一種戰(zhàn)爭(zhēng)創(chuàng)傷快速止血產(chǎn)品及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種戰(zhàn)爭(zhēng)創(chuàng)傷快速止血產(chǎn)品及其制備方法和應(yīng)用，該產(chǎn)品包含添加了所述的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(mTG)的基質(zhì)，其中所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的氨基酸序列具有如SEQ?ID?NO：3所述的基因編碼的蛋白序列，或具有如SEQ?ID?NO：4所述的蛋白序列。更具體地，該止血產(chǎn)品選自止血?jiǎng)?、止血裝置、止血急救包或常見的止血制品，并且所述基質(zhì)為人體可吸收的流體或半固體形態(tài)，或可塑性的膠狀或膠體形態(tài)。其含有微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶和明膠。本發(fā)明具有快速止血、使用方便、防器官黏連、促進(jìn)傷口愈合、毒副作用低、吸收完全等優(yōu)勢(shì)，除了用于戰(zhàn)爭(zhēng)止血外，還可廣泛用于消防、安全事故等野外環(huán)境的創(chuàng)傷快速止血。
【專利說明】一種戰(zhàn)爭(zhēng)創(chuàng)傷快速止血產(chǎn)品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于用于野外創(chuàng)傷的快速止血產(chǎn)品，具體涉及一種含有微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(mTG)的止血組合物及其制備方法和應(yīng)用，該產(chǎn)品可用于戰(zhàn)爭(zhēng)、消防、安全事故等野外環(huán)境的創(chuàng)傷快速止血。
【背景技術(shù)】
[0002]失血過多是和平時(shí)期平民因創(chuàng)傷而死亡的主要因素之一，控制出血(或流血)是急救和創(chuàng)傷治療的重要步驟。在作戰(zhàn)等野外環(huán)境中，如戰(zhàn)爭(zhēng)、消防、安全事故等，由于現(xiàn)場(chǎng)搶救措施有限、時(shí)間緊迫、條件簡(jiǎn)陋，使得流血過多而引起死亡的事件時(shí)有發(fā)生。根據(jù)一項(xiàng)最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，美軍在反恐作戰(zhàn)的陣亡官兵中，有90%死在送往醫(yī)院的途中，而將近I / 4在受傷5~10分鐘之內(nèi)就因失血過多而不治身亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，戰(zhàn)爭(zhēng)中周圍主干血管傷占全部血管損傷的95%以上，止血技術(shù)已成為目前戰(zhàn)傷救治中最重要的環(huán)節(jié)，所以在戰(zhàn)爭(zhēng)中及時(shí)止血對(duì)于降低陣亡率起關(guān)鍵作用。另外，交通事故大等安全事故中大出血也常常引起死亡，在我國(guó)每年僅因交通事故而導(dǎo)致至少10萬人死亡，在安全事故中，至少有20%人員因大量失血(超過自身血液總量20%以上)而導(dǎo)致死亡。因此，及時(shí)研制適應(yīng)于我國(guó)戰(zhàn)爭(zhēng)或安全事故創(chuàng)傷等實(shí)際需要的快速止血產(chǎn)品尤為重要。
[0003]目前，國(guó)際上認(rèn)為理想的用于戰(zhàn)爭(zhēng)或意外事故的急救止血產(chǎn)品有8項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，SP:(I)快速止血；(2)隨時(shí)可用，不需提前準(zhǔn)備或混合；(3)簡(jiǎn)單易用，不需專業(yè)醫(yī)護(hù)人員的參與；(4)重量輕而持久耐用；(5)至少2年的貯存期和寬溫度范圍貯存能力(-10°C至55°C)；
(6)無毒副作用，沒有傷害或傳播病毒性疾病的風(fēng)險(xiǎn)；(7)成本低廉；(8)對(duì)傷口副作用小，便于傷口快速愈合。目前市`售產(chǎn)品包括以下幾種:
[0004](一 )沸石類
[0005]沸石是自然界中一種礦物質(zhì)，多分布于礦物質(zhì)沉淀或湖底火山灰沉積地帶。以鋁酸鹽聚合物和硅酸鹽為原料，通過控制反應(yīng)類型和結(jié)晶溫度，可制造出與天然沸石類似的人工沸石。天然或人工沸石結(jié)晶體經(jīng)脫水、消毒后，成為一種強(qiáng)力吸收劑，可選擇性吸收多種氣體和液體，也可吸收血液中的水分。根據(jù)該原理，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)院研制開發(fā)了一種速效止血粉，它是研制開發(fā)的以沸石主要為成分的止血產(chǎn)品，具有止血效果較好，成本低等優(yōu)勢(shì)。然而，沸石類止血材料有一些不足之處:一是止血過程中釋放熱量，使局部溫度升高，瞬間溫度接近60~70°C，容易造成創(chuàng)傷處燒傷；二止血后清除困難，給患者造成身心痛苦，有可能造成二次出血，加重身心痛苦；三是沸石密度大，攜帶不便。但由于目前沒有更好地替代品，故仍然成為目前應(yīng)用于戰(zhàn)爭(zhēng)或野外事故自救的止血產(chǎn)品
[0006](二)Quickclot
[0007]美軍在阿富汗戰(zhàn)爭(zhēng)以及伊拉克戰(zhàn)爭(zhēng)中使用了 Quickclot來對(duì)戰(zhàn)傷傷口進(jìn)行止血，效果較好，顯著提高了傷員的存活率。該材料是由硅氧化物、鋁、鈉、鎂及少量石英組成的一種人工合成惰性顆粒狀礦物質(zhì)，具有分子篩和吸附水分的功效，使用時(shí)將其覆蓋在出血傷口上，迅速吸收血塊中的水分，加速凝血過程，使血痂提早形成。但是，和沸石類似，該材料在也存在發(fā)熱、清楚困難等不足。
[0008](三)纖維蛋白膠類
[0009]2000 年 Rorbert(Rorbert Lff.Tissue adhesive for battle field hemorrhagecontrol [C]ADB209674, 2000:1?14.)研制出一種戰(zhàn)傷止血敷料，它由三層組成:最里層是撒有纖維蛋白膠干粉的有機(jī)硅膜，中間一層為聚氨酯泡沫材料，外層為醫(yī)用壓敏膠，目的是可以用來對(duì)動(dòng)脈破裂進(jìn)行止血。但該類材料不足之處是可能帶來人體或動(dòng)物血源性疾病感染、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，造價(jià)高，使用不便、止血速度慢，以及對(duì)大血管止血效果差等。
[0010]另外，有些纖維蛋白膠在使用時(shí)需臨時(shí)加入抑肽酶(例如=Tisseel和Beriplast均配有牛抑肽酶，而Crosseal配有氨甲環(huán)酸)以減緩凝血過程中纖維蛋白的溶解。2008年曾有關(guān)于抑肽酶使心臟手術(shù)死亡率增加的報(bào)道(Fergusson D A, Hebert P C，Mazer CD, Fremes S, MacAdams C，Murkin J M, et al.A comparison of aprotinin and lysineanalogues in high risk cardiac surgery[J].N Engl J Med, 2008，358:23192331.),其后Bayer醫(yī)藥公司回收了其在各醫(yī)院藥房的抑肽酶制劑(商品名=Trasylol)。
[0011](四)氧化纖維素類
[0012]氧化纖維素(商品名:0xycel)是纖維素衍生物的一種，由纖維素經(jīng)一氧化氮氧化而成。而氧化再生纖維素(又稱速即紗，中國(guó)稱:可溶性止血紗布，商品名=Surgicel),是一種再生氧化纖維編織紗塊，屬于羧甲基纖維素類止血材料，是纖維素經(jīng)氧化處理成為纖維素酸的薄紗狀或棉布狀可吸收止血材料。其止血機(jī)制是具有酸性的羧基與血紅蛋白中Fe3+結(jié)合，形成棕色膠塊，封閉毛細(xì)血管末端而止血，同時(shí)在密切接觸傷口后，可使血液中的凝血成分聚集在網(wǎng)眼紗布上，但并不依賴生理性凝血機(jī)制(Jamborova G.PospisilovaN,Semecky V, Hyspler R, Ticha A, Pospechova K, et al.Microdispersed oxidizedcellulose as a novel potential substance with hypolipidemic properties[J].Nutrition, 2008, 24:11741181.)。可溶性止血紗布在密切接觸傷口后，可使血液凝血成分聚集在其周圍，在2~Smin完成止血，`目前常用于手術(shù)創(chuàng)面出血以及滲血不易停止的部位，如骨面滲血等。有證據(jù)表明Surgicel于接觸創(chuàng)面一天內(nèi)便開始被機(jī)體吸收,吸收速率隨用量和局部血供以及局部組織的性質(zhì)而定，一股為4~8周。該產(chǎn)品具有組織相容性好，柔軟而菲薄，易于包、敷、填塞等優(yōu)點(diǎn)。不足之處是止血時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)出血迅猛者效果較差，不適合單獨(dú)作為傷口止血材料(周激.介紹一種新型長(zhǎng)方形急救包[J].人民軍醫(yī)，2002，45(1):61.) ο另外，Surgicel能降低損傷組織周圍pH值,這種高酸性環(huán)境有一定的抗菌能力，然而高酸性環(huán)境同時(shí)能增強(qiáng)損傷組織周圍炎癥反應(yīng)，使傷口愈合延遲(Krizov P，M sov L, Suttnar J, Salaj P, Dyr J E, Homola J, et al.The influence of intrinsiccoagulation pathway on blood platelets activation by oxidized cellulose[J].Biomed Mater Res A, 2007, 82:274280.)。
[0013](五)止血明膠類
[0014]止血明膠經(jīng)豬或牛等動(dòng)物皮提取并純化而成，其多孔結(jié)構(gòu)可吸收重于自身45倍的血液，在吸收血液后體積膨脹封閉血管裂口或創(chuàng)面，并激活血小板，促進(jìn)血凝塊形成，達(dá)到止血目的。止血明膠雖然來源于動(dòng)物組織，但沒有抗原性，無組織反應(yīng)，留在體內(nèi)經(jīng)酶作用4~6周后可被人體消化吸收。與上述氧化再生纖維素不同的是，止血明膠不會(huì)影響創(chuàng)傷周圍組織的pH值，因此更適合與其他止血材料聯(lián)合使用(Igai H, Yamamoto Y, ChangS S，Yamamoto M, Tabata Y, Yokomise H.Tracheal cartilage regeneration by slowrelease of basic fibroblast growth factor from a gelatin sponge[J].J ThoracCardiovasc Surg, 2007, 134:170175.)。但明膠止血需要機(jī)體凝血因子的參與，對(duì)于有凝血障礙的患者效果欠佳(Martinowite U, Spotnite W D.Fibrin tissue adnesives [J].Thromb Haemost, 1997, 78:661.)，同時(shí)因其吸收血液后膨脹可能壓迫傷口周圍組織，故不適用于靠近神經(jīng)或空間狹小的手術(shù)部位。由Baxter公司研發(fā)的FloSeal將牛明膠基質(zhì)與凝血酶制劑進(jìn)行了組合，明膠顆粒通過體積膨脹對(duì)傷口進(jìn)行填塞壓迫止血，凝血酶加速血凝塊形成。但如前文所述，這兩種成分發(fā)揮止血作用均依賴機(jī)體凝血機(jī)制。另外，F(xiàn)loSeal中的凝血酶來自人類血漿，目前已經(jīng)證實(shí)通過兩步蒸汽加熱法處理可以有效降低血漿中的病毒載量，但制造商承認(rèn)目前尚沒有能夠徹底清除人類血漿制品中病毒傳染性的加工工藝(Ereth M H, Schaff M, Ericson E F,Wetjen N M, Nuttall G A, Oliver W C Jr Comparativesafety and efficacy of topical hemostatic agents in a rat neurosurgicalmodel [J].Neurosurgery, 2008, 63:369372.),說明該類產(chǎn)品存在轉(zhuǎn)播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0015]綜上所述，國(guó)際上用于戰(zhàn)爭(zhēng)或安全事故的急救止血產(chǎn)品分為三大類(前兩種為化學(xué)材料類):
[0016]表1
[0017]
【權(quán)利要求】
1.一種新的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶mTG，其特征在于該mTG與野生型mTG相比發(fā)生了四個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變，即S23A、G73Y、K317Q、K325Q。
2.權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶mTG，其中該酶具有如SEQID NO:3所述的基因編碼的蛋白序列；或者，具有如SEQ ID NO:4所述的蛋白序列。
3.用于編碼權(quán)利要求1-3所述酶的基因序列。
4.一種用于戰(zhàn)爭(zhēng)或事故現(xiàn)場(chǎng)創(chuàng)傷的快速止血產(chǎn)品，其特征在于，包含添加了所述的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶mTG的基質(zhì)，其中所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的氨基酸序列具有如權(quán)利要求3所述的基因編碼的蛋白序列，或具有如權(quán)利要求1或2所述的蛋白序列。
5.如權(quán)利要求4所述的止血產(chǎn)品，其特征在于，其中止血產(chǎn)品選自止血?jiǎng)?、止血裝置、止血急救包或常見的止血制品，并且所述基質(zhì)為人體可吸收的流體、半固體、粉末或可塑性的膠狀或膠體形態(tài)。
6.如權(quán)利要求5所述的止血產(chǎn)品，其特征在于，所述流體或半固體形態(tài)的基質(zhì)或材料包括液體纖維蛋白密封材料或膠類，諸如角蛋白、膠原蛋白、流體明膠。
7.如權(quán)利要求6所述的止血產(chǎn)品，其特征在于，所述液體纖維蛋白密封材料或膠類包括溶解液，所述溶解液為磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液PH范圍從7.0至9.0。
8.如權(quán)利要求5所述的止血產(chǎn)品，其特征在于，所述可塑性的膠狀或膠體形態(tài)包括氧化纖維素、氧化再生纖維素、殼聚糖、角蛋白、膠原蛋白、明膠海綿。
9.如權(quán)利要求4-8之任一項(xiàng)所述的止血產(chǎn)品，其特征在于，所述基質(zhì)選自蛋白質(zhì)物質(zhì)，包括可吸收纖維蛋白膠、角蛋白、膠原蛋白或各種來源的醫(yī)用明膠以及液體纖維蛋白密封材料或膠，或者糖類物質(zhì)，·諸如氧化纖維素、氧化再生纖維素、殼聚糖、蛋白多糖、乙醇酸聚合物、乳酸聚合物；其中，所述蛋白多糖是聚-N-乙酰葡萄糖胺。
10.如權(quán)利要求9所述的止血產(chǎn)品，其特征在于，所述基質(zhì)優(yōu)選是明膠。
11.如權(quán)利要求10所述的止血產(chǎn)品，其特征在于，所述基質(zhì)選自哺乳動(dòng)物的A型高分子量明膠，或是20 %~60 %脯氨酸羥化的明膠。
12.如權(quán)利要求5所述的止血產(chǎn)品，其特征在于，所述止血產(chǎn)品的原材料形狀是:(i)粉末、顆?；蚱渌腆w形式的明膠；(ii)粉末、顆粒或其他固體形式的轉(zhuǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。
13.如權(quán)利要求5所述的止血產(chǎn)品，其特征在于，所述止血產(chǎn)品是止血帶或止血紗布，包括以棉紗或可溶性止血紗布為本體的止血帶或止血紗布外層，和用于接觸和包扎傷口的內(nèi)層，其中所述內(nèi)層中含有所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的基質(zhì)粉末或藥芯。
14.如權(quán)利要求5所述的的止血產(chǎn)品，其特征在于，所述止血產(chǎn)品是快速止血的噴霧裝置，包括加壓的噴霧或泡沫、明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶組分的混合物。
15.如權(quán)利要求5所述的止血產(chǎn)品，其特征在于，所述止血產(chǎn)品是含有上述明膠和谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶組分的止血急救包、急救箱等軍用止血。
16.制備上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述用于戰(zhàn)爭(zhēng)或事故現(xiàn)場(chǎng)創(chuàng)傷的快速止血產(chǎn)品方法，包括以下步驟: (1)制備能表達(dá)所述微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的重組微生物，并進(jìn)行重組表達(dá)； (2)收集并純化具有所述活性的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，并配置成活性溶液； (3)通過常規(guī)方法，將所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的活性溶液添加在人體可吸收基質(zhì)中； (4)將所述基質(zhì)進(jìn)行常規(guī)處理，即得到上述用于戰(zhàn)爭(zhēng)或事故現(xiàn)場(chǎng)創(chuàng)傷的快速止血產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】A61L15/38GK103816562SQ201410035698
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】易正芳, 呂方, 叢曉楠, 金明飛, 裴正培, 劉明耀 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)