類葉升麻苷在制備保護(hù)對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起損傷的腦神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及類葉升麻苷在制備保護(hù)腦神經(jīng)的藥物應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種類葉升麻苷在制備保護(hù)對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起損傷的腦神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次提出類葉升麻苷作用于谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體而起到保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞的作用，類葉升麻苷能夠顯著提高學(xué)習(xí)記憶能力，提高了SOD活性，提高了神經(jīng)細(xì)胞的EAAT2mRNA轉(zhuǎn)錄水平，提高了腦神經(jīng)細(xì)胞的EAAT2基因的表達(dá)水平，表明類葉升麻苷對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起的腦神經(jīng)細(xì)胞損傷具有顯著保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與EAAT2基因表達(dá)水平的上調(diào)有關(guān)，由此為尋找新型和有效的慢性神經(jīng)退行性疾病的治療藥物具有重要意義。
【專利說明】類葉升麻苷在制備保護(hù)對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起損傷的腦神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及類葉升麻苷在制備保護(hù)腦神經(jīng)的藥物應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種類葉升麻苷在制備保護(hù)對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起損傷的腦神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與突觸傳遞，其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)成記憶和認(rèn)知的基礎(chǔ)，其是學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的重要神經(jīng)遞質(zhì)。在腦組織內(nèi)含有大量的谷氨酸，正常情況下，大部分存在于細(xì)胞內(nèi)，僅少數(shù)存在于細(xì)胞間隙，跨膜濃度梯度大約是幾千倍。由于胞外沒有谷氨酸代謝酶，因而使谷氨酸在神經(jīng)系統(tǒng)滅活的唯一途徑是通過神經(jīng)細(xì)胞的吸收和再攝取，其中起主要作用的是谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。谷氨酸攝取是借助谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，利用跨膜電化學(xué)梯度作為驅(qū)動(dòng)力進(jìn)行的，其攝取速率很高。然而，一旦谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能受損導(dǎo)致對(duì)谷氨酸攝取抑制，幾秒之內(nèi)就會(huì)引起突觸間隙或胞外谷氨酸大量積聚，過度激活谷氨酸受體，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。因而，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能正常與否對(duì)于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能具有重要意義。目前研究表明，谷氨酸攝取功能障礙與肌萎縮性側(cè)束硬化癥(ALS )、阿爾茨海默病(AD )、帕金森病(PD )等退行性疾病的發(fā)病有關(guān)。因此，研究谷氨酸神經(jīng)細(xì)胞損傷的干預(yù)及其分子機(jī)制是目前國內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)之一，特別是對(duì)于尋找有效的腦損傷干預(yù)藥物有著重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
[0003]類葉升麻苷(Acteoside)為苯乙醇苷類化合物，目前已在100余種植物中分離獲得類葉升麻苷。近年來的研究表明，類葉升麻苷具有抗氧化、抑制前列腺增生、肝損傷保護(hù)、補(bǔ)腎壯陽、抑制骨質(zhì)增生、抗疲勞、增強(qiáng)免疫、DNA損傷修復(fù)以及神經(jīng)保護(hù)作用等多種生理活性，尤其是其腦神經(jīng)保護(hù)方面的作用最為引人關(guān)注，目前已公開文獻(xiàn)報(bào)道的腦神經(jīng)保護(hù)作用靶點(diǎn)如下:` I)通過對(duì)膽堿酯酶的抑制作用(樸景華，蒲小平，馬建等.類葉升麻苷對(duì)東莨菪堿所致記憶獲得性障礙的改善作用.中國藥理學(xué)通報(bào)，2001，17(6):625-627 ; Ki Yong Lee, EunJu Jeongj Heum-Sook Lee, et al.Acteoside of Callicarpa dichotoma AttenuatesScopolamine-1nduced Memory Impairments.Biol.Pharm.Bull.2006，29 (I):71-74.)。
[0004])通過對(duì)氧自由基引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡的抑制作用(NguyenXNj Phan VKjChau VM.Phenylpropanoid glycosides from heterosmilax erythrantha and theirantioxidant activity.Arch Pharm Res，2009，32(10):1373-1377 ; Wen FCj Lie CL,Chieh FC.Acteoside protects endothelisl cells against fress radical-1nducedoxidative stress.J Pharm Pharmacol, 2004，56(6): 743-748 ;彭曉明，高莉，甘萍等.類葉升麻苷抗H202誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，中藥藥理與臨床，2013，29(3):35-38)0
[0005])通過對(duì)谷氨酸引起的Ca+內(nèi)流，NO和活性氧過度生成的抑制作用(KyungAhKooj Seung Hyun Kimj Tae Hwan Ohj et al.Acteoside and its aglycones protectprimary cultures of rat cortical cells from glutamate-1nduced excitotoxicity.Life sciences, 2006, 79:709-716)。
[0006])通過對(duì)神經(jīng)元凋亡的抑制作用(GuoQS, Jin RZ, Xiao PP, et al.Protective effect of verbascoside on 1-methyl-4-phenylpyridinium ion-1nducedneurotoxicity in PC12 cells.Eur J of Pharmacol, 2002, 451 (2): 119-124 ;楊芳艷，蒲小平.類葉升麻苷對(duì)魚藤酮致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，中國藥理學(xué)通報(bào)，2006,22(2): 159-164)。
[0007]以上研究表明，類葉升麻苷主要通過抑制膽堿酯酶活性、抗氧化、抑制谷氨酸以及抗凋亡等作用以保護(hù)腦神經(jīng)，但是迄今為止，尚未見有其通過作用于谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體從而保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供了一種類葉升麻苷在制備保護(hù)對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起損傷的腦神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明首次提出類葉升麻苷作用于谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體而起到保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞的作用。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的:一種類葉升麻苷在制備保護(hù)對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起損傷的腦神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
[0010]下面是對(duì)上述發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn):
上述類葉升麻苷可以干品重量計(jì)，類葉升麻苷的含量為90%至99.9%。
[0011]上述類葉升麻苷可為從植物中提取的類葉升麻苷或者通過合成得到的類葉升麻苷。
[0012]本發(fā)明首次提出類葉升麻苷作用于谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體而起到保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞的作用，類葉升麻苷能夠顯著改善L-trans`-PDC誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，提高了細(xì)胞存活率，抑制了 Glu、LDH、MDA和ROS的生成，能夠顯著提高學(xué)習(xí)記憶能力，提高了 SOD活性，提高了神經(jīng)細(xì)胞的EAAT2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，提高了腦神經(jīng)細(xì)胞的EAAT2基因的表達(dá)水平，表明類葉升麻苷對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起的腦神經(jīng)細(xì)胞損傷具有顯著保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與EAAT2基因表達(dá)水平的上調(diào)有關(guān)，由此為尋找新型和有效的慢性神經(jīng)退行性疾病的治療藥物具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]附圖1為正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組的PC12細(xì)胞形態(tài)的顯微鏡圖。
[0014]附圖2為正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組的PC12細(xì)胞凋亡圖。
[0015]附圖3為正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組的PC12細(xì)胞EAAT2基因轉(zhuǎn)錄水平的電泳圖。
[0016]附圖4為正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組的SD大鼠的軌跡路線圖。
[0017]附圖5為正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組的SD大鼠的EAAT2基因表達(dá)的蛋白雜交圖。
[0018]附圖6為類葉升麻苷的結(jié)構(gòu)式。【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實(shí)際情況來確定具體的實(shí)施方式。
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述:
實(shí)施例1:類葉升麻苷在制備保護(hù)對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起損傷的腦神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。類葉升麻苷的結(jié)構(gòu)式如圖6所示。
[0021]實(shí)施例2:與上述實(shí)施例的不同之處在于，類葉升麻苷以干品重量計(jì)，類葉升麻苷的含量為90%至99.9%、
實(shí)施例3:與上述實(shí)施例的不同之處在于，類葉升麻苷為從植物中提取的類葉升麻苷或者通過合成得到的類葉升麻苷。
[0022]下面為根據(jù)本發(fā)明中上述實(shí)施例的類葉升麻苷在制備保護(hù)對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起損傷的腦神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用的具體藥理試驗(yàn):
一.類葉升麻苷對(duì)L-trans-PDC所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 I試驗(yàn)材料
類葉升麻苷(AS)，純度≥90%,RPMI1640培養(yǎng)基為GIBCO的產(chǎn)品，胎牛血清為Hyclone的產(chǎn)品，L-反式-吡咯烷-2，4- 二羧酸(L-trans-PDC)、氨芐青霉素鈉和硫酸鏈霉素均購自sigma公司，Rat ROS Elisa Kit購自R&D公司，谷氨酸(Glu)測試盒、乳酸脫氫酶(LDH)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、BCA蛋白含量測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，其余在試驗(yàn)過程中使用到的試劑均為分析純。GAPDH引物:上游 5’- GAC CAC AGT CCA TGC CAT CAC _3’，下游 5’- TGA GGT CCA CCA CCC TGTTGC -3，;EAAT2 引物:上游 5’- GGG TCA TCC TGG ATG GAG GTC-3’，下游 5’- CGT GTC GTCATA AAC GGA CTG-3’ ；以上引物由上海生工生物工程有限公司合成。細(xì)胞株:PC12細(xì)胞購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。
[0023]細(xì)胞的培養(yǎng)方法
將PC12細(xì)胞以5X IO5個(gè)/ml接種于含有10%胎牛血清、0.llg/L丙酮酸鈉、2.5g/L葡萄糖、1.5g/L的NaHCO3、100U/ml的氨芐青霉素鈉和100U/ml的硫酸鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，并將RPMI1640培養(yǎng)基放置于溫度為37°C和體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3天換一次液。
[0024]細(xì)胞損傷模型(模型對(duì)照組)的建立以及正常組、類葉升麻苷給藥組(AS組)的建立 當(dāng)培養(yǎng)瓶中PC12細(xì)胞的融合率達(dá)到80%左右時(shí)，用0.25%胰酶消化PC12細(xì)胞，調(diào)節(jié)
RPMI1640培養(yǎng)基中細(xì)胞密度至5X IO4個(gè)/ml，以100 μ I/孔鋪至96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48h后將PC12細(xì)胞分為三組，第一組為正常組，第二組用100 μ M/L的L-trans-PDC進(jìn)行誘導(dǎo)，將經(jīng)過24h的L-trans-PDC誘導(dǎo)并吸棄培養(yǎng)液后建立模型對(duì)照組，第三組用100 μ M/L的L-trans-PDC進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)過24h的誘導(dǎo)后，吸棄培養(yǎng)液，接著以類葉升麻苷為藥物進(jìn)行給藥并建立類葉升麻苷給藥組，類葉升麻苷給藥組的3個(gè)給藥濃度分別為:0.1 μ M/L、10 μ M/L、1000 μ M/L,給藥作用48h后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，將正常組和模型對(duì)照組加入至無血清RPMI1640培養(yǎng)基中，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組的PC12細(xì)胞形態(tài)的顯微鏡圖(局部200X)如圖1所示，在圖1中，A為正常組的顯微鏡圖，B為模型對(duì)照組的顯微鏡圖，C為給藥濃度為0.1 μ M/L的AS組的顯微鏡圖，D為給藥濃度為10 μ M/L的AS組的顯微鏡圖，E為給藥濃度為1000 μ M/L的AS組的
顯微鏡圖。
[0025]噻唑藍(lán)(MTT)法測定PC12細(xì)胞的存活率
向培養(yǎng)正常組和模型對(duì)照組P C12細(xì)胞的無血清RPM116 4 O培養(yǎng)基中均加入MT T，培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)液，然后，加入DMSO震蕩溶解后，接著于Multiskan Go 1510酶標(biāo)儀測定490nm處吸光度值，并計(jì)算正常組和模型對(duì)照組的細(xì)胞存活率，向中經(jīng)過48h后的類葉升麻苷給藥組的培養(yǎng)基中加入MTT，培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)液，然后，加入DMSO震蕩溶解后，接著于Multiskan Go 1510酶標(biāo)儀測定490nm處吸光度值,并計(jì)算類葉升麻苷給藥組的細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=A /A正常組X 100%，其中A為吸光度值，正常組的細(xì)胞存活率記作100%。正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組的細(xì)胞存活率如表1所示。
[0026]細(xì)胞上清液中Glu含量、LDH活性、MDA含量和SOD活性的測定
細(xì)胞外Glu的含量水平是反映細(xì)胞毒性及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體受損程度的重要指標(biāo)，LDH的測定客觀的衡量細(xì)胞的受損程度，SOD在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標(biāo)，通過測定MDA含量、SOD活性不僅可反映神經(jīng)細(xì)胞損傷的原因，而且還可以判斷細(xì)胞損傷的程度。
[0027]分別收集正常組、經(jīng)過L-trans-PDC誘導(dǎo)一定時(shí)間后的模型對(duì)照組和經(jīng)過類葉升麻苷作用一定時(shí)間后的類葉升麻苷給藥組的PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清液40 μ 1，根據(jù)Glu、LDH、MDA,SOD試劑盒說明書測定正常組、模型對(duì)照組和類葉升麻苷給藥組的培養(yǎng)液中Glu含量、LDH活性、MDA含量和SOD活性。正常組、模型對(duì)照組(模型組)、類葉升麻苷給藥組的Glu含量、LDH活性、MDA含量和SOD活性如表1所示。
[0028]細(xì)胞內(nèi)活性氧簇`(ROS)的測定
分別吸取正常組、模型對(duì)照組和類葉升麻苷給藥組的PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清液，向正常組、模型對(duì)照組和類葉升麻苷給藥組的PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清液中均加入50 μ I PBS (pH為7.2-7.4)，然后，以上加入50 μ I PBS的三組PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清液在溫度為-80°C的冰箱中反復(fù)凍融，以使細(xì)胞裂解，接著，在轉(zhuǎn)速為2000rpm的條件下離心15min，收集正常組、模型對(duì)照組和類葉升麻苷給藥組的PC12細(xì)胞的上清液用于測定蛋白濃度及ROS含量，ROS的測定依據(jù)下述方法進(jìn)行:參照ROS試劑盒說明書，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品并在酶標(biāo)包被板上設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔15孔，空白孔3個(gè)，在Elisa板的空白孔和測定孔中分別加入40 μ I樣品稀釋液，然后吸取測定樣品10 μ I加入到待測孔，封膜板封板置于37°C溫育30min，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干，然后，每孔加入50 μ I酶標(biāo)試劑(空白孔除外)，37°C溫育30min、洗滌液洗滌5次，拍干，每孔加入50 μ I顯色劑A和50 u I顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色15min，每孔加終止液50 μ I后，450nm測定吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算線性回歸方程，由線性回歸方程得出各組測定樣品中的ROS濃度C，然后計(jì)算各組樣品中實(shí)際ROS濃度。實(shí)際ROS濃度=C (IU/ml)X稀釋倍數(shù)/待測樣本蛋白濃度(mgprot/ml)。正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組的ROS含量如表2所示。
[0029]細(xì)胞的早期凋亡比率的檢測
將正常組、模型對(duì)照組和類葉升麻苷給藥組中的PC12細(xì)胞依序經(jīng)過0.25%胰酶消化和棄去消化液后，向各組中加如Hank’ s液，用吸管將PC12細(xì)胞自瓶壁上輕輕吹打下來，并移入離心管中，在轉(zhuǎn)速為800-1000rpm的條件下離心5min,棄上清液,用IX結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X IO6個(gè)/ml。取100μ I細(xì)胞懸液，加入5μ I FITC標(biāo)記的AnnexinV和10 μ I PI溶液。輕輕混勻，室溫避光染色20min。加入I X結(jié)合緩沖液400 μ 1，混勻，于BD FACS Aria II流式細(xì)胞儀測定各組的細(xì)胞早期凋亡比率，正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組的PC12細(xì)胞的早期凋亡比率如表2所示，正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組的PC12細(xì)胞凋亡圖如圖2所示，在圖2中的五個(gè)小圖中，從左至右，依序排列:正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組(0.1 μ M/L)、類葉升麻苷給藥組(10 μ M/L)、類葉升麻苷給藥組(ΙΟΟΟμΜ/L)。
[0030]細(xì)胞的ΕΑΑΤ2基因轉(zhuǎn)錄水平的測定
ΕΑΑΤ2是人腦內(nèi)興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體中最重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其功能紊亂或表達(dá)降低能夠顯著影響谷氨酸的再攝取，導(dǎo)致谷氨酸在胞外積聚及神經(jīng)死亡。
[0031]將正常組、模型對(duì)照組和類葉升麻苷給藥組的PC12細(xì)胞根據(jù)TRIpure LS Reagent總RNA抽提試劑說明書，提取PC12細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度，并將各組RNA濃度調(diào)節(jié)一致，按TIANScript RT Kit TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR，PCR反應(yīng)條件為:94°C 5min,94°C 30s, 55°C 45 s, 72°C 45s, 30 個(gè)循環(huán)后 72°C延伸 10 min，然后冷卻至4°C，吸取IOml PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外透射儀下觀察結(jié)果并拍照，并計(jì)算EAAT2/GAPDH比值，并計(jì)算各個(gè)組的EEAT2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，均以EAAT2^SS/GAPDH|SS比值表示，正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組的EEAT2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄水平如表3所示，正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組的PC12細(xì)胞EAAT2基因轉(zhuǎn)錄水平的電泳圖如圖3所示，在圖3中，1-2代表正常組，3-4代表模型對(duì)照組，5-6代表類葉升麻苷給藥組(0.1 μ M/L), 7-8代表類葉升麻苷給藥組(10 μ M/L), 9-10代表類葉升麻苷給藥組(1000 μM/L)。
[0032]結(jié)果討論與分析` (I)對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響
由圖1可以看出，正常組中的PC12細(xì)胞的輪廓層次較分明，細(xì)胞立體感及折光性較強(qiáng)，細(xì)胞突觸明顯且較多，細(xì)胞數(shù)量也較多，而模型對(duì)照組的PC12細(xì)胞的細(xì)胞輪廓層次較差，神經(jīng)元胞體表面粗糙，且細(xì)胞突觸減少，相對(duì)于模型對(duì)照組而言，類葉升麻苷給藥組中各個(gè)不同給藥劑量小組的PC12細(xì)胞的立體感、折光性增強(qiáng)，細(xì)胞突起增多并交織成網(wǎng)狀，胞漿內(nèi)顆粒物減少，退化死亡的PC12細(xì)胞明顯減少，不同濃度的類葉升麻苷對(duì)PC12細(xì)胞都有一定程度保護(hù)作用，且保護(hù)強(qiáng)度呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。
[0033](2)對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率、Glu含量、LDH活性、MDA含量和SOD活性的影響 如表1所示，利用100 μ M/L的L-trans-PDC誘導(dǎo)PC12細(xì)胞24h后的模型對(duì)照組的細(xì)胞
存活率和SOD活性相對(duì)于正常組的細(xì)胞存活率和SOD活性明顯降低，模型對(duì)照組的LDH活性、谷氨酸含量和MDA含量顯著升高，表明L-trans-PDC致PC12細(xì)胞損傷模型誘導(dǎo)成功，而經(jīng)過濃度為0.1 μ M/L、10 μ M/L和1000 μ M/L的類葉升麻苷作用48h后的類葉升麻苷給藥組，相對(duì)于模型對(duì)照組而言，類葉升麻苷給藥組能顯著提高PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率和SOD活性，抑制LDH活性、谷氨酸和MDA的生成，并且隨著類葉升麻苷給藥濃度的增大，PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率和SOD活性隨之提高，LDH活性降低，谷氨酸含量和MDA含量隨之下降。
[0034](3)對(duì)PC12細(xì)胞的ROS含量和早期凋亡比率的影響由表2中的數(shù)據(jù)以及圖2可以看出，模型對(duì)照組相對(duì)于正常組而言，模型對(duì)照組的ROS含量大于正常組的ROS含量，說明模型對(duì)照組中的PC12細(xì)胞在L-trans-PDC影響下，PC12細(xì)胞受到高濃度的谷氨酸攻擊，胞內(nèi)ROS大量聚集，類葉升麻苷給藥組相對(duì)于模型對(duì)照組而言，類葉升麻苷給藥組的ROS含量低于模型對(duì)照組的ROS含量，并且可以看出，類葉升麻苷給藥組的ROS含量隨著類葉升麻苷的給藥濃度的增加而降低，說明類葉升麻苷對(duì)ROS含量具有抑制的作用，通過早期凋亡細(xì)胞比率數(shù)據(jù)可以看出，模型對(duì)照組的早期凋亡細(xì)胞比率大于正常組的早期凋亡細(xì)胞比率，類葉升麻苷給藥組的早期凋亡細(xì)胞比率小于模型對(duì)照組的早期凋亡細(xì)胞比率，并且類葉升麻苷給藥組的早期凋亡細(xì)胞比率隨著類葉升麻苷給藥濃度的增加而降低，說明類葉升麻苷能夠降低損傷的PC12細(xì)胞的早期凋亡細(xì)胞比率，類葉升麻苷作用48h后，早期凋亡細(xì)胞比率下降至20.83%、18.97%和15.75%，并具有顯著差異。
[0035](4)對(duì)PC12細(xì)胞EAAT2轉(zhuǎn)錄水平的影響
從表3可以看出，與正常組比較，模型對(duì)照組的EAAT2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，類葉升麻苷給藥組相對(duì)于模型對(duì)照組而言，類葉升麻苷給藥組的EAAT2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平得到提高，并且隨著類葉升麻苷給藥組的給藥濃度的增加，EAAT2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)上調(diào)趨勢，說明類葉升麻苷能夠提高受損神經(jīng)細(xì)胞的EAAT2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
[0036]小結(jié)
類葉升麻苷能夠顯著改善L-trans-PDC誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，提高了 PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率，抑制了 PC12細(xì)胞中的Glu、LDH、MDA和ROS的生成，提高了 SOD活性和EAAT2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，表明類葉升麻苷對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與EAAT2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)有關(guān)。
[0037]二、類葉升麻苷對(duì)L-trans-PDC所致大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 1.試驗(yàn)材料
類葉升麻苷(AS)，純度> 90% ;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF清潔級(jí)SD大鼠50只，雌性，體重為250±20g，由新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK (新)2003-0002 ；EAAT2 (一抗)、β -Tubulin (一抗)、二抗均為Millipore公司的產(chǎn)品；L-反式-批咯燒-2, 4- 二羧酸(L-trans-PDC)購自 sigma 公司；western Breeze chromogenicimmunodetection system購自Invitrogen公司；超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、BCA蛋白含量測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。
[0038].谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取障礙模型(模型對(duì)照組)的建立以及正常組、類葉升麻苷給藥組(AS組)的建立
50只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型對(duì)照組和類葉升麻苷給藥組，類葉升麻苷給藥組依據(jù)類葉升麻苷的給藥量分為三個(gè)給藥小組，正常組、模型對(duì)照組SD大鼠的數(shù)量均為10只，三個(gè)給藥小組的的SD大鼠的數(shù)量均為10只，50只SD大鼠均用戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位以上，50只SD大鼠顱頂正中切開暴露至顱骨，根據(jù)SD大鼠盧頁腦立體定位圖譜，對(duì)基底右腦定位(前鹵后0.8mm,右側(cè)旁開中線1.5mm,深度3mm),用牙科鉆鉆開顱骨，正常組用微量進(jìn)樣器向大鼠右側(cè)腦室注射5μ I的生理鹽水，其余各組注射等量的采用生理鹽水溶解的2mg/ml的L-trans-PDC，注射完畢后以局部軟組織封閉針孔，縫合皮膚，術(shù)后給予青霉素鈉 5U肌注(除正常組外)，每天I次，連續(xù)3天，然后，對(duì)正常組和模型對(duì)照組的SD大鼠灌胃生理鹽水，同時(shí)，對(duì)類葉升麻苷組的三個(gè)給藥小組進(jìn)行給藥，給藥劑量分別為5mg/kg、50mg/kg、500mg/kg, I次/天,連續(xù)灌胃30天。
[0039].Morris水迷宮測試
在正常組和模型對(duì)照組灌胃生理鹽水第25天開始進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，在類葉升麻苷給藥組中各組SD大鼠給藥后第25天開始進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)主要包括定位巡航實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。
[0040]定位巡航實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)前讓每只SD大鼠在安全平臺(tái)上站15s，然后將其頭朝下背對(duì)水池壁依次從東北、東南、西南、西北(NE、SE、SW、NW) 4個(gè)象限投入水中，游泳時(shí)間設(shè)定為120s,記錄大鼠進(jìn)駐平臺(tái)所需時(shí)間(大鼠找到平臺(tái)并滯留其上5s為成功進(jìn)駐)為逃避潛伏時(shí)間(escape latency, ST)。如在120s內(nèi)大鼠不能成功進(jìn)駐平臺(tái)，貝U實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)并強(qiáng)制其停留15s，照此方法，連續(xù)5天。正常組、模型對(duì)照組和類葉升麻苷給藥組在定位巡航實(shí)驗(yàn)中的潛伏期(S)和尋求次數(shù)如表4所示。
[0041]空間探索實(shí)驗(yàn):第6天，將各組的SD大鼠從一固定象限(NW)投入水池中，記錄SD大鼠120s內(nèi)在原平臺(tái)象限的游泳時(shí)間和游泳軌跡，計(jì)算大鼠穿越原安全平臺(tái)所在位置的次數(shù)(穿臺(tái)次數(shù))及各象限游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比(原平臺(tái)象限比)。正常組、模型對(duì)照組和類葉升麻苷給藥組的穿臺(tái)次數(shù)和原平臺(tái)象限比如表4所示。正常組、模型對(duì)照組(模型組)、類葉升麻苷給藥組的SD大鼠的軌跡路線圖如圖4所示，在圖4中，A為正常組SD大鼠的軌跡路線，B為模型對(duì)照組SD大鼠的軌跡路線，C、D、E分別為給藥量為5mg/kg、50mg/kg、500mg/kg的類葉升麻苷給藥組SD大鼠的軌跡路線。
[0042].對(duì)SD大鼠海馬組織中MDA含量、SOD活性的影響
在正常組、模型對(duì)照組和類葉升麻苷給藥組的SD大鼠完成Morris水迷宮測試并且各組完成相應(yīng)的灌胃生理鹽水或類葉升麻苷給藥后，每組取5只SD大鼠尾靜脈注射1%硫噴妥鈉(40mg.kg-1)麻醉,迅速`斷頭,冰上取腦，于前鹵后2.3mm至前鹵后6.3mm處剝離出海馬，加入9倍的生理鹽水勻漿并離心，吸取組織勻漿上清液用于MDA含量和SOD活性的測定，MDA含量和SOD活性的測定方法均參照南京建成生物研究所的MDA測定試劑盒和SOD活性測定試劑盒上的說明書進(jìn)行。正常組、模型對(duì)照組和類葉升麻苷給藥組的MDA含量和SOD活性的測定結(jié)果如表5所示。
[0043].對(duì)大鼠海馬組織中EAAT2基因表達(dá)水平的影響
在正常組、模型對(duì)照組和類葉升麻苷給藥組的SD大鼠完成Morris水迷宮測試并且各組完成相應(yīng)的灌胃生理鹽水或類葉升麻苷給藥后，每組另取5只大鼠，分離海馬組織，加入蛋白提取試劑，冰上勻漿并離心，吸取蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。然后，將各組蛋白濃度調(diào)整一致，SDS-PAGE電泳，半干式轉(zhuǎn)膜。利用western Breeze chromogenicimmunodetection system進(jìn)行western blot (蛋白質(zhì)印跡法),然后封閉液封閉、加入一抗、洗滌、加入二抗孵育、顯影，室溫晾干PVDF膜后，于凝膠成像系統(tǒng)拍照，進(jìn)行目的條帶的灰度值分析，并計(jì)算各組的EEAT2基因表達(dá)水平，均以EAAT2#SS/ β -Tubulin比值表示，正常組、模型對(duì)照組和類葉升麻苷給藥組的EAAT2基因表達(dá)水平如表6所示，正常組、模型對(duì)照組、類葉升麻苷給藥組的SD大鼠的EAAT2基因表達(dá)的蛋白雜交圖如圖5所示，在圖5 中，1-2 為 AS 組(5mg/kg)，3-4 為 AS 組(50mg/kg ),5-6 % AS 組(500mg/kg)，7-8 為正常組，9-10為模型模型對(duì)照組。
[0044]結(jié)果討論與分析(I)SD大鼠在Morris水迷宮中游泳的路線軌跡
從圖4可以看出，正常組的SD大鼠的軌跡路線呈趨向式，說明正常組的SD大鼠具有一定的學(xué)習(xí)記憶能力；模型對(duì)照組的SD大鼠的軌跡路線呈隨機(jī)式，說明模型對(duì)照組的SD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降；類葉升麻苷給藥組的SD大鼠的軌跡路線呈趨向式，說明類葉升麻苷給藥組的SD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力相對(duì)于模型對(duì)照組的SD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有所上升。
[0045](2) SD大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績
由表4可見，模型對(duì)照組的潛伏期相對(duì)于正常組的潛伏期變長，說明模型對(duì)照組SD大鼠的學(xué)習(xí)記憶行為能力下降，穿臺(tái)次數(shù)也較低，而類葉升麻苷給藥組的潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)增加而明顯縮短，穿臺(tái)次數(shù)顯著升高(P < 0.05)，類葉升麻苷對(duì)SD大鼠的受損大腦具有一定程度的保護(hù)作用。
[0046](3)對(duì)SD大鼠海馬組織中MDA含量和SOD的影響
從表5可以看出，相對(duì)于正常組而言，模型對(duì)照組的SD大鼠腦勻漿中SOD活性下降，MDA含量升高，類葉升麻苷給藥組相對(duì)于模型對(duì)照組而言，類葉升麻苷給藥組的SOD活性升高，MDA含量下降，同時(shí)可以看出，在類葉升麻苷給藥組中，隨著類葉升麻苷的給藥量的增加，MDA呈下降的趨勢，SOD活性呈上升的趨勢，說明類葉升麻苷能夠顯著抑制大鼠海馬組織中MDA含量的升高，提高SOD的活性。
[0047](4)對(duì)SD大鼠海馬組織EAAT2基因表達(dá)的影響
由表6的數(shù)據(jù)可知，相對(duì)于正常組而言，模型對(duì)照組的EAAT2基因表達(dá)水平下降，類葉升麻苷給藥組相對(duì)于模型對(duì)照 組而言，類葉升麻苷給藥組的EAAT2基因表達(dá)水平上升，并且，EAAT2基因表達(dá)水平隨著類葉升麻苷給藥組的給藥劑量的增加而呈上調(diào)的趨勢，這與圖5 一致。
[0048]小結(jié)
由上可知，類葉升麻苷能夠顯著提高L-trans-PDC所致的SD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，有效地抑制了海馬組織細(xì)胞中MDA的生成，提高了 SOD活性，提高了腦神經(jīng)細(xì)胞的EAAT2基因表達(dá)水平，試驗(yàn)結(jié)果表明，類葉升麻苷對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有顯著保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與EAAT2基因表達(dá)水平的上調(diào)有關(guān)。
[0049]注:在以上類葉升麻苷在制備保護(hù)對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起損傷的腦神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用的具體藥理試驗(yàn)中，數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)均采用F 土S表示，應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P <0.05代表有顯著性差異，P <0.01代
表差異極顯著，與正常組比較，Λ表示/表示/；與模型對(duì)照組比較，*表禾 P〈 0.05,'k 'k 衰元、P < 0.01。
[0050]綜上所述，本發(fā)明首次提出類葉升麻苷作用于谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體而起到保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞的作用，類葉升麻苷能夠顯著改善L-trans-PDC誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài),提高了細(xì)胞存活率，抑制了 Glu、LDH、MDA和ROS的生成，能夠顯著提高學(xué)習(xí)記憶能力，提高了 SOD活性，提高了神經(jīng)細(xì)胞的EAAT2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，提高了腦神經(jīng)細(xì)胞的EAAT2基因的表達(dá)水平，表明類葉升麻苷對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起的腦神經(jīng)細(xì)胞損傷具有顯著保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與EAAT2基因表達(dá)水平的上調(diào)有關(guān)，由此為尋找新型和有效的慢性神經(jīng)退行性疾病的治療藥物具有重要意義。
【權(quán)利要求】
1.一種類葉升麻苷在制備保護(hù)對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起損傷的腦神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類葉升麻苷在制備保護(hù)對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起損傷的腦神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用，其特征在于類葉升麻苷以干品重量計(jì)，類葉升麻苷的含量為90%至99.9%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的類葉升麻苷在制備保護(hù)對(duì)由谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取抑制引起損傷的腦神經(jīng)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用，其特征在于類葉升麻苷為從植物中提取的類葉升麻苷或者通過合成得到的類葉升麻苷。
【文檔編號(hào)】A61P25/00GK103816168SQ201410076060
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月3日
【發(fā)明者】高莉, 彭曉明, 霍仕霞, 閆明 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所