鏡下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4°C保存。
[0055]熒光統(tǒng)計(jì)方法:PCNA免疫熒光染色統(tǒng)計(jì)采用IPP軟件計(jì)數(shù)，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分比=PCNA陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)/ (內(nèi)膜+中膜)的總DAPI個(gè)數(shù)*100% ；CyclinDl免疫熒光染色統(tǒng)計(jì)采用IPP軟件直接測(cè)陽(yáng)性吸光度。
[0056]免疫熒光發(fā)觀察PCNA、CyclinDl在WT和IRF9-K0小鼠血管損傷后的表達(dá)變化，結(jié)果見圖2。PCNA, CyclinDl在血管組織中有表達(dá)，IRF9-K0小鼠在術(shù)后14d、28d PCNA的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)及CyclinDl的熒光強(qiáng)度均要小于同組的WT小鼠，表明IRF9基因敲除可以抑制PCNA, CyclinDl的表達(dá)，可抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和內(nèi)膜增生。
[0057]實(shí)施例4平滑肌細(xì)胞表型的檢測(cè)
免疫熒光染色檢測(cè)平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物:平滑肌肌動(dòng)蛋白(Smooth Muscle Actin,SMA)、平滑肌細(xì)胞分化特異性抗原(Smoothelin)、平滑肌22 a (smooth muscle 22 alpha,SM22a )、骨橋蛋白(osteopontin，0PN)的表達(dá)。所需一抗信息:SMA (ab5694; 1:100;rabbit; Abeam), Smoothelin (sc-28562; 1:100; rabbit; Santa Cruz), OPN (BS1264;1:100; rabbit; Bioworld) and SM22 a (abl4106; 1:100; rabbit; Abeam);所需二抗信息:Alexa Fluor 488-conjugated goat ant1-rabbit IgG (Al 1008; Invitrogen,Carlsbad, CA)。
[0058]主要步驟為:
1)烤片:將石蠟切片置于烤箱中30min以上。
[0059]2)脫蠟:二甲苯 5minX3 次。
[0060]3)水合:100% 乙醇 5minX 2 次；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ;ddH20 浸洗 5minX 2次。
[0061]4)檸檬酸鹽組織抗原修復(fù)(高壓修復(fù)):取一定量的pH6.0檸檬酸鹽抗原修復(fù)工作液于修復(fù)盒中，修復(fù)工作液的量必須能足夠浸沒(méi)整張切片，將修復(fù)盒放入已加入適量自來(lái)水的高壓鍋中，大火加熱至沸騰，將脫蠟水合后的組織切片置于耐高溫染色架上，再將染色架緩慢放入修復(fù)盒中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，開始計(jì)時(shí)5min后，壓力鍋斷開電源，去閥開蓋，取出修復(fù)盒；室溫放置20min自然冷卻后取出切片。
[0062]5 ) ddH20 漂洗 5min X 2 次，PBS 漂洗 5min X 2 次。
[0063]6)組化筆劃圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封閉，于濕盒中37°C封閉60mino
[0064]7)棄封閉液，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4°C孵育過(guò)夜，37°C復(fù)溫30min。
[0065]8)棄去一抗，PBS 洗 IOminX3 次。
[0066]9)滴加二抗，于濕盒中37°C孵育60min，棄去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0067]10) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0068]11)熒光鏡下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4°C保存。
[0069]熒光統(tǒng)計(jì)方法:采用IPP軟件直接測(cè)陽(yáng)性吸光度。
[0070]血管損傷后，血管平滑肌細(xì)胞由中膜向內(nèi)膜遷移，平滑肌細(xì)胞的增殖凋亡失平衡，表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，血管壁不適重塑，從而引起內(nèi)膜增生。免疫熒光發(fā)觀察SMA、Smoothelin、SM22 a和OPN在WT和KO小鼠血管損傷后的表達(dá)變化，結(jié)果見圖3。SMA,Smoothelin、SM22 a和 OPN在血管組織中有表達(dá)，IRF9-K0小鼠在術(shù)后14d、28d SMA、Smoothelin, SM22 a的熒光強(qiáng)度均要高于同組的WT小鼠，OPN的熒光強(qiáng)度均要低于同組的WT小鼠，表明IRF9基因敲除可以促進(jìn)SMA、Smoothelin、SM22 a的表達(dá)，抑制OPN的表達(dá)，可抑制平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成型的表型轉(zhuǎn)換，從而抑制內(nèi)膜增生。
[0071]上述實(shí)施例結(jié)果顯示，野生型小鼠和IRF9-K0小鼠在血管損傷模型(VI)的誘導(dǎo)下均發(fā)生血管損傷，與野生型小鼠相比，IRF9-K0小鼠內(nèi)膜新生及細(xì)胞增殖受到抑制。這些結(jié)果提示，IRF9對(duì)促進(jìn)內(nèi)膜新生及細(xì)胞增殖具有強(qiáng)大的影響，具有促進(jìn)血管狹窄和支架及內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄形成的能力。證明了 IRF9基因在血管損傷疾病模型中有著重要的惡化作用，其抑制劑可用于制備治療血管狹窄疾病的藥物。
[0072]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.1RF9作為藥物靶標(biāo)在篩選治療血管狹窄疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.1RF9作為藥物靶標(biāo)在篩選治療支架后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。
3.1RF9作為藥物靶標(biāo)在篩選治療內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。
4.1RF9的抑制劑在制備治療血管狹窄疾病的藥物中的應(yīng)用。
5.一種治療血管狹窄疾病的藥物，包含IRF9的抑制劑。
6.1RF9的抑制劑在制備治療支架后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。
7.一種治療支架后再狹窄的藥物，包含IRF9的抑制劑。
8.1RF9的抑制劑在制備治療內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄的藥物中的應(yīng)用。
9.一種治療內(nèi)膜剝脫術(shù)后再狹窄的藥物，包含IRF9的抑制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求4、6或8所述的應(yīng)用或權(quán)利要求5、7或9所述的藥物，其特征在于:所述的IRF9的抑制劑為 IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA干擾載體或IRF9的抗體。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK103784961SQ201410031604
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】李紅良, 張書敏, 朱麗華, 張曉東, 蔣丁勝, 向梅 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)