含卵黃膜外層蛋白1在制備治療干眼藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了含卵黃膜外層蛋白1在制備治療干眼藥物中的應用。本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，卵黃膜外層蛋白1可以延長小鼠和大鼠的淚膜破裂的時間，因此可以用于治療干眼。本發(fā)明的卵黃膜外層蛋白1可以延長小鼠和大鼠的淚膜破裂的時間，因此可以用于預防和治療干眼，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】含卵黃膜外層蛋白1在制備治療干眼藥物中的應用
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明屬于藥物制劑領域，具體涉及含卵黃膜外層蛋白I在制備治療干眼藥物中的應用。
【背景技術】:
[0002]正常的眼表面覆蓋一層淚膜，穩(wěn)定的淚膜是維持眼表面健康的基礎。干眼是由于淚液量或質(zhì)異常引起淚膜不穩(wěn)定和眼表損害，從而導致的一類疾??；為最常見的眼表疾病之一，能嚴重影響人們的生活質(zhì)量。其發(fā)病率在全球達5-30%(50歲以上)，我國報道的則更高(北京:40歲以上為21%;上海:20歲以上為30%;內(nèi)蒙古:40歲以上有癥狀50%，淚膜破裂時間縮短37%)。干眼現(xiàn)有的治療手段包括非藥物治療、藥物治療和手術治療等，而病因治療是最佳方案。由于引起干眼的原因十分復雜，對于難以發(fā)現(xiàn)病因的患者，緩解干眼癥狀是其治療的重要目標。不同原因引起的干眼及不同類型的干眼，其治療方法不同，目前最方便、有效地緩解干眼癥狀的治療方法是外用滴眼制劑。而人工淚液替代治療是治療任何類型干眼的基礎治療措施。選用人工淚液制劑時應考慮以下因素:首先，其化學成分和物理、化學特性應該與生理淚液一致。例如PH值為中性，滲透壓和生理淚液相同，否則使用后可能會對眼睛產(chǎn)生刺激、疼痛及其他不適。其次，應含有模擬生理淚液中粘蛋白層作用的成分，使水液層更長時間依附于眼球表面，達到長時間緩解眼部干澀的作用。再次，其粘度應和生理淚液相近，使用后不會感覺粘膩或使視力模糊，而且不會影響隱性眼鏡的配戴。最后，人工淚液最好不含有抗生素，并且所含的保存劑對角結膜影響極小或沒有影響。長期或頻繁使用人工淚液制劑者(例如每日用藥超過4-6次)應首選不含防腐劑，至少所含的防腐劑不影響角膜的人工淚液，以防止其毒副作用。
[0003]VMOl最早發(fā)現(xiàn)于雞蛋的卵黃膜外層，是一種水溶性蛋白質(zhì)。本發(fā)明使用的是人重組vmol, vmol的氨基酸序列的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1的51~659位所示，SEQ ID N0.1 所示的序列的 Genbank:BC104195.1。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0004]本發(fā)明的第一個目的是提供含卵黃膜外層蛋白I (VMOl)在制備治療干眼藥物中的應用。
[0005]我們發(fā)現(xiàn)VMOl高豐度表達于駱駝的淚液中，綿羊和小鼠的淚液中也存在此種蛋白，而人和兔的淚液中并不存在此種蛋白。淚液中的蛋白質(zhì)在穩(wěn)定淚I吳、防御微生物感染、促進角結膜上皮愈合等方面發(fā)揮重要作用。針對相關眼病(干眼)中淚液蛋白表達譜的變化情況，有人嘗試將溶菌酶、乳鐵蛋白引入人工淚液的研制中，用于補充濃度降低的蛋白質(zhì)，以維持淚膜的穩(wěn)定及防御眼表微生物的感染。 [0006]本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，卵黃膜外層蛋白I (其編碼基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1的51~659位所示)可以延長小鼠和大鼠的淚膜破裂的時間，因此可以用于治療干眼。
[0007]本發(fā)明的第二個目的是提供一種治療干眼的外用滴眼制劑，其特征在于，含有有效量的含卵黃膜外層蛋白I和輔料。
[0008]所述的含卵黃膜外層蛋白I的氨基酸序列，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1的51~659位所示。
[0009]所述的含卵黃膜外層蛋白1，其含量為每100mL滴眼制劑中含卵黃膜外層蛋白
10.3~0.75g。含卵黃膜外層蛋白I溶解在滴眼制劑中，其可以是純蛋白、復合蛋白或其混合物。
[0010]外用滴眼制劑根據(jù)眼部對滲透壓及PH值的耐受有一定范圍的要求，加入一定量的輔料如滲透壓調(diào)節(jié)劑、PH值調(diào)節(jié)劑以減少滴眼制劑的刺激性，提高順應性，保證治療的順利實施。根據(jù)滴眼制劑為多次給藥制劑，可以添加一種或多種一定量的防腐劑。
[0011]所述的輔料包括透明質(zhì)酸或其鹽、滲透壓調(diào)節(jié)劑和PH值調(diào)節(jié)劑。
[0012]所述的透明質(zhì)酸或其鹽占滴眼制劑總質(zhì)量的0.1-0.5%，優(yōu)選為透明質(zhì)酸鈉。透明質(zhì)酸或其鹽用來增加滴眼制劑的粘度，其粘度可以通過調(diào)整濃度來調(diào)節(jié)，其中透明質(zhì)酸鈉效果最佳。
[0013]滴眼制劑的滲透壓最佳為等滲，但眼部可耐受一定范圍的低滲或高滲溶液。因正常情況下淚液的滲透壓為295-309m0sm/l，所以本發(fā)明的外用滴眼制劑將滲透壓控制在295-309m0sm/l之間，保持與淚液的一致性，盡量減少對眼睛的刺激。
[0014]所述滲透壓調(diào)節(jié)劑可選自氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、甘露醇、聚乙二醇或其混合物。
[0015]本發(fā)明采用加入PH值調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)PH值，滴眼制劑的PH值維持在眼睛可耐受的范圍內(nèi)，一般為5-9。因正常情況下淚液的PH值一般在5.20-8.35之間,所以本發(fā)明的外用滴眼制劑將PH值控制在5.20-8.35之間，保持與淚液的一致性，盡量減少對眼睛的刺激。
[0016]所述PH值調(diào)節(jié)劑可選自鹽酸、硫酸、磷酸、枸櫞酸、酒石酸、乳酸、羥乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、硼酸、硼砂、磷酸二氫鹽、磷酸氫二鹽或其混合物。
[0017]本發(fā)明的滴眼制劑可以加或不加防腐劑。如需加防腐劑，將選對眼睛的刺激性較小防腐劑，可選自尼泊金類、苯甲酸類、山梨酸類、醇類、有機酸類、銨類防腐劑或其混合物。
[0018]本發(fā)明的治療干眼的外用滴眼制劑按本領域常規(guī)方法制備。
[0019]本發(fā)明的卵黃膜外層蛋白I可以延長小鼠和大鼠的淚膜破裂的時間，因此可以用于預防和治療干眼，具有廣闊的應用前景。
【具體實施方式】:
[0020]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0021]實施例1:
[0022]按下述組方配比制備治療干眼的外用滴眼制劑
[0023]以100mL計，VM01(其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1的51~659位所示，可以由Novoprotein公司購買到，其貨號為C650)0.75g、透明質(zhì)酸鈉0.3g、右旋糖酐-700.lg、左旋肉堿0.25g、硼酸0.7g、硼酸鈉0.2g、氯化鈉0.4g和氯化鉀0.04g。
[0024]A.將45ml純水和0.3g透明質(zhì)酸鈉攪拌溶解，120-130攝氏度加熱消毒30_60分鐘，制成溶液I ;
[0025] B.將45ml高壓消毒的純水和0.75g VMOU0.25g左旋肉堿、0.1g右旋糖酐_70以及硼酸、硼 酸鈉、氯化鈉、氯化鉀混合，攪拌均勻后經(jīng)0.45um、0.22um微孔濾膜過濾，制成溶液2 ；
[0026]C.將A和B步驟制作的溶液I和2混合直至均勻成一相，加入鹽酸或氫氧化鈉以調(diào)節(jié)酸堿度至5.20-8.35之間，加入氯化鈉或氯化鉀以調(diào)節(jié)滲透壓至295-309m0sm/l之間，用高壓消毒的純水將體積調(diào)至100ml，攪拌均勻后經(jīng)0.45um、0.22um微孔濾膜過濾，無菌灌裝，由此得到本實施例的治療干眼的外用滴眼制劑。
[0027]實施例2:
[0028]按下述組方配比制備治療干眼的外用滴眼制劑
[0029]以100mL計，VM010.3g、透明質(zhì)酸鈉0.3g、右旋糖酐-700.lg、左旋肉堿0.25g、硼酸0.7g、硼酸鈉0.2g、氯化鈉0.4g和氯化鉀0.04g。
[0030]A.將45ml純水和0.3g透明質(zhì)酸鈉攪拌溶解，120-130攝氏度加熱消毒30_60分鐘，制成溶液I ;
[0031]B.將45ml高壓消毒的純水和0.3g VMOU0.25g左旋肉堿、0.1g右旋糖酐-70以及硼酸、硼酸鈉、氯化鈉、氯化鉀混合，攪拌均勻后經(jīng)0.45um、0.22um微孔濾膜過濾，制成溶液2 ；
[0032]C.將A和B步驟制作的溶液I和2混合直至均勻成一相，加入鹽酸或氫氧化鈉以調(diào)節(jié)酸堿度至5.20-8.35之間，加入氯化鈉或氯化鉀以調(diào)節(jié)滲透壓至295-309m0sm/l之間，用高壓消毒的純水將體積調(diào)至100ml，攪拌均勻后經(jīng)0.45um、0.22um微孔濾膜過濾，無菌灌裝，由此得到本實施例的治療干眼的外用滴眼制劑。
[0033]實施例3:
[0034]含VMOl的治療干眼的外用滴眼制劑對C57小鼠淚膜破裂時間的影響。
[0035]具體方法:6-8周雌雄不限的C57小鼠240只，隨機分為2組。其中A組120只小鼠為對照組，B組120只小鼠為實驗組。所有小鼠只用右眼做實驗，左眼不作任何處理。A組小鼠用只含有終濃度為質(zhì)量分數(shù)0.25%的熒光素鈉的水溶液滴右眼，并在裂隙燈下觀察、記錄其淚膜破裂的時間。B組小鼠用含有終濃度為0.75ug/ul的VMOl和終濃度為0.25%的熒光素鈉的水溶液(其是在實施例1的治療干眼的外用滴眼制劑中添加熒光素鈉，熒光素鈉的含量為質(zhì)量分數(shù)0.25%)滴右眼，并在裂隙燈下觀察、記錄其淚膜破裂的時間。實驗采用盲法處理。
[0036]結果如表1所示，從表1可以看出實驗組與對照組小鼠淚膜破裂時間有統(tǒng)計學差異(P〈0.001)。即實驗組小鼠的淚膜破裂時間發(fā)生顯著改變。證實局部滴用含VMOl的滴眼液可以延長小鼠淚膜破裂的時間。
[0037]表1:對照組小鼠與實驗組小鼠的淚膜破裂時間的統(tǒng)計結果。
[0038]
【權利要求】
1.含卵黃膜外層蛋白I在制備治療干眼藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的含卵黃膜外層蛋白I的氨基酸序列，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1的51~659位所示。
3.一種治療干眼的外用滴眼制劑，其特征在于，含有有效量的含卵黃膜外層蛋白I和輔料。
4.根據(jù)權利要求3所述的外用滴眼制劑，其特征在于，所述的含卵黃膜外層蛋白I的氨基酸序列，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1的51~659位所示。
5.根據(jù)權利要求4所述的外用滴眼制劑，其特征在于，所述的卵黃膜外層蛋白1，其含量為每100mL滴眼制劑中含卵黃膜外層蛋白10.3~0.75g。
6.根據(jù)權利要求3所述的外用滴眼制劑，其特征在于，所述的輔料包括透明質(zhì)酸或其鹽、滲透壓調(diào)節(jié)劑和PH值調(diào)節(jié)劑。
7.根據(jù)權利要求6所述的外用滴眼制劑，其特征在于，所述的透明質(zhì)酸或其鹽占滴眼制劑總質(zhì)量的0.1-0.5%。
8.根據(jù)權利要求6所述的外用滴眼制劑，其特征在于，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑選自氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、甘露醇、聚乙二醇或其混合物。
9.根據(jù)權利要求6所述的外用滴眼制劑，其特征在于，所述PH值調(diào)節(jié)劑選自鹽酸、硫酸、磷酸、枸櫞酸、酒石酸、乳酸、羥乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、硼酸、硼砂、磷酸二氫鹽、磷酸氫二鹽或其混合物。
10.根據(jù)權利要求6所述的外用滴眼制劑，其特征在于，所述的外用滴眼制劑還含有防腐劑，所述的防腐劑選自尼泊金類、苯甲酸類、山梨酸類、醇類、有機酸類、銨類防腐劑或其混合物。
【文檔編號】A61K38/17GK103893742SQ201410075266
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月3日 優(yōu)先權日:2014年3月3日
【發(fā)明者】吳開力, 陳子沿, 王哲, 楊倩 申請人:中山大學中山眼科中心