胡蘆巴乙醇提取物在制備治療酒精性脂肪肝藥物、食品、保健品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供胡蘆巴乙醇提取物在制備治療酒精性脂肪肝藥物、食品、保健品中的應(yīng)用。本 申請人:研究表明，胡蘆巴可以保護(hù)肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，通過增強(qiáng)和酒精機(jī)體清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化作用的能力，改善脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對肝臟的損傷，發(fā)揮對酒精性脂肪肝損傷的治療作用。胡蘆巴對酒精性脂肪肝有一定治療作用，為研究胡蘆巴成為對抗AFL的食品、藥品或者保健品奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】胡蘆巴乙醇提取物在制備治療酒精性脂肪肝藥物、食品、保健品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于豆科【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及胡蘆巴乙醇提取物在制備治療酒精性脂肪肝藥物、食品、保健品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]胡蘆巴為豆科一年生草本植物，全株有香氣，花期4一6月，果期7—8月。在安徽、四川、河南等地多栽培。其主要功用為補(bǔ)腎陽，祛寒濕，治寒疝，腹脅脹滿，寒濕腳氣，腎虛腰酸，陽痿。目前尚未見將其用于制備治療酒精性脂肪肝藥物的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本 申請人:發(fā)現(xiàn),胡蘆巴乙醇提取物對酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver,簡稱AFL)有一定的治療作用，因此，本申請的發(fā)明目的在于提供胡蘆巴乙醇提取物在制備治療酒精性脂肪肝藥物、食品、保健品中的應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明提供一種胡蘆巴乙醇提取物的提取方法，是將胡蘆巴子粉碎后加入乙醇回流提取，過濾后將濾液濃縮，加熱蒸干收集浸膏，得到胡蘆巴乙醇提取物。
[0005]本發(fā)明的第二個目的是提供胡蘆巴乙醇提取物在制備治療酒精性脂肪肝藥物、食品、保健品中的應(yīng)用。
[0006]胡蘆巴乙醇提取物對酒精性脂肪肝具有一定的治療作用，可以將其作為有效成分來制備藥物、食品和保健品，本發(fā)明對制備的方法無特殊的要求，制備的方法采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法即可。
[0007]本發(fā)明的第三個目的是提供一種藥物，其有效成分為胡蘆巴乙醇提取物。
[0008]本發(fā)明的第四個目的是提供一種食品，其含有胡蘆巴乙醇提取物。
[0009]本發(fā)明的第五個目的是提供一種保健品，其有效成分為胡蘆巴乙醇提取物。
[0010]本發(fā)明的第六個目的是提供一種建立酒精性脂肪肝動物模型的方法，是將酒精灌胃與高脂飼料喂養(yǎng)相結(jié)合，并采用梯度增大酒精濃度的灌胃方式。
[0011]本發(fā)明通過酒精灌胃和高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合造模的方式，成功建立大鼠酒精性脂肪肝動物模型。采用白酒梯度逐漸增大酒精濃度的灌胃方式，實(shí)驗動物造模成功率升高，死亡率降低，酒精灌胃10周后觀察到大鼠肝正常結(jié)構(gòu)消失，干細(xì)胞放射狀結(jié)構(gòu)不明顯，肝竇消失，肝細(xì)胞及肝竇間出現(xiàn)大量的脂肪滴，血清中TC、TG、HDLC, LDLC, AST、ALT、TB明顯升高，造模成功，灌胃14周觀察到酒精性脂肪肝進(jìn)一步加重。
[0012]本 申請人: 研究表明，胡蘆巴可以保護(hù)肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，通過增強(qiáng)和酒精機(jī)體清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化作用的能力，改善脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對肝臟的損傷，發(fā)揮對酒精性脂肪肝損傷的治療作用。胡蘆巴對酒精性脂肪肝有一定治療作用，為研究胡蘆巴成為對抗AFL的食品、藥品或者保健品奠定了基礎(chǔ)?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0013]圖1為肝臟切片組織病理學(xué)檢查圖，其中，圖1a為正常對照組大鼠肝組織(HEX 100),圖1b為正常對照組大鼠肝組織(HEX400)，圖1c為模型組大鼠肝組織(HEX 100)，圖1d為模型組大鼠肝組織(HEX400)；
[0014]圖2為AFL模型組與正常對照組大鼠HI柱形比較圖；
[0015]圖3為AFL模型組與正常對照組大鼠血清TC、TG柱形比較圖；
[0016]圖4為AFL模型組與正常對照組大鼠血清HDL-C、LDL-C柱形比較圖；
[0017]圖5為AFL模型組與正常對照組大鼠肝臟TC、TG柱形比較圖；
[0018]圖6為AFL模型組與正常對照組大鼠血清ALT、AST活性比較柱形圖；
[0019]圖7為AFL模型組與正常對照組大鼠血清TB活性比較柱形圖；
[0020]圖8為各組大鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果圖；其中，圖8a為正常對照組大鼠肝組織(HEX100);圖813為正常對照組大鼠肝組織(HEX400)，圖Sc為標(biāo)準(zhǔn)組大鼠肝組織(HEX 100)，圖8d為標(biāo)準(zhǔn)組大鼠肝組織(HEX400)，圖Se為小劑量給藥組大鼠肝組織(HEX100)，圖8f為小劑量給藥組大鼠肝組織(HEX400)，圖8g為中劑量給藥組大鼠肝組織(HEX 100)，圖8h為中劑量給藥組大鼠肝組織(HEX400)，圖8i為大劑量給藥組大鼠肝組織(HEX 100)，圖8j 為大劑量給藥組大鼠肝組織(HEX400)，圖8k為陽性對照I組(水飛薊賓組)大鼠肝組織(HEX 100)，圖81為陽性對照2組(TFGs組)大鼠肝組織(HEX 100)；
[0021]圖9為胡蘆巴乙醇提取物對AFL大鼠HI影響效果柱形圖；
[0022]圖10為胡蘆巴乙醇提取物對AFL大鼠肝臟TC、TG影響效果柱形圖；
[0023]圖11為胡蘆巴乙醇提取物對AFL大鼠血清HDL-C、LDL-C影響效果柱形圖；
[0024]圖12為胡蘆巴乙醇提取物對AFL大鼠血清TC、TG影響效果柱形圖；其中圖12a為胡蘆巴乙醇提取物對AFL大鼠血清TC影響效果柱形圖，圖12b為胡蘆巴乙醇提取物對AFL大鼠血清TG影響效果柱形圖；
[0025]圖13為胡蘆巴乙醇提取物對AFL大鼠血清ALT、AST的影響效果柱形圖；
[0026]圖14為胡蘆巴乙醇提取物對AFL大鼠血清TBili的影響效果柱形圖；
[0027]圖15為胡蘆巴乙醇提取物對AFL大鼠SOD影響效果柱形圖；
[0028]圖16為胡蘆巴乙醇提取物對AFL大鼠AMPK影響效果柱形圖；
[0029]圖17為胡蘆巴乙醇提取物對AFL大鼠TNF- α影響效果柱形圖；
[0030]圖18為胡蘆巴乙醇提取物對AFL大鼠ADP影響效果柱形圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0032]I實(shí)驗材料
[0033]1.1 材料
[0034](I)胡蘆巴總皂苷(TFGS)干燥粉末:昌吉衛(wèi)生學(xué)校藥學(xué)組提供或通過2.1中的制備方法制備；
[0035](2)胡蘆巴乙醇提取物:昌吉衛(wèi)生學(xué)校藥學(xué)組提供或通過2.1中的制備方法制備；[0036](3)水飛薊賓膠囊(水林佳):批號:120701，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20040299，天津天士力制藥股份有限公司；
[0037](4)紅星二鍋頭白酒(56度V/V):北京鑫帝酒業(yè)開發(fā)有限公司出品；
[0038](5)豬油:市售；
[0039](6)膽固醇:上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號121125 ；
[0040](7)膽酸鈉:上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號121025 ；
[0041](8)丙基硫氧嘧啶:上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號121008 ；
[0042](9)蛋黃粉:廣州市食品工業(yè)研究所有限公司，批號2012070701 ；
[0043](10)甲醛溶液:成都市科龍化工試劑廠，批號20120619 ；
[0044](11)大鼠超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒:RB，批號:201301 ;
[0045](12)大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)試劑盒:RB，批號:201301 ;
[0046](13)大鼠腫瘤壞死因子α (TNF-α ) (ELISA)試劑盒:RB，批號:201301 ；
[0047](14)大鼠脂聯(lián)素(ADP) (ELISA)試劑盒:RB，批號:201301 ；
[0048](15)胡蘆巴子:新疆本草堂中藥飲片公司；產(chǎn)地:山東；批號1106801。
[0049]1.2 動物
[0050]實(shí)驗中使用的小鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心，為SPF級健康成年昆明種小鼠，共20只雌雄各半，體重在18 - 22g之間。實(shí)驗中使用的大鼠為SPF級健康成年SD大鼠，全部為雄性，105只，體重180±20g。實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號(清潔級)SYXK (新)2003 一
0001。
[0051]1.3 儀器
[0052](I) TGL — 16G型臺式離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器四廠；
[0053](2)高速組織勻衆(zhòng)機(jī):(Jintan Medical Instrument Factory)；
[0054](3)電子分析天平:北京賽多利斯；
[0055](4)酶標(biāo)儀:(BIO-RAD, Coda Automated EIA Analyzer);
[0056](5)恒溫式水浴鍋:(Jiangsu Jintan Medical Instrument Factory)；
[0057](6)全自動生化分析儀:邁瑞B(yǎng)S-320，深圳；
[0058](7)潤旋器(Shanghai the First Medical College Instrument Factory)；
[0059](8) -20 V 冰箱:AUCMA 公司生產(chǎn)；
[0060](9)低溫離 心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);
[0061](10)高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；
[0062](11)超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；
[0063](12)海爾-80°C冰箱(Haier Medical and Laboratory Products C0., Ltd)；
[0064](13)多功能提取濃縮機(jī)=DC-NSG型，上海達(dá)程實(shí)驗設(shè)備有限公司；
[0065](14)多級閃蒸器JMF-320A型，河南金鼎科技有限責(zé)任公司；
[0066](15)加熱板:T I1-1I薄層加熱器，上?？普苌邢挢?zé)任公司。
[0067]2實(shí)驗方法及實(shí)驗結(jié)果與分析
[0068]2.1胡蘆巴乙醇提取物和胡蘆巴總皂苷的制備
[0069]取胡蘆巴子5kg，粉碎成粗粉，置多功能提取濃縮機(jī)組中，加入60%(體積百分比)乙醇40kg，回流提取1-3小時，濃縮，得濃縮液約8000ml，過濾(六層紗布)，濾液分為兩份，各為 4000ml ο
[0070]取上述濾液3000_5000ml置多級閃蒸器濃縮，得濃縮液約1000ml。將濃縮液置方盤中，于加熱板上90°C加熱蒸干，收集浸膏，得胡蘆巴乙醇提取物，收率約12%。
[0071]將大孔樹脂用乙醇浸泡，濕發(fā)裝柱，用乙醇沖洗至流出液與水混合后不渾濁，將乙醇溶液回收，再將樹脂柱用水洗至無醇味，棄去流出液，得到處理后的大孔吸附樹脂柱。
[0072]取前述濾液3000-5000ml，通過上述經(jīng)過處理的大孔吸附樹脂柱(D101型，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號:201103017，5kg裝柱)，用0.5%Na0H溶液洗脫至近無色，棄洗脫液；樹脂柱再用水洗脫至近中性，棄洗脫液；樹脂柱再用20-40%乙醇洗脫至近無色，棄洗脫液；樹脂柱再用60-80%乙醇洗脫至無皂苷反應(yīng)，收集乙醇洗脫液，置多級閃蒸器濃縮，得濃縮液約1000ml，濃縮液置方盤中，于加熱板80-100°C加熱蒸干，收集浸膏，得胡蘆巴總皂苷提取物，收率約3%。
[0073]2.2胡蘆巴乙醇提取物最大耐受量的測定
[0074]有關(guān)資料顯示胡蘆巴無毒性，經(jīng)預(yù)實(shí)驗后胡蘆巴乙醇提取物最大濃度3g/ml，以小鼠灌胃容量0.4ml/20g計算，即以給藥量60g/kg為最大給藥劑量進(jìn)行最大耐受量實(shí)驗。
[0075]正式實(shí)驗:昆明種小鼠20只，雌雄各半，動物購買適應(yīng)性喂養(yǎng)3-5天，觀察無異常現(xiàn)象，按小鼠體重，給予胡蘆巴乙醇提取物60g/kg 一次性灌胃給藥，連續(xù)觀察7d。若無死亡，7d即可，若出現(xiàn)死亡觀察14d，計算死亡率，做半數(shù)致死量實(shí)驗。實(shí)驗結(jié)果:7d內(nèi)動物表現(xiàn)正常，無死亡，且動物體重有所增加，則認(rèn)為胡蘆巴乙醇提取物對動物的經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量大于60g/kg。
[0076]60g/kg粉末相當(dāng)于500g原胡蘆巴生藥材，因此,胡蘆巴的小鼠的最大耐受量大于500go
[0077]2.3大鼠酒精性脂肪肝病動物模型的建立、分組及給藥
[0078]SD大鼠105只適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為正常對照組、模型組。其中正常對照組12只，其余93只大鼠作為模型組。造模方法參照張偉、馬麗(張偉，大鼠酒精性脂肪肝模型的建立[J].安徽醫(yī)藥，2012，16(7):885-887。馬麗，高玉杰，錢月慧等.丹葛解酲湯對大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21 (7): 1596-1597。)等，模型組喂以10% (質(zhì)量百分比)的高脂飼料，并在第I周按照lml/100g灌胃，其中每ml中含體積百分比為30%的紅星二鍋頭白酒，剩余70%為水；第2周按照lml/100g灌胃40%紅星二鍋頭白酒，從第3周開始按照lml/100g用50%紅星二鍋頭白酒灌胃至第10周，每天早上灌胃一次。正常對照組灌胃相同體積生理鹽水。10周后模型組隨機(jī)取6只大鼠處死，取血分離血清測定血脂四項、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，總膽紅素(TB)，并取肝臟進(jìn)行組織病理學(xué)檢查造模是否成功。
[0079]酒精灌胃方式建立大鼠酒精性脂肪肝病模型死亡率較高為25-35%，但采用濃度梯度酒精灌胃方式建立模型，可有效減少動物死亡率減少至多少15-20%。因此，可通過梯度酒精灌胃方式減少 造模死亡率。
[0080]2.4實(shí)驗動物的觀察及處理
[0081]每日在灌胃前后對小鼠進(jìn)行觀察并記錄，記錄內(nèi)容包括大鼠精神狀態(tài)、活動及反應(yīng)狀況、飲食飲水狀況、皮毛變化、糞便情況等，并每周一次定時給大鼠稱量體重。14周后大鼠的處理:處理前需要禁食12h，提前2h再給次藥，麻醉劑選用10%水合氯醛(0.4ml/100g)麻醉動物，采集、分離與保存血液:腹主動脈真空無菌采血，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，分離血清，血清凍存于-80°C冰箱內(nèi)。肝臟的采集與處理:迅速剝離動物肝臟，仔細(xì)去除周圍結(jié)締組織，用濾紙吸干，稱取肝臟新鮮重量，分割肝臟右葉距邊緣Icm的組織塊浸泡于10%甲醛中，用于做切片，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，剩余肝臟組織迅速置于液氮中，以免酶的破壞，后轉(zhuǎn)入-80 V冰箱內(nèi)凍存，備用。
[0082]大鼠臟器系數(shù)和檢測指標(biāo)均采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(I 表示，采用SPSS18.0(PASW
Statistics)統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。數(shù)據(jù)資料進(jìn)行多樣本資料均數(shù)兩兩比較(Dunnett-t 檢驗)的方差分析，α =0.05 和 α =0.01。
[0083]2.5 大鼠肝指數(shù)(Hepatielndex, HI)測定
[0084]采用公式計算H1:肝臟重量(g)/大鼠體重(g) X 100%作為大鼠肝指數(shù)。
[0085]AFL模型組大鼠肝臟HI與正常對照組大鼠比較顯著升高(P〈0.01)，這與觀察到的AFL模型組大鼠肝臟腫大現(xiàn)象一致。具體數(shù)值參見表1和圖2。
[0086]表1AFL模型組與正常對照組大鼠HI比較(Λ ± S )
[0087]
【權(quán)利要求】
1.胡蘆巴乙醇提取物的提取方法，是將胡蘆巴子粉碎后加入乙醇回流提取，過濾后將濾液濃縮，加熱蒸干收集浸膏，得到胡蘆巴乙醇提取物。
2.胡蘆巴乙醇提取物在制備治療酒精性脂肪肝藥物、食品、保健品中的應(yīng)用。
3.一種藥物，其有效成分為胡蘆巴乙醇提取物。
4.一種食品，其含有胡蘆巴乙醇提取物。
5.一種保健品，其有效成分為胡蘆巴乙醇提取物。
6.一種建立酒精性脂肪肝動物模型的方法，是將酒精灌胃與高脂飼料喂養(yǎng)相結(jié)合，并采用梯度增大酒精濃 度的灌胃方式。
【文檔編號】A61P39/06GK104000867SQ201410075464
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年3月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月3日
【發(fā)明者】李琳琳, 毛新民, 楊衛(wèi)星, 孫國棟, 李新霞, 伊永進(jìn), 駱新, 陶義存, 王燁 申請人:新疆醫(yī)科大學(xué)