免疫調(diào)節(jié)多肽zl-1在制備抗腫瘤藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及免疫調(diào)節(jié)多肽ZL-1在制備抗腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明對Alloferon-1的部分氨基酸的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，采用固相化學(xué)合成法獲得具有較高免疫調(diào)節(jié)活性抗腫瘤活性多肽ZL-1。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的多肽ZL-1體內(nèi)通過激活免疫系統(tǒng)顯著抑制小鼠肝癌H22荷瘤鼠腫瘤的生長，可用于腫瘤的免疫治療。
【專利說明】免疫調(diào)節(jié)多肽ZL-1在制備抗腫瘤藥物中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種免疫調(diào)節(jié)多肽的及其應(yīng)用，本發(fā)明的多肽具有免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性。
【背景技術(shù)】
[0002]抗微生物肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有殺滅或抑制細(xì)菌或病毒的小分子多肽，具有抗細(xì)菌、抗病毒和抗腫瘤活性。一般認(rèn)為抗微生物肽殺菌機(jī)理主要是作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，破壞其完整性并產(chǎn)生穿孔現(xiàn)象，造成細(xì)胞內(nèi)容物溢出胞外而死亡首先由靜電吸引而附于細(xì)菌膜表面，疏水性的C端插入膜內(nèi)疏水區(qū)并改變膜的構(gòu)象，多個(gè)抗微生物肽在膜上形成離子通道而導(dǎo)致某些離子逸出而死亡。
[0003]Alloferon- 1是原先從麗蠅(Calliphora vicina)中分離提取到的肽,其氨基酸序列為(組氨酸-甘氨酸-纈氨酸-絲氨酸-甘氨酸-組氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-組氨酸-甘氨酸-纈氨酸-組氨酸-甘氨酸)，在小鼠體內(nèi)具有誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生抗病毒和抗腫瘤功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明對Alloferon-1的部分氨基酸的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，采用固相化學(xué)合成法獲得具有較高免疫調(diào)節(jié)活性抗腫瘤多肽ZL-1。本發(fā)明多肽ZL-1，氨基酸序列如SEQ ID:N0.1所示，其氨基酸全序列為:組氨酸-甘氨酸-纈氨酸-絲氨酸-甘氨酸-色氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-組氨酸-甘氨酸。其分子量為1236.2，等電點(diǎn)為6.9。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，ZL-1體內(nèi)抑制H22肝癌荷瘤鼠腫瘤生長，該抑瘤活性主要通過激活免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，表明ZL-1可能作為一種免疫治療的抗腫瘤藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0005]圖1ZL-1對小鼠肝癌H22荷瘤鼠瘤重的影響
[0006]圖2ZL-1對小鼠肝癌H22荷瘤鼠抑瘤率的影響
[0007]圖3ZL-1對小鼠肝癌H22荷瘤鼠脾臟T細(xì)胞亞群的影響
[0008]圖4ZL-1對小鼠肝癌H22荷瘤鼠脾臟CTL活性的影響
[0009]圖5ZL-1對小鼠肝癌H22荷瘤鼠脾臟NK活性的影響
[0010]圖6ZL-1對小鼠肝癌H22荷瘤鼠血清IL-2、TNF-a、IFN- Y分泌的影響
【具體實(shí)施方式】
[0011]一、多肽ZL-1體內(nèi)抑制H22荷瘤鼠腫瘤的生長
[0012]按移植性腫瘤研究法建立小鼠模型。選擇接種H22 8天后的腹水小鼠，消毒腹部皮膚，用無菌注射器抽吸腹水，生理鹽水稀釋，臺盼藍(lán)染色后用血球計(jì)數(shù)板在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)位98%以上，調(diào)整細(xì)胞濃度為5X106/ml。取18_22g的ICR小鼠，于小鼠右前腋窩皮下接種0.1ml細(xì)胞懸液。待小鼠腫瘤長至50-100mm3時(shí),接種后的小鼠隨機(jī)分為五組，每組十只，分別為模型組，ZL-1低、中、高劑量給藥組，陽性對照組。模型組注射生理鹽水0.2ml ；ZL-1低、中、高劑量組小鼠分別給予0.1,0.2,0.4mg/kg,陽性對照組小鼠給予5-FU(25mg/kg/day),隔天給藥一次,連續(xù)給藥兩周,給藥結(jié)束取實(shí)驗(yàn)各組老鼠瘤組織稱重。
[0013]按文獻(xiàn)方法計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=[1-給藥組平均小鼠瘤重(g)/模型組平均小鼠瘤重]X 100%。
[0014]結(jié)果見附圖1和附圖2，ZL-1顯著抑制H22荷瘤鼠腫瘤生長，低、中、高三個(gè)劑量對小鼠移植性實(shí)體瘤H22的抑制率分別為18.9%,37.4%和48.5%。陽性對照組(5-FU)的腫瘤抑制率為66.5%，由此可見ZL-1抑瘤效果比較明顯。
[0015]二、多肽ZL-1對H22荷瘤小鼠脾細(xì)胞中T細(xì)胞亞群表達(dá)的影響
[0016]脾淋巴細(xì)胞懸液制備:取實(shí)驗(yàn)各組小鼠，頸椎脫白處死，75%酒精浸泡5min，無菌條件下剖開小鼠腹腔取脾，研磨過200目篩網(wǎng)，Hank' s液沖洗，收集分離的脾細(xì)胞懸液，1000r/min離心5分鐘，棄上清；加紅細(xì)胞裂解液10ml，混勻脾細(xì)胞，靜止4_5分鐘，待紅細(xì)胞完全破碎，1000r/min離心5分鐘，棄上清去除紅細(xì)胞，HanV s液洗2_3遍，用RPM1-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至I X 106/ml，細(xì)胞于1000r/min離心5min，4°C以上冷PBS洗一次，加入FITC標(biāo)記的抗小鼠⑶3、⑶4、⑶8單克隆抗體，避光冰上孵育30min，PBS洗兩次；接著用1%多聚甲醒200 μ I室溫固定40min, 1000r/min離心5min,棄上清,流式細(xì)胞儀檢測。
[0017]結(jié)果見圖3，ZL-1低、中、高劑量組與模型組相比，⑶4+T、⑶8+T細(xì)胞比例及⑶3+T細(xì)胞總數(shù)均有提高，分別提高了，其中ZL-1中、高劑量促進(jìn)T細(xì)胞增殖活性與模型相比有顯著差異(P < 0.01)。結(jié)果顯示，ZL-1劑量依賴性地上調(diào)T細(xì)胞數(shù)量提高機(jī)體的細(xì)胞免疫。 [0018]三、ZL-1對H22荷瘤鼠脾淋巴細(xì)胞的CTL活性的影響
[0019]取實(shí)驗(yàn)各組小鼠，頸脫臼處死，分別無菌制備脾淋巴細(xì)胞懸液，用含有10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為I X IO6個(gè)/ml作為效應(yīng)細(xì)胞。靶細(xì)胞取培養(yǎng)24_48h的小鼠肝癌H22細(xì)胞，用臺盼藍(lán)排除實(shí)驗(yàn)測定活力，并按效靶比為40: 1,20: 1,10: I分別調(diào)整細(xì)胞數(shù)。將效、靶細(xì)胞以調(diào)整后的濃度鋪于96孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)孔加效、靶細(xì)胞各100 μ I ;效應(yīng)細(xì)胞對照孔加效應(yīng)細(xì)胞、培養(yǎng)液各100 μ I ;靶細(xì)胞對照孔加靶細(xì)胞、培養(yǎng)液各100 μ 1，每組各做3復(fù)孔。效靶細(xì)胞共同孵育6h后，各孔加入20 μ I的ΜΤΤ，于37°C、5 %CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。孵育結(jié)束后棄上清，每孔加入DMS0150y 1，輕輕振蕩IOmin溶解甲臜，酶標(biāo)儀570nm處測吸光值。CTL細(xì)胞活性的計(jì)算方法如下:取3個(gè)復(fù)孔A值的均值，按下述方法計(jì)算CTL細(xì)胞活性，以殺傷率(％)表示。CTL細(xì)胞活性(％) = 1_(實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞組A值)/靶細(xì)胞組A值X 100%。
[0020]結(jié)果見附圖4，ZL-1實(shí)驗(yàn)組中的CTL細(xì)胞對體外培養(yǎng)的H22細(xì)胞有明顯的殺傷作用，其殺傷功能明顯高于腫瘤模型組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖)。
[0021]四、ZL-1對H22荷瘤鼠脾淋巴細(xì)胞的NK活性的影響
[0022]取實(shí)驗(yàn)各組小鼠，頸脫臼處死，分別無菌制備脾淋巴細(xì)胞懸液，用含有10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為I X IO6個(gè)/ml作為效應(yīng)細(xì)胞。靶細(xì)胞取培養(yǎng)24_48h的小鼠淋巴瘤YAC-1細(xì)胞，用臺盼藍(lán)排除實(shí)驗(yàn)測定活力，并按效靶比為40: 1,20: 1，
10: I分別調(diào)整細(xì)胞數(shù)。將效、靶細(xì)胞以調(diào)整后的濃度鋪于96孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)孔加效、靶細(xì)胞各100 μ I ;效應(yīng)細(xì)胞對照孔加效應(yīng)細(xì)胞、培養(yǎng)液各100 μ I ;靶細(xì)胞對照孔加靶細(xì)胞、培養(yǎng)液各100 μ 1，每組各做3復(fù)孔。效靶細(xì)胞共同孵育6h后，各孔加入20 μ I的ΜΤΤ，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。孵育結(jié)束后棄上清，每孔加入DMS0150l.! 1，輕輕振蕩IOmin溶解甲臜，酶標(biāo)儀570nm處測吸光值。NK細(xì)胞活性的計(jì)算方法如下:取3個(gè)復(fù)孔A值的均值，按下述方法計(jì)算NK細(xì)胞活性，以殺傷率(％)表示。NK細(xì)胞活性(％) = 1-(實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞組A值)/靶細(xì)胞組A值X 100 %。
[0023]結(jié)果見附圖5，ZL-1實(shí)驗(yàn)組中的NK細(xì)胞對體外培養(yǎng)的YAC-1細(xì)胞有明顯的殺傷作用，其殺傷功能明顯高于腫瘤模型組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖)。
[0024]五、對H22荷瘤鼠脾細(xì)胞上清中IL-2、TNF- a、IFN- Y的影響
[0025]收集實(shí)驗(yàn)各組的血清于印管，每孔100 μ I，各三復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)按小鼠IL-2/TNF-a /IFN-Y單克隆抗體的ELISA試劑盒說明書指示操作。具體步驟如下:從已平衡至室溫的密封袋中取出所需板條；除空白孔外，分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100μΙ/孔)加入相應(yīng)孔中，用膠紙封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育90分鐘；洗板4次；除空白孔外，加入生物素化抗體工作液(100μΙ/孔)。用膠紙封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育60分鐘；洗板4次；除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液(100 μ I/孔)。用膠紙封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育30分鐘；洗板4次；加入顯色劑100 μ I/孔，避光37°C孵箱孵育10-15分鐘；加入終止液100 μ I/孔，混勻后即刻測量OD45tl值(5分鐘內(nèi))。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，由各組OD450值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各試驗(yàn)孔的IL-2、TNF-a ,IFN-Y濃度即可由其相應(yīng)的OD45tl值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出。
[0026]由圖6可以看出，ZL-1可顯著增加H22荷瘤鼠血清中的IL-2、TNF-a及IFN-Y的分泌。隨著給藥劑量的提高，刺激作用不斷增強(qiáng)，表明ZL-1促進(jìn)IL-2、TNF-a及IFN-Y的分泌活性呈現(xiàn)明顯的 劑量依賴性。
【權(quán)利要求】
1.免疫調(diào)節(jié)多肽ZL-1在制備抗腫瘤藥物中的用途，其氨基酸序列如SEQ ID:N0.1所示。
【文檔編號】A61P35/00GK103948910SQ201410060235
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】王樹生, 趙磊, 王文加 申請人:張家港市第一人民醫(yī)院