珊瑚萃取物及其萃取方法以及其用途、珊瑚萃取物保養(yǎng)品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于皮膚美白、保濕、改善彈性、抗發(fā)炎以及傷口愈合的珊瑚萃取物及其萃取方法；該珊瑚萃取物為一種皮軟珊瑚（Briareumexcavatum）的萃取物；該萃取方法包括：以有機(jī)溶劑萃取、以水和乙酸乙酯分配萃取，并以管柱層析法分離；該珊瑚萃取物可應(yīng)用于皮膚美白、保濕、改善彈性、抗發(fā)炎以及傷口愈合等領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】珊瑚萃取物及其萃取方法以及其用途、珊瑚萃取物保養(yǎng)品

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種珊瑚萃取物、萃取方法以及用途，尤其是指一種皮軟珊瑚 (Briareum excavatum)，該萃取物具有提高皮膚保濕、彈性、抑制酪胺酸酶活性、減少黑色 素形成，并減緩發(fā)炎細(xì)胞浸潤(rùn)與控制傷口面積等功效。

【背景技術(shù)】
[0002] 由于海洋生態(tài)環(huán)境的特殊性使得海洋生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成途徑 和酶反應(yīng)系統(tǒng)與陸地生物相比有顯著的差異，導(dǎo)致海洋生物往往能夠產(chǎn)生一些化學(xué)結(jié)構(gòu)新 穎、生物活性多樣的具有與陸地生物完全不同結(jié)構(gòu)特征的海洋次級(jí)代謝產(chǎn)物。
[0003] 珊瑚屬于腔腸動(dòng)物門，有9000余種，是海洋中最常見(jiàn)的生物之一，約占海洋生物 種類的22. 4%，是可以大量利用的海洋生物資源。軟珊瑚目（gorgonian)俗稱海扇、海鞭、 海柳，是珊瑚動(dòng)物中的一大分支。在對(duì)珊瑚化學(xué)成分的研究中，自美國(guó)的Weinheiner等于 1969年從軟珊瑚目中發(fā)現(xiàn)豐富的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和強(qiáng)烈生理活性的前列腺素前體以來(lái)，吸引 了眾多天然產(chǎn)物化學(xué)家把研究對(duì)象從陸地生物轉(zhuǎn)向海洋生物，大量被發(fā)現(xiàn)的海洋天然產(chǎn)物 具有廣泛的生物活性，主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，且許多有顯著的抗 腫瘤活性。
[0004] 近年來(lái)對(duì)軟珊瑚的研究仍很活躍，例如，從Briareum屬的軟珊瑚目中發(fā)現(xiàn)眾多有 活性的briarane型二萜，但囿于野生珊瑚來(lái)源的限制，故有學(xué)者嘗試對(duì)軟珊瑚目中的皮軟 珊瑚（Briareum excavatum)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室人工養(yǎng)殖，然而迄今并無(wú)任何文獻(xiàn)數(shù)據(jù)或?qū)＠鞍?曾經(jīng)揭示，可以從皮軟珊瑚得到具有抑制酪胺酸酶活性、加速傷口愈合并可抗發(fā)炎的萃取 產(chǎn)物或經(jīng)純化的化合物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種一種珊瑚萃取物，其由皮軟珊瑚（Briareum excavatum)萃取而得，具有提高皮膚保濕、彈性、抑制酪胺酸酶活性、減少黑色素形成，并減 緩發(fā)炎細(xì)胞浸潤(rùn)與控制傷口面積等功效。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種珊瑚萃取物的萃取方法，其方法簡(jiǎn)便易于量產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種珊瑚萃取物的用途，其將前述的珊瑚萃取物施用 于一活體的皮膚，以使皮膚美白、保濕、改善皮膚彈性、抗發(fā)炎且可以促使傷口愈合。
[0008] 為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是：
[0009] -種用于皮膚美白、保濕、改善彈性、抗發(fā)炎以及傷口愈合的珊瑚萃取物，其借由 下列步驟所制得：
[0010] a.以一有機(jī)混合液萃取干燥皮軟珊瑚（Briareum excavatum)樣品，獲得有機(jī)層 初萃取液，其中該有機(jī)混合液包含等比例的C1-C4醇類和C1-C4的含氯烷類；b.以水和低 級(jí)酯類分配萃取該有機(jī)層初萃取液，獲得一低級(jí)酯類粗萃物，該低級(jí)酯類粗萃物含有5? 50 %的一珊瑚活性成分。 toon] 上述b.步驟的該低級(jí)酯類粗萃物進(jìn)一步以一管柱層析分析加以純化，其以一沖 提液沖提該低級(jí)酯類粗萃物，以得一沖提物，其中該沖提液的沖提梯度由正己烷/乙酸乙 酯的一第一混合溶劑與乙酸乙酯/甲醇的一第二混合溶劑所提供。
[0012] 上述a.步驟的C1-C4醇類為甲醇。
[0013] 上述a.步驟的C1-C4的含氯烷類為二氯甲烷。
[0014] 上述b.步驟的低級(jí)酯類為乙酸乙酯。
[0015] 上述第一混合溶劑中正己烷的溶劑梯度為0%_99%。
[0016] 上述第二混合溶劑中乙酸乙酯的溶劑梯度比例為0%_90%。
[0017] 上述珊瑚活性成分將該低級(jí)酯類粗萃物進(jìn)一步由該第一混合溶劑加以沖提而 得，其中該第一混合溶劑的沖提梯度為：正己烷：乙酸乙酯為90:10至70:30的劃分 (fraction)。
[0018] 上述珊瑚活性成分經(jīng)沖提后于該低級(jí)酯類粗萃物所占比例為5-30%。
[0019] 上述珊瑚活性成分將該低級(jí)酯類粗萃物進(jìn)一步由該第一混合溶劑加以沖提而 得，其中該第一混合溶劑的沖提梯度為：正己烷：乙酸乙酯為60:40至50:50的劃分 (fraction)。
[0020] 上述珊瑚活性成分經(jīng)沖提后于該低級(jí)酯類粗萃物所占比例為20-50%。
[0021] 一種所述的珊瑚萃取物的萃取方法，包含：
[0022] a.以一有機(jī)混合液萃取干燥皮軟珊瑚（Briareum excavatum)樣品，獲得有機(jī)層 初萃取液，其中該有機(jī)混合液包含等比例的C1-C4醇類和C1-C4的含氯烷類；b.以水和低 級(jí)酯類分配萃取該有機(jī)層初萃取液，獲得一低級(jí)酯類粗萃物，該低級(jí)酯類粗萃物含有5? 50 %的一珊瑚活性成分。
[0023] 上述b.步驟的該低級(jí)酯類粗萃物進(jìn)一步以一管柱層析分析加以純化，其以一沖 提液沖提該低級(jí)酯類粗萃物，以得一沖提物，其中該沖提液的沖提梯度由正己烷/乙酸乙 酯的一第一混合溶劑與乙酸乙酯/甲醇的一第二混合溶劑所提供。
[0024] -種珊瑚萃取物的用途，其所述的珊瑚萃取物施用于一活體的皮膚，以使皮膚美 白。
[0025] -種珊瑚萃取物的用途，其將所述的珊瑚萃取物施用于一活體的皮膚，以使皮膚 保濕。
[0026] -種珊瑚萃取物的用途，其將所述的珊瑚萃取物施用于一活體的皮膚，以改善皮 膚彈性。
[0027] -種珊瑚萃取物的用途，其施用所述的珊瑚萃取物，以抗發(fā)炎。
[0028] -種珊瑚萃取物的用途，其施用所述的珊瑚萃取物，以促使傷口愈合。
[0029] 一種保養(yǎng)品，其包含所述珊瑚萃取物，該珊瑚萃取物具0. 00001?10%的重量比。
[0030] 采用上述結(jié)構(gòu)后，本發(fā)明為珊瑚萃取物及其萃取方法，該珊瑚萃取物借由下列步 驟所制得：a.以一有機(jī)混合溶劑萃取干燥皮軟珊瑚（Briareum excavatum)樣品，獲得有 機(jī)層初萃取液，其中該有機(jī)混合液包含等比例的C1-C4醇類和C1-C4的含氯烷類；b.以水 和低級(jí)酯類分配萃取該有機(jī)層初萃取液，獲得一低級(jí)酯類粗萃物，該低級(jí)酯類粗萃物含有 5?50%的一珊瑚活性成分；其由皮軟珊瑚（Briareum excavatum)萃取而得，具有提高皮 膚保濕、彈性、抑制酪胺酸酶活性、減少黑色素形成，并減緩發(fā)炎細(xì)胞浸潤(rùn)與控制傷口面積 等功效。
[0031] 本發(fā)明珊瑚萃取物的用途，其將前述的珊瑚萃取物施用于一活體的皮膚，以使皮 膚美白、皮膚保濕、改善皮膚彈性、抗發(fā)炎、且可以促使傷口愈合。
[0032] 本發(fā)明保養(yǎng)品包含前述的珊瑚萃取物，其中珊瑚萃取物可具0. 00001?10%的重 量比。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1是養(yǎng)殖型皮軟珊瑚（Briareum excavatum)有效成分的粗萃及分離步驟；
[0034] 圖 2 是 BP1 的 1H-NMR 圖譜；
[0035] 圖 3 是 BP2 的 1H-NMR 圖譜；
[0036] 圖 4 是 BP3 的 1H-NMR 圖譜；
[0037] 圖 5 是 BP4 的 1H-NMR 圖譜；
[0038] 圖 6 是 BP5 的 1H-NMR 圖譜；
[0039] 圖 7 是 BP6 的 1H-NMR 圖譜；
[0040] 圖 8 是 BP7 的 1H-NMR 圖譜；
[0041] 圖9是皮軟珊瑚各粗萃取進(jìn)行動(dòng)物皮膚過(guò)敏性測(cè)試結(jié)果；
[0042] 圖10是離體酪胺酸酶活性測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0043] 圖11是離體黑色素含量測(cè)試的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0044] 圖12是BP2活體美白活性分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0045] 圖13是BP3活體美白活性分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0046] 圖14是以老鼠的纖維母細(xì)胞：NIH/3T3進(jìn)行離體傷口愈合測(cè)試實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，圖中 A、B為控制組，不給予測(cè)試物；C、D為BP2低劑量組，濃度為10 μ g/ml ;E、F為BP2高劑量 組，濃度為2〇μ8/πι1 ;G、H為BP3低劑量組，濃度為lOyg/ml ;I、J為BP3高劑量組，濃度為 20 μ g/ml ;K為各組的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；
[0047] 圖15是以人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株：EA. hy926進(jìn)行離體傷口愈合測(cè)試實(shí)驗(yàn)的結(jié)果， 圖中A、B為控制組，不給予測(cè)試物；C、D為BP2低劑量組，濃度為10 μ g/ml ;E、F為BP2高 劑量組，濃度為2(^8/1111;6、!1為8?3低劑量組，濃度為1(^8/1111 ;1、1為8?3高劑量組，濃 度為20 μ g/ml ;K為各組的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；
[0048] 圖16是以3mg/0. 2ml的ΒΡ2、ΒΡ3、純?nèi)橐褐委煹膫谟显囼?yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0049] 圖17是以40μ g/0. 2ml的BP2、BP3、粗萃物、純?nèi)橐褐委煹膫谟显囼?yàn)的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果；
[0050] 圖18是利用HE染色（5X)的大白鼠燒燙傷皮膚組織病理切片，圖中A為控制組、 B為燒燙傷組、C為BP2組、D為BP3組，給予天然物濃度皆為3mg/0. 2ml ;
[0051] 圖19是利用HE染色（5X)的大白鼠燒燙傷皮膚組織病理切片，圖中A為控制組、 B為燒燙傷組、C為BP2組、D為BP3組、E為粗萃物組，給予天然物濃度皆為40 μ g/0. 2ml ;
[0052] 圖20是3種雛型保養(yǎng)品與空白組及乳霜基質(zhì)在保濕比較；
[0053] 圖21是3種雛型保養(yǎng)品與空白組及乳霜基質(zhì)在彈力的比較。

【具體實(shí)施方式】
[0054] 為了進(jìn)一步解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡 述。
[0055] 制備例1 :以有機(jī)溶劑萃取皮軟珊瑚
[0056] 將大量養(yǎng)殖于0· 6噸養(yǎng)殖水缸的生物樣品Briareum excavatum皮軟珊瑚 (1021. 49g，濕重）進(jìn)行冷凍干燥，并將干燥的珊瑚組織磨碎（得干重417. 75g)，接著以 有機(jī)溶劑甲醇/二氯甲烷（1:1)混合比例在室溫下萃取，經(jīng)多次重復(fù)萃取至添加的有機(jī) 溶劑呈現(xiàn)澄清后，得到有機(jī)層初萃取液。再將初萃取液過(guò)濾后進(jìn)行減壓濃縮，得到的粗萃 物以水和乙酸乙酯進(jìn)行分配萃取，經(jīng)過(guò)分配萃取與減壓濃縮后得到乙酸乙酯層的粗萃物 (15. 75g)。再進(jìn)行下述分離流程后可取得BP2 (2. 44g，約占粗萃物的15. 5%)及BP3 (5. 6g， 約占粗萃物的35.6%)。
[0057] 制備例2 :粗萃物分離流程
[0058] 參見(jiàn)圖1，利用管柱層析法對(duì)乙酸乙酯層進(jìn)行初步的分離，選用的填充劑為硅膠 (Merck，230-400me Sh)，以正己烷/乙酸乙酯與乙酸乙酯/甲醇的混合溶劑為沖提液作梯度 沖提，共分為七個(gè)劃分（fraction)，各劃分的沖提條件如下所示 ：
[0059] 劃分 1 (BP1) :Hexane:EtOAC(正己燒：乙酸乙酯）99:1 ?93:7。
[0060] 劃分 2(BP2) :Hexane:EtOAC(正己烷：乙酸乙酯）90:10 ?70:30。
[0061] 劃分 3(BP3) :Hexane:EtOAC(正己烷：乙酸乙酯）60:40 ?50:50。
[0062] 劃分 4(BP4) :Hexane:EtOAC(正己烷：乙酸乙酯）40:60 ?20:80。
[0063] 劃分 5(BP5) :Hexane:EtOAC(正己烷：乙酸乙酯）10:90 ?0 :100。
[0064] 劃分 6(BP6) :Et0AC:Me0H(乙酸乙酯：甲醇）90:10 ?50:50。
[0065] 劃分 7(BP7) :Et0AC:Me0H(乙酸乙酯：甲醇）40:60 ?0 :100。
[0066] 之后每一個(gè)劃分經(jīng)過(guò)減壓濃縮后以核磁共振儀作檢測(cè)，得到1H-NMR圖譜的訊號(hào) (請(qǐng)參見(jiàn)圖2至圖8)作為判斷指標(biāo)成分存在依據(jù)，以利進(jìn)行更進(jìn)一步的生物活性實(shí)驗(yàn)的依 據(jù)。
[0067] 測(cè)試?yán)? :離體抗發(fā)炎活性測(cè)試 [0068] 1.天然物篩選及細(xì)胞株使用
[0069] 針對(duì)梯度沖提步驟后粗萃取物，使用酯多糖誘發(fā)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264. 7細(xì)胞株 離體發(fā)炎模式進(jìn)行篩選工作。控制6公分培養(yǎng)皿的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264. 7數(shù)目在3xl06 個(gè)，先給予粗萃取物，再給予酯多醣（LPS) 16-18小時(shí)后收集細(xì)胞。
[0070] 2.西方點(diǎn)墨法蛋白質(zhì)表現(xiàn)量分析
[0071] 使用 4%憐酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline, PBS) (137mM NaCl, 2. 68mM KC1, lOmM Na2HP04, 1. 76mM KH2P04, pH=7. 2)收集至 1. 5ml 離心管中，待以 3000rpm 離心 8分鐘后去除上清液，再加入溫度4°C的lysis buffer200y l(50mM Tris，pH7. 5, 150mM NaCl, l%TritonX-100,0. ImM EDTA,0. ImM EGTA, 100 μ g/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 μ g/ml Aprotinin, 20mM NaF, 0· 2mM Na3V04)打破細(xì)胞膜后，在溫度4°C之下，以 14, OOOrpm離心30分鐘，取出上清液并仿照Lowry等人的方法（Lowry et al.，1951)進(jìn)行 蛋白質(zhì)定量。
[0072] 使用 Bio-Rad DC protein assay kit (Hercules，CA，USA)及酶測(cè)讀儀（Thermo Electron Corporation, USA)分析上清液的吸光值，以測(cè)定各標(biāo)本的蛋白質(zhì)量。將經(jīng)校正 后取樣本總體積的三分之一體積的標(biāo)本緩沖液（sample buffer ;2%SDS, 10%glycerol, 0. 1% bromophenol bule, 10%2-mercaptoethanol, 50mM Tris, Bio-Rad Laboratories, inc)〇 利 用7%、10%的SDS-PAGE以80伏特電壓分離蛋白質(zhì)。將SDS-PAGE上的蛋白質(zhì)以135毫安電 流轉(zhuǎn)置 overnight 到 PVDF 膜（0· 45mm pore size, Tmmobi 1 on~P, Millipore, Bedford, MA, U SA)上。
[0073] 轉(zhuǎn)印后的 PVDF 膜以含 5% 脫酯奶粉 TTBS 溶液（Tris-Tween buffer saline) (Tris-HC120mM,NaC1137mM，pH7. 4,0. l%Tween20)在室溫下覆蓋 40 分鐘，再與 1:1000 稀 釋比例的針對(duì)誘發(fā)型一氧化氮合成酶和第二型環(huán)氧化酶作用的一級(jí)抗體在室溫下反應(yīng) 兩小時(shí)。隨后以TTBS溶液清洗三次，接著以HRP-conjugated的anti-rabbit IgG抗 體（1 :2000)在室溫中反應(yīng)一小時(shí)三十分鐘，二級(jí)抗體結(jié)束后以TTBS溶液清洗三次， 最后利用呈色液(Tmmobi 1 on Western Chemi luminescent HRP Substrate, Millipore Corporation, Billerica, MA01821U. S. A.)與 PVDF 膜反應(yīng)，并以影像分析處理設(shè)備（UVP Biospectrum AC System, UVP Inc, U. S. A.)偵測(cè)冷光反應(yīng)，紀(jì)錄蛋白質(zhì)的表現(xiàn)量，以計(jì)算機(jī) 分析軟件（VisionWorks LS Acquisition and analysis software, copyright2007, LLC, U. S. A.)偵測(cè)并計(jì)算相對(duì)量。并以單獨(dú)加入酯多醣組別為100%，最后以a-actin作為內(nèi)控制 組。
[0074] 其結(jié)果比較不同劃分層的粗萃取物在離體抗發(fā)炎的成果，進(jìn)一步作為活體實(shí)驗(yàn)?zāi)?式和其他離體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ阶鰹閰⒖肌?br> [0075] 3.使用的目標(biāo)抗體
[0076] (1)誘發(fā)型一氧化氮合成酶（BD Pharmingen, San Diego, CA, USA :catalog no. 6103322 :polyclonal antibody),稀釋比例 1:1000。
[0077] (2)第二型環(huán)氧化酶（Cayman Chemical, USA; catalog no. 160106;polyclonal antibody),稀釋比例 1:1000。
[0078] (3) β -actin (sigma, St. Louis, M0, USA; catalog no. A5316-2ML; monoclonal antibody),稀釋比例 1:2000。
[0079] 4.試驗(yàn)結(jié)果
[0080] 參見(jiàn)圖9,其比較不同劃分層的粗萃取物在離體抗發(fā)炎的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 μ g/ ml的BP2(劃分2)及BP3(劃分3)即具有非常明顯的離體抗發(fā)炎效果。
[0081] 測(cè)試?yán)? :美白活性分析A.離體酪胺酸酶活性測(cè)試（in vitro tyrosinase activity assay)
[0082] 1.試驗(yàn)步驟
[0083] 試驗(yàn)步驟參照Wang(2010)的研究報(bào)告，其整體皆引作為本案的參考數(shù)據(jù)。將 B16-F10種入24小格培養(yǎng)盤（24well plate)的孔洞中，每小格種入1*105個(gè)細(xì)胞，放置 于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱24小時(shí)后，將原有的細(xì)胞培養(yǎng)液移除，并加入含有粗萃物的細(xì)胞培 養(yǎng)液，再放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。給藥結(jié)束后移除原有細(xì)胞培養(yǎng)液，并加200 μ 1 PBS潤(rùn) 洗一次，然后加入100 μ 1 trypsin作用1?2分鐘使細(xì)胞脫離底面，然后加入200 μ 1細(xì) 胞培養(yǎng)液中和trypsin反應(yīng)，并將含細(xì)胞的培養(yǎng)液裝入微量離心管內(nèi)以3000rpm離心5分 鐘后去除上清液，加入200 μ 1 PBS潤(rùn)洗一次，再以3000rpm離心5分鐘，去除上清液，加入 100 μ ll%triton X-100/PBS，混合均勻使細(xì)胞破碎。接著在4°C下以lOOOOrpm離心10分 鐘，取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。在同濃度下的蛋白質(zhì)，取等體積上清液和L-dopa(2mg/ml) 混合，反應(yīng)一小時(shí)后利用酶測(cè)讀儀測(cè)波長(zhǎng)475nm的吸光值做統(tǒng)計(jì)整理。
[0084] 2.試驗(yàn)結(jié)果
[0085] 參見(jiàn)圖10,其利用加入不同濃度BP2及BP3于黑色素瘤細(xì)胞，48小時(shí)后進(jìn)行酪 胺酸酶活性分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中X軸為各濃度藥物，Y軸為離體酪胺酸酶活性/黑色素 含量，若產(chǎn)生的生成物愈多，則表示催化強(qiáng)度愈強(qiáng)量。由此結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同蛋白質(zhì)濃度 下，給予BP2及BP3的組別皆具有抑制酪胺酸酶的活性，且隨著濃度提升呈現(xiàn)劑量依存 (dose-dependent)的趨勢(shì)。
[0086] B.離體黑色素含量測(cè)試（in vitro melanin content assay)
[0087] 1.試驗(yàn)步驟
[0088] 試驗(yàn)步驟參照Wang(2010)的研究報(bào)告，其整體皆引作為本案的參考數(shù)據(jù)。將 B16-F10種入24小格培養(yǎng)盤的孔洞中，每小格種入1*105個(gè)細(xì)胞，放置于37°C、5%C02的培 養(yǎng)箱24小時(shí)后，將原有的細(xì)胞培養(yǎng)液移除，加入含有粗萃物的細(xì)胞培養(yǎng)液，再放入培養(yǎng)箱 培養(yǎng)48小時(shí)后，以200 μ 1 PBS潤(rùn)洗一次，然后加入100 μ 1 trypsin作用1?2分鐘使細(xì) 胞脫離盤底，然后加入200 μ 1細(xì)胞培養(yǎng)液中和trypsin反應(yīng)，裝入微量離心管內(nèi)以3000rpm 離心5分鐘，去除上清液。再加入200 μ 1 PBS潤(rùn)洗一次，并以3000rpm離心5分鐘，去除上 清液后，加入100 μ 11N NaOH在80°C下反應(yīng)一小時(shí)。利用酶測(cè)讀儀測(cè)波長(zhǎng)405nm的吸光值 做統(tǒng)計(jì)整理。
[0089] 2.試驗(yàn)結(jié)果
[0090] 參見(jiàn)圖11，其利用加入不同濃度BP2及BP3于黑色素瘤細(xì)胞48小時(shí)后進(jìn)行黑色 素（melanin)含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將細(xì)胞加入氫氧化鈉并加熱溶解后，利用分光光度計(jì) 測(cè)定波長(zhǎng)為490nm的吸收值時(shí)，吸收值愈高則說(shuō)明黑色素含量也愈高。由數(shù)據(jù)顯示結(jié)果與 酪胺酸酶活性相吻合，隨著藥物濃度愈高，降低的酪胺酸酶活性愈顯著，而黑色素的表現(xiàn)量 亦隨著下降。
[0091] C.蘑菇酪胺酸酶抑制能力分析
[0092] 1.實(shí)驗(yàn)步驟
[0093] 在96well plate中，于每個(gè)孔洞中加入70μ 1的ΡΒ、20μ 1各種不同濃度的檢品 溶液，混合均勻。接著加入1〇μ 1的12U酪胺酸酶，放入37°C培養(yǎng)箱中反應(yīng)30分鐘。再加 入10 μ 1的15mM L-dopa，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中反應(yīng)30分鐘后，于波長(zhǎng)492nm之下測(cè)其吸光值 的變化量。以H20或50%Et0H作為控制組。以下式的抑制酪氨酸酶百分率求得待測(cè)物的抗 氧化率。抑制脂質(zhì)過(guò)氧化率（%)愈高，表示抗氧化性愈強(qiáng)。
[0094] 抑制酪氨酸酶百分率（Inhibition of Tyrosinase%, IT%) = [1 -(樣品于 492nm 的吸光值）八未添加樣品的控制組于49211111的吸光值）]\100。
[0095] 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0096] 酪胺酸酶為黑色素形成的速率決定因子，如果待測(cè)物可抑制酪胺酸酶的活性，便 可減少dopaquinone類化合物的產(chǎn)生，在492nm的波長(zhǎng)下所測(cè)得的吸光值則相對(duì)減少，由吸 光值的高低可推算出待測(cè)物抑制酪胺酸酶活性的能力，進(jìn)而可抑制黑色素生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，在500 μ g/ml及1000 μ g/ml的BP2及BP3具有顯著抑制酪胺酸酶活性，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果 可參見(jiàn)下表1 :
[0097]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于皮膚美白、保濕、改善彈性、抗發(fā)炎以及傷口愈合的珊瑚萃取物，其特征在 于，借由下列步驟所制得： a. 以一有機(jī)混合液萃取干燥皮軟珊瑚（Briareum excavatum)樣品，獲得有機(jī)層初萃取 液，其中該有機(jī)混合液包含等比例的C1-C4醇類和C1-C4的含氯烷類； b. 以水和低級(jí)酯類分配萃取該有機(jī)層初萃取液，獲得一低級(jí)酯類粗萃物，該低級(jí)酯類 粗萃物含有5?50 %的一珊瑚活性成分。
2. 如權(quán)利要求1所述的珊瑚萃取物，其特征在于：b.步驟的該低級(jí)酯類粗萃物進(jìn)一步 以一管柱層析分析加以純化，其以一沖提液沖提該低級(jí)酯類粗萃物，以得一沖提物，其中該 沖提液的沖提梯度由正己烷/乙酸乙酯的一第一混合溶劑與乙酸乙酯/甲醇的一第二混合 溶劑所提供。
3. 如權(quán)利要求1所述的珊瑚萃取物，其特征在于：a.步驟的C1-C4醇類為甲醇。
4. 如權(quán)利要求1所述的珊瑚萃取物，其特征在于：a.步驟的C1-C4的含氯烷類為二氯 甲烷。
5. 如權(quán)利要求1所述的珊瑚萃取物，其特征在于：b.步驟的低級(jí)酯類為乙酸乙酯。
6. 如權(quán)利要求2所述的珊瑚萃取物，其特征在于：該第一混合溶劑中正己烷的溶劑梯 度為 0%-99%。
7. 如權(quán)利要求2所述的珊瑚萃取物，其特征在于：該第二混合溶劑中乙酸乙酯的溶劑 梯度比例為0%_90%。
8. 如權(quán)利要求6所述的珊瑚萃取物，其特征在于：該珊瑚活性成分將該低級(jí)酯類粗萃 物進(jìn)一步由該第一混合溶劑加以沖提而得，其中該第一混合溶劑的沖提梯度為：正己烷： 乙酸乙酯為90:10至70:30的劃分（fraction)。
9. 如權(quán)利要求8所述的珊瑚萃取物，其特征在于：該珊瑚活性成分經(jīng)沖提后于該低級(jí) 酯類粗萃物所占比例為5-30%。
10. 如權(quán)利要求1所述的珊瑚萃取物，其特征在于：該珊瑚活性成分將該低級(jí)酯類粗萃 物進(jìn)一步由該第一混合溶劑加以沖提而得，其中該第一混合溶劑的沖提梯度為：正己烷： 乙酸乙酯為60:40至50:50的劃分（fraction)。
11. 如權(quán)利要求10所述的珊瑚萃取物，其特征在于：該珊瑚活性成分經(jīng)沖提后于該低 級(jí)酯類粗萃物所占比例為20-50%。
12. -種如權(quán)利要求1所述的珊瑚萃取物的萃取方法，包含： a. 以一有機(jī)混合液萃取干燥皮軟珊瑚（Briareum excavatum)樣品，獲得有機(jī)層初萃取 液，其中該有機(jī)混合液包含等比例的C1-C4醇類和C1-C4的含氯烷類； b. 以水和低級(jí)酯類分配萃取該有機(jī)層初萃取液，獲得一低級(jí)酯類粗萃物，該低級(jí)酯類 粗萃物含有5?50 %的一珊瑚活性成分。
13. 如權(quán)利要求12所述的萃取方法，其特征在于：b.步驟的該低級(jí)酯類粗萃物進(jìn)一步 以一管柱層析分析加以純化，其以一沖提液沖提該低級(jí)酯類粗萃物，以得一沖提物，其中該 沖提液的沖提梯度由正己烷/乙酸乙酯的一第一混合溶劑與乙酸乙酯/甲醇的一第二混合 溶劑所提供。
14. 一種珊瑚萃取物的用途，其將如權(quán)利要求1所述的珊瑚萃取物施用于一活體的皮 膚，以使皮膚美白。
15. -種珊瑚萃取物的用途，其將如權(quán)利要求1所述的珊瑚萃取物施用于一活體的皮 膚，以使皮膚保濕。
16. -種珊瑚萃取物的用途，其將如權(quán)利要求1所述的珊瑚萃取物施用于一活體的皮 膚，以改善皮膚彈性。
17. -種珊瑚萃取物的用途，其施用如權(quán)利要求1所述的珊瑚萃取物，以抗發(fā)炎。
18. -種珊瑚萃取物的用途，其施用如權(quán)利要求1所述的珊瑚萃取物，以促使傷口愈 合。
19. 一種保養(yǎng)品，其包含如權(quán)利要求1?11任一項(xiàng)所述珊瑚萃取物，其特征在于：該珊 瑚萃取物具0. 00001?10%的重量比。
【文檔編號(hào)】A61P29/00GK104095883SQ201410066589
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月1日
【發(fā)明者】宋秉鈞, 王維賢, 溫志宏, 溫依珊, 周泰延, 鄭銀彬, 郭智杰 申請(qǐng)人:統(tǒng)欣生物科技股份有限公司