密碼子優(yōu)化的非洲豬瘟病毒p54基因、其核酸疫苗及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種經密碼子優(yōu)化的非洲豬瘟病毒P54基因，及基于該基因的核酸疫苗，該核酸疫苗由真核表達載體和經密碼子優(yōu)化的非洲豬瘟病毒P54基因組成。該核酸疫苗的構建是通過如下步驟：P54蛋白密碼子優(yōu)化、設計特異性性引物、人工合成非洲豬瘟病毒P54基因序列轉入克隆載體、將純化后的P54基因重組到真核表達載體中。本核酸疫苗可以用于預防非洲豬瘟的發(fā)生，亦是解決非洲豬瘟免疫防控的有力工具。與傳統(tǒng)的疫苗相比，本核酸疫苗可以達到相同的免疫效果所需的量小，并且安全、長效、穩(wěn)定、操作便捷。
【專利說明】密碼子優(yōu)化的非洲豬瘟病毒P54基因、其核酸疫苗及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物基因工程【技術領域】，具體涉及一種密碼子優(yōu)化的非洲豬瘟病毒P54基因，及基于該基因的DNA核酸疫苗，同時還涉及該基因在制備預防非洲豬瘟的疫苗方面的應用。
【背景技術】
[0002]非洲豬痕(AfricanSwine fever, ASF)是由非洲豬痕病毒(African Swine fevervirus，ASFV)引起的一種主要感染豬的一種烈性病毒病，自1909年首次在非洲發(fā)現以來，目前已蔓延擴散到整個非洲、歐洲和南美洲等國家和地區(qū)，許多國家因此蒙受了巨大的經濟損失，該病被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為重要動物疫病。我國雖然還沒有發(fā)現非洲豬瘟疫情，但我國周邊很多國家均有非洲豬瘟流行的報道，我國已面臨ASFV傳入和流行的嚴重威脅。目前，國內外學者對其疫苗研制開展了大量工作，但還無有效的疫苗和藥物可以預防和治療該病。研究發(fā)現，非洲豬瘟滅活疫苗效果不明顯，而弱毒疫苗的安全性差，易導致慢性流行，迫切需要一種新型疫苗來克服目前存在的問題。
[0003]核酸疫苗與傳統(tǒng)的滅活疫苗、亞單位疫苗和基因工程疫苗等相比，其具有如下優(yōu)點:1.免疫保護力增強，主要是通過接種后蛋白質在宿主細胞內表達，直接與組織相容性復合物MHCI或II類分子結合，同時誘導產生細胞免疫和體液免疫；2.制備簡單，省時省力。核酸疫苗作為一種重組質粒，易在工程菌內大量擴增，提純方法簡單，且可將編碼不同抗原基因的多種重組質粒聯合應用，制備多價核酸疫苗，這樣可大大減少人力、物力、財力以及多次接種帶來的應激反應；3.同種異株交叉保護是核酸疫苗的最大優(yōu)點之一，可通過對基因表達載體所攜帶的靶基因進行改造，從而選擇抗原決定簇；4.核酸疫苗應用較安全，接種后蛋白質抗原在宿主細胞內表達，不存在毒力返祖或殘留毒力病毒引起發(fā)病的危險，也不會引起對機體的不良反`應；5.可產生持久免疫應答，一次接種可獲得長期免疫力，無需反復多次加強免疫；6.貯存、運輸方便，核酸疫苗的質粒DNA穩(wěn)定性好，便于貯存和運輸，無須冷藏。因此，核酸疫苗可能是解決非洲豬瘟免疫防控的有力工具。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種經密碼子優(yōu)化的非洲豬瘟病毒P54基因、及基于該基因的非洲豬瘟病毒核酸疫苗。
[0005]本發(fā)明為達到其目的，采用的技術方案如下:
[0006]本發(fā)明第一方面提供一種密碼子優(yōu)化的非洲豬瘟病毒P54基因，其序列如序列表中序列I所示。密碼子優(yōu)化的非洲豬瘟病毒P54基因和原序列對比如下:
[0007]優(yōu)化后:AT(^ATTCTGMTTTTTTCMOI^T￡TATCOGAGACATTATGGTGAGTG職TCACCAGTCAQJCCA
[0008]原序列:ATGGATTCTGMTTTTTTCMCOGGTTTATCOGCGGCATTATGGTGAGTGTTTGTCACCAGTCACCCCA
[0009]優(yōu)化后!(XMGTITCTrCTtXACACATATCTATACTAnCTMITGCTATairaTCCTAGTCAmmTCATOGTC
[0010]原序列zOCMGCTTCTTCTOCACACATATGTATAaWrTCTCATTGCTATOGTGGTCTTAGIUmTVTTATCATCm'[0011]優(yōu)化后:CTMTCTATCTATTCTCTTCMGAAAMAAAM(rr(rr(X2GCTATTGAGGAGGAAGATATTCAATTT
[0012]原序列:CTMTCTATCTATTCTCTTCMGMAGAMMAGCTGCTGCOGCTATTGAGGAGGMGATATACAGTTT
[0013]優(yōu)化后:AIIM￡COeTATCMGATCMCMTGGGCAGMGTCACTCCACMCCAGGTAqiTCTMACOGGCTGG
[0014]原序列:ATAMTCCTTATCMGATCAGCMTGGGCAGMGTCACTCCACMCCAGGTACCTCTMACOGGCTGG
[0015]優(yōu)化后:￡GCIACTACAGCMGTGCAGGCMACCAGTCACGGGCAGACCGGCMCMACAGACCAGCMCM
[0016]原序列:AGCGACTACAGCMGTGCAGGCMACCAGTCACGGGCAGACCGGCMCMACAGACCAGCMCM
[0017]優(yōu)化后:ACMACCAGTCACGGACMCCCAGT￡ACGGACAGACTAGTCATGGCMCTGGCGGICCAGCIGCIGC
[0018]原序列:ACMACCAGTCACGGACMCCCAGTTACGGACAGACTAGTCATGGCMCTGGCGGGCCAGCGGCCGC
[0019]優(yōu)化后:ACqQGQIGQEGQEAGTGCTCATCOGACTGAGCOGTAIAOGACAGTCACTACTCMAACACTGCTTCAC
[0020]原序列:ACCTGCGGCOGCGAGTGCTCATCOGACTGAGCCTTACAOGACAGTCACTACTCAGMCACTGCTTCAC
[0021]優(yōu)化后:AMCMTGT(XGCTATTGAAMOTMGACAMGAMCACTTATAOGCATAAAGACCTAGAAAACTCC
[0022]原序列:MACMTGTOGGCTATTGAMATTTAOGACMAGMACACCTATAOGCATAMGACCTAGAMACTCC [0023]優(yōu)化后:￡TATAA
[0024]原序列:TTGTAA
[0025]本發(fā)明第二方面提供一種用于擴增如上文所述的密碼子優(yōu)化的非洲豬瘟病毒P54基因的引物對，所述引物對其序列如下所示:
[0026]Pl:5’-GCCATGGATTCTGAATTTTTTCAACC-3’ ；
[0027]P2:5’-TTATAGGGAGTTTTCTAGGTCT-3’ 。
[0028]本發(fā)明第三方面提供一種非洲豬瘟病毒核酸疫苗，其由經密碼子優(yōu)化的非洲豬瘟病毒P54基因和真核表達載體組成，所述經密碼子優(yōu)化的非洲豬瘟病毒P54基因其序列如序列表中序列I所示。
[0029]所述的表達載體可為任何一種真核表達載體，所述真核表達載體具體可為但不限于 pcDNA3.3。
[0030]本發(fā)明提供的非洲豬瘟病毒，其構建包括如下步驟:
[0031](I)ASFV P54基因密碼子的優(yōu)化:密碼子優(yōu)化，即根據表達系統(tǒng)對氨基酸密碼子的偏愛性，對基因序列進行重新設計，將基因序列中利用率低或稀有的密碼子修改為表達系統(tǒng)使用頻繁的密碼子，同時確保所表達蛋白的氨基酸序列不變。根據Genebank公布的ASFVP54基因序列(EU874328.1 )，利用EMBOSS軟件分析，結合哺乳動物細胞對密碼子的偏愛性，對P54基因進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的ASFV P54基因其序列如序列表中序列I所示，優(yōu)化前的ASFV P54基因其序列如序列表中序列2所示。
[0032](2)人工合成密碼子優(yōu)化的ASFV P54基因:委托基因公司通過化學合成得到密碼子優(yōu)化的ASFV P54基因，并克隆至pUC18克隆載體中，得到標記為pUC18-ASFV P54的重組載體。
[0033](3)密碼子優(yōu)化的ASFV P54基因的PCR引物設計及擴增:根據密碼子優(yōu)化后的ASFV P54基因序列，設計特異性上游引物和下游引物，引物對P1/P2的序列分別如下所示:
[0034]Pl:5’-GCCATGGATTCTGAATTTTTTCAACC-3’ ；
[0035]P2:5’-TTATAGGGAGTTTTCTAGGTCT-3’ 。
[0036]利用設計的特異性引物P1/P2，從pUC18-ASFV P54中擴增密碼子優(yōu)化的ASFV P54基因。(4)將步驟(3)中擴增獲得的ASFV P54基因經過凝膠電泳、回收后，克隆到pcDNA3.3真核表達載體中，得到重組質粒pcDNA3.3-ASFV P54。經過對pcDNA3.3-ASFV P54的純化、酶切、測序鑒定后，確定得到了非洲豬瘟核酸疫苗。
[0037]將純化的pcDNA3.3-ASFV P54質粒，利用脂質體將其轉染到BHK-21細胞中，經過G418持續(xù)加壓篩選、PCR檢測鑒定后，獲得陽性細胞系。間接免疫熒光試驗證實，獲得的陽性BHK-21細胞中表達了非洲豬瘟P54蛋白，表明研制的非洲豬瘟核酸疫苗在哺乳動物細胞中可以持續(xù)產生目的蛋白。
[0038]將純化的pcDNA3.3-ASFV P54按照50 μ g/次的接種量，分三次肌肉接種Balb/c小鼠，采集小鼠血清進行ELISA檢測，結果發(fā)現小鼠血清中非洲豬瘟抗體均為陽性，表明非洲豬瘟核酸疫苗接種小鼠后，可以誘導產生抗非洲豬瘟抗體。
[0039]上文所述的非洲豬瘟病毒核酸疫苗可在制備用于預防非洲豬瘟的藥物中的應用。
[0040]本發(fā)明的有益效果:
[0041]本發(fā)明提供的非洲豬瘟核酸疫苗，使得ASFV P54基因在哺乳動物細胞中得到顯著表達，并可有效刺激被接種動物的免疫系統(tǒng)，產生相應的抗體，有利于免疫抵抗非洲豬瘟病毒。本核酸疫苗可以用于預防非洲豬瘟的發(fā)生，亦是解決非洲豬瘟免疫防控的有力工具。與傳統(tǒng)的疫苗相比，本核酸疫苗可以達到相同的免疫效果，但所需的量小，并且安全、長效、穩(wěn)定、操作便捷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1是pcDNA3.3質粒載體圖譜；
[0043]圖2是ASFV P54基因的PCR擴增檢測電泳圖:
[0044]M為DNA分子量標準，I為優(yōu)化后的ASFV P54基因擴增產物，2為陰性對照。
[0045]圖3是重組質粒pcDNA3.3-ASFV P54的PCR鑒定:
[0046]M為DNA分子量標準，I為使用CMV Forword Primer和ASFV P2兩條引物擴增pcDNA3.3-ASFV P54質粒的產物，2為陰性對照，3為使用ASFV P54P1和P2兩條引物擴增pcDNA3.3-ASFV P54質粒的產物，4為陰性對照。
[0047]圖4是轉染pcDNA3.3-ASFV P54的BHK-21細胞的PCR鑒定結果:
[0048]M為DNA分子量標準，I為擴增轉染pcDNA3.3-ASFV P54的BHK-21細胞的產物，2為擴增pcDNA3.3-ASFV P54質粒的產物，3為陰性對照。
[0049]圖5A-圖 5B:
[0050]圖5A、圖5B是BHK-21細胞中表達目的蛋白的間接免疫熒光試驗結果。
[0051]圖6是BHK-21細胞中表達目的蛋白的Western Blot試驗結果:
[0052]I為轉化pcDNA3.3-ASFV P54質粒的BHK-21細胞，2和3為正常BHK-21細胞。
[0053]圖7是抗體水平監(jiān)測圖。
【具體實施方式】
[0054]下面結合附圖和實施例來對本發(fā)明作進一步的說明。
[0055]實施例1:非洲豬瘟病毒P54基因核酸疫苗的構建
[0056]1.1密碼子優(yōu)化的ASFV P54基因的設計和合成
[0057]首先利用EMBOSS軟件分析ASFV P54基因序列，找出其密碼子使用偏愛性以及與哺乳動物細胞密碼子使用偏愛性。根據密碼子偏愛性，對ASFV P54基因進行密碼子優(yōu)化，此密碼子優(yōu)化后的基因序列所編碼的蛋白質氨基酸序列保持不變。密碼子優(yōu)化后的基因其序列如序列表中序列I所示。密碼子優(yōu)化的ASFV P54基因由TAKARA公司合成，并克隆入PUC18克隆載體中，構建成重組質粒pUC18-ASFV P54。經測序證實合成的基因序列正確。
[0058]1.2密碼子優(yōu)化的ASFV P54某閔的PCR擴增與序列分析
[0059]首先，根據優(yōu)化后的ASFV P54基因序列，設計一對特異性擴增引物P1/P2，從PUC18-ASFV P54質粒中擴增ASFV P54基因，引物序列P1、P2分別如下所示:
[0060]Pl:5’-GCCATGGATTCTGAATTTTTTCAACC-3’ ；
[0061 ] P2:5’-TTATAGGGAGTTTTCTAGGTCT-3’。
[0062]以人工合成的pUC18-ASFV P54質粒為模板，利用引物對P1/P2進行擴增，反應體系見表1:
[0063]表1:PCR反應體系配制表
【權利要求】
1.一種密碼子優(yōu)化的非洲豬瘟病毒P54基因，其序列如序列表中序列I所示。
2.一種用于擴增如權利要求1所述的密碼子優(yōu)化的非洲豬瘟病毒P54基因的引物對，其特征在于，所述引物對其序列如下所示:
Pl:5’-GCCATGGATTCTGAATTTTTTCAACC-3’ ；
P2:5’-TTATAGGGAGTTTTCTAGGTCT-3’ 。
3.—種非洲豬瘟病毒核酸疫苗，其特征在于，其包含非洲豬瘟病毒P54基因和真核表達載體，所述非洲豬瘟病毒P54基因其序列如序列表中序列I所示。
4.根據權利要求3所述的非洲豬瘟病毒核酸疫苗，其特征在于，所述的真核表達載體為任何一種真核表達載體。
5.根據權利要求4所述的非洲豬瘟病毒核酸疫苗，其特征在于，所述真核表達載體為pcDNA3.3o
6.如權利要求3~5任一項所述的非洲豬瘟病毒核酸疫苗在制備用于預防非洲豬瘟的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P31/20GK103805615SQ201410055866
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月19日 優(yōu)先權日:2014年2月19日
【發(fā)明者】孫潔, 楊俊興, 廖立珊, 胡運發(fā), 劉蕓, 曾少靈, 劉建利, 林慶燕, 陶虹, 曹琛福, 張彩虹, 阮周曦, 唐金明, 呂建強, 花群義 申請人:孫潔