臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)百草枯中毒肺損傷的治療作用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用間充質(zhì)干細(xì)胞治療肺損傷，尤其涉及使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療百草枯中毒肺損傷。
【專利說(shuō)明】臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)百草枯中毒肺損傷的治療作用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及充質(zhì)干細(xì)胞治療領(lǐng)域，尤其涉及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)百草枯中毒肺損傷的治療。
【背景技術(shù)】
[0002]百草枯(Paraquat，PQ)是一種廣泛使用的高效除草劑，對(duì)人有較強(qiáng)的毒性作用。由于其中毒致死量小、無(wú)特效解毒劑、常規(guī)對(duì)癥治療效果極差，故死亡率居高不下。百草枯中毒的特征性改變是肺損傷，早期表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞受損，肺泡內(nèi)出血水腫，晚期則表現(xiàn)為肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)纖維化。
[0003]近年來(lái)隨著干細(xì)胞研究的進(jìn)展，干細(xì)胞在臨床難治性和頑固性疾病治療方面的研究越來(lái)越多。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)因取材方便、再生能力強(qiáng)、細(xì)胞增殖快、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而廣受青睞。已有研究1顯示，MSCs可被募集到肺損傷部位，分化并修復(fù)肺泡上皮細(xì)胞，增加表面活性物質(zhì)分泌，減輕炎癥反應(yīng)，具有治療肺損傷的巨大潛力。本研究探討臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cell, UCMSC)治療百草枯中毒性肺損傷的可行性，旨在為百草枯中毒的臨床治療開拓新的途徑。
[0004]以往的文獻(xiàn)報(bào)道，MSC對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化有治療作用。但目前尚未見到采用MSC治療百草枯中毒誘導(dǎo)的肺纖維化的研究。不同原因引起的肺纖維化機(jī)理不同。MSC能否用于治療百草枯中毒誘導(dǎo)的急性肺損傷以及能否阻止百草枯中毒后存活的病人的肺纖維化，是無(wú)法預(yù) 料的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本研究首次發(fā)現(xiàn)臍帶MSC對(duì)百草枯中毒誘導(dǎo)的肺纖維化有治療作用，動(dòng)物死亡率下降，肺纖維化評(píng)分下降。本研究探討了臍帶MSC對(duì)急性肺損傷生存率的改善，發(fā)現(xiàn)對(duì)于較低劑量百草枯中毒改善明顯，而較高劑量時(shí)效果不好。因此，本研究表明臨床應(yīng)用干細(xì)胞進(jìn)行百草枯中毒病人的救治需要選擇病例；同時(shí)探討了細(xì)胞移植時(shí)間對(duì)療效的影響，發(fā)現(xiàn)24小時(shí)輸注細(xì)胞效果較好，從而為MSC應(yīng)用于臨床時(shí)治療方案的制定有指導(dǎo)意義。由于百草枯中毒后存活的病人具有肺纖維化的遠(yuǎn)期并發(fā)癥，因此本研究為臨床改善病人長(zhǎng)遠(yuǎn)的生存質(zhì)量提供了新的治療方法。
[0006]本發(fā)明的目的在于使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療中毒肺損傷，尤其是百草枯中毒肺損傷。
[0007]在一些實(shí)施方案中，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的劑量為IxlO6~IxlO8細(xì)胞/kg體重。
[0008]在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的劑量為5xl06~5xl07細(xì)胞/kg體重。
[0009]在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的劑量為IxlO7~2.5xl07細(xì)胞/kg體重。[0010]在一些實(shí)施方案中，所述百草枯中毒中的百草枯劑量為I~59mg/kg體重。
[0011]在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述百草枯中毒中的百草枯劑量為10~50mg/kg體重。
[0012]在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述百草枯中毒中的百草枯劑量為20~40mg/kg體重。
[0013]在一些實(shí)施方案中，中所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的輸注時(shí)間為中毒后24小時(shí)。
[0014]在一些實(shí)施方案中，所述藥物除含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外，還含有輔助藥物。
[0015]在具體實(shí)施方案中，所述輔助藥物可為糖皮質(zhì)激素例如地塞米松或甲基強(qiáng)的松龍。
[0016]本發(fā)明的有益效果為:首次發(fā)現(xiàn)臍帶MSC對(duì)百草枯中毒誘導(dǎo)的肺纖維化有治療作用，動(dòng)物死亡率下降，肺纖維化評(píng)分下降。發(fā)現(xiàn)了臍帶MSC對(duì)急性肺損傷生存率的改善，對(duì)于較低劑量百草枯中毒改善明顯，而較高劑量時(shí)效果不好。因此，本研究表明臨床應(yīng)用干細(xì)胞進(jìn)行百草枯中毒病人的救治需要選擇病例；同時(shí)探討了細(xì)胞移植時(shí)間對(duì)療效的影響，發(fā)現(xiàn)24小時(shí)輸注細(xì)胞效果較好，從而為MSC應(yīng)用于臨床時(shí)治療方案的制定有指導(dǎo)意義。這在以往的研究中未見闡述。由于百草枯中毒后存活的病人具有肺纖維化的遠(yuǎn)期并發(fā)癥，因此本研究為臨床改善病人長(zhǎng)遠(yuǎn)的生存質(zhì)量提供了新的治療方法。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為急性百草枯中毒性肺損傷HE染色。左:PBS組；右=UCMSC組。
[0018]圖2為UCMSC對(duì)百草枯中毒性肺纖維化的治療作用的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0019]圖3為UCMSC治療百草枯中毒性肺纖維化HE染色。左:PBS組；右=UCMSC組。
[0020]圖4為圖4UCMSC移植后不同時(shí)間點(diǎn)肺組織人特異性基因CBM檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，以下實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換或改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購(gòu)買得到的。
[0022]實(shí)施例
[0023]材料與方法
[0024]1.動(dòng)物
[0025]健康成年雌性C57BL/6小鼠，體重19_21g，于屏障環(huán)境內(nèi)活動(dòng)，室內(nèi)恒溫恒濕，人工照明12h/d，自由進(jìn)食水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)I周。
[0026]2.UCMSC的分離、培養(yǎng)、鑒定
[0027]UCMSC取空軍總醫(yī)院健康胎兒，簽署知情同意書，無(wú)感染性疾病。臍帶樣品沖洗干凈，剪成2-3mm3的小塊，加入1%膠原酶消化液37°C消化2h，用70 μ m篩網(wǎng)過濾，收集上清，離心收集細(xì)胞。用PBS清洗 后，加入5mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，370C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。80%_90%匯合時(shí)，按1:2或1:3比例傳代。動(dòng)物體內(nèi)移植采用6-8代細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSC表面標(biāo)志的表達(dá)。
[0028]3.百草枯中毒性肺損傷模型的制備
[0029]動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后一次性腹腔注射40mg/kg百草枯溶液，注射液體量為0.2ml/10g。急性肺損傷動(dòng)物模型于造模后7天處死；肺纖維化模型于造模后21天處死。
[0030]4.動(dòng)物分組
[0031]105只動(dòng)物，根據(jù)百草枯給藥劑量(40mg/kg,50mg/kg,60mg/kg)以及是否輸注UCMSC 進(jìn)行治療分為 6 組:40mg/kg-PBS 組(n=30) ；40mg/kg-UCMSC 組(n=29) ；50mg/kg-PBS組(n=13) ；50mg/kg-UCMSC 組(n=13) ；60mg/kg-PBS 組(n=10) ;60mg/kg_UCMSC 組(n=10)。PBS組于百草枯造模后24小時(shí)尾靜脈注射PBS ;UCMSC組于造模后24小時(shí)尾靜脈輸注IxlO7細(xì)胞/kg體重的UCMSC。其中40mg/kg-PBS組和40mg/kg_UCMSC組各取14只于21天處死，觀察UCMSC對(duì)百草枯誘導(dǎo)肺纖維化的治療作用；其余動(dòng)物7天處死，觀察UCMSC對(duì)急性肺損傷的治療作用。記錄死亡率和體重變化，并取肺組織進(jìn)行病理包埋和切片，病理評(píng)分。
[0032]5.肺組織病理切片染色及評(píng)分
[0033]肺組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，按照急性肺損傷或肺纖維化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。
[0034]急性肺損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)2，病理評(píng)分范圍為0-16分，具體如下表:
[0035]表1急性肺損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
【權(quán)利要求】
1.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療百草枯中毒肺損傷的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的劑量為IxlO6~IxlO8細(xì)胞/kg體重。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的劑量為5xl06~5xl07細(xì)胞/kg體重。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的劑量為IxlO7~2.5xl07細(xì)胞/kg體重。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的用途，其中所述百草枯中毒肺損傷中的百草枯中毒劑量為1~59mg/kg。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述百草枯中毒肺損傷中的百草枯劑量為10~50mg/kg.
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述百草枯中毒肺損傷中的百草枯劑量為20~40mg/kg.
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的用途，其中所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的輸注時(shí)間為中毒后24小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的用途，其中所述藥物除含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外，還含有輔助藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中所述輔助藥物可為糖皮質(zhì)激素例如地塞米松或甲基強(qiáng)的松龍。
【文檔編號(hào)】A61P11/00GK103816186SQ201410072002
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】呂雙紅, 王慧娜, 杜麗欣, 劉兵 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院