治療膀胱癌的基因針劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種治療膀胱癌的基因針劑及其制備方法，每1L基因針劑由以下體積量的成分組成：IFN-β0.8mL-1.2mL，人血白蛋白0.2mL-0.3mL，溶解了4.5-5.2g聚甜素的磷酸鹽緩沖溶液380mL-480mL，余量為醫(yī)用注射用水。本發(fā)明基因針劑通過腺病毒載體的擴(kuò)增和純化、動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證IFN-β基因可用性和基因針劑制備步驟制得。本發(fā)明采用AdhIFN-β誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的凋亡，為人膀胱癌的治療提供理論依據(jù)；本發(fā)明基因針劑安全、高效、易用，制備方法簡單。
【專利說明】治療膀胱癌的基因針劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種治療膀胱癌的基因針劑及其制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]世界范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第九位，不同人群的膀胱癌組織類型不同目前膀胱癌的治療，多以手術(shù)治療輔以化療為主。肌層浸潤性膀胱癌根治性膀胱切除術(shù)后，高達(dá)50%的患者會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，與傳統(tǒng)放化療大面積無選擇的殺傷腫瘤及正常組織不同，基因治療有選擇的作用于腫瘤細(xì)胞，組織特異性調(diào)控序列和單鏈抗體的靶向治療是解決這一問題的有效策略。[0003]干擾素IFN是一個(gè)通過調(diào)節(jié)天然糖蛋白來調(diào)整細(xì)胞生長和分化的家族，干擾素IFN抑制癌基因的表達(dá)，上調(diào)凋亡，激活淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞，干擾素毒副作用較絲裂霉素、卡介苗BCG小，且作用比較顯著。
[0004]腺病毒(adenovirus, Ad)是一種無外殼的雙鏈DNA病毒,基因組長約36kb,腺病毒由于宿主范圍廣，對人致病性低，在基因治療、基因免疫等方面應(yīng)用開發(fā)得較好的一種基因載體，在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)基因，能有效進(jìn)行增殖，滴度高，與人類基因同源，不整合到染色體中，無插入致突變性，能在懸浮培養(yǎng)液中擴(kuò)增，能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因等諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來受到廣泛關(guān)注，被認(rèn)為是很有潛力的基因治療載體。
[0005]張輝等人(干擾素-β基因?qū)θ税蚣∫菩屑?xì)胞癌系253JB_VK體外增殖及凋亡的影響，山東醫(yī)藥，2008年第48卷第8期)以重組腺病毒AdhIFN-β轉(zhuǎn)染人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞TCC系253JB—VK，應(yīng)用RT-PCR檢測hIFN-β基因在253JB_VK中的表達(dá)，應(yīng)用細(xì)胞生長抑制試驗(yàn)、集落形成能力試驗(yàn)檢測hIFN-β基因?qū)?53JB-VK細(xì)胞體外增殖的影響，為膀胱癌的基因治療提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種治療膀胱癌的基因針劑。
[0007]本發(fā)明的另一目的還在于提供一種治療膀胱癌的基因針劑的制備方法。
[0008]本發(fā)明的原理:腺病毒Ad轉(zhuǎn)染干擾素IFN- β，使hIFN- β基因?qū)氚螂啄[瘤細(xì)胞253J B-Vk*，在253J B-Vk中表達(dá)hIFN-β蛋白，hIFN-β蛋白能有效刺激機(jī)體的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，對正常細(xì)胞則無損傷。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種治療膀胱癌的基因針劑，每I L基因針劑由以下體積量的成分組成:IFN-13 0.8mL-Ι.2 mL，人血白蛋白0.2 mL -0.3 mL，溶解了 4.5-5.2 g聚甜素的磷酸鹽緩沖溶液380mL-480 mL，余量為醫(yī)用注射用水。
[0010]所述IFN-β的基因在動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞TCC系253J B_VK并成功表達(dá)，誘導(dǎo)膀胱腫瘤細(xì)胞253J B-Vk凋亡。[0011]所述磷酸緩沖溶液是濃度為0.01 mol/L，pH值為7.0-7.2的磷酸鈉或者磷酸鉀緩沖溶液。
[0012]所述基因針劑為淡白色澄清液體。
[0013]本發(fā)明基因針劑使用時(shí)，從_20°C取出，待完全融化后，輕輕混勻，盡量勿使藥液沾染瓶蓋，對直徑≥4 cm的腫瘤，用生理鹽水稀釋至4 mL。
[0014]所述基因針劑注射方法為靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射或者瘤內(nèi)注射。
[0015]所述基因針劑的用法與用量:放射治療前72 h開始注射，一周I次，每次1012VP，4周為一個(gè)療程。
[0016]一種治療膀胱癌的基因針劑的制備方法，包括以下步驟:
(1)腺病毒載體的擴(kuò)增和純化
A.在DMEM完全培養(yǎng)液中接種HEK293細(xì)胞，當(dāng)HEK293細(xì)胞生長至80_90%，用無血清DMEM將細(xì)胞清洗2-3次；
B.將無血清DMEM稀釋的未經(jīng)擴(kuò)增和純化的AdhIFN-β加入到步驟a培養(yǎng)得到HEK293細(xì)胞中，輕輕晃動(dòng)使其均勻鋪滿瓶底，置37°C，5%C02孵箱中培養(yǎng)1-2 h，加入DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，3-5 d后，當(dāng)所有細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)CPE時(shí)，收集細(xì)胞于離心管中，以5000 r/min離心5 min,棄上清；5%DMEM重懸,棄上清,收集下層懸池液；
C.將步驟b得到的懸濁液在液氮和37°C反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞破裂釋放病毒，臺式離心機(jī)上16000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞碎片，收集病毒上清，_80°C保存；
D.按腺病毒純化試劑盒說明書純化并濃縮病毒；
(2)動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證IFN-β基因可用性
以重組腺病毒AdhIFN-β轉(zhuǎn)染受試動(dòng)物膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞TCC系253J B-Vk，局部或全身注射0.5-lh，重組腺病毒開始進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，3周后，重組腺病毒DNA被降解；
(3)基因針劑的制備
a.配制磷酸鹽緩沖溶液；稱取8.5 g NaCl,2.8 g Na2HPO4.12H20和0.38 gNaH2PO4.2H20，用IL醫(yī)用注射用水溶解，調(diào)pH值為7.0-7.2，濃度為0.01 mol/L，然后在118-122°C條件下濕熱滅菌20-40 min ；
按所述的基因針劑的組成準(zhǔn)備合適量聚甜素、IFN-β、人血白蛋白和磷酸鹽緩沖溶
液；
b.將聚甜素溶解在380-480mL步驟a的磷酸鹽緩沖液中，加入IFN-β，然后醫(yī)用注射用水定容到500 mL，混合均勻，氫氧化鈉溶液或者磷酸溶液調(diào)節(jié)PH值為7.0-7.2，用0.22μ m微孔濾膜對混合溶液過濾，得到混合溶液I ;
c.人血白蛋白加入20-50mL注射用水中溶解，醫(yī)用注射用水定容到500 mL，混合均勻，得到混合溶液II ；
d.混合溶液I和混合溶液II混合，用0.22um微孔濾膜過濾混合溶液，即得本發(fā)明基因針劑；
e.2 mL西林瓶包裝基因針劑，每小盒裝1支，每支含重組腺病毒hIFN-β基因顆粒1012VP。
[0017]步驟(1)所述DMEM培養(yǎng)液含200 mM的L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素，培養(yǎng)液pH值為7.2，-20°C貯存?zhèn)溆?。[0018]本發(fā)明的積極有益效果:
1.本發(fā)明采用AdhIFN-β誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的凋亡，為人膀胱癌的治療提供理論依據(jù)；
2.本發(fā)明基因針劑安全、高效、易用，制備方法簡單。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合一些具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0020]材料及來源
ΗΕΚ293細(xì)胞、253J B-Ve人膀胱TCC細(xì)胞，2012年5月，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院； IFN- β ,AdhIFN- β重組腺病毒、hIFN- β基因重組腺病毒載體，2012年3月，鄭州大學(xué)消化疾病研究所；
空載體病毒AdGep，2012年5月，鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院；
小鼠，購自天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。
[0021]基因針劑 實(shí)施例1
一種治療膀胱癌的基因針劑，每IL針劑組成為:1 mL IFN-β ,0.2 mL人血白蛋白，溶解了 5.04 g聚甜素的磷酸鹽緩沖溶液450 mL，余量為醫(yī)用注射用水。
[0022]實(shí)施例2
一種治療膀胱癌的基因針劑，每IL針劑組成為:0.8 mL IFN-β ,0.3 mL人血白蛋白，溶解了 4.5 g聚甜素的磷酸鹽緩沖溶液480 mL，余量為醫(yī)用注射用水。
[0023]實(shí)施例3
一種治療膀胱癌的基因針劑，每IL針劑組成為:1.2 mL IFN-β ,0.25 mL人血白蛋白，溶解了 4.62 g聚甜素的磷酸鹽緩沖溶液380 mL，余量為醫(yī)用注射用水。
[0024]實(shí)施例4
一種治療膀胱癌的基因針劑，每IL針劑組成為:0.9 mL IFN-β ,0.21 mL人血白蛋白，溶解了 5.2 g聚甜素的磷酸鹽緩沖溶液400 mL，余量為醫(yī)用注射用水。
[0025]實(shí)施例5
一種治療膀胱癌的基因針劑，每IL針劑組成為:1.1 mL IFN-β ,0.26 mL人血白蛋白，溶解了 4.93 g聚甜素的磷酸鹽緩沖溶液420 mL，余量為醫(yī)用注射用水。
[0026]制備方法 實(shí)施例1
上述基因針劑實(shí)施例1-5任意之一所述的基因針劑的制備方法，包括以下步驟:
(1)配制磷酸鹽緩沖溶液:稱取8.5 g NaCl,2.8 g Na2HPO4.12H20和0.38 gNaH2PO4.2H20，用IL醫(yī)用注射用水溶解，調(diào)pH值為7.0，濃度為0.01 mol/L，然后在121。。條件下濕熱滅菌30 min ；
按基因針劑實(shí)施例1-5任意之一所述的基因針劑的組成準(zhǔn)備合適量聚甜素、IFN-β、人血白蛋白和磷酸鹽緩沖溶液；
(2)將聚甜素溶解在磷酸鹽緩沖液中，加入IFN-β，然后醫(yī)用注射用水定容到500mL,混合均勻，氫氧化鈉溶液或者磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0，用0.22 μπι微孔濾膜對混合溶液過濾，得到混合溶液I ;
(3)人血白蛋白加入50mL醫(yī)用注射用水中溶解，然后用醫(yī)用注射用水定容到500 mL,混合均勻，得到混合溶液II ；
(4)將I和II溶液混合，得到I和II的混合溶液，用0.22 μ m微孔濾膜過濾混合溶液，即得本發(fā)明基因針劑。
[0027]實(shí)施例2
上述實(shí)施例1-5任意之一所述的基因針劑的制備方法，包括以下步驟:
上述基因針劑實(shí)施例1-5任意之一所述的基因針劑的制備方法，包括以下步驟:
(1)配制磷酸鹽緩沖溶液:稱取8.5 g NaCl,2.8 g Na2HPO4.12H20和0.38 gNaH2PO4.2H20，用IL醫(yī)用注射用水溶解，調(diào)pH值為7.1，濃度為0.01 mol/L，然后在118。。條件下濕熱滅菌40 min ；
按基因針劑實(shí)施例1-5任意之一所述的基因針劑的組成準(zhǔn)備合適量聚甜素、IFN-β、人血白蛋白和磷酸鹽緩沖溶液；
(2)將聚甜素溶解在磷酸鹽緩沖液中，加入IFN-β，然后醫(yī)用注射用水定容到500mL,混合均勻，氫氧化鈉溶液或者磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值為7.1，用0.22 μπι微孔濾膜對混合溶液過濾，得到混合溶液I ;
(3)人血白蛋白加入20mL醫(yī)用注射用水中溶解，然后用醫(yī)用注射用水定容到500 mL,混合均勻，得到混合溶液II ；
(4)將I和II溶液混合，得到I和II的混合溶液，用0.22 μ m微孔濾膜過濾混合溶液，即得本發(fā)明基因針劑。
[0028]實(shí)施例3
上述基因針劑實(shí)施例1-5任意之一所述的基因針劑的制備方法，包括以下步驟:
(1)配制磷酸鹽緩沖溶液:稱取8.5 g NaCl,2.8 g Na2HPO4.12H20和0.38 gNaH2PO4.2H20，用IL醫(yī)用注射用水溶解，調(diào)pH值為7.2，濃度為0.01 mol/L，然后在122 V條件下濕熱滅菌20 min ；
按基因針劑實(shí)施例1-5任意之一所述的基因針劑的組成準(zhǔn)備合適量聚甜素、IFN-β、人血白蛋白和磷酸鹽緩沖溶液；
(2)將聚甜素溶解在磷酸鹽緩沖液中，加入IFN-β，然后醫(yī)用注射用水定容到500mL,混合均勻，氫氧化鈉溶液或者磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值為7.2，用0.22 μπι微孔濾膜對混合溶液過濾，得到混合溶液I ;
(3)人血白蛋白加入40mL醫(yī)用注射用水中溶解，然后用醫(yī)用注射用水定容到500 mL,混合均勻，得到混合溶液II ；
(4)將I和II溶液混合，得到I和II的混合溶液，用0.22 μ m微孔濾膜過濾混合溶液，即得本發(fā)明基因針劑。
[0029]使用方法:從-20°C取出，待完全融化后，輕輕混勻，盡量勿使藥液沾染瓶蓋，對直徑≥4cm的腫瘤，用生理鹽水稀釋至4 mL。
[0030]所述基因針劑的用法與用量:放射治療前72 h開始注射，一周I次，每次1012VP，4周為一個(gè)療程。
[0031]動(dòng)物試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為四組:A空白對照組(注射生理鹽水)、B高劑量藥物組(每次2024VP)、C中劑量藥物組(每次1012VP)和D低劑量藥物組(每次506VP)。
[0032]小鼠(購自天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)24只，6~8周齡，雌性，體重16_20g，每一組6只，動(dòng)物均為自由飲水采食。
[0033]253J B-Vk用0.025%胰蛋白酶和0.01%依地酸EDTA溶液采集253J B-Ve人TCC腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)液CMEM中單層培養(yǎng)，輕敲培養(yǎng)瓶分離細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)液CMEM洗滌，再次在HBSS中懸浮，然后選取對數(shù)生長期253J B-Ve人TCC腫瘤細(xì)胞-80°C凍存24h，移入液氮內(nèi)保存；所述培養(yǎng)液CMEM含200 mM的L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素和10%胎牛血清；
收集培養(yǎng)的253J B-Ve人TCC腫瘤細(xì)胞細(xì)胞，使用PBS稀釋至細(xì)胞數(shù)1.5 X 108/mL，接種于小鼠腋下，每只小鼠的接種量為0.1 mL，腫瘤接種后第6天，腫瘤直徑達(dá)0.2 cm左右時(shí)開始注射本發(fā)明實(shí)施例1制備的基因針劑，瘤內(nèi)注射，一周I次，觀察小鼠體重、狀態(tài)的變化。
[0034]從給藥后裸鼠體重變化以及狀態(tài)可見，A、C鼠進(jìn)食和活動(dòng)正常，體重比較穩(wěn)定，而B和D組裸鼠狀態(tài)萎靡不振，進(jìn)食較少，試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明基因針劑適當(dāng)劑量用藥可有效抑制腫瘤生長，在一定程度上提高了小鼠對藥物的順應(yīng)性，不良反應(yīng)有所降低。
[0035]細(xì)胞凋亡率的測定 試驗(yàn)分為三組:
實(shí)驗(yàn)組:AdhIFN- β轉(zhuǎn)染253J B-Ve細(xì)胞組；
對照組=AdGep轉(zhuǎn)染253J B-Ve細(xì)胞；
空白對照組:未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0036]將用藥后小鼠的腫瘤細(xì)胞在37°C，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，取對數(shù)生長期的253J B-Vk細(xì)胞接種到六孔板中，每孔I X IO6個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞生長至80%，實(shí)驗(yàn)組和對照組分別加入AdhIFN-β和AdG印，對照組不需加入任何病毒，0.2%胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，再加入完全培養(yǎng)基并使細(xì)胞分散均勻，離心，分別制備各組單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液移入1.5ml離心管中，4°C，500 r/min離心5 min，形成細(xì)胞團(tuán)，移去上清液，冰預(yù)冷的PBS溶液清洗細(xì)胞2-3次，每管細(xì)胞數(shù)> IO6個(gè)，流式細(xì)胞儀檢測，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，結(jié)果見表1。
[0037]表1細(xì)胞凋亡率
【權(quán)利要求】
1.一種治療膀胱癌的基因針劑，其特征在于，每I L基因針劑由以下體積量的成分組成:IFN-β 0.8 mL-1.2 mL，人血白蛋白0.2 mL -0.3 mL，溶解了 4.5-5.2 g聚甜素的磷酸鹽緩沖溶液380 mL-480 mL，余量為醫(yī)用注射用水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療膀胱癌的基因針劑，其特征在于，所述IFN-β的基因在動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞TCC系253J B-Ve并成功表達(dá)，誘導(dǎo)膀胱腫瘤細(xì)胞253J B-Vk 凋亡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療膀胱癌的基因針劑，其特征在于，所述的磷酸鹽緩沖溶液是濃度為0.01 mol/L, pH值為7.0-7.2的磷酸鈉或者磷酸鉀緩沖溶液。
4.一種權(quán)利要求1所述的治療膀胱癌的基因針劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)配制磷酸鹽緩沖溶液:稱取8.5 g NaCl,2.8 g Na2HPO4.12H20和0.38 gNaH2PO4.2H20，用I L醫(yī)用注射用水溶解，調(diào)pH值為7.0-7.2，濃度為0.01 mol/L，然后在118-122°C條件下濕熱滅菌20-40 min ； 按權(quán)利要求1所述的基因針劑的組成準(zhǔn)備合適量聚甜素、IFN-β、人血白蛋白和磷酸鹽緩沖溶液； (2)將聚甜素溶解在380-480mL步驟(1)的磷酸鹽緩沖液中，加入IFN-β，然后醫(yī)用注射用水定容到500 mL,混合均勻，氫氧化鈉溶液或者磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0-7.2，用0.22μ m微孔濾膜對混合溶液過濾，得到混合溶液I ; (3)人血白蛋白加入20-50mL醫(yī)用注射用水中溶解，然后用醫(yī)用注射用水定容到500mL，混合均勻，得到混合溶液II ； (4)將I和II溶液混合，得到I和II的混合溶液，用0.22 μ m微孔濾膜過濾混合溶液，即得本發(fā)明基因針劑。
【文檔編號】A61K47/42GK103877565SQ201410061136
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】張卉, 張輝, 楊鐵驪, 張小方, 尹曉峰 申請人:黃淮學(xué)院