納米金在制備測量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了納米金在制備測量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用，所述納米金是由以下粒徑的納米金顆粒組成：粒徑范圍9~15nm、平均粒徑11±0.5nm1份；粒徑范圍18~31nm、平均粒徑27±0.5nm1份；粒徑范圍41~63nm、平均粒徑48.5±0.5nm1份；粒徑范圍50~76nm、平均粒徑68±0.5nm1份；粒徑范圍93~114nm、平均粒徑104±0.5nm1份；粒徑范圍134~156nm、平均粒徑145.5±0.5nm1份；粒徑范圍151~176nm、平均粒徑166±0.5nm1份，按重量比計。本發(fā)明利用不同粒徑的納米金顆粒完成對腦外傷動物血腦屏障通透性的定量測量，不僅可以測得滲入血腦屏障的納米金數(shù)量，還能通過滲入血腦屏障的納米金粒徑估算出血腦屏障開放的最大孔隙，為動物實驗中各種血腦屏障損傷模型的提供了定量測量標準。
【專利說明】納米金在制備測量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于利用材料測量的領(lǐng)域，具體涉及納米金在制備測量血腦屏障(BloodBrain Barrier, BBB)通透性試劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]血腦屏障是存在于人類與動物血液和腦組織之間的主要生理屏障。正常狀況下，血腦屏障的開放程度只有幾納米，但在病理狀態(tài)下(特別是各種顱腦損傷)，血腦屏障可能將會開放達到幾十甚至幾百納米，這將導(dǎo)致一系列繼發(fā)腦損傷。
[0003]血腦屏障的通透性極大程度地影響著各種顱腦損傷模型的預(yù)后。國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)實驗研究中，對實驗動物血腦屏障通透性的檢測是判斷損傷程度與預(yù)后的重要實驗手段。現(xiàn)行主流的測量血腦屏障通透性的方法有十幾種，然而沒有一種可以定量地對血腦屏障通透性進行測量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了納米金在制備測量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下措施實現(xiàn)的:
[0006]納米金在制備測量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用。
[0007]上述納米金是由以下粒徑的納米金顆粒組成:粒徑范圍9~15nm、平均粒徑
11±0.5nml份；粒徑范圍18~31nm、平均粒徑27±0.5nml份；粒徑范圍41~63nm、平均粒徑48.5±0.5nml份；粒徑范圍50~76nm、平均粒徑68±0.5nml份；粒徑范圍93~114nm、平均粒徑104±0.5nml份；粒徑范圍134~156nm、平均粒徑145.5±0.5nml份；粒徑范圍151~176nm、平均粒徑166±0.5nml份,按重量比計。本發(fā)明不僅可以測得滲入血腦屏障的納米金數(shù)量，還能通過滲入血腦屏障的納米金粒徑估算出血腦屏障開放的最大孔隙，為動物實驗中各種血腦屏障損傷模型的提供了定量測量標準。
[0008]優(yōu)選地,上述納米金用水配制成溶液,溶液濃度為65~75ug/ml。所述納米金能迅速到達腦組織，并具靶向性的穩(wěn)定牢固的沉積于血腦屏障的開放孔隙，且易于檢測。
[0009]上述納米金的制備方法，采用氯金酸與檸檬酸三鈉反應(yīng)制得，其特征在于:以質(zhì)量份數(shù)計，氯金酸1份，檸檬酸三鈉分別為5份、1.5份、1份、0.6份、0.42份、0.32份、0.25份在水溶液中反應(yīng)，氯金酸質(zhì)量濃度為1%，分別制得粒徑范圍9~15nm、平均粒徑11.05nm ；粒徑范圍18~31nm、平均粒徑27.33nm ;粒徑范圍41~63nm、平均粒徑53nm ;粒徑范圍50~76nm、平均粒徑68.12nm ;粒徑范圍93~114nm、平均粒徑103.97nm ;粒徑范圍134~156nm、平均粒徑145.66nm ;粒徑范圍151~176nm、平均粒徑165.96nm的納米金顆粒。
[0010]為了使納米金粒徑在恰當范圍，上述納米金的制備方法，所述反應(yīng)溫度為90°C，時間為IOmin。
[0011]上述納米金的制備方法，包括以下步驟:在室溫下，將氯金酸晶體溶解于雙蒸水中配制成100ml濃度為0.01%的氯金酸溶液，加熱至90°C，維持10分鐘；分別迅速加入5.0ml、1.5ml、1.0ml,0.60ml,0.42ml,0.32ml,0.25ml的1%檸檬酸三鈉水溶液，邊加熱邊攪拌30分
鐘，攪拌速度設(shè)為200轉(zhuǎn)/分鐘，得到納米金溶液；過濾后將納米金溶液在8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心，棄除上清液，再用100ml雙蒸水溶解后在8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心，重復(fù)三次，最后用雙蒸水定容至100ml。
[0012]采用上述納米金測量血腦屏障通透性的方法，利用乙炔火焰法測定腦組織溶液中納米金的含量。
[0013]采用上述納米金測量血腦屏障通透性的方法，選取同樣程度腦外傷后24小時的雄性體重220-260g Sprague-Dawley大鼠,分別通過尾靜脈注射2ml上述納米金溶液；2小時后，大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，灌注500ml生理鹽水后完整取出腦組織，去除小腦，對半切開左右半腦，取傷測腦稱重，置于IOml離心管中，按重量加入3ml/g的65%濃硝酸，加熱至900C I分鐘，于37°C恒溫箱孵育24小時，然后見腦組織完全溶解，過濾，最后每管用雙蒸水定容IOml制得樣本；采用乙炔火焰法測量每管樣本溶液中金元素的濃度:調(diào)節(jié)原子吸收分光光度計(日立NITACHI180-80)，吸收波長設(shè)為242.8nm,空氣壓力設(shè)為1.65kg/cm3,乙炔
0.25kg/cm3 ;通過標準含金元素溶液標定儀器，然后將樣本進樣，進樣Iml后開始讀數(shù)，連續(xù)讀數(shù)五次取平均值，得到各粒徑納米金含量。
[0014]有益效果
[0015]1.本發(fā)明利用不同粒徑的納米金顆粒完成對腦外傷動物血腦屏障通透性的定量測量，不僅可以測得滲入血腦屏障的納米金數(shù)量，還能通過滲入血腦屏障的納米金粒徑估算出血腦屏障開放的最大孔隙，首次建立為動物實驗中各種血腦屏障損傷模型的提供了定量測量標準的試驗。
[0016]2.本發(fā)明原料簡單，操作方便快捷，所述納米金能迅速到達腦組織，并具靶向性的穩(wěn)定牢固的沉積于血腦屏障的開放孔隙，且易于檢測，能準確、真實的反映血腦屏障的開放情況。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1實施例1制得的納米金顆粒的粒徑參數(shù)
[0018]圖2實施例1中乙炔火焰法測得各組樣本金含量
[0019]圖3實施例1中制得的納米金的電鏡圖(粒徑25nm)
[0020]圖4實施例1蛛網(wǎng)膜下腔出血后滲入血腦屏障的納米金的電鏡圖
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】做進一步的描述，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。
[0022]實施例1
[0023]在室溫條件下，將氯金酸晶體溶解于雙蒸水中配制成100ml濃度為0.01%的氯金酸溶液，加熱至 90°C，維持 10 分鐘;迅速加入 5.0ml、1.5ml、1.0ml,0.60ml,0.42ml,0.32ml、
0.25ml的1%檸檬酸三鈉水溶液，邊加熱邊攪拌30分鐘，攪拌速度設(shè)為200轉(zhuǎn)/分鐘，得到納米金溶液；過濾后將納米金溶液在8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心，棄除上清液，再用100ml雙蒸水溶解后在8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心，重復(fù)三次，最后用雙蒸水定容至100ml。得到表1的納米金顆粒。使用馬爾文納米粒度儀檢測納米金粒徑，詳見圖1。
[0024]采用同樣程度腦外傷蛛網(wǎng)膜下腔出血后24小時的雄性Sprague-Dawley大鼠(體重 250-300g) 7 組(n=6)和正常對照 Sprague-Dawley 大鼠 I 組(n=6)(體重 250_300g)，分別通過尾靜脈注射2ml上述制得的組I~7的納米金溶液及等量0.9%生理鹽水。2小時后，大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，灌注500ml生理鹽水后完整取出腦組織。去除小腦，對半切開左右半腦，取傷測腦稱重，置于IOml離心管中，按重量加入3ml/g的65%濃硝酸。加熱至90°C I分鐘，于37°C恒溫箱孵育24小時。然后見腦組織完全溶解，過濾。最后每管用雙蒸水定容
IOml o
[0025]采用乙炔火焰法測量每管溶液中金元素的濃度:調(diào)節(jié)原子吸收分光光度計(日立NITACHI 180-80)，吸收波長設(shè)為242.8nm,空氣壓力設(shè)為1.65kg/cm3,乙炔0.25kg/cm3。通過標準含金元素溶解標定儀器。然后將樣本進樣，進樣Iml后開始讀數(shù)，每個樣讀數(shù)五次，記錄其平均值，詳見圖2。
[0026]由不同腦樣本含金濃度計算出各腦樣本含金量(含金量=濃度X 10ml)，再根據(jù)不同粒徑納米金滲入血腦屏障的量的差值計算出血腦屏障開放孔隙在各個范圍所占比例，詳見表2。
[0027]
【權(quán)利要求】
1.納米金在制備測量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的納米金在制備測量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用，所述納米金是由以下粒徑的納米金顆粒組成:粒徑范圍9~15nm、平均粒徑11 ±0.5nm 1份；粒徑范圍18~31nm、平均粒徑27±0.5nm 1份；粒徑范圍41~63nm、平均粒徑48.5±0.5nm 1份；粒徑范圍5(T76nm、平均粒徑68±0.5nm 1份；粒徑范圍93~114nm、平均粒徑104±0.5nm1份；粒徑范圍134~156nm、平均粒徑145.5±0.5nm 1份；粒徑范圍151~176nm、平均粒徑166±0.5nm 1份，按重量比計。
3.如權(quán)利要求2所述的納米金在制備測量血腦屏障通透性試劑中的應(yīng)用，所述納米金用水配制成溶液，溶液濃度為65~75ug/ml。
4.如權(quán)利要求1~3任一所述納米金的制備方法，采用氯金酸與檸檬酸三鈉反應(yīng)制得，其特征在于:以質(zhì)量份數(shù)計，氯金酸1份，檸檬酸三鈉分別為5份、1.5份、1份、0.6份、0.42份、0.32份、0.25份在水溶液中反應(yīng)，氯金酸質(zhì)量濃度為1%，分別制得粒徑范圍擴15nm、平均粒徑11.05nm ;粒徑范圍18~31nm、平均粒徑27.33nm ;粒徑范圍41~63nm、平均粒徑53nm ；粒徑范圍5(T76nm、平均粒徑68.12nm ;粒徑范圍93~114nm、平均粒徑103.97nm ;粒徑范圍134~156nm、平均粒徑145.66nm ;粒徑范圍151~176nm、平均粒徑165.96nm的納米金顆粒。
5.如權(quán)利要求4所述納米金的制備方法，所述反應(yīng)溫度為90°C，時間為lOmin。
6.如權(quán)利要求4或5所述納米金的制備方法，包括以下步驟:在室溫下，將氯金酸晶體溶解于雙蒸水中配制成100ml濃度為0.01%的氯金酸溶液，加熱至90°C，維持10分鐘；分別迅速加入 5.0ml、1.5ml、1.0ml,0.60ml,0.42ml,0.32ml,0.25ml 的 1%檸檬酸三鈉水溶液，邊加熱邊攪拌30分鐘，攪拌速度設(shè)為200轉(zhuǎn)/分鐘，得到納米金溶液；過濾后將納米金溶液在8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心，棄除上清液，再用100ml雙蒸水溶解后在8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C條件下離心，重復(fù)三次，最后用雙蒸水定容至100ml。
7.權(quán)利要求1-3任一所述納米金測量血腦屏障通透性的方法，利用乙炔火焰法測定腦組織溶液中納米金的濃度。
【文檔編號】A61K49/00GK103800920SQ201410036178
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月24日
【發(fā)明者】譚亮, 李飛, 胡榮, 李文龑, 馮華 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院