一種維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材制備方法。首先通過溶解法和凝膠法制備出介孔硅納米顆粒，并將其開發(fā)成為β-雌二醇藥物分子的納米儲存器；而后，利用層層自組裝技術在負載藥物分子的介孔硅表面構建殼聚糖－明膠多層膜，封堵介孔硅表面的介孔，構建功能性介孔硅納米顆粒；其次，再次利用層層自組裝技術將功能性納米顆粒組裝到殼聚糖－明膠多層膜修飾的鈦材表面，從而構建出一種調控成骨細胞的生物學行為，并能提高骨質疏松癥患者的骨修復能力鈦材表面系統(tǒng)。
【專利說明】一種維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材制備方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于醫(yī)用材料領域。
【背景技術】
[0002]鈦材植入體作為骨修復材料只能被動的與骨發(fā)生整合。這種不良骨整合將會導致植入體固定強度不足，造成植入體的松動并誘發(fā)骨溶癥。就患有骨質疏松癥的患者而言，骨移植手術仍然是面臨巨大挑戰(zhàn)。
[0003]近年來，研究人員廣泛關注利用鈦材植入體表面遞送骨生成刺激性介質(包括生長因子或其他的治療性藥物)，加速植入體周圍骨形成的相關研究。例如，研究證實在鈦材表面組裝單層膜也可用于藥物遞送。另外，表面負載遞送生物活性因子(轉換生長因子β O的孔狀鈦材植入體能促進人類骨髓基質干細胞的生物學功能并增強了宿主的組織整合性。然而，在提高鈦材表面性能的方面，以上方法仍存在以下幾點不足:首先，底物表面的藥物負載率較低；其次，鈦材表面藥物控釋性能較差，仍存在藥物的的“暴釋”現(xiàn)象，其不利于植入體植入體內后與骨之間的長期整合；再次，體內蛋白酶或催化劑會引發(fā)藥物或生長因子的失活。因此，急需尋求新的方法以提高鈦材骨整合性，為骨移植患者尤其是骨質疏松癥患者提供更好的技術支持。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是構建一種維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材界面系統(tǒng)。
[0005]為實現(xiàn)本發(fā)明目的而采用的技術方案是這樣的，一種維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006]I)制備介孔硅納米顆粒，即利用模板法和溶膠凝膠制備出單分散的介孔硅納米顆粒，并將所述介孔硅納米顆粒羧基化；
[0007]2)利用擴散原理，使β_雌二醇藥物負載到步驟I)所得的介孔硅納米顆粒內；
[0008]3)采用層層自組裝技術，在負載β -雌二醇藥物的介孔硅納米顆粒的表面構建多層膜，所述多層膜由若干殼聚糖層和明膠層交錯疊加而成，制備出功能性納米顆粒；
[0009]4)在鈦材表面構建多層膜，所述多層膜由若干殼聚糖層和明膠層交錯疊加而成，得到經(jīng)多層膜修飾的鈦材；
[0010]5)采用層層自組裝技術，將步驟3)所得的功能性納米顆粒組裝到步驟4)所得的多層膜修飾的鈦材的表面，得到維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材。
[0011]值得說明的是，眾所周知，細胞微環(huán)境是由由溶性信號(如生長因子等)和非溶性信號(激素)等多種蛋白和糖蛋白組成的復雜的網(wǎng)絡體系。這些信號分子與細胞生存及功能的發(fā)揮密不可分。然而，在保護活性分子的生物活性方面，簡單的類細胞外基質結構效用有限。盡管研究表明通過層層自組裝技術細胞微環(huán)境中的活性因子可以成功組裝到材料表面，實現(xiàn)活性分子的可控持續(xù)釋放。然而如何保持材料表面活性因子或藥物的生物活性是調控細胞生理功能的重要環(huán)節(jié)。[0012]因此，為了構筑具有細胞微環(huán)境活性界面，克服材料界面藥物遞送的缺點，在本專利中，我們運用層層自組裝技術在鈦材表面構建界面存儲器。鈦材界面儲存器的優(yōu)點是其表面負載高、長期維持活性因子構象和生理活性等。利用逐層自組裝技術，我們將包含β -雌二醇藥物的功能性納米顆粒(納米存儲器)包埋在多層陰一陽離子聚合物間。研究證實，β_雌二醇藥物可以原位遞送到粘附于材料表面的細胞內，調控細胞生物功能，促進骨生成。另外，本專利所設計的鈦合金表面生物儲存器還可用于儲存骨形態(tài)發(fā)生蛋白、其他生長因子(VAGF)或含抗炎癥藥物(青霉素)等，從而調控細胞的相應生物學行為。
[0013]進一步，步驟I)具體的過程是:將水溶液作為反應溶劑，向所述水溶液中加入雙親性表面活性劑作為模板，在堿性條件和反應溫度為75V~85°C的控制條件下，向所述水溶液中加入正硅酸四乙酯；所述正硅酸四乙酯水解后，再抽取表面活性劑后，得到介孔硅納米顆粒。
[0014]進一步，步驟2)具體的過程是:將雌二醇溶解于I，4-二氧六環(huán)中，配置成濃度為2 X 10_2~8 X 10_2Μ的β -雌二醇溶液；將羧基化的介孔硅納米顆粒加入到β -雌二醇溶液中，室溫攪拌不低于24h ;離心后清洗；置于37°C放置不少于48h，即得到負載了 β -雌二醇藥物的介孔硅納米顆粒。
[0015]進一步，步驟3)具體的過程是:
[0016]a)配置濃度為1~10mg/mL的殼聚糖溶液和濃度為I~10mg/mL的明膠溶液；
[0017]b)將負載β -雌二醇藥物的介孔硅納米顆粒懸浮所述殼聚糖溶液中；室溫下攪拌懸浮液，之后離心分離出固體；
[0018]c)將負載β -雌二醇藥物的介孔硅納米顆粒懸浮所述明膠溶液中；室溫下攪拌懸浮液，之后離心分離出固體；
[0019]d)重復步驟b~c若干次；
[0020]e)將負載β -雌二醇藥物的介孔硅納米顆粒懸浮所述殼聚糖溶液中；室溫下攪拌懸浮液，之后離心分離出固體，清洗并烘干固體后，即得功能性納米顆粒。
[0021]進一步，步驟4)具體的過程是:
[0022]i)配置濃度為5mg/mL的聚乙烯亞胺溶液；配置濃度為Ι-lOmg/mL的殼聚糖溶液和濃度為Ι-lOmg/mL的明膠溶液；
[0023]ii)將鈦材沉浸于聚乙烯亞胺中10_30min，使其表面吸附帶正電荷的分子；
[0024]iii)將鈦材沉浸在所述明膠溶液中，沉浸時間為5_15min，取出后潤洗；
[0025]iv)將鈦材沉浸在所述殼聚糖溶液中，沉浸時間為5_15min，取出后潤洗；
[0026]V)重復步驟iii)~iv)若干次；
[0027]vi)將鈦材沉浸在所述明膠溶液中，沉浸時間為5_15min，取出后潤洗；，即得到經(jīng)多層膜修飾的鈦材。
[0028]進一步，步驟5)具體的過程是:
[0029]A)將步驟3)得到的功能性納米顆粒懸浮于磷酸鹽緩沖液中，得到濃度為1-1Omg/mL的功能性納米顆粒懸浮液；配置濃度為Ι-lOmg/mL的殼聚糖溶液和濃度為Ι-lOmg/mL的明膠溶液；
[0030]B)將步驟4)得到的經(jīng)多層膜修飾的鈦材沉浸在所述功能性納米顆粒懸浮液，時間不少于15min,取出后潤 洗；[0031]C)將鈦材沉浸在所述明膠溶液中，沉浸時間為5_15min，取出后潤洗；
[0032]D)將鈦材沉浸在所述殼聚糖溶液中，沉浸時間為5_15min，取出后潤洗；
[0033]E)將鈦材沉浸在所述明膠溶液中，沉浸時間為5_15min，取出后潤洗；
[0034]F)重復步驟D~E若干次，即得到維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材。
[0035]本發(fā)明還公開一種以上述方法獲得的維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材。
[0036]本發(fā)明的有益效果在于:該方法具有操作簡單、成本低廉、通用性強，不需要特殊設備。利用該方法制備的生物功能化鈦材界面具有較好的細胞相性及骨誘導性能，在骨質疏松癥的治療和移植技術中有重要的臨床應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】[0037]圖1介孔硅納米顆粒(MSN)的掃描電鏡圖；
[0038]圖2功能性介孔納米納米復合顆粒(E2-MSN — PEM)的掃描電鏡圖；
[0039]圖3Ti/PEI/(Gel/Chi)2/Gel修飾鈦材的掃描電鏡圖；
[0040]圖4Ti/PEI/(Gel/Chi)2/Gel/(E2-MSN@PEM/Gel/(Chi/Gel)2)2 修飾的鈦材表面的掃描電鏡圖。
[0041]圖5不同底物表面成骨細胞培養(yǎng)4天后的細胞活性，n=4 ；
[0042]圖6不同底物表面成骨細胞培養(yǎng)4天后堿性磷酸酶的活性，η=5，*ρ〈0.05; **ρ〈0.01 ；
[0043]圖7不同底物表面成骨細胞培養(yǎng)16天后礦化的定量檢測，η=3, **ρ〈0.01。
【具體實施方式】
[0044]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不應該理解為本發(fā)明上述主題范圍僅限于下述實施例。在不脫離本發(fā)明上述技術思想的情況下，根據(jù)本領域普通技術知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應包括在本發(fā)明的保護范圍內。
[0045]實施例1:維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材的制備
[0046]a.介孔硅的制備:將0.28g氫氧化鈉與Ig十六烷基三甲基溴化銨均勻分散至二蒸水(480mL)中，劇烈攪拌并加熱至80°C。而后，逐滴加入5g正硅酸四乙酯，并劇烈攪拌2h，直至混合液成為白色懸濁液，即正硅酸四乙酯水解得到介孔硅納米材料。將帶有表面活性劑的介孔硅納米材料(CTAB@MSNs)均勻分散于150mL的甲醇一鹽酸(135mL:15mL)混合液中，劇烈攪拌。將上述溶液置于80°C的水浴鍋中回流48h，抽取表面活性劑(CTAB)，得到規(guī)則孔道結構的介孔二氧化硅納米顆粒(MSNs )。
[0047]b.藥物的負載:將雌二醇溶解于1，4_ 二氧六環(huán)中，濃度為5Χ10-2Μ。將0.3g介孔硅加入到30mLi3 -雌二醇溶液中，室溫攪拌24h。離心后一次用無水乙醇清洗2次，二蒸水清洗I次。最后將樣品置于37°C放置48h，記為E2-MSN。
[0048]c.功能性納米顆粒的合成:用2% (V — V)醋酸制備殼聚糖溶液(濃度為5mg/mL),PBS緩沖液(pH=7.4)制備明膠(5mg/mL)溶液。將E2-MSN (0.2g)顆粒懸浮于20ml殼聚糖溶液中，室溫條件下攪拌15min。離心后，二蒸水清洗2次。而后，將上述E2-MSN顆粒懸浮于20ml明膠溶液中，室溫攪拌15min。重復該過程，直至在E2-MSN表面構建(Chi/Gel)2/Chi多層膜，即E2-MSN/(Chi/Gel)2/Chi。樣本置于37°C干燥48小時，樣品記為E2-MSN —PEM。
[0049]d.生物功能化鈦材界面的構建:將適量E2-MSN0PEM懸浮于PBS中，濃度為5mg/mL。聚乙烯亞胺溶于二蒸水中，濃度為5mg/mL。將鈦膜沉浸于PEI溶液中20min，使其表面吸附帶正電荷的PEI分子，將其引發(fā)層。將鈦膜沉浸在明膠溶液中，沉浸時間為lOmin。而后用蒸餾水潤洗2次，每次Imin ;再鈦膜沉浸在殼聚糖溶液中，沉浸時間為lOmin。而后用蒸餾水潤洗2次，每次lmin。重復上述步驟完成Ti/PEI/(Gel/Chi) 2/Gel多層膜的構建。隨后，將Ti/PEI/ (Gel/Chi) 2/Gel多層膜表面暴露于E2-MSN0PEM顆粒懸浮液中15min，蒸餾水潤洗4次，每次lmin。隨后，在E2-MSN0PEM納米顆粒層表面構建Gel/(Chi/Gel)2多層膜。重復上述步驟，完成生物功能化鈦材界面的構建。
[0050]上述a步驟和c步驟處理后的介孔硅納米材料和功能性介孔硅納米復合顆粒的掃描電鏡圖分別為圖1.和圖2 ;可見本發(fā)明制備的介孔硅納米顆粒大小均勻、具有規(guī)則有序的孔道結構，而經(jīng)過載藥和多層膜修飾介孔硅納米材料的孔道比較模糊，粒徑有所增大；該結果表明多層膜已成功吸附到介孔硅材料表面。僅用Gel/Chi膜修飾的鈦材表面及實例a_d各個步驟處理后的鈦材表面的掃描電鏡圖分別為圖3和圖4 ;從圖中可看出，與Gel/Chi膜修飾的鈦材表面相比，生物功能性鈦材均勻的分布E2-MSN0PEM納米顆粒。由于Gel/(Chi/Gel)2多層膜覆蓋于E2-MSN0PEM納米顆粒表面造成的顆粒的邊緣較為模糊。證實E2-MSN0PEM納米顆粒成功組裝到鈦膜表面Chi/Gel網(wǎng)絡結構中。
[0051 ] 實驗例1:生物功能化鈦材表面的細胞相容性
[0052]本研究考察成骨細胞在生物功能化鈦材表面的細胞活性。
[0053]用MTT檢測底物表面的細胞相容性。首先，培養(yǎng)原代成骨細胞，將第三代成骨細胞接種接種在不同鈦膜及TCPs表面，接種密度為1.5 X KMcells/cm2，于37°C培養(yǎng)。4天后，棄上清，加入0.9mL新鮮培養(yǎng)基，再加入0.1mL MTT(5mg/ml)。培養(yǎng)4h后，棄上清，加入0.7mL二甲基亞砜(DMSO)溶解結晶物甲臜。徹底溶解后，將溶解液置于離心管中，離心10min，取上清于490nm處測其吸收值。
[0054]MTT能被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能還原為藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞不具有此功能。在一定細胞數(shù)范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。二甲基亞砜(DMSO)的作用是溶解細胞中的甲瓚，因此根據(jù)測得的吸光度值(OD值)，來判斷活細胞數(shù)量。OD值越大，細胞活性越強。如圖5顯示了在不同底物表面細胞內所產(chǎn)生甲瓚的吸光值。與純鈦材及Gel/Chi多層膜修飾的鈦膜相比，生物功能化鈦材表面的成骨細胞表現(xiàn)出較高的細胞活性。該結果與其它文獻中關Chi/Gel及硅顆粒具有良好生物相容性的報道相統(tǒng)一。結果表明生物功能化鈦材表面具有細胞相容性且無毒副作用。
[0055]實驗例2:生物功能化鈦材表面成骨細胞堿性磷酸酶的活性
[0056] 選取實施例1制備而得到的生物功能化鈦材，考察材料表面成骨細胞的堿性磷酸酶活性。首先將第三代原代培養(yǎng)的成骨細胞接種在不同的鈦材及TCPS表面。培養(yǎng)4天后，用l%TitonX-100裂解細胞，收集細胞裂解液。用堿性磷酸酶檢測試劑盒分別檢測裂解液中的堿性磷酸酶活性。如圖6所示:生物功能化鈦材表面的成骨細胞堿性磷酸酶活性均高于純鈦材及多層膜修飾的鈦材(即LBL+Ti )。在p〈0.01水平上，生物功能化鈦材(即LBL+E2-MSN0PEM+Ti)與純鈦材之間存在著顯著性差異。另外，在p〈0.05水平上生物功能化鈦材與多層膜化鈦材也存在顯著性差異。結果表明生物功能化鈦材表面有利于早期骨生成，可促進骨整合。伴隨著鈦材表面Ch1、Gel多層膜降解，釋放出β -雌二醇或E2-MSN顆粒被細胞吸收。Ε2可以結合到細胞內激素受體，激活靶基因(包括堿性磷酸酶和I型膠原)的轉錄。該研究結果表明生物功能化鈦材對于骨疾病如骨質疏松癥中激素取代治療具有潛在的優(yōu)越性。β -雌二醇在鈦材表面負載量可通過簡單的改變E2-MSN0PEM納米顆粒層而實現(xiàn)。
[0057]實驗例3:生物功能化鈦材表面成骨細胞的礦化
[0058]選取實施例1制備而得到的生物功能化鈦材，并定量考察材料表面成骨細胞的礦化。成骨細胞的礦化是骨生成的后期標志，體現(xiàn)了細胞的高級分化。以茜素紅染色檢測不同鈦材表面成骨細胞的礦化情況。如圖7所示，培養(yǎng)16天后，與純鈦、多層膜化鈦材(SPLBL+Ti)及至TCPs相比，生物功能化鈦材表面(即LBL+E2-MSN@PEM+Ti)成骨細胞顯示了較高的礦化能力。生物功能化鈦材表面與多層膜化鈦材及純鈦材相比，在P〈0.01水平上都具有顯著性差異。結構表明生物功能化鈦材表面有利于促進成骨細胞的礦化。在本研究中，一方面我們利用介孔硅作為藥物存儲器存儲遞送β -雌二醇，有效地提高藥物的藥物遞送效率；另一方面，鈦材 表面多層膜可調控載藥介孔硅釋放，利于骨疾病的長期治療。
【權利要求】
1.一種維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)制備介孔硅納米顆粒，并將所述介孔硅納米顆粒羧基化； 2)使β-雌二醇藥物負載到步驟I)所得的介孔硅納米顆粒內； 3)在負載β-雌二醇藥物的介孔硅納米顆粒的表面構建多層膜，所述多層膜由若干殼聚糖層和明膠層交錯疊加而成，制備出功能性納米顆粒； 4)在鈦材表面構建多層膜，所述多層膜由若干殼聚糖層和明膠層交錯疊加而成，得到經(jīng)多層膜修飾的鈦材； 5)將步驟3)所得的功能性納米顆粒組裝到步驟4)所得的多層膜修飾的鈦材的表面，得到維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材制備方法，其特征在于，步驟I)具體的過程是:將水溶液作為反應溶劑，向所述水溶液中加入雙親性表面活性劑作為模板，在堿性條件和反應溫度為75°C~85°C的控制條件下，向所述水溶液中加入正硅酸四乙酯；所述正硅酸四乙酯水解后，再抽取表面活性劑后，得到介孔硅納米顆粒。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材制備方法，其特征在于，步驟2)具體的過程是:將β-雌二醇溶解于I，4-二氧六環(huán)中，配置成濃度為2Χ10_2~8 X 10_2Μ的β -雌二醇溶液；將羧基化的介孔硅納米顆粒加入到β -雌二醇溶液中，室溫攪拌不低于24h ;離心后清洗；置于37°C放置不少于48h，即得到負載了 β -雌二醇藥物的介孔娃納米顆粒。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材制備方法，其特征在于，步驟3)具體的過程是: a)配置濃度為I~10mg/mL的殼聚糖溶液和濃度為I~10mg/mL的明膠溶液； b)將負載β_雌二醇藥物的介孔硅納米顆粒懸浮所述殼聚糖溶液中；室溫下攪拌懸浮液，之后離心分離出固體； c)將負載β_雌二醇藥物的介孔硅納米顆粒懸浮所述明膠溶液中；室溫下攪拌懸浮液，之后離心分離出固體； d)重復步驟b~c若干次； e)將負載β_雌二醇藥物的介孔硅納米顆粒懸浮所述殼聚糖溶液中；室溫下攪拌懸浮液，之后離心分離出固體，清洗并烘干固體后，即得功能性納米顆粒。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材制備方法，其特征在于，步驟4)具體的過程是: i)配置濃度為5mg/mL的聚乙烯亞胺溶液；配置濃度為1-lOmg/mL的殼聚糖溶液和濃度為1-lOmg/mL的明膠溶液； ii)將鈦材沉浸于聚乙烯亞胺中10-30min，使其表面吸附帶正電荷的分子； iii)將鈦材沉浸在所述明膠溶液中，沉浸時間為5-15min，取出后潤洗； iv)將鈦材沉浸在所述殼聚糖溶液中，沉浸時間為5-15min，取出后潤洗； V)重復步驟iii)~iv)若干次； vi)將鈦材沉浸在所述明膠溶液中，沉浸時間為5-15min，取出后潤洗；，即得到經(jīng)多層膜修飾的鈦材。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材制備方法，其特征在于，步驟5)具體的過程是: A)將步驟3)得到的功能性納米顆粒懸浮于磷酸鹽緩沖液中，得到濃度為1-10mg/mL的功能性納米顆粒懸浮液；配置濃度為1-10mg/mL的殼聚糖溶液和濃度為1-10mg/mL的明膠溶液； B)將步驟4)得到的經(jīng)多層膜修飾的鈦材沉浸在所述功能性納米顆粒懸浮液，時間不少于15min,取出后潤洗； C)將鈦材沉浸在所述明膠溶液中，沉浸時間為5-15min，取出后潤洗； D)將鈦材沉浸在所述殼聚糖溶液中，沉浸時間為5-15min，取出后潤洗； E)將鈦材沉浸在所述明膠溶液中，沉浸時間為5-15min，取出后潤洗； F)重復步驟D~E若干次，即得到維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材。
7.通過I~6任一項權利要求所述方法獲得的維持骨動態(tài)平衡的生物功能化鈦材。
【文檔編號】A61L31/16GK103933622SQ201410073243
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月3日 優(yōu)先權日:2014年3月3日
【發(fā)明者】蔡開勇, 胡燕, 羅忠 申請人:重慶大學