明膠-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶止血敷料和密封材料的制作方法
【專利摘要】一種醫(yī)用粘合材料，其包括明膠和無毒性交聯(lián)材料（例如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）。本發(fā)明的可選擇的實(shí)施方案包括其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層夾在第一和第二明膠層之間的敷料。該止血產(chǎn)品對創(chuàng)傷組織的治療是有用的。
【專利說明】明膠-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶止血敷料和密封材料
[0001]本申請是申請日為2007年12月17日，申請?zhí)枮?00780051215.4，發(fā)明名稱為“明膠-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶止血敷料和密封材料”的申請的分案申請。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及包含可吸收或不可吸收的材料和/或凝固蛋白的止血敷料、裝置和劑。所述止血裝置對創(chuàng)傷組織的治療是有用的。
[0003]發(fā)明背景
[0004]控制出血(流血)是急救和戰(zhàn)地創(chuàng)傷治療的關(guān)鍵步驟。遺憾的是，可及部位的過度流血或致命的出血常常發(fā)生(J.M.Rocko等人(1982).J.Trauma22:635)。來自越南戰(zhàn)爭的死亡率數(shù)據(jù)表明10%的戰(zhàn)斗死亡歸因于未控制的肢體出血。越南戰(zhàn)爭期間多達(dá)三分之一的由于失血的死亡本可通過使用有效的戰(zhàn)地出血控制法來避免。(SAS/STAT使用指導(dǎo)，第4版(Cary, N.C.:SAS Institute Inc; 1990))。
[0005]盡管平民創(chuàng)傷死亡率統(tǒng)計(jì)沒有提供由于肢體出血的院前死亡的確切數(shù)字，但實(shí)例和軼事性報(bào)道指出相似的發(fā)生率(J.M.Rocko等人(1982).J.Trauma22:635)。這些數(shù)據(jù)表明通過院前使用簡單并有效的出血控制的方法可實(shí)現(xiàn)存活的顯著增加。遺憾的是，這種方法還沒有通過使用商業(yè)上可獲得的止血裝置而被成功地證明過。
[0006]個(gè)別地，外科手術(shù)創(chuàng)傷閉合目前通過有利于通過將組織拉在一起而愈合的縫合線和縫合釘來完成。然而，它們常常未能產(chǎn)生對避免流體滲出來說必需的足夠的密封。因此，對避免外科手術(shù)后的滲出(包 括常常沿縫合釘和縫合線的線發(fā)生的滲出)的設(shè)備和方法存在巨大的、未滿足的需求。需要這種設(shè)備和方法作為縫合線和縫合釘?shù)妮o助以在外周血管重建、硬膜重建、胸部、心血管、肺、神經(jīng)以及胃腸道的外科手術(shù)中實(shí)現(xiàn)止血或其他的流體淤滯(Fluid-stasis)。
[0007]目前市場上的大多數(shù)高壓止血裝置如果真是粘合的，都是標(biāo)稱的。這種設(shè)備的好的實(shí)例為 QuikClot? ACS? (Z-Medica, ffallington, CT)和 HemCon? 繃帶(HemCon, Portland, OR),目前對美國武裝部隊(duì)成員提供的這兩種止血裝置。QuikClot海綿中的礦物沸石晶體引起血液中水分子的吸收，因此濃縮了凝固因子并加快了血液凝固。構(gòu)成HemCon繃帶的殼聚糖混合物具有正電荷并吸引具有負(fù)電荷的紅血球。紅血球細(xì)胞被拉進(jìn)敷料中，形成創(chuàng)傷上的密封并穩(wěn)定創(chuàng)傷表面。
[0008]上文提及的HemCon繃帶產(chǎn)品是為了提供院前出血控制而開發(fā)的并已經(jīng)在本領(lǐng)域內(nèi)顯示出一定的成功。然而構(gòu)成HemCon繃帶的殼聚糖網(wǎng)絡(luò)可被血液飽和并在面對快的血流或在1-2小時(shí)后遇到創(chuàng)傷的中速血流時(shí)迅速失效(B.S Kheirabadi等人(2005).J.Trauma.59:25-35 ;Α.E.Pusateri 等人(2006).J.Trauma.60:674-682)。而且，HemCon 繃帶片只可用作不能容易地適應(yīng)不規(guī)則創(chuàng)傷的剛性片，進(jìn)一步限制了其效用。
[0009]已表明用于出血控制的其他基于多糖的止血設(shè)備是RDH?(Acetyl Glucosamine)、TraumaDEX?(MPH)和 Chitoskin?(Chitosan&Gelatin)。然而，這些類型的繃帶中沒有一個(gè)能夠始終如一地顯示出在面對大量血流時(shí)避免失效。其他近來介紹的止血設(shè)備包括Ce I ox? (Chi to san Crystals)和 WoundStat?(TraumaCure Inc., MD)(蒙脫石礦物質(zhì)和超級吸收性聚合物的顆粒狀混合物)。然而，這兩種產(chǎn)品都迅速膨脹以充滿創(chuàng)傷部位，使得它們僅適于在特定類型的創(chuàng)傷中加快血液凝固并帶來降低甚至清除周圍血管中血流的危險(xiǎn)。
[0010]也是上文提及的QuikClot ACS?也具有已證明的對中等水平的出血止血的效力。然而，礦物沸石的水吸收機(jī)制在沒有大量的熱釋放時(shí)不能發(fā)生。因此，QuikClot ACS?的施用導(dǎo)致了創(chuàng)傷部位的高溫和嚴(yán)重的燒傷，其損害了周圍組織區(qū)域并使得之后的醫(yī)療護(hù)理復(fù)雜得多(A.E.Pusateri等人(2006).J.Trauma.60:674-682)。明顯地，沒有這種顯著副作用的止血溶液是更理想的。盡管QuikClot已經(jīng)開發(fā)了一種在施用時(shí)釋放較少熱的礦物混合物，但較冷的混合物的效力對嚴(yán)重的外傷治療來說并不足夠。此外，最初的或是較冷的礦物混合物都不能停止快速的動(dòng)脈流血。
[0011]所有上文提及的產(chǎn)品都依賴于自然凝固級聯(lián)以控制流體從創(chuàng)傷部位滲出。因此，它們都只對停止血流有用并且每一種都只在適于該特定裝置的條件下有用。一般的創(chuàng)傷部位密封(尤其是創(chuàng)傷部位滲出非血液的流體時(shí))超出了這些產(chǎn)品的范圍。
[0012]發(fā)明概沭
[0013]得到可被用于廣泛應(yīng)用(包括但不限于外科手術(shù)應(yīng)用、止血控制和創(chuàng)傷流血控制)的無毒性的粘合材料是所需要并且有用的。得到可被用作止血繃帶的部分的無毒性的粘合材料也是所需要并且有用的。得到可被用作的外科手術(shù)的密封材料的無毒性的粘合材料也是所需要并有用的。
[0014]本發(fā)明通過提供包含可交聯(lián)的蛋白和誘導(dǎo)所述可交聯(lián)的蛋白交聯(lián)的非毒性材料的粘合材料而克服了【背景技術(shù)】的缺陷。優(yōu)選地，可交聯(lián)的蛋白包括如本文所描述的明膠和任何明膠變體或變體蛋白?？蛇x擇并且優(yōu)選地，無毒性材料包含可選擇地包含微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(mTG)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)。依照本發(fā)明的某些實(shí)施方案，粘合材料被提供于繃帶中，該繃帶優(yōu)選地適用作止血繃帶。依照其他的實(shí)施方案，它被提供為密封材料，該密封材料優(yōu)選地適用作外科手術(shù)的密封材料。
[0015]當(dāng)通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶起作用時(shí)，蛋白膠原蛋白變性形式的明膠經(jīng)歷了迅速的交聯(lián)而形成顫動(dòng)的凝膠(vibrant gel)。所發(fā)生的凝膠化過程與纖維蛋白在其與凝血因子XIII和鈣接觸時(shí)經(jīng)歷的自然的晚期凝固級聯(lián)非常相似。而且所產(chǎn)生的凝膠表現(xiàn)出非常相似于(如果不高于)纖維蛋白膠的粘合能力((M.K.McDermott, Biomacromolecules.2004年7月-8 月；5(4):1270-9)。
[0016]本發(fā)明利用了明膠-TG交聯(lián)與纖維蛋白凝固級聯(lián)的相似性來模仿高級纖維蛋白敷料優(yōu)良的止血性能。用凝膠-TG層疊物取代纖維蛋白繃帶的纖維蛋白-凝血酶層疊物的結(jié)果是產(chǎn)生了可控制出血而沒有顯著副作用的、新的、便宜并且穩(wěn)定的敷料。這一新的繃帶通過允許以防止TG蔓延至沒有被繃帶接觸的區(qū)域的方式對創(chuàng)傷部位受控地應(yīng)用大量混合物而將明膠-TG混合物的粘合性最大化。因此，這一協(xié)作性的技術(shù)代表了高級纖維蛋白敷料領(lǐng)域和明膠-TG粘合領(lǐng)域兩者的進(jìn)展。 [0017]不像凝固的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，明膠-TG網(wǎng)絡(luò)因其可使用除此以外沒有生理活性的特定蛋白酶特異性地溶解而具有額外益處(τ.Chen, Biomacromolecules.2003年11月-12月；4 (6): 1558-63)。因此，在明膠-mTG止血層疊物敷料可復(fù)制纖維蛋白-凝血酶止血層疊物的性能的同時(shí)，它還可沒有困難地按需要被除去。[0018]除了其作為用于創(chuàng)傷治療的止血的戰(zhàn)地敷料的應(yīng)用外，本發(fā)明的基于明膠-TG的止血裝置在控制手術(shù)期間快的動(dòng)脈流血，血管內(nèi)導(dǎo)管插入(catherization)后的流血或者損傷后或做手術(shù)后其他體液的滲出上具有巨大的潛力。
[0019]到目前為止，盡管交聯(lián)的明膠-TG的膠凝性質(zhì)和明膠-TG交聯(lián)的粘合能力已經(jīng)被分別研究，但是還沒有做出努力來同時(shí)利用兩種性質(zhì)以形成止血的或組織密封的組合物。
[0020]已在大鼠視網(wǎng)膜模型中體內(nèi)證明了明膠-TG化合物的粘合使用，其中將一滴明膠-TG 混合物用于視網(wǎng)膜附著(T.Chen, J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2006 年 5月;77(2):416-22)。
[0021]還試驗(yàn)了明膠-TG凝膠作為細(xì)胞療法的支架的使用(美國專利5，834，232。還有Ito A, J Biosci&Bioeng.2003; 95 (2): 196-99。還有 Broderick EP, J Biomed Mater Res BAppl Biomate.2005 年 I 月 15 H ;72 (I):37-42)。
[0022]這些研究強(qiáng)調(diào)了明膠-TG混合物的生理使用的安全性，但它們每一種僅使用明膠-TG交聯(lián)的特性之一，并且未能教導(dǎo)或顯示本發(fā)明提出的止血和組織密封的進(jìn)展。
[0023]用于止血或 流體淤滯的明膠-TG混合物的使用還標(biāo)志著使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、尤其是組織TG獨(dú)立地作為外科手術(shù)粘合劑的大量證據(jù)充分的嘗試的顯著進(jìn)步(USP5736132，USP61908196，及其他)。使用明膠作為TG的底物為TG活性增加了機(jī)械支架，提供了超過TG單獨(dú)使用的大量優(yōu)點(diǎn)。TG與明膠一起與TG單獨(dú)相比可被更精確施用，可精確適應(yīng)創(chuàng)傷部位并容許受控的生物可吸收性。
[0024]本發(fā)明克服了【背景技術(shù)】中的缺陷。之前所嘗試的溶液使用了用于輕微至中度的止血的修飾的和未修飾的明膠網(wǎng)絡(luò)的許多形式。然而，原位形成可控制快速流血?jiǎng)用}出血或其他顯著的體液滲出的強(qiáng)力交聯(lián)的明膠網(wǎng)絡(luò)的方法是欠缺的。一種方法，例如可體內(nèi)形成強(qiáng)力明膠網(wǎng)絡(luò)的明膠-TG交聯(lián)增加了明膠基質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度并使得它適于控制高壓的動(dòng)脈流血和其他體液滲出。除了改進(jìn)的交聯(lián)方法以外，本發(fā)明涉及許多其他的創(chuàng)新，其為它提供了具有超過現(xiàn)有的基于明膠的止血材料的優(yōu)點(diǎn)。下文提供了非限制性的、示例性說明的部分列表:
[0025]I)明膠鏈和組織ECM (細(xì)胞外基質(zhì))內(nèi)生膠原蛋白之間的原位交聯(lián)產(chǎn)生強(qiáng)力的止血的流體障礙物。
[0026]2)明膠和TG可通過以凍干的形式被施用以及被血液或其他體液重構(gòu)而更有效實(shí)現(xiàn)止血或流體淤滯。
[0027]3)凍干形式的明膠-TG混合物已經(jīng)增加了保存期限。
[0028]4)層疊的凍干形式的明膠和TG提供了更迅速的重新構(gòu)成，其對高壓流體流動(dòng)環(huán)境有幫助。
[0029]5)向基本的明膠-TG混合物加入機(jī)械襯墊通過減緩流體以及使得明膠-TG有更多時(shí)間交聯(lián)并封閉流體滲出而增加了混合物的止血或流體控制能力。
[0030]依照本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方案，明膠-mTG混合物在向創(chuàng)傷部位施用前或凍干前被部分交聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，未交聯(lián)的明膠或mTG與部分交聯(lián)的明膠-mTG—起存在。
[0031]本質(zhì)上是粘性的止血繃帶是本領(lǐng)域已知的，它們的使用還有許多困難和缺陷。例如，纖維蛋白原和凝血酶的廣泛的止血使用在第二次世界大戰(zhàn)的最后一年中是普遍的，但由于肝炎的傳播而被放棄了(D.B.Kendrick,第二次世界大戰(zhàn)中的血液計(jì)劃(WashingtonDC:美國衛(wèi)生總署辦公室(Office of the Surgeon General),陸軍部(Department ofArmy) ; 1989)，363-368)。
[0032]第一次世界大戰(zhàn)期間在Grey和他的同事制得預(yù)先聚合的纖維蛋白薄片和粉末時(shí)，纖維蛋白原敷料被創(chuàng)傷外科醫(yī)生首次使用。第二次世界大戰(zhàn)期間，美國軍隊(duì)和美國紅十字會(huì)使用纖維蛋白和纖維蛋白膜的預(yù)先聚合的泡沫聚苯乙烯狀的薄片生產(chǎn)纖維蛋白膠。與對照相比較時(shí)，基于纖維蛋白的敷料在控制流血時(shí)間和減少血液損失上顯示出顯著的差異(Jackson, M.,等人(1996).J.0f Surg.Res.60:15-22 ;和 Jackson, Μ.等人(1997).Surg.Forum.XL, VII1:770-772)。
[0033]盡管纖維蛋白原敷料在控制出血上的效力，但當(dāng)包含血液和血清源性疾病(例如肝炎和HIV)常常被傳播時(shí)，終止了纖維蛋白原敷料的使用，因?yàn)榉罅习兓娜祟惢騽?dòng)物纖維蛋白原或其他純化的血液產(chǎn)品(Holcomb, J.B.等人(1997).Surgical Clinics ofNorth America.77:943-952)。
[0034]然而在過去的幾年中，血漿純化技術(shù)已經(jīng)大大減小了血液和血清源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，對用于治療創(chuàng)傷的基于纖維蛋白的產(chǎn)品已經(jīng)有了恢復(fù)的興趣。
[0035]美國紅十字會(huì)已經(jīng)描述了一種止血的層疊物敷料，它包含夾在纖維蛋白原層之間的凝血酶層(參見，例如PCT/US99/10952，美國專利第6054122、6762336號)。這種止血敷料已經(jīng)在治療可能致命的創(chuàng)傷上顯示了很大的成功(Ε.M.Acheson.(2005).J.Trauma.59 (4): 865-74 ；討論 874-5; B.S.Kheirabad1.(2005).J.Trauma.59(1): 25-34 ;討論 34-5 ;Α.E.Pusater1.(2004).J.Biomed.Mater.Res.B App1.Biomater.15; 70 (I): 114-21 )。事實(shí)上，在這些對豬的研究中，纖維蛋白層疊物敷料在治療可能致命的創(chuàng)傷上性能大大超過HemCon和QuikClot產(chǎn)品,相對于使用標(biāo)準(zhǔn)的軍隊(duì)?wèi)?zhàn)地繃帶HemCon繃帶或QuikClot粉末時(shí)的0%的存活，顯示出>75%的2小時(shí)后存活率。
[0036]盡管這些敷料可在用于治療創(chuàng)傷組織的方法中被使用，但這些傳統(tǒng)的層疊物敷料可發(fā)生分層，由此敷料的層的邊緣不再彼此粘附。這種分層可導(dǎo)致敷料組成層的減少的相互作用，以及敷料在防止出血上降低的效力。
[0037]—種改進(jìn)的基于纖維蛋白的止血層疊物敷料已經(jīng)被描述，其包括包含可吸收性物質(zhì)和/或凝固蛋白的多個(gè)層。尤其是，所述敷料(參見PCT/US03/28100，美國專利申請第0060155234號)包括夾在第一和第二層纖維蛋白原之間的凝血酶層，其中凝血酶層不與第一和/或第二層纖維蛋白原共同擴(kuò)張(coextensive)。
[0038]盡管纖維蛋白創(chuàng)傷敷料上的進(jìn)展，這些繃帶還是具有許多的缺陷。必須從人類血漿中純化用于制造繃帶的凍干的纖維蛋白原。由于這是昂貴并且需要小心處理的方法，所得的纖維蛋白原繃帶對于生產(chǎn)來說極其昂貴并且在常溫下只具有非常短的保存期限。向襯墊中加入的纖維蛋白原越多，在停止流血時(shí)繃帶產(chǎn)生的效果越好。然而，向襯墊中加入的纖維蛋白原越多，繃帶越昂貴。此外，繃帶襯墊上大量的纖維蛋白原可增加繃帶的脆性，使得它易碎而難以操作。作為這些限制的結(jié)果，沒有有效的纖維蛋白繃帶是商業(yè)上可獲得的。
[0039] 因此，盡管高級的纖維蛋白敷料可控制出血而沒有顯著的副作用并且彌補(bǔ)之前所提及的活性創(chuàng)傷治療止血的不足，但是價(jià)格和穩(wěn)定性的限制為這種類型的敷料的使用帶來明顯缺點(diǎn)。[0040]液體纖維蛋白密封材料或膠已經(jīng)作為出血控制的手術(shù)室輔助而被使用了許多年(J.L.Garza 等人(1990).J.Trauma.30:512-513 ;Η.B.Kram 等人(1990).J.Trauma.30:97-101 ;Μ.G.0chsner 等人(1990).J.Trauma.30:884-887 ;Τ.L.Matthew 等人(1990).Ann.Thorac.Surg.50:40-44 ;Η.Jakob 等人(1984).J.Vase.Surg.1:171-180)。而且，臨床上已經(jīng)將單一供體纖維蛋白密封材料廣泛地用于各種手術(shù)情況中。(ff.D.Spotnitz.(1995).Thromb.Haemost.74:482-485 ；R.Lerner 等人(1990).J.Surg.Res.48:165-181)
[0041]盡管在外科手術(shù)領(lǐng)域目前使用大量可吸收的外科手術(shù)止血?jiǎng)?，但現(xiàn)有產(chǎn)品不夠強(qiáng)大以提供控制嚴(yán)重的出血或其他生物流體的有力流動(dòng)所必需的機(jī)械和生物支持。
[0042]目前可獲得的止血繃帶例如膠原蛋白創(chuàng)傷敷料(INSTAT?, Ethicon, Somerville,NJ和AVITENE?，CR Bard, Murray Hill, NJ)或干燥的纖維蛋白凝血酶創(chuàng)傷敷料(TACH0C0MB?, Hafslund Nycomed Pharma, Linz, Austria)被限制在外科手術(shù)應(yīng)用中使用，并且不足以抵抗大血流中的溶解。他們還未擁有足夠的粘合性質(zhì)以在嚴(yán)重血流的止血中起到任何實(shí)際的作 用。這些現(xiàn)在可獲得的外科手術(shù)的止血繃帶還是需要小心處理的并且因此它們經(jīng)彎曲或承載壓力受損時(shí)容易失效。它們還容易在出血性流血中溶解。這些繃帶的這種溶解和瓦解可能是災(zāi)難性的，因?yàn)槠淇梢詫?dǎo)致對創(chuàng)傷粘合的喪失并且使得流血持續(xù)不減弱。
[0043]施用氧化的纖維素(SURGICEL, Ethicon, Somerville, NJ)或明膠海綿(SURGIFOAM, Ethicon, Somervi 11e，NJ)可吸收性止血?jiǎng)┮膊豢商幚韯?dòng)脈流血。這些產(chǎn)品意圖控制經(jīng)由骨和硬膜外靜脈滲透的低壓流血。明膠海綿不適于高壓快速流動(dòng)的動(dòng)脈流血，因?yàn)樗鼈儾荒芘c流血源形成緊密結(jié)合并因此容易被移去。氧化的纖維素也不適于控制動(dòng)脈流血，因?yàn)樗蛎洸⑶倚枰谕瓿芍寡獣r(shí)將其從施用部位除去。當(dāng)血流過大時(shí)，在完成止血之前發(fā)生過多的膨脹(M.Sabel 等人(2004).Eur.Spine J.13 (I): S97-101 )。
[0044]由于通常與輕微的毒性和在本領(lǐng)域中不能被容易的制備和應(yīng)用有關(guān)的原因，最廣泛使用的組織粘合劑通常不適于被用作止血或體內(nèi)流體淤滯裝置。這一粘合劑的好的實(shí)例是氰基丙烯酸酯家族的局部皮膚粘合劑，例如DermabondTM、IndermilTM、LiquibandTM等。氰基丙烯酸酯當(dāng)暴露于空氣時(shí)迅速活化的性質(zhì)使得基于氰基丙烯酸酯的產(chǎn)品不適于在活性止血的戰(zhàn)地敷料中使用，并且它們不能結(jié)合至濕表面使得它們不適于體內(nèi)止血或流體淤滯使用。
[0045]意圖用于體內(nèi)流體游滯使用的現(xiàn)有的產(chǎn)品還有顯著的問題。B i oG I ue? (Cr y ο I i feInc.)是強(qiáng)粘合劑和密封材料但是包含通過戊二醛交聯(lián)的白蛋白，一種有毒并且高神經(jīng)毒性的物質(zhì)。這一毒性大大的限制了其使用。另一種密封材料是C0Seal(Baxter),其包含聚乙二醇(PEG)。盡管它是無毒的，但它只有弱粘合力，大大限制了其應(yīng)用。
[0046]明膠已被用于各種創(chuàng)傷敷料中。由于明膠凝膠具有相對低的熔點(diǎn)，它們在體溫時(shí)不是非常穩(wěn)定。因此，通過建立蛋白鏈之間的交聯(lián)而使這些凝膠穩(wěn)定化是很重要的。實(shí)踐中，這通常通過用戊二醛或甲醛處理明膠而獲得。因此可將交聯(lián)的明膠制成對在流血?jiǎng)?chuàng)傷中誘導(dǎo)止血有用的干燥的海綿。這種海綿的商業(yè)上可獲得的實(shí)例包括 Spongostan (Ferrosan, Denmark) > Gelfoam (Up john, USA)和 Surgifoam (Ethicon.Somerville, NJ)。這些海綿的主要的缺點(diǎn)在于所使用的交聯(lián)劑(戍二醒或甲醒)對細(xì)胞來說是有毒的。例如通過de Vries等人(WHS第二次年會(huì)的摘要集，Richmond，USA，第51頁，1992)的發(fā)現(xiàn)來示例性說明戊二醛交聯(lián)的負(fù)面影響。這些作者表示戊二醛交聯(lián)的膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對細(xì)胞來說是有毒的，而未交聯(lián)的品種無毒。因此，即使它們具有有益于止血的性質(zhì)，這些產(chǎn)品作為用于治療有問題的創(chuàng)傷的創(chuàng)傷敷料還不是非常理想的。所以，使用不同的毒性更小的交聯(lián)技術(shù)的基于明膠的創(chuàng)傷敷料是非常需要的。
[0047]除了潛在的毒性之外，明膠網(wǎng)絡(luò)獨(dú)自不提供對于控制快速流血來說所必需的機(jī)械性質(zhì)。他們更適于僅需要小量流體吸收的創(chuàng)傷治療應(yīng)用。在一個(gè)研究中，結(jié)論是戊二醛交聯(lián)的明膠的薄片更適于作為用于尤其是需要較長時(shí)間的營養(yǎng)障礙組織的持續(xù)創(chuàng)傷愈合的敷料?？蛇x擇地，它們可用作細(xì)胞附著的支架，其中它們可在整個(gè)延長的原位存在期間激發(fā)差反應(yīng)性微環(huán)境(poorly reactive microenvironment) (MG Tucc1.(2001).J.Bioactive&Comp.Polymers.16 (2):145-157)。
[0048]用多糖交聯(lián)的明膠網(wǎng)絡(luò)也已經(jīng)被建議用于控制流血。這些止血化合物是不受戊二醛交聯(lián)的明膠海綿的潛在的毒性所限制的。然而，明膠-多糖物質(zhì)通常缺少機(jī)械強(qiáng)度并且主要意在手術(shù)期間控制小量的滲透流體或在延長的醫(yī)療護(hù)理后時(shí)期限制創(chuàng)傷滲透。
[0049]明膠-多糖化合物的一個(gè)實(shí)例是原位交聯(lián)的明膠-藻酸鹽創(chuàng)傷敷料。這種敷料沒有粘合功能并且主要被用于控制創(chuàng)傷部位的濕度。所述敷料膨脹至它的原始尺寸的90%,其大大減少了它的機(jī)械強(qiáng)度(B Balakrishnan等人(2005).Biomaterials.26(32):6335-42)。
[0050]另一個(gè)更加廣泛的實(shí)例是交聯(lián)的明膠-殼聚糖創(chuàng)傷敷料(美國專利6，509, 039、4，572，906中的實(shí)例)。雖然某些人已經(jīng)建議使用這種敷料用于創(chuàng)傷治療(Chitoskin?)，但這一材料的止血性質(zhì)完全不足以控制高壓流血。而且，所述材料在面對大體積的體液時(shí)顯著膨脹。這種敷料更適用于治療慢性創(chuàng)傷和燒傷。
[0051]還有另一個(gè)實(shí)例被提及(美國專利6，132，759)，其中用氧化的葡聚糖交聯(lián)增溶(solubilized)明膠。這一材料由于其表現(xiàn)出高吸收能力以及對于治療物質(zhì)的遞送(尤其是向創(chuàng)傷)來說有利的控制釋放性質(zhì)而被建議用于創(chuàng)傷的覆蓋和長期治療。
[0052]目前沒有涉及交聯(lián)的明膠網(wǎng)絡(luò)的物質(zhì)或與明膠交聯(lián)的其他物質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)能夠獨(dú)立地提供對快速的體內(nèi)流血的止血，即使添加凝血酶。已經(jīng)進(jìn)行了對比浸泡在活性凝血酶溶液中的FloSeal明膠基質(zhì)(BioSurgery,Fremont, CA)和GelFoam明膠基質(zhì)的止血能力的研究。5分鐘后沒有一種強(qiáng)化的止血裝置能夠在超過2/3的患者中停止流動(dòng)特征的流血。脈動(dòng)的動(dòng)脈流血是遠(yuǎn)比流動(dòng)流血更加快速的并且肯定給這些凝血酶浸泡的基質(zhì)帶來問題(FAWeaver 等人(2002).Ann.Vase.Surg.16 (3): 286-93)。
[0053]在任何一種實(shí)例中，都有在創(chuàng)傷治療上的不同的缺陷，原因是沒有能夠控制出血而沒有顯著副作用的可獲得的新的活性止血戰(zhàn)地敷料。相似地，在手術(shù)護(hù)理上也有不同的缺陷，原因是沒有能夠承受快速流血并能夠密封滲出非血液的體液的創(chuàng)傷部位的可獲得的無毒性的密封材料。
[0054]根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，提供了一種治療創(chuàng)傷組織的方法，其包括對所述組織施用包含明膠和無毒性交聯(lián)劑的組合物。
[0055] 可選擇地，無毒性交聯(lián)劑包括轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。優(yōu)選地，將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物的一部分被包括，并且明膠與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物的重量比率是在從約1:1至約300:1的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物具有至少約40U/gm的比活性水平。最優(yōu)選地，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物具有至少約800U/gm的比活性水平。
[0056]可選擇并且優(yōu)選地，明膠-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性是從約25至約400U/g明膠。更優(yōu)選地，所述活性是從約40至約200U/g明膠。
[0057]可選擇地，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶包含除了血液來源的凝血因子XIII外的植物、重組動(dòng)物或微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。優(yōu)選地，所述組合物具有從約5至約8范圍內(nèi)的pH。
[0058]可選擇地，從動(dòng)物來源、重組來源或其組合生產(chǎn)明膠。優(yōu)選地，動(dòng)物來源選自由魚和哺乳動(dòng)物組成的組。更優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物選自由豬和牛組成的組。
[0059]可選擇地，明膠是A型(酸處理的)或B型(堿處理的)。更優(yōu)選地，明膠包含高分子量明膠。
[0060]可選擇地，創(chuàng)傷的組織選自由外科手術(shù)切割的組織、外科手術(shù)修復(fù)的組織和受外傷的組織組成的組。
[0061 ] 可選擇地，方法進(jìn)一步包括減少組織的流血或其他體液的滲出?？蛇x擇地，體液選自由腦脊髓液、腸液、氣(air)、膽汁和尿組成的組。優(yōu)選地，方法進(jìn)一步包括在組織中誘導(dǎo)止血或其他滲出的體 液的淤滯。
[0062]可選擇地，創(chuàng)傷正在流血或滲出另一種體液，并且治療創(chuàng)傷的組織包括對創(chuàng)傷部位施用所述組合物以促進(jìn)明膠鏈和組織細(xì)胞外基質(zhì)的內(nèi)生膠原蛋白之間的原位交聯(lián)以產(chǎn)生對流體滲出或流血的障礙物。
[0063]可選擇地，方法進(jìn)一步包括形成仿生的血塊。
[0064]可選擇地，施用所述組合物包括:將明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶混合以形成混合物；以及向組織施用混合物。
[0065]依照本發(fā)明的其他實(shí)施方案，提供了一種用于在哺乳動(dòng)物的創(chuàng)傷中誘導(dǎo)止血的方法，方法包括對創(chuàng)傷施用包含明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的組合物。
[0066]依照本發(fā)明的其他實(shí)施方案，提供了在受損傷的血管部位誘導(dǎo)仿生血塊形成的方法，其包括對創(chuàng)傷施用包含明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的組合物。
[0067]依照本發(fā)明的其他實(shí)施方案，提供了包含明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的組合的組合物，其中選擇明膠的量和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的量的比率以在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)仿生血塊的形成。
[0068]依照本發(fā)明的其他的實(shí)施方案，提供了包含明膠和無毒性交聯(lián)劑的組合的組合物，其中明膠的量和無毒性交聯(lián)劑的量的比率足以在哺乳動(dòng)物的創(chuàng)傷中減少流血。
[0069]優(yōu)選地，無毒性交聯(lián)劑包括轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。更優(yōu)選地，將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物的一部分加入并且明膠與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物的重量比率是在從約1:1至約300:1的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，比率是在從約1:1至約100:1的范圍內(nèi)。最優(yōu)選地，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物具有至少約40U/gm的比活性水平。同樣最優(yōu)選地，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物具有至少約80U/gm的比活性水平。同樣最優(yōu)選地，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物具有至少約200、400或800U/gm的比活性水平。
[0070]可選擇地，明膠-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性是從約25至約400U/g明膠。優(yōu)選地，活性是從約40至約200U/g明膠。
[0071]可選擇地，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶包含除了血液來源的凝血因子XIII外的植物、重組動(dòng)物或微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。優(yōu)選地，所述組合物進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑或填料。同樣優(yōu)選地，組合物具有從約5至約8范圍內(nèi)的pH。
[0072]可選擇地，從動(dòng)物來源、重組來源或其組合生產(chǎn)明膠。優(yōu)選地，動(dòng)物來源選自由魚和哺乳動(dòng)物組成的組。更優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物選自由豬和牛組成的組。最優(yōu)選地，明膠包含豬皮或豬骨或者其組合。同樣最優(yōu)選地，明膠是A型(酸處理的)或B型(堿處理的)。同樣最優(yōu)選地，明膠包含高分子量明膠。
[0073]可選擇地，明膠具有至少約250布盧姆(bloom)。優(yōu)選地，所述魚包括冷水種類的魚。
[0074]可選擇地，重組的明膠是使用細(xì)菌、酵母、動(dòng)物、昆蟲或植物系統(tǒng)或者任何類型的細(xì)胞培養(yǎng)物所生產(chǎn)的。
[0075]可選擇地，將明膠純化以除去鹽。
[0076]可選擇地，明膠具有至 少一種調(diào)整、定制或預(yù)定的特性?？蛇x擇地，明膠沒有經(jīng)歷熱致可逆凝膠化。
[0077]依照本發(fā)明的其他實(shí)施方案，提供了包含明膠和無毒性交聯(lián)劑的組合的止血或體液密封劑?？蛇x擇地，無毒性交聯(lián)劑包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。優(yōu)選地，所述組合包含聚集的明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
[0078]如本文所描述的，一種方法或組合物，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可選擇地從巴爾達(dá)齊鏈輪絲菌(Streptoverticillium Baldaccii)、吸水鏈霉菌(Streptomyces Hygroscopicus)菌株或大腸桿菌(Escherichia Coli)中的一種或多種中提取。
[0079]依照本發(fā)明的其他實(shí)施方案，提供了在創(chuàng)傷組織中誘導(dǎo)止血和/或密封創(chuàng)傷組織的方法，其包括對組織施用包含交聯(lián)的蛋白底物和無毒性交聯(lián)劑的組合物?？蛇x擇地，無毒性交聯(lián)劑包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。優(yōu)選地，底物包括以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)位點(diǎn)為特征的一種或多種合成的聚合物序列。更優(yōu)選地，底物包括修飾的包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)位點(diǎn)的多肽。
[0080]依照本發(fā)明的其他實(shí)施方案，提供了誘導(dǎo)止血和/或密封創(chuàng)傷的組合物，其包括明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的混合物，其中混合物被修飾以便明膠與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在低于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物明膠的正常的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度下形成溶液。
[0081]可選擇地，明膠已經(jīng)被修飾以具有降低的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度。優(yōu)選地，組合物進(jìn)一步包括添加劑以增加混合物中明膠的溶解度。更優(yōu)選地，組合物進(jìn)一步包括添加劑以降低明膠的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度。最優(yōu)選地，組合物進(jìn)一步包括增塑劑。可選擇地并且最優(yōu)選地,增塑劑選自由多元醇、甘油(glycerine)、丙三醇(glycerol)、木糖醇、鹿糖、山梨糖醇、三乙醇胺、間苯二酹、硫二甘醇、甲苯磺酸(toluenesulphoacid)的鈉鹽、丁二醇、硝酸脲、硫脲、脲、谷氨酸、天冬氨酸(aspargic acid)、繳氨酸、甘氨酸、KSCN、KI和LiBr組成的組。
[0082]可選擇地，丙三醇的濃度比率范圍是從約0.5:1至約5:1的丙三醇:明膠，重量/重量。優(yōu)選地，濃度比率范圍是從約1:1至約2:1的丙三醇:明膠，重量/重量?？蛇x擇地，山梨糖醇的濃度比率范圍是從約0.5:1至約5:1的山梨糖醇:明膠，重量/重量。優(yōu)選地，濃度比率范圍是從約1:1至約3:1的山梨糖醇:明膠，重量/重量。
[0083]可選擇地，脲的濃度比率范圍是從約1:2至約2:2的脲:明膠，重量/重量。
[0084]可選擇地，組合物進(jìn)一步包括選自由pH調(diào)節(jié)劑和離子濃度調(diào)節(jié)劑組成的組的調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選地，pH調(diào)節(jié)劑提供從約1.5至約5.0或從約7.0至約9.0的范圍內(nèi)的pH。[0085]可選擇地，組合物進(jìn)一步包括鹽。
[0086]可選擇地，組合物進(jìn)一步包括海藻糖糖類、甘露醇糖類或其他糖類以便噴霧干燥、冷凍干燥或其他蛋白干燥的穩(wěn)定。
[0087]可選擇地，組合物進(jìn)一步包括變性劑。優(yōu)選地，變性劑選自由鹽酸胍和脲組成的組。更優(yōu)選地，濃度比率范圍是從約1:2至約2:2的GuHCl:明膠，重量/重量。同樣更優(yōu)選地，濃度比率范圍是從約0.5:1至約1:1的脲:明膠，重量/重量。
[0088]可選擇地，組合物進(jìn)一步包括還原劑。優(yōu)選地，還原劑選自由氯化鎂和氫醌組成的組。更優(yōu)選地，氫醌以從約0.2至約0.5M的濃度存在于混合物的溶液中。最優(yōu)選地，濃度是從約0.3至約0.4M。
[0089]可選擇地，氯化鎂以從約2至約4M的濃度存在于混合物的溶液中。優(yōu)選地，濃度是從約2.5至約3.5M。
[0090]可選擇地，組合物進(jìn)一步包括放熱劑。優(yōu)選地，放熱劑包括氯化鈣、其他鈣鹽、氯化鎂、金屬氧化物/沸石或其組合中的一種或多種。更優(yōu)選地，對高出室溫的每一攝氏度的溫度增加來說，氯化鈣在溶液中以從約0.2至0.7g氯化鈣每mL混合物的量存在。
[0091]可選擇地，組合物進(jìn)一步包括明膠特異性蛋白酶。
[0092]可選擇地，組合物進(jìn)一步包括蛋白酶抑制劑。
[0093]可選擇地，組合 物進(jìn)一步包括另外的止血?jiǎng)?yōu)選地，另外的止血?jiǎng)┻M(jìn)一步包括白蛋白、膠原蛋白、纖維蛋白、凝血酶、殼聚糖、硫酸鐵或其他金屬硫酸鹽中的一種或多種。
[0094]根據(jù)本發(fā)明其他的實(shí)施方案，提供了止血或密封敷料，其包括:(i)第一明膠層；(?)與第一明膠層相鄰的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層；以及(iii)與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層相鄰的第二明膠層，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層與第一明膠層和/或第二明膠層共同擴(kuò)張或非共同擴(kuò)張。
[0095]根據(jù)本發(fā)明其他的實(shí)施方案，提供了止血或密封敷料，其包括:(?)可吸收性或非可吸收性材料層；(ii)與材料層相鄰的第一明膠層；(iii)與第一明膠層相鄰的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層；以及(iv)與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層相鄰的第二明膠層，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層與第一明膠層和/或第二明膠層共同擴(kuò)張或非共同擴(kuò)張。
[0096]根據(jù)本發(fā)明其他的實(shí)施方案，提供了止血或密封敷料，其包括:(i)明膠層；(ii)與明膠層相鄰的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層與明膠層共同擴(kuò)張或非共同擴(kuò)張。
[0097]根據(jù)本發(fā)明其他的實(shí)施方案，提供了止血或密封敷料，其包括:(i)可吸收性或非可吸收性材料層；(ii)與材料層相鄰的明膠層；(iii)與明膠層相鄰的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層與明膠層共同擴(kuò)張或非共同擴(kuò)張。
[0098]根據(jù)本發(fā)明其他的實(shí)施方案，提供了止血或密封敷料，其包括:(i)明膠層；(ii)與第一明膠層相鄰的可吸收性或非可吸收性材料層；(iii)與材料層相鄰的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層與明膠層共同擴(kuò)張或非共同擴(kuò)張。
[0099]可選擇地,敷料進(jìn)一步包括襯墊材料。
[0100]根據(jù)本發(fā)明其他的實(shí)施方案，提供了止血或密封裝置，其包括:(i)可吸收性或非可吸收性基質(zhì)；(ii)明膠；(iii)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶被包含于基質(zhì)中。
[0101]根據(jù)本發(fā)明其他的實(shí)施方案，提供了止血或密封裝置，其包括:(i)多孔的可吸收性或非可吸收性基質(zhì)；(ii)明膠；(iii)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶粘合于基質(zhì)。
[0102]根據(jù)本發(fā)明其他的實(shí)施方案，提供了用于插入人類或低等哺乳動(dòng)物的體內(nèi)的醫(yī)療裝置，其包括如本文所描述的止血或密封劑或者組合物。優(yōu)選地，裝置包括血管導(dǎo)管。
[0103]根據(jù)本發(fā)明其他的實(shí)施方案，提供了用于在人類或低等哺乳動(dòng)物的身體上局部施用的醫(yī)療裝置，其包括如本文所描述的止血或密封劑或者組合物?？蛇x擇地，裝置包括加壓的噴霧或泡沫。
[0104]應(yīng)當(dāng)理解的是，之前的一般描述和下文的詳細(xì)描述都僅僅是示例性和說明性的并且意圖提供如所要求保護(hù)的本發(fā)明的進(jìn)一步的說明。
[0105]除非另有定義，本文所用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的技術(shù)人員通常所理解的一樣。本文所提及的所有專利、專利申請和出版物通過引用并入本文。
[0106]如本文所用的，被說明為與明膠層“非共同擴(kuò)張的”轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層是其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層的在兩個(gè)維度上的空間邊界小于一個(gè)或所有兩個(gè)明膠層的空間邊界以便轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層獨(dú)立地與止血敷料的第一明膠層表面積的僅僅約5%至約95%共同擴(kuò)張和/或與止血敷料的第二明膠層表面積僅僅約5%至約95%共同擴(kuò)張的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層。例如，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層可獨(dú)立地與第一和第二明膠層中的每一個(gè)的表面積的約10、20、30、40、50、60、70、75、80或90%共同擴(kuò)張。與明膠層“共同擴(kuò)張的”轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層提供了明膠層的完全覆蓋并且與明膠層 表面積的100%共同擴(kuò)張。例如通過使用具有不同總表面積或形狀的明膠層，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層可與第一明膠層非共同擴(kuò)張但與第二明膠層共同擴(kuò)張，反之亦然。
[0107]本文所用的“患者”是指需要醫(yī)療護(hù)理和/或治療的人類或動(dòng)物個(gè)體。
[0108]本文所用的“創(chuàng)傷”是指對患者的任何組織的任何損害，其導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)的血液損失或其生理通路的任何其他體液的損失。組織可以是體內(nèi)組織(例如器官或血管)，或者是體外組織(例如皮膚)。血液或體液的損失可以是體內(nèi)的(例如從破裂的器官)，或者是體外的(例如從裂傷)。創(chuàng)傷可以在軟組織(例如器官)中，或者在硬組織(例如骨)中。損害可由任何劑或任何來源(包括外傷性損傷、感染或外科手術(shù)介入)導(dǎo)致。損害可以是危及生命的或非危及生命的。
[0109]本文所用的“可吸收性材料”是指自發(fā)和/或經(jīng)由哺乳動(dòng)物身體分解為組分的材料，所述組分以不顯著干擾創(chuàng)傷愈合和/或組織再生的方式被消耗或消除，并且不會(huì)導(dǎo)致任何顯著的代謝紊亂。
[0110]本文所用的“穩(wěn)定性”是指決定活性和/或功能的那些材料特性的保留。
[0111]本文所用的“結(jié)合劑”是指增強(qiáng)止血敷料的一個(gè)層對一個(gè)或多個(gè)不同層的粘合和/或給定層的組分對該層其他組分的粘合的化合物或化合物的混合物。
[0112]本文所用的“增溶劑”是指增加蛋白在(優(yōu)選地)水性溶劑中的溶解的化合物或化合物的混合物。
[0113]本文所用的“填料”是指對止血敷料的一層或多層提供松密度/或孔隙率的化合物或化合物的混合物。
[0114]本文所用的“脫模劑”是指有助于止血敷料從制造模具上脫掉的化合物或化合物的混合物。
[0115]本文所用的“發(fā)泡劑”是指當(dāng)在適合的條件下水合時(shí)產(chǎn)生氣體的化合物或化合物的混合物。[0116]“TG”是指任何類型的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；根據(jù)上下文，“mTG”還可以指微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和/或任何類型的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(在下文的特定的實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例中，所述術(shù)語是指微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)
[0117]術(shù)語“哺乳動(dòng)物”，尤其是涉及治療方法和/或與裝置和/或組合物的使用和應(yīng)用時(shí)，除非另外具體說明，是指人類和低等哺乳動(dòng)物。
[0118]本文所用的“約”意指指示值的加或減大約十個(gè)百分比。
[0119]根據(jù)以下詳細(xì)說明和權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)是明顯的。
[0120]附圖簡沭
[0121]參考附圖，本文僅舉例描述本發(fā)明。現(xiàn)在具體參考附圖細(xì)節(jié)，所強(qiáng)調(diào)的是所展示的細(xì)節(jié)僅僅作為實(shí)例并且為示例性討論本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的目的，并且是為了提供被認(rèn)為是本發(fā)明的原理和概念方面的最有用和最容易理解的描述而提出。在這點(diǎn)上，沒有試圖以比本發(fā)明的基本理解所必需更詳細(xì)地去顯示本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，采用附圖的說明使得如何在實(shí)踐中具體實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的幾種形式對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的。
[0122]附圖中:
[0123]圖1是根據(jù)本發(fā)明的示例性繃帶的示意方框圖；
[0124]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的示例性繃帶的主視圖，所述繃帶用可選擇的吸收性襯墊和可選擇的塑料封套覆蓋；
[0125]圖3是根據(jù)本發(fā)明的示例性止血裝置的示意方框圖，所述裝置包含多孔基質(zhì)；
[0126]圖4是顯示了不同百分比的所測試的明膠對粘合強(qiáng)度的影響的圖示；
[0127]圖5顯示了溫度對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的影響(所試驗(yàn)的溫度范圍是32~150° F；最佳的范圍是 122-131° F (50-55。。));
[0128]圖6顯示基于組合物A的組織粘合劑的代表性的破裂壓力測量；
[0129]圖7顯示基于組合物B的組織粘合劑的代表性的破裂壓力測量；
[0130]圖8是顯示了凝膠的形成還有止血的誘導(dǎo)的照片(圖8A顯示完整面積而圖SB顯示為進(jìn)一步細(xì)節(jié)而被放大的面積的一部分);
[0131]圖9A顯示在對照溶液的施用之后血塊形成的缺乏，而圖9B顯示實(shí)驗(yàn)性溶液的凝膠化和止血。
[0132]圖10A-D顯示了當(dāng)動(dòng)脈正在被割破時(shí)動(dòng)脈的照片(10A);大量地流血的割破的動(dòng)脈的照片(IOB);對割破的動(dòng)脈施用本發(fā)明的組合物的照片(IOC);以及伴有仿生血塊形成的止血的照片(IOD)；
[0133]圖1lA和IlB顯示了兩組分止血密封材料的雙注射器施用法的實(shí)例；以及
[0134]圖12A和12B顯示了血管插入點(diǎn)閉合的實(shí)例，其中導(dǎo)管被本文所描述的組分覆蓋。
[0135]發(fā)明詳沭
[0136] 本發(fā)明涉及包含可交聯(lián)蛋白和誘導(dǎo)可交聯(lián)蛋白交聯(lián)的無毒性材料的粘合材料。優(yōu)選地，可交聯(lián)的蛋白包括如本文所描述的明膠和任何明膠變體或變體蛋白?？蛇x擇地和優(yōu)選地，無毒性材料包括轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)，其可選擇地包括任何類型的鈣依賴性或非依賴性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(mTG)，其可例如可選擇地為微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，將粘合材料提供于繃帶中，所述繃帶優(yōu)選地適于作為止血繃帶使用。下文更詳細(xì)地在章節(jié)標(biāo)題下描述本發(fā)明的各種實(shí)施方案，提供章節(jié)標(biāo)題僅為了清楚的目的而沒有以任何方式進(jìn)行限制的任何意圖。
[0137] 明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶
[0138]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了用于止血和組織密封的組合物，其中交聯(lián)物質(zhì)包括轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，而可交聯(lián)的蛋白包括明膠。
[0139]根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶存在于具有至少約100U/gm的比活性水平的組合物中，盡管可選擇地例如通過可選擇地調(diào)節(jié)上文所描述的比率也可使用較低的活性水平。組合物的這種可選擇地較低的活性水平優(yōu)選地包括至少約20U/gm，更優(yōu)選地至少約40U/gm,甚至更優(yōu)選地至少約60U/gm以及最優(yōu)選地至少約80U/gm。
[0140]優(yōu)選地以一定量向明膠加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(無論單獨(dú)還是作為組合物的一部分)以便混合物中所得的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性優(yōu)選地為從約25至約100U/g明膠，并且更優(yōu)選地從約40至約60U/g明膠。
[0141]可通過對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說已知并可用的方法中的任一種獲得適合的明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。明膠可選擇地包括任何類型的明膠，所述明膠包括本領(lǐng)域已知的蛋白，優(yōu)選地包括但不限于通過動(dòng)物組織和/或從動(dòng)物組織獲得的膠原蛋白的部分水解獲得的明膠，所述動(dòng)物組織包括但不限于動(dòng)物皮膚、結(jié)締組織(包括但不限于韌帶、軟骨和類似組織)、鹿角或角質(zhì)物以及類似物、和/或骨、和/或魚的鱗和/或骨或其他組分；和/或使用細(xì)菌、酵母、動(dòng)物、昆蟲或植物系統(tǒng)或者任何類型的細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的重組明膠。
[0142]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，來自動(dòng)物來源的明膠優(yōu)選地包括來自哺乳動(dòng)物來源的明膠并且更優(yōu)選地包括豬肉皮、豬肉和牛骨，或二層牛皮，或任何其他的豬或牛來源中的一種或多種。更優(yōu)選地，這種明膠包括豬明膠，因?yàn)槠渚哂休^低的過敏反應(yīng)率。來自動(dòng)物來源的明膠可選擇地為A型(酸處理的)的或B型(堿處理的)的，但是其優(yōu)選是A型的。
[0143]優(yōu)選地，來自動(dòng)物來源的明膠包括在第一次提取期間獲得的明膠，所述提取通常在較低的溫度(50-60°C，但是這一提取溫度的范圍并不必須作為限制)下進(jìn)行。以這一方式生產(chǎn)的明膠將在250-300布盧姆的范圍內(nèi)并且具有至少約95-100kDa的高分子量。優(yōu)選地，使用300布盧姆的明膠。
[0144]這種明膠的生產(chǎn)者的非限制性實(shí)例是PB Gelatins (Tessenderlo Group,Belgium)。
[0145]根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，來自動(dòng)物來源的明膠可選擇地包括來自魚的明膠。可選擇地，可使用任何類型的魚，優(yōu)選魚的冷水種類例如鯉魚、鱈魚、或梭魚或金槍魚。這類明膠的PH (在10%的溶液中測量)優(yōu)選地范圍從4至6。
[0146]10°C時(shí)冷水魚明膠在水中形成溶液并且因此所有冷水魚明膠被認(rèn)為是O布盧姆的。對于本發(fā)明來說，高分子量的冷水魚明膠是優(yōu)選使用的，更優(yōu)選地包括至少約95-100kDa的分子量。這相當(dāng)于250-300布盧姆動(dòng)物明膠的分子量。作為其較低的脯氨酸和羥脯氨酸水平的結(jié)果，冷水魚明膠在比動(dòng)物明膠低得多的溫度經(jīng)歷熱致可逆凝膠化。每1000個(gè)氨基酸殘基，與動(dòng)物明膠中的135-145個(gè)脯氨酸和90-100個(gè)羥脯氨酸相比，冷水魚明膠具有100-130個(gè)脯氨酸和50-75個(gè)羥脯氨酸基團(tuán)(Haug IJ, Draget KI, SnmisiVK丨0.(2004).Food Hydrocolloids.18:203-213)。
[0147]這種明膠的生產(chǎn)者的非限制性實(shí)例是Norland Products (Cranbury, NJ)。
[0148]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，將明膠純化以除去鹽。這可根據(jù)之前描述的技術(shù)來完成。一種這類技術(shù)涉及在水中形成20%w/v的明膠溶液并將其在攪拌下加熱至60°C。之后將混合物靜置過夜。將所獲得的凝膠經(jīng)反復(fù)更換的去離子水透析以消除鹽，攪拌并加熱至50°C以解聚物理網(wǎng)絡(luò)。將最終溶液過濾并冷凍干燥(Crescenzi V,Francescangeli A,Taglienti A.(2002).Biomacromolecules.3:1384-1391 )。可選擇地，可通過尺寸排阻柱將明月父去鹽。
[0149]根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，使用了重組的明膠。重組的明膠目前由FibroGen(San Francisco, CA)商業(yè)生產(chǎn)。目前優(yōu)選的方法是使用重組的酵母系統(tǒng)(PichiaPastoris)以表達(dá)I型、α I人類序列膠原蛋白的特定片段。
[0150]在本發(fā)明的可選擇的但優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組的明膠是完全合成的分子，不包含來自人類或任何動(dòng)物的摻雜組分?！昂铣傻摹币庵该髂z是優(yōu)選根據(jù)選自化學(xué)合成，無細(xì)胞蛋白合成，細(xì)胞組織培養(yǎng)，任何類型的細(xì)菌、昆蟲或酵母培養(yǎng)或者在植物中的方法生產(chǎn)的。合成的明膠的使用消除了組織來源的材料具有的許多可變因素和缺陷，包括引起不想要的免疫應(yīng)答。例如,魚明膠顯示出高度的變應(yīng)原性而動(dòng)物明膠顯示出低中度的變應(yīng)原性,而重組明膠可無變應(yīng)原性。在人類安全性研究中，未發(fā)現(xiàn)與重組明膠相關(guān)的不良事件。
[0151]產(chǎn)生重組明膠的方法和它們的使用的益處被充分描述于美國專利6，413，742和6,992, 172中，其通過引用并入本文，如同在本文完整陳述。
[0152]可將重組明膠生產(chǎn)為高度(99%)純化的。重組明膠生產(chǎn)允許可選擇地生產(chǎn)具有至少一種限定的和預(yù)定的特性(包括但不限于限定的分子量、Pi (等電點(diǎn))，有保證的批次間的重復(fù)性以及調(diào)整分子量以匹配特定應(yīng)用的能力)的明膠。
[0153]之前已經(jīng)描述了調(diào)整分子量以匹配特定應(yīng)用的實(shí)例，其中將明膠生產(chǎn)為高度親水的(Werten MWT 等人(2001).Protein Engineering.14(6): 447-454)。可選擇地并優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的明膠包括具有至少一種調(diào)整、定制或預(yù)定的特性的明膠。
[0154]可選擇地根據(jù)本發(fā)明這樣定制的其他類型的特性的非限制性實(shí)例包括經(jīng)歷或不經(jīng)歷熱致可逆凝膠化。可生產(chǎn)重組明膠以經(jīng)歷熱致可逆凝膠化或不經(jīng)歷熱致可逆凝膠化。具有天然動(dòng)物明膠的一種或多種有益特性但未經(jīng)歷熱致可逆凝膠化的明膠在于其正常經(jīng)歷熱致可逆凝膠化的溫度下通過其他方式使得明膠能夠交聯(lián)上具有巨大的效用。這種明膠還被本發(fā)明的某些實(shí)施方案所包括。
[0155]動(dòng)物(牛、豬等等)明膠，溫水魚明膠和重組明膠(膠凝類型)可在35-40度之間某點(diǎn)經(jīng)歷熱致可逆凝膠化，尤其是在高分子量和/或高濃度(>20%)和/或具有修飾和/或一種或多種附加物質(zhì)時(shí)(描述參見下文)。室溫時(shí)，它們處于凝膠形式并且不能容易地與mTG混合。下文描述根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案的化合物的各種修飾以在室溫時(shí)將明膠溶液維持于液體形式。
[0156]冷水魚明膠和重組明膠(非膠凝類型)在室溫時(shí)不形成熱致可逆的凝膠，即使沒有進(jìn)一步的修飾和/或一種或多種附加物質(zhì)的存在。它們具有遠(yuǎn)低于室溫的轉(zhuǎn)變點(diǎn)。室溫時(shí)，它們保留在溶液中并且可與mTG反應(yīng)而無需進(jìn)一步修飾
[0157]根據(jù)本發(fā)明的關(guān)于重組明膠的優(yōu)選的實(shí)施方案，使用一種適合的體外培養(yǎng)系統(tǒng)以生產(chǎn)重組明膠。除了使 用用于重組明膠生產(chǎn)的重組的甲基營養(yǎng)型酵母系統(tǒng)之外，其他微生物也被使用。
[0158]已經(jīng)在大腸桿菌中表達(dá)了重組的明膠樣蛋白，但是通常在大腸桿菌中獲得的表達(dá)水平相當(dāng)?shù)筒⑶壹?xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的蛋白的純化可能是困難的。短芽孢桿菌(Bacillus brevis)已經(jīng)被用于明膠樣蛋白的表達(dá)，其中序列段選自天然膠原蛋白基因并且被聚合以形成半合成的明膠(Werten MWT 等人，Secreted production of a custom-designed, highlyhydrophilic gelatin in Pichia pastoris (畢赤酵母中專門設(shè)計(jì)的高度親水的明膠的分泌型生產(chǎn)).Protein Engineering,第 14 卷，第 6 期，447-454，2001 年 6 月)。
[0159]在生產(chǎn)重組明膠上的其他的成功的努力已經(jīng)包括使用哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞的重組明膠的生產(chǎn)。膠原蛋白和明膠還被表達(dá)在轉(zhuǎn)基因番茄植物、轉(zhuǎn)基因小鼠中。一種轉(zhuǎn)基因的蠶系統(tǒng)已經(jīng)被用于生產(chǎn)包含膠原蛋白序列的融合蛋白。這些系統(tǒng)缺少足以產(chǎn)生完全羥基化的膠原蛋白的內(nèi)源脯氨酰羥化酶活性，這可通過脯氨酰羥化酶的過表達(dá)來克服(Olsen D等人 Recombinant collagen and gelatin for drug delivery (用于藥物遞送的重組膠原蛋白和明膠).Adv Drug Deliv Rev.2003 年 11 月 28 日；55 (12): 1547-67)。也可選擇地使用基于植物的系統(tǒng)；例如愛荷華州立大學(xué)正在和Fibrogen正在合作開發(fā)在轉(zhuǎn)基因玉米中明膠的表達(dá)。
[0160]止血敷料中使用的明膠可是明膠復(fù)合物或任何明膠，或者其衍生物或代謝物，或者根據(jù)單一工序或多個(gè)工序生產(chǎn)的明膠。例如明膠可選擇地包括明膠A型或明膠B型或其組合。
[0161]轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可選擇地包括優(yōu)選除了血液來源的凝血因子XIII之外的任何植物、動(dòng)物或微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。優(yōu)選地，使用來自茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraensis)微生物轉(zhuǎn)谷氨酸胺酶。
[0162]轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可選擇地可在包含至少一種其他物質(zhì)(例如穩(wěn)定劑或填料)的組合物中。這種材料的非限制性實(shí)例包括麥芽糖糊精、水解的脫脂乳蛋白或任何其他的蛋白物質(zhì)、氯化鈉、紅花油、磷酸 三鈉、酪蛋白酸鈉或乳糖或者其組合。
[0163]盡管天然轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的最佳pH是6.0，但在pH5.0至pH8.0的范圍內(nèi)它同樣以高活性起作用。因此，用于止血的根據(jù)本發(fā)明的組合物優(yōu)選地具有從約5至約8的范圍內(nèi)的pH值。
[0164]轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶以負(fù)的溫度系數(shù)為特征。在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的溫度范圍內(nèi)，較高的溫度時(shí)反應(yīng)較短的時(shí)間而較低溫度時(shí)需要較長的時(shí)間來開始起作用。下表顯示對比與在50°C、pH6.0時(shí)十分鐘內(nèi)發(fā)生的反應(yīng)相同的反應(yīng)等級時(shí)不同溫度下的不同反應(yīng)時(shí)間:
[0165]表1-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的反應(yīng)溫度
[0166]
溫度5°C ISeC 20°C 30°C 40°C
時(shí)間(分鐘) 240 105 70 35 20
[0167]商業(yè)上可獲得的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶產(chǎn)品的非限制性實(shí)例包括由AjinomotoC0.(Kawasaki, Japan)所生產(chǎn)的那些。來自這一公司的這種產(chǎn)品的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例是Activa TG-TI (在歐洲:Activa WM)-成分:mTG 和麥芽糖糊精；活性:81_135U/g Activa0來自這一公司的適合的產(chǎn)品的其他非限制性實(shí)例包括Activa TG-FP (成分:水解的脫脂乳蛋白、mTG ;活性:34-65U/g Activa TG-FP)；Activa TG-GS (成分:氯化鈉、明膠、磷酸三鈉、麥芽糖糊精、mTG和紅花油(加工助劑);活性:47-82U/g Activa TG-GS) ；Activa TG-RM (在歐洲:Activa EB)-成分:酪蛋白酸鈉、麥芽糖糊精和mTG ;活性:34_65U/g Activa ；ActivaMP (成分:mTG、乳糖和麥芽糖糊精；活性:78-126U/g Activa)。
[0168]商業(yè)上可獲得的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶產(chǎn)品的其他非限制性實(shí)例包括由YimingBiological Products C0.(Jiangsu, China)所生產(chǎn)的那些。來自這一公司的這種產(chǎn)品的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例是TG-B (成分:l%mTG、99%輔助蛋白；活性:80-130U/g TG-B)。來自這一公司的適合的產(chǎn)品的其他非限制性實(shí)例包括TG-A (成分:0.5%mTG、99.5%輔助蛋白；活性:40-65U/g TG-A)。
[0169]對于所有的實(shí)例來說，優(yōu)選的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶產(chǎn)品是具有高比活性和最簡單的輔助成分的那些，因?yàn)樗鼈儽徽J(rèn)為(不希望被單一的假設(shè)所限制)在施用時(shí)具有最佳的反應(yīng)性和對不期望的副反應(yīng)來說較低的可能性。
[0170]在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可選擇地可從巴爾達(dá)齊鏈輪絲菌或吸水鏈霉菌菌株中提取以生產(chǎn)已經(jīng)表現(xiàn)出在較低的溫度(分別在大約37°C和37°C -45°C)下起最佳作用的酶變體(Negus SS.A Novel Microbial Transglutaminase Derived FromStreptoverticillium Baldaccii (產(chǎn)自巴爾達(dá)齊鏈輪絲菌的一種新的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶).博士論文.School of Biomolecular and Biomedical Science.Griffith University,Queensland, Australia 和 Cui L 等人 Purification and characterization oftransglutaminase from a newly isolated Streptomyces hygroscopicus (來自新近分離的吸水鏈霉菌的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的純化和鑒定).2007:105 (2)第612-618頁)。為了在環(huán)境條件下獲得較快和較強(qiáng)明膠交聯(lián)，較低的溫度下較高的比活性是所期望的。
[0171]根據(jù)某些實(shí)施方案，可以任何一種上文所描述的組合物的形式使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，可選擇地包括任何一種商業(yè)上可獲得的包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的混合物。
[0172]在另一個(gè)實(shí)施方案中，可選擇地將上文中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶混合物中的任何一種通過凝膠過濾、陽離子交換層析、空心纖維過濾或切向流動(dòng)過濾純化以除去它們的載體蛋白和/或糖類。之前已經(jīng)描述過這些方法中的一些(Bertoni F, Barbani N,Giusti P, Ciardelli G.:transglutaminase reactivity with gelatine!perspectiveapplications in tissue engineering (轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與明膠的反應(yīng)性:在組織工程中的應(yīng)用前景)Biotechnol Lett (2006) 28:697-702) (Broderick EP 等人 EnzymaticStabilization of Gelatin-Based Scaffolds (基于明膠的支架的酶穩(wěn)定化)J BiomedMater Res72B:37-42，2005)。過濾所用的濾器孔徑優(yōu)選地為大約10KDA。
[0173]無論如何，優(yōu)選地在根據(jù)本發(fā)明的組合物的使用和/或制造之前用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶反應(yīng)性測定測量轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性。這種測定可選擇地包括但不限于異羥肟酸法、Nessler測定、比色測定或的任何其他的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性測定(參見，例如Folk JE, ColePff.transglutaminase!mechanistic features of the active site as determined bykinetic and inhibitor studies (轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶:通過動(dòng)力學(xué)和抑制劑研究測定的活性位點(diǎn)的機(jī)械特征).Biochim Biophys Acta.1966; 122:244-64 ;或 Bertoni F, Barbani N,Giusti P, Ciardelli G.transglutaminase reactivity with gelatine:perspectiveapplications in tissue engineering (轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與明膠的反應(yīng)性:在組織工程中的應(yīng)用前景)Biotechnol Lett (2006) 28:697-702 中所描述的 Nessler 測定)。
[0174]通常，用于止血組合物中的明膠和/或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的純度和/或質(zhì)量將具有對相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說已知的適當(dāng)?shù)募兌纫援a(chǎn)生蛋白的效力和穩(wěn)定性。[0175]除了明膠之外的交聯(lián)蛋白底物
[0176]如上文所表明的，可交聯(lián)的蛋白優(yōu)選地包含明膠但是還可另外地或可選擇地包含另一種類型的蛋白。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，蛋白也是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的底物并且優(yōu)選地以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶特異性多肽和聚合物序列為特征。這些蛋白可選擇地可包括但不限于獨(dú)立地具有形成生物粘合劑的性質(zhì)的合成的聚合物序列，或已經(jīng)更優(yōu)選地用加強(qiáng)材料通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶被交聯(lián)的能力的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶特異性底物修飾過的聚合物。下文描述了這些類型的材料的每一種的非限制性的實(shí)例。
[0177]已經(jīng)開發(fā)了具有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)靶的合成的多肽和聚合物序列，其具有優(yōu)選地從約20至約40°C的轉(zhuǎn)變點(diǎn)。優(yōu)選物理特性包括但不限于結(jié)合組織的能力和形成纖維的能力。像膠凝類型的明膠(上文所描述的)一樣，這些多肽可選擇地用于同樣以降低它們的轉(zhuǎn)變點(diǎn)的一種或多種物質(zhì)為特征的組合物中。
[0178]這種肽的非限制性實(shí)例被描述于均由ZymoGenetics Inc申請的美國專利第5，428，014和5，939，385號其，兩項(xiàng)專利都通過引用并入本文，如同在本文完整陳述。美國專利第5，428，014號描述了生物相容的、生物粘合的、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可交聯(lián)的多肽，其中已知轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化蛋白結(jié)合的谷氨酰胺?；鶜埢腨-甲酰胺基團(tuán)和Lys殘基的ε-氨基基團(tuán)之間的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，導(dǎo)致ε-(Υ-谷氨酰基)賴氨酸異肽鍵的形成。
[0179]例如，描述了具有13-120個(gè)氨基酸殘基、包含式S1-Y-S2的片段的多肽，其中:S1是Thr-1le-Gly-Glu-Gly-Gln ;Y是1_7個(gè)氨基酸的間隔肽或不存在；并且S2是 Xaa-Lys-Xaa-Ala-Gly-Asp-Val?？蛇x擇地，間隔妝 Y 是 Gln-His-His-Leu-Gly、Gln-His-His-Leu-Gly-Gly 或 His-His-Leu-Gly-Gly。同樣可選擇地,S2 的 Xaa(氨基酸 I)是Ala或Ser?？蛇x擇地，間隔肽包含His-His-Leu_Gly。可選擇地并且優(yōu)選地,Y和S2中的至少一個(gè)沒有Gln殘基?？蛇x擇地，多肽的羧基末端氨基酸殘基是Pro或Gly。多肽的具體的非限制性實(shí)例包括下列:Thr-1Ie-Gly-Glu-Gly-Gln-Gln-His-HiS-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val, Thr-1le-Gly-Glu-Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Ala-Lys-GIn-Ala-Gly-Asp-Val, Thr-1le-Gly-Glu-Gly-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val或Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Gly。專利還描述了涉及這些妝的高分子量的、生物相容的、生物粘合的、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可交聯(lián)的共聚物和均聚物。
[0180]美國專利第5，939，385號描述了生物相容的、生物粘合的、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可交聯(lián)多肽。這些多肽優(yōu)選地具有約9-120個(gè)氨基酸殘基，包含式S1-Y-S2的片段，其中:S1選自由 Ile-Gly-Glu-Gly-Gln、Gly-Glu-Gly-Gln、Glu-Gly-Gln 和 Gly-Gln 組成的組；Y 是His-His-Leu-Gly-Gly 或 His-His-Leu-Gly ;并且 S2 選自由 Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp、Ala_Lys-Gln-AIa_Gly、Ala-Lys-GIn-Ala> AIa_Lys_Gln、Ala-Lys-Ala-Gly-Asp-Val>Ala-Lys-Ala和Ala-Lys組成的組,其中所述多肽具有氨基末端和羧基末端并且可被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)。優(yōu)選的多肽是Gly-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln。同樣優(yōu)選的是其中多肽氨基末端和羧基末端中的任一個(gè)或兩個(gè)的側(cè)翼具有彈性體多肽的多肽。進(jìn)一步提供了彈性體多肽(其中彈性體多肽是五肽或四肽)，尤其是加側(cè)翼的多肽(其中側(cè)翼彈性體多妝是 Val-Pro-Gly-Val-Gly、Ala-Pro-Gly-Val-Gly、Gly-Val-Gly-Val-Pro>Val-Pro-Gly-Gly或其任何部分，優(yōu)選使側(cè)翼多肽的氨基末端是Val且側(cè)翼多肽的羧基末端是Gly)。 專利還描述了涉及這些肽的高分子量的、生物相容的、生物粘合的、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可交聯(lián)的共聚物和均聚物。
[0181]這些專利認(rèn)可所描述的肽和聚合物在創(chuàng)傷閉合和各種其他的醫(yī)療應(yīng)用中作為組織粘合劑使用的效用。然而，所有兩項(xiàng)專利都表明這些肽和聚合物的所期望的轉(zhuǎn)變點(diǎn)是20-40°C并且認(rèn)可需要降低轉(zhuǎn)變點(diǎn)以便肽/聚合物在創(chuàng)傷部位中能夠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶反應(yīng)。所有兩項(xiàng)專利都聲稱:“聚合物的轉(zhuǎn)變溫度可通過能夠通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)的多肽多肽單體的數(shù)目來調(diào)節(jié)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所應(yīng)理解的，對于臨床應(yīng)用來說，應(yīng)用時(shí)轉(zhuǎn)變溫度的降低將有助于創(chuàng)傷部位處基質(zhì)的迅速凝固?！?br> [0182]當(dāng)然，為了確保想要作為生物粘合劑使用的交聯(lián)的聚合物的最大的內(nèi)聚和粘合強(qiáng)度，除去可交聯(lián)的單體常常是不可能的。事實(shí)上，為了使這種粘合劑的內(nèi)聚和粘合強(qiáng)度最大化，加入更多可交聯(lián)的單體底物通常是優(yōu)選的。因此，在這些專利中所描述的聚合物的生物粘合潛力明顯受到聚合物溶液的轉(zhuǎn)變溫度的限制。
[0183]本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案顯著地提高了這些多肽或聚合物在止血、粘合和組織密封材料應(yīng)用中使用的效用。例如對于降低在室溫膠凝的聚合物的轉(zhuǎn)變點(diǎn)，下文描述了可選擇的實(shí)施方案。這些策略可被用于降低這些專利中所描述的肽序列和聚合物的轉(zhuǎn)變點(diǎn)。
[0184]同樣如下文中所更詳細(xì)地描述的，優(yōu)選地，對于本發(fā)明的實(shí)施方案來說，相對于上文專利(其沒有教導(dǎo)也沒有建議本文描述的本發(fā)明的任何使用)中所描述的最初的使用，這些聚合物的量不同。例如，這些專利中教導(dǎo)的組織粘合劑試劑盒中使用的聚合物濃度范圍是5至100mg/ml以及優(yōu)選35_50mg/ml。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括更高的聚合物濃度，例如在150-250mg/ml的 范圍內(nèi)。對于本發(fā)明的某些實(shí)施方案來說，更高的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃度也是優(yōu)選的。
[0185]根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，也可選擇地提供其他的合成底物。優(yōu)選地，合成短的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物并且之后將其與大的聚合物分子連接和/或結(jié)合。所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物通常非常短(〈20個(gè)氨基酸殘基)。這種底物的溶解度和轉(zhuǎn)變點(diǎn)是依賴于底物所連接的聚合物。例如，如果底物與膠凝的明膠連接，則這一新合成分子的溶液將需要加入另一種物質(zhì)以在室溫下維持為流體形式。
[0186]這種類型的物質(zhì)的非限制性實(shí)例描述于美國專利7，208，171中，其通過引用并入本文，如同在本文完整陳述，其描述了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物肽的合理設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)策略是基于將用于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)的可獲得的?；荏w賴氨酸肽底物和可獲得的?；w谷氨酰胺?；牡孜锏臄?shù)量最大化。此外，Lys和Glu底物肽被設(shè)計(jì)為具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的已知的生物大分子和合成肽底物的特征。例如，基于隨著不斷增加的Glu重復(fù)序列長度，肽成為更好的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶底物(Gorman，J.J.；Folk, J.E.J.Biol.Chem.1980，255，419_427&Kahlem，P.；Terre, C ；Green, H.；Djian, P.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.1996，93，14580-14585)和已知包含兩個(gè)或更多個(gè)相鄰的Glu殘基的蛋白是好的底物(Etoh, Y.；Simon, M.；Green,H.Biochem.Biophys.Res.Commun.1986, 136, 51-56&Hohenadl, C ；Mann, K.；Mayer, U.；Timpl, R.；Paulsson, R.；Aeschlimann, D.J.Biol.Chem.1995, 270, 23415-23420)的證據(jù)，Glu底物肽包含2-5個(gè)相連的Glu殘基。在幾個(gè)肽中，Leu殘基被置于與C-末端附近的Glu相鄰，因?yàn)檫@已經(jīng)顯示出導(dǎo)致Glu特異性的顯著增加(Gross, M.；ffhetzel,N.K.；Folk,J.E.J.Biol.Chem.1975, 250, 4648-4655)?關(guān)于Lys底物肽，已經(jīng)顯示出肽和蛋白底物中與賴氨酸殘基相鄰的氨基酸組成和序列對胺特異性有影響(Groenen，P.；Smulders, R.；Peters，R.F.R.；Groot jans, J.J.;Vandeni jssel，P.;Bloemendal，H.；Dejong, W.W.Eur.J.Biochem.1994，220，795_799&Groot jans，J.J.；Groenen, P.;Dejong，W.W.J.Biol.Chem.1995，270, 22855-22858 )。最后，在所有肽中，在C-末端側(cè)加上Gly殘基以起到肽-聚合物軛合物中的肽和聚合物之間的間隔的作用，以便軛合物中的肽對酶來說可更易接近。
[0187]這一專利中描述的肽的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶特異性測定表明，他們成功地制得了具有高轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶結(jié)合特異性的?；荏w和酰基供體底物。專利中表明，可將這些底物與PEG、樹狀高分子、殼聚糖、明膠、可溶性膠原蛋白、透明質(zhì)酸、藻酸鹽和白蛋白共價(jià)軛合。專利繼續(xù)表明，這些溶液或液體形式的聚合物-肽軛合物可被用作外科手術(shù)密封材料和/或醫(yī)療粘合劑。
[0188]盡管這一專利描述了高特異性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可交聯(lián)的肽底物，但它沒有教導(dǎo)或表明作為本發(fā)明一部分所描述的先進(jìn)的施用方法或材料修飾，也沒有教導(dǎo)或表明本發(fā)明的組合物。然而專利所教導(dǎo)的底物可選擇地被用于增強(qiáng)通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)產(chǎn)生的生物粘合劑或另外從非轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶特異性的聚合物產(chǎn)生這樣的生物粘合劑。這些底物將需要與本文所描述的一種或多種其他蛋白或支架組合以用于本發(fā)明。
[0189]除轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶以外的交聯(lián)材料
[0190]如上文所表明的，交聯(lián)材料優(yōu)選地包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，但是也可另外或可選擇地包含另一種類型的交聯(lián) 材料。
[0191]這種交聯(lián)劑的非限制性實(shí)例包括碳二亞胺例如N，N-(3_( 二甲基氨基)丙基)-N-乙基碳二亞胺(EDC)、和EDC —起的N-羥基丁二酰胺(NHS)或與聚(L-谷氨酸)(PLGA)和聚丙烯酸一起使用的碳二亞胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這種交聯(lián)劑可包括酪氨酸酶或與殼聚糖一起的酪氨酸酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，交聯(lián)(聚合)是用紫外光或Y-射線光起始的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，交聯(lián)劑可包括烯屬烴(alkylene)、檸檬酸(碳酸)或納米羥基憐灰石(Nano-hydroxyapataite) (n-HA) + 聚(乙烯醇)(PVA)。
[0192]在另一個(gè)實(shí)施方案中，交聯(lián)劑是植物來源的多酚例如(即，水解的肉桂酸，例如咖啡酸(3，4-二羥基肉桂酸)、綠原酸(其奎尼酸酯)、咖啡酰酒石酸(其酒石酸酯)和類黃酮(即，如櫟精和蕓香苷))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，另外的交聯(lián)劑是氧化的單或二糖、氧代乳糖或基于糖部分的二醛(半乳已二醛糖)(GALA)0在另一個(gè)實(shí)施方案中，京尼平或其他環(huán)烯醚萜苷衍生物或類裂環(huán)烯醚萜、優(yōu)選的橄欖苦苷構(gòu)成交聯(lián)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，交聯(lián)劑是硫醇反應(yīng)性聚(乙二醇)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，交聯(lián)劑是葡聚糖、氧化的葡聚糖、葡聚糖二醛。在另一個(gè)實(shí)施方案中，交聯(lián)劑是多銅氧化酶，例如漆酶或膽紅素氧化酶。
_3] 示例性i兌明的組合物
[0194]上述交聯(lián)底物和交聯(lián)材料可選擇地與一種或多種其他的材料組合以形成根據(jù)本發(fā)明的各種組合物。根據(jù)某些實(shí)施方案，粘合材料可選擇地并優(yōu)選地包含:(i)明膠；(ii)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；其中將明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶單獨(dú)或一起形成顆粒。更優(yōu)選地，以足以被用作密封、止血?jiǎng)┑牧刻峁┟髂z和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
[0195]之前已經(jīng)描述過每一種的不同量和它們的比率?？蛇x擇地將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶含量增加以增加反應(yīng)速率，或降低以增加安全性。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，優(yōu)選地施用明膠的15-30%的溶液，隨后是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的15-30%的溶液。
[0196]此外，止血產(chǎn)品中也可包含一種或多種補(bǔ)充物，例如藥物諸如生長因子、多克隆和單克隆抗體和其他化合物。這種補(bǔ)充物的示例性說明的實(shí)例包括但不限于:抗生素，例如四環(huán)素和環(huán)丙沙星、羥氨芐青霉素和甲硝唑；抗凝血?jiǎng)?，例如活化的蛋白C、肝素、前列環(huán)素(prostracyclin) (PGI2)、前列腺素、白細(xì)胞三烯、抗轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶II1、ADP酶和血纖維蛋白溶酶原活化劑；類固醇，例如地塞米松、抑制炎癥的、前列環(huán)素、前列腺素、白細(xì)胞三烯和/或激肽的抑制劑；心血管藥物，例如鈣通道阻滯劑、血管擴(kuò)張劑和血管收縮劑；化學(xué)引誘物；局部麻醉劑例如布比卡因；以及抗增殖/抗腫瘤藥物，例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇和/或泰索替爾(taxotere);抗病毒劑,例如更昔洛韋(gangcyclovir)、齊多呋定、金剛燒胺(amantidine)、阿糖腺苷、利巴韋林(ribaravin)、曲氟尿苷、無環(huán)鳥苷、二脫氧尿苷和抗病毒組分或基因產(chǎn)物的抗體；細(xì)胞因子，例如α-或β-或Y-干擾素、α-或β-腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素；集落刺激因子；紅細(xì)胞生成素；抗真菌劑，例如大扶康、酮康唑(ketaconizole)和制霉菌素；抗寄生蟲劑,例如戍燒脒；消炎劑，例如α-1-抗胰蛋白酶和α-1-抗胰凝乳蛋白酶；麻醉劑，例如布比卡因；止痛劑；防腐劑；以及激素。其他示例性補(bǔ)充物包括但不限于:維生素和其他營養(yǎng)補(bǔ)充物；糖蛋白；纖連蛋白；肽和蛋白；糖類(單一和/或復(fù)合的)；蛋白多糖；抗血管生成素(antiangiogenins);抗原；脂質(zhì)或脂質(zhì)體；以及寡聚核苷酸(正義和/或反義DNA和/或RNA)。
[0197] 根據(jù)本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方案，提供了以經(jīng)歷了熱致可逆交聯(lián)的明膠(如上文所描述的，某些但不是所有類型的明膠經(jīng)歷沒有修飾和/或使用一種或多種另外材料的熱致可逆交聯(lián))為特征的組合物。動(dòng)物明膠的熱致可逆凝膠化在將明膠溶液冷卻至低于大約體溫(37°C)時(shí)發(fā)生。在室溫下的明膠-mTG混合物中，這一凝膠化捕獲了熱致可逆凝膠中的mTG并避免其與明膠反應(yīng)以形成不可逆的密封凝膠。由于手術(shù)室溫度通常被保持在220C，在臨床環(huán)境下如果沒有將其持續(xù)地加熱，那么明膠溶液的熱致可逆凝膠化將發(fā)生得相當(dāng)迅速。這在明膠-mTG混合物的止血應(yīng)用中帶來問題，因?yàn)槊髂z溶液必須在其與mTG混合前被加熱。由于例如加熱器需要被加至敏感的手術(shù)室環(huán)境中，從后勤和安全性角度來看，必須在即將應(yīng)用之前將明膠加熱是所不希望的；在手術(shù)室外的緊急情況和/或急迫的醫(yī)療護(hù)理情況下這種加熱的需求是更成問題的。
[0198]除了其對組織粘合和止血的阻礙，明膠不能在室溫時(shí)形成溶液并與微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶混合對于明膠-mTG混合物的其他可能的應(yīng)用來說也帶來了困難。例如當(dāng)明膠-mTG凝膠已經(jīng)被用作組織工程中細(xì)胞封裝的支架時(shí)，不得不需要特別小心以確保明膠溶液在細(xì)胞封裝之前已經(jīng)足夠冷。此外，由于明膠的熱致可逆凝膠化發(fā)生在將明膠-mTG混合物安全地植入體內(nèi)之前，封裝的細(xì)胞的植入是相當(dāng)復(fù)雜的。在局部藥物遞送方面存在相似的問題，其中某些藥物的效力可由于與加熱的明膠接觸而受損害并且包含某些藥物的明膠-mTG凝膠的植入可被明膠的熱致可逆凝膠化阻礙。
[0199]幸運(yùn)的是,經(jīng)由mTG的明膠的交聯(lián)通過連接Lys和Gln氨基基團(tuán)而發(fā)生(Chen等人Biomacromolecules,第4卷，第6期，2003),而明膠中負(fù)責(zé)其熱致可逆凝膠化的氨基酸基團(tuán)是 Pro&Hyp (Haug 等人 Food Hydrocolloidsl8 (2004) 203-213)。因此，存在減小明膠熱致可逆凝膠化的傾向而不損害其通過mTG交聯(lián)形成交聯(lián)的凝膠的能力的可能。換句話說，可增加明膠-mTG混合物中使用的明膠的溶解度并且降低其熔點(diǎn)，以使其與mTG形成室溫溶液而不會(huì)負(fù)面影響所形成的交聯(lián)的明膠-mTG凝膠。
[0200]根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，提供了明膠-mTG混合物的物質(zhì)組合物，其中所述混合物通過許多方法中的一種修飾以增加明膠的溶解度并且使明膠在低于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物明膠的正常熔點(diǎn)的溫度下可以與mTG形溶液。這些組合物包括(i)使用已經(jīng)被修飾減小其熔點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)明膠制得的明膠-mTG混合物；(ii)包含增加明膠-mTG混合物本身中明膠的溶解度的添加劑的明膠-mTG混合物；(iii)使用商業(yè)上可獲得的經(jīng)處理而具有較低的轉(zhuǎn)變溫度的明膠產(chǎn)品制得的明膠-mTG混合物；以及(iv)在特定的，小心控制的降低明膠熔點(diǎn)的環(huán)境條件(溫度、pH、離子濃度等)下形成溶液的明膠-mTG混合物。
[0201]這些新的組合物大大增加了明膠-mTG凝膠的效用并且允許可利用可通過在室溫混合明膠和mTG而形成的明膠-mTG凝膠的廣泛的應(yīng)用(尤其是在醫(yī)療領(lǐng)域中)。此外，在許多情況中，明膠和用包含較低熔點(diǎn)的明膠的明膠溶液形成的明膠-mTG溶液將具有降低溶液的初始粘度、使得mTG更自由的移動(dòng)并增加明膠-mTG反應(yīng)發(fā)生的速度的附加的益處。
[0202]根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，還對明膠-mTG混合物提供了具有改善基于明膠-mTG的產(chǎn)品的性質(zhì)的潛力的另外的增強(qiáng)。例如本發(fā)明還以進(jìn)一步將明膠-mTG混合物中的mTG穩(wěn)定化以增加其保存期限的方法為特征。
[0203]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將增塑劑加入明膠-mTG溶液中。已經(jīng)顯示增塑劑降低明膠的熔點(diǎn)，使得其在較低的溫度下形成溶液而無需經(jīng)歷熱致可逆凝膠化。優(yōu)先在明膠溶液與mTG或mTG溶液混合前向明膠顆?；蛳蛎髂z溶液加入一種或多種增塑劑以降低其熔點(diǎn)。在明膠和mTG溶液被凍干的情況下，在其凍干前向明膠溶液加入一種或多種增塑劑。在可選的實(shí)施方案中，如前文所描述的，向明膠溶液加入一種或多種增塑劑，使得可以在mTG不是高活性的較低溫度下添加mTG。之后可將明膠-mTG-增塑劑溶液以已經(jīng)混合的形式凍干或以其它方式干燥。
[0204]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多元醇或多羥基化合物被用作增塑劑。這種多羥基化合物包括甘油、丙三醇 、木糖醇、蔗糖和山梨糖醇。山梨糖醇使明膠-mTG凝膠更有彈性并更粘。丙三醇使明膠-mTG凝膠更硬并加速明膠的mTG交聯(lián)。優(yōu)選的丙三醇濃度比率范圍優(yōu)選地是從約0.5:1至約5:1的丙三醇:明膠，更優(yōu)選地從約1:1至約2:1的丙三醇:明膠，重量/重量。優(yōu)選的山梨糖醇濃度比率范圍優(yōu)選地是從約0.5:1至約5:1的山梨糖醇:明膠，更優(yōu)選地從約1:1至約3:1的山梨糖醇:明膠，重量/重量。
[0205]在與相似大小的一元醇相比較時(shí)，多元醇具有較高的沸點(diǎn)。在與相似大小的一元醇相比較時(shí)，多元醇的水溶解度較高，因?yàn)橛懈辔肿拥牧u基基團(tuán)。在食品工業(yè)中，如美國專利2，558，065 (其通過引用由此并入本文，如同在本文完整陳述，其中用多元醇例如甘油灌澆明膠顆粒)和美國專利3，939，001 (其通過引用由此并入本文，如同在本文完整陳述，其中使得明膠在以足以使明膠膠囊膨脹但未溶解的一段時(shí)間吸收多元醇)中所描述的，多元醇例如甘油被用來增加明膠的水溶解度，那些專利中所描述的這些技術(shù)和這些技術(shù)的變化將被認(rèn)為是作為本發(fā)明的一部分描述的多元醇用途的優(yōu)先實(shí)施方案。
[0206]不同濃度的增塑劑丙三醇、木糖醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖對降低明膠的轉(zhuǎn)變點(diǎn)的影響是得到充分證實(shí)的(D，Cruz NM, Bell LN.Thermal Unfolding of Gelatin inSolids as Affected by the Glass Transition (固體中的明膠在被玻璃轉(zhuǎn)變影響時(shí)的熱伸展).J Food Science2005:70 (2), Kozlov PV, Burdygina G1.The structure andproperties of solid gelatin and the principles of their modification (固體明膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及它們的修飾的原理).Polymer, 1983(24):第651-666頁)。[0207]盡管多元醇對明膠熔點(diǎn)的影響已經(jīng)被充分證實(shí)，但在本發(fā)明之前，從未將它們與明膠或明膠溶液在其與mTG或與明膠-mTG溶液混合前一起使用。
[0208]在加入多羥基化合物增塑劑的實(shí)施方案中，增塑劑與明膠的重量比率的優(yōu)選的范圍優(yōu)選為從約0.5:1至約1:1，增塑劑:明膠。
[0209]在使用明膠增塑劑降低溶液中明膠的熔點(diǎn)的另一個(gè)實(shí)施方案中，所用的增塑劑的種類可包括三乙醇胺、間苯二酚、硫二甘醇、甲苯磺酸的鈉鹽、丁二醇、硝酸脲、硫脲、脲、谷氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、甘氨酸、KSCN、KI和LiBr。
[0210]之前已經(jīng)研究了明膠溶液中脲的加入并證實(shí)其防止高分子量明膠(99kDa)在25°C形成熱致可逆凝膠的能力(Otani Y, Tabata Y, Ikada Y.Effect of additives ongelation and tissue adhesion of gelatin-poly(L-glutamic acid)mixture (添加劑對明膠-聚(L-谷氨酸)混合物的凝膠化和組織粘合的影響).Biomaterialsl9 (1998) 2167-2173)。
[0211]使用脲防止明膠或明膠-mTG溶液中在低于它們正常熔點(diǎn)的溫度下熱致可逆凝膠化的優(yōu)選的實(shí)施方案中，以0.25-0.2重量/重量之間的脲:明膠的比率向溶液加入脲。甚至更優(yōu)選地，以從約1:2至約2:2重量/重量的脲:明膠的比率向溶液加入脲。
[0212]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)水性溶劑的pH水平和離子濃度以增加溶于溶劑中的明膠的溶解度。產(chǎn)品PH離等離子pH越遠(yuǎn)，明膠的溶解度將越好。這一技術(shù)中使用的優(yōu)選的水性溶劑是磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。其他適合的緩沖劑包括硼酸鹽、磷酸鹽、HEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪州’-[2-乙基磺酸(6讓31^8111作11化sacid)])和類似物。
[0213]通常，在將被用于活體器官的混合物中，將明膠溶于被緩沖于pH5.0-9.0并具有低至中度的離子強(qiáng)度(相當(dāng)于約I至1000mM的NaCl,優(yōu)選地100至150mM的NaCl)的水性溶劑中是優(yōu)選的。更優(yōu)選地，溶液的pH為約6.0-8.0，更優(yōu)選地約7.4。盡管在這些pH和離子濃度下明膠是可溶的，但其溶解度可通過增加明膠的溶液PH和等離子pH之間的差異來提高其溶解度。
[0214]可選擇地加入一種或多種鹽以降低明膠的轉(zhuǎn)變溫度。優(yōu)選地，以適當(dāng)?shù)臐舛确秶尤臌}以降低轉(zhuǎn)變溫度，更優(yōu)選地至低于室溫。例如，發(fā)現(xiàn)指明的濃度范圍的下列鹽降低明膠的轉(zhuǎn)變點(diǎn)至低于室溫:溴化鈉(1-2M)、硝酸鈉(1-2M)、硫氰酸鈉(0.5-1.5M)、碘化鈉(0.5-1.5M)、苯磺酸鈉(0.5-1.5M)、水楊酸鈉(0.25-1M)、二氯乙酸鈉(1-2M)、三氯乙酸鈉(0.5-1.5M)、二溴乙酸鈉(0.5-1.5M)、三溴乙酸鈉(0.25-1M)、二碘乙酸鈉(0.5-1.5M)、乙酰色氨酸鈉(0.5-1.5M)、乙炔二羧酸鈉(1-2M)、水楊酸鋰(1-2M)、二碘水楊酸鋰(LithiumDiidodosalicylate) (0.2-1M)(參見,例如 Bello J, Riese HCA, Vinograd JR.Mechanismof Gelation of Gelatin (明膠凝膠化的機(jī)制).1nfluence of Certain Electrolytes onthe Melting Points of Gels of Gelatin and Chemically Modified Gelatins (某些電解對明膠和化學(xué)修飾的明膠的凝膠的熔點(diǎn)的影響).Am Chem Soc.1956年9月(60).第1299-1306 頁)。
[0215] 可選擇并優(yōu)選地，向組合物加入一種或多種酸性物質(zhì)以降低pH。降低明膠溶液的PH降低了其轉(zhuǎn)變點(diǎn)。通常，降低明膠轉(zhuǎn)變點(diǎn)對于37度在體內(nèi)重新構(gòu)成明膠是有用的。對于本文所用的某些優(yōu)選種類的明膠來說，當(dāng)例如來自哺乳動(dòng)物來源時(shí)，降低PH為明膠的轉(zhuǎn)變點(diǎn)提供了更好的結(jié)果。然而，對于某些種類的明膠來說，升高PH可選擇地提供更好的結(jié)果。[0216]在增加明膠溶液和明膠等離子點(diǎn)之間的pH差異的另一個(gè)實(shí)施方案中，明膠本身被修飾。這可如美國專利6，863，783(其通過引用由此并入本文，如同在本文完整陳述)中的通過在將它溶解在溶液中之前將它處理以產(chǎn)生帶靜電的明膠或如美國專利2，398，004 (其通過引用由此并入本文，如同在本文完整陳述)中的通過控制明膠的等電點(diǎn)來完成
[0217]如果明膠溶液的pH被升高而不是降低，那么溶液的pH將更接近明膠的等離子點(diǎn)并且轉(zhuǎn)變點(diǎn)將被升高。這一修飾可選擇地可被用來在植入體內(nèi)后將未交聯(lián)的明膠保持為熱致可逆凝膠。
[0218]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，明膠、mTG或這兩種物質(zhì)在與海藻糖糖類或其他糖類混合后已經(jīng)經(jīng)歷了干燥以穩(wěn)定處于其活性形式的蛋白或酶，使其可以被容易地重新構(gòu)成。干燥的不同的實(shí)施方案是冷凍干燥、噴霧干燥、滾筒干燥、空氣干燥、加熱干燥、真空干燥或干燥明膠-海藻糖或明膠-mTG-海藻糖溶液的任何其他方法。
[0219]海藻糖在空氣干燥和冷凍干燥中的優(yōu)良的穩(wěn)定化能力已經(jīng)被充分證實(shí)了。已經(jīng)顯示當(dāng)在已經(jīng)向特定的材料或溶液加入海藻糖后進(jìn)行干燥時(shí)干燥的材料經(jīng)歷更迅速的重新構(gòu)成(Crowe LM, Reid DS, Crowe JH.1s Trehalose Special for PreservingDry Biomaterials?(海藻糖是專門用于保護(hù)干燥的生物材料的嗎？)BiophysicalJournal1996(71):2087-2093)。
[0220]在環(huán)境溫度和大氣壓 下干燥包含海藻糖的蛋白溶液已經(jīng)被充分描述于美國專利
4,891,319中。在那里所描述的實(shí)施例中，保護(hù)了干燥的蛋白的功能。
[0221]在明膠的特定的實(shí)例中，向明膠溶液中加入海藻糖具有增加明膠凝膠的強(qiáng)度的另外的益處(Norie N, Kazuhiro M, Masami N, Yusuke O, Takashi O, Keiko N.FactorsAffecting the Gelation of a Gelatin Solution in the Presence of Sugar(在糖存在的情況下，影響明膠溶液的凝膠化的因素).Journal of Home Economics of Japan.55 (2):第 159-166 頁(2004))。
[0222]此外，明膠-mTG交聯(lián)反應(yīng)與天然血液因子的交聯(lián)反應(yīng)具有許多相似性。海藻糖干燥來穩(wěn)定血液因子近來已經(jīng)被證實(shí)了(美國專利6，649，386和7，220,836)并且處于被商業(yè)用于制備具有可容易地被重新構(gòu)成的血液蛋白的產(chǎn)品的過程中(ProFibrix?，LeiderdorpX
[0223]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在糖存在的情況下干燥明膠。這可包括在不同支持物(例如糖、麥芽糖糊精或淀粉)上的明膠的噴霧化。
[0224]在本發(fā)明的一個(gè)可選的實(shí)施方案中，使用一種由PB Gelatins (TessenderloGroup, Belgium)生產(chǎn)的叫做Cryogel?的商業(yè)明膠產(chǎn)品。Cryogel在比等價(jià)但未處理的明膠低5-6°C的溫度下是可溶的。用于Cryogel生產(chǎn)的精確處理過程是有專利權(quán)的。
[0225]在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可選擇地以一種或多種其他物質(zhì)為特征。例如，組合物可選擇地包含變性劑，包括但不限于鹽酸胍或脲中的一種或多種。組合物也可選擇地、二選一地或另外地包含還原劑，包括但不限于氯化鎂或氫醌中的一種或多種。組合物也可選擇地、二選一地或另外地包含例如異丙醇的物質(zhì)以便增加氫鍵形成。組合物也可選擇地、二選一地或另外地包含質(zhì)子極性溶劑，優(yōu)選地是能夠與蛋白在結(jié)構(gòu)上相互作用并防止明膠中螺旋形成的溶劑，例如DMSO (二甲基亞砜)。組合物也可選擇地、二選一地或另外地包含在進(jìn)入溶液時(shí)放熱的干燥劑，諸如氯化鈣。[0226]根據(jù)某些實(shí)施方案，本發(fā)明還以明膠特異性蛋白酶為特征，所述明膠特異性蛋白酶包括可迅速破壞明膠分子鏈但是不會(huì)對基于天然纖維的凝固網(wǎng)絡(luò)有不利影響的酶或酶的混合物。
[0227]明膠特異性蛋白酶可選擇地被用于從創(chuàng)傷部位除去繃帶/敷料/可吸收性止血?jiǎng)?密封材料而不會(huì)損害天然的內(nèi)源纖維蛋白凝塊并導(dǎo)致再次流血。與現(xiàn)有的產(chǎn)品相比，這一特征是本發(fā)明的另外的益處，并且解決了粘性足以良好粘合至創(chuàng)傷部位并停止流血的止血敷料不能在不除去或破壞纖維蛋白凝塊的條件下被除去的技術(shù)難題。盡管根據(jù)本發(fā)明的繃帶的至少某些實(shí)施方案是可吸收的，但可能有如果醫(yī)生想要在創(chuàng)傷部位上進(jìn)行手術(shù)則從創(chuàng)傷將其除去或?qū)⒖噹Х旁诓煌恢玫男枰?br> [0228]一種示例性的非限制性的蛋白酶是蛋白酶K (Chen,等人Biomacromolecules2003,4, 1558-1563)。但是可選擇地，可使用其他蛋白酶，尤其是較快起作用的酶。
[0229]根據(jù)其他的實(shí)施方案，可選擇地加入一種或多種蛋白酶抑制劑，包括但不限于抑肽酶、凝血酸(transexamic acid)、α-2血纖維蛋白溶酶抑制劑、α-1抗胰蛋白酶或α-1抗胰蛋白酶的Pittsburgh突變體(Arg-358 α-1抗胰蛋白酶；參見Owen等人N.Engl.J.Med.309:694-698，1983和美國專利第4,711, 848號，其通過引用由此并入本文，如同在本文完整陳述)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以足以提供1500-20，000KIU/mL的最終工作濃度的量包含抑肽酶。
[0230]根據(jù)其他的實(shí)施方案，除了明膠和TG，本發(fā)明的止血材料可進(jìn)一步包含另外的止血物質(zhì)。這種物質(zhì)本質(zhì)上可以是生物的或合成的并可包括但不限于一種或多種已知的止血?jiǎng)?，例如白蛋白、膠原 蛋白、纖維蛋白、凝血酶、殼聚糖、硫酸鐵或其他金屬硫酸鹽。
[0231]根據(jù)又一些另外的實(shí)施方案，本發(fā)明的止血材料可進(jìn)一步包括用于在將交聯(lián)材料(諸如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)與明膠相結(jié)合時(shí)加快交聯(lián)的促進(jìn)劑。這種促進(jìn)劑可選擇地包括例如鈣。
[0232]鈣是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶/明膠交聯(lián)反應(yīng)的優(yōu)選的組分。不同研究已經(jīng)證實(shí)，不同的鈣濃度和/或鈣動(dòng)員藥物(包括但不限于刺尾魚毒素(MTX))的添加可加速轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶凝固反應(yīng)。因此根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，包括鈣和/或鈣動(dòng)員藥物，但可選擇地不使用鈣和/或鈣動(dòng)員藥物。使用鈣的這些修改用于鈣依賴性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶而不用于不依賴鈣的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
[0233]根據(jù)又一些另外的實(shí)施方案，本發(fā)明的止血材料可進(jìn)一步包含用于優(yōu)選地在將交聯(lián)材料(諸如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)與明膠相結(jié)合時(shí)誘導(dǎo)放熱反應(yīng)的材料。放熱反應(yīng)的誘導(dǎo)可選擇并優(yōu)選地支持交聯(lián)，甚至在周圍環(huán)境的條件下，其中“周圍”可選擇地被定義為具有小于約30°C的溫度的任何環(huán)境。這種放熱劑可選擇地包含例如鈣、含氯分子(例如氯化鈣或氯化鎂)、金屬氧化物/沸石或其組合中的一種或多種。
[0234]鉬合物制各
[0235]本文所描述的組合物可選擇地根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方案的一種或多種不同的方法制備。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使明膠-mTG混合物中的明膠在其與mTG混合之前經(jīng)受涉及使用熱的非常具體的干燥方法。這些干燥方法通過降低其熔點(diǎn)(優(yōu)選地至低于手術(shù)室溫度)而提高明膠的溶解度。干燥方法可提高明膠的溶解度而無需任何添加劑并且不會(huì)改變形成明膠或明膠-mTG溶液的環(huán)境條件。但是，某些添加劑例如增塑劑或穩(wěn)定劑的加入，或者某些環(huán)境因素例如明膠或明膠-mTG溶液的溫度、離子強(qiáng)度和滲透壓的調(diào)控可被用于進(jìn)一步增強(qiáng)已經(jīng)包含使用降低其熔點(diǎn)的技術(shù)干燥的明膠的明膠-mTG混合物的性質(zhì)。
[0236]在熱依賴性明膠干燥以制備可在降低的溫度下與mTG形成溶液的明膠的優(yōu)選的實(shí)施方案中，將具有至少35%的水含量的純明膠溶液在超過凝膠化和凝固溫度的溫度噴霧在包含少于8%的水的過量細(xì)碎的固體明膠顆粒上。之后將顆粒在流化床中干燥至8-13%的水含量。這一過程，以及也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的這一過程的變化，被詳細(xì)描述于美國專利4，889，920中，其通過引用由此并入本文，如同在本文完整陳述。
[0237]在熱依賴性明膠干燥以制備可在降低的溫度下與mTG形成溶液的明膠的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將具有基于明膠和水的總重量的超過8%重量的水含量的明膠經(jīng)受微波加熱以除去至少35%的所述水含量以獲得具有基于明膠和水的總重量的不超過16%重量的水含量的明膠。這一過程，以及也應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分的這一過程的變化，被詳細(xì)描述于美國專利4，224，348中，其通過引用由此并入本文，如同在本文完整陳述。
[0238]在熱依賴性明膠干燥以制備可在降低的溫度下與mTG形成溶液的明膠的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如美國專利2，803，548 (其通過引用由此并入本文，如同在本文完整陳述)中所描述的，將明膠于100°C在減壓下干燥。這一過程改變了明膠鏈本身，使得它們不能夠被熱致可逆凝膠化。盡管明膠的mTG交聯(lián)不依賴于明膠形成熱致可逆凝膠的能力，但這一干燥過程導(dǎo)致明膠鏈的削弱，以及因此在明膠-mTG交聯(lián)中使用這種明膠所產(chǎn)生的任何凝膠的削弱。
[0239]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使明膠-mTG混合物中的明膠在其與mTG混合之前經(jīng)受涉及冷凍干燥的使用的非常具體的干燥方法。這些干燥方法通過降低其熔點(diǎn)(優(yōu)選地至低于手術(shù)室溫度)提高了明膠的溶解度。干燥方法可提高明膠的溶解度而無需任何添加劑并且不會(huì)改變形成明膠或明膠-mTG溶液的環(huán)境條件。但是，某些添加劑例如增塑劑或穩(wěn)定劑的加入，或者某些環(huán)境因素例如明膠或明膠-mTG溶液的溫度、離子強(qiáng)度和滲透壓的調(diào)控可被用于進(jìn)一步增強(qiáng)已經(jīng)包含使用降低其熔點(diǎn)的冷凍干燥技術(shù)干燥的明膠的明膠-mTG混合物的性質(zhì)。
[0240]在冷凍干燥明膠干燥以制備可在降低的溫度下與mTG形成溶液的明膠的優(yōu)選的實(shí)施方案中，將以0.1-2%重量的濃度溶于水的明膠在減壓下冷凍干燥。這一過程，以及也應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分的這一過程的變化，被詳細(xì)描述于美國專利2，166，074中，其通過引用由此并入本文，如同在本文完整陳述。
[0241]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，一旦明膠和mTG已經(jīng)在溶液中被混合，就將明膠-mTG混合物經(jīng)受冷凍干燥。這降低明膠的熔點(diǎn)而產(chǎn)生均勻混合的冷凍干燥的明膠-mTG混合物，其中干燥形式的明膠與干燥形式的mTG相接觸。在這一實(shí)施方案中，明膠和mTG同時(shí)從冷凍干燥狀態(tài)重新構(gòu)成并立即在重新構(gòu)成位點(diǎn)形成溶液?？蓛?yōu)先將這一技術(shù)與已經(jīng)具有比標(biāo)準(zhǔn)明膠低的熔點(diǎn)的明膠或明膠混合物一起使用，因?yàn)閙TG的活性在較低的溫度(低于約37 °C)時(shí)指數(shù)級下降。
[0242]因此可在低溫下形成由降低熔點(diǎn)的明膠和mTG組成的溶液而沒有迅速的交聯(lián)和凝膠化發(fā)生。之后可將這一溶液冷凍干燥，產(chǎn)生均質(zhì)分布的明膠和mTG的干燥的混合物。這種混合物在與較溫暖的溶劑接觸時(shí)可被迅速重新構(gòu)成以形成凝膠?？蓛?yōu)先在創(chuàng)傷敷料中使用這種技術(shù)，其中體液在其37°C的正常溫度下可重新構(gòu)成明膠和mTG。[0243]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，提供了用于止血或組織密封材料目的的明膠-mTG顆?；旌衔铮渲袑⒚髂z和mTG —起噴霧干燥以產(chǎn)生包含適于止血或組織密封材料施用的濃度的明膠和mTG的良好分散的粉末。
[0244]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，為了增加其溶解度。作為明膠-mTG混合物的一部分所使用的明膠已經(jīng)被水解、部分水解，或者一定百分比的明膠混合物已經(jīng)被水解或部分水解。這種技術(shù)的一個(gè)實(shí)例已經(jīng)在涉及用水解的明膠薄膜包被標(biāo)準(zhǔn)的明膠顆粒的過程中被成功地證實(shí)了(美國專利4，729，897，其通過引用由此并入本文，如同在本文完整陳述)。這一實(shí)施方案可包括在增塑劑存在下已經(jīng)被水解或部分水解的明膠的使用，所述增塑劑可包括如前文所描述的多元醇、糖類或其他增塑劑。
[0245]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將包含預(yù)混的mTG和明膠或其他蛋白水解產(chǎn)物的溶液冷凍干燥以增加化合物的穩(wěn)定性。這一技術(shù)，如在制備食品加工所使用的組合物中所使用的，被描述于美國專利6，030, 821中，其通過引用由此并入本文，如同在本文完整陳述。
[0246]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將作為明膠-mTG混合物的一部分所使用的明膠在與酸混合形成稀釋酸性的明膠溶液(其中酸被保持在明膠水平的5-20%)后噴霧干燥，使得形成精細(xì)的小滴以進(jìn)一步干燥。這一過程被描述于加拿大專利896，965中，其通過引用由此并入本文，如同在本文完整陳述。
[0247]在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，一起或順序地使用用于加強(qiáng)包含明膠和mTG的產(chǎn)品的上文所描述的技術(shù)中的一種或多種。這可優(yōu)先包括在明膠或明膠-mTG溶液中一起使用兩種或更多種增塑劑，在使用所描述的干燥方法中的一種將其干燥之前在明膠或明膠-mTG溶液中使用一種或多種增塑劑。它還可包括使用一種干燥技術(shù)干燥明膠或明膠-mTG，在溶液中溶解 干燥的明膠或明膠-mTG，之后再次干燥明膠或明膠-mTG。
[0248]這些方法還可選擇地被用于經(jīng)歷熱致可逆凝膠化的組合物，優(yōu)選地包括例如用于包含非明膠蛋白以及可選擇地其他交聯(lián)劑(除了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶以外)的各種組合的組合物。
[0249]型|
[0250]本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方案是關(guān)于止血敷料的(例如用于治療患者中的創(chuàng)傷組織的止血敷料)，其包括明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，優(yōu)選地為分開的，直到為了繃帶的活性而要求或需要它們的相互反應(yīng)?？噹Э蛇x擇地以非吸收性的襯墊例如塑料襯墊為特征?？噹Э蛇x擇地以可吸收的材料層為特征。
[0251]本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方案是關(guān)于用于治療患者中的創(chuàng)傷組織的止血敷料的，其可選擇并優(yōu)選地包括:(i)明膠層；(ii)與所述明膠層相鄰的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層與明膠層共同擴(kuò)張或非共同擴(kuò)張。
[0252]本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方案是關(guān)于用于治療患者中的創(chuàng)傷組織的止血敷料的，其可選擇并優(yōu)選地包括:(i)可吸收性或非可吸收性材料層；(ii)與所述材料層相鄰的明膠層；(iii)與所述明膠層相鄰的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層與明膠層共同擴(kuò)張或非共同擴(kuò)張。
[0253]本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方案是關(guān)于用于治療患者中的創(chuàng)傷組織的止血敷料的，其包括:(i)第一明膠層；(ii)與第一明膠層相鄰的可吸收性材料層；(iii)與可吸收性材料層相鄰的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層，以及(iv)與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層相鄰的第二明膠層，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層與第一和/或第二明膠層非共同擴(kuò)張。
[0254] 根據(jù)某些實(shí)施方案，本發(fā)明提供了包括夾在第一和第二明膠層之間的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層的止血敷料(例如繃帶)，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層可與第一和/或第二明膠層共同擴(kuò)張或非共同擴(kuò)張。這種止血敷料對于治療創(chuàng)傷來說是有用的。與其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層與整個(gè)第一和第二明膠層共同擴(kuò)張的敷料相比，非共同擴(kuò)張的模型提供了抑制層的分層的優(yōu)點(diǎn)。但是共同擴(kuò)張的模型的止血性能可優(yōu)于非共同擴(kuò)張的模型的止血性能
[0255]根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方案，提供了本發(fā)明的敷料，其可選擇并優(yōu)選地包括:(i)可吸收性或非可吸收性基質(zhì)；(ii)明膠；(iii)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層被包含于所述基質(zhì)中。
[0256]在另一個(gè)實(shí)施方案中，止血裝置包括:(i)多孔的可吸收性或非可吸收性基質(zhì)；
(ii)明膠；(iii)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其中明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層粘合于所述基質(zhì)。
[0257]在各種實(shí)施方案中，可以多種形狀和樣式中任何一種將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層成形。例如，并且非限制性地，可將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層成形為包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的點(diǎn)陣，或者成形為包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的單一的點(diǎn)?？蛇x擇地，可將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層成形為包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的多條線。
[0258]止血敷料的每一層還可選擇地包含一種或多種適當(dāng)?shù)奶盍稀⒔Y(jié)合劑和/或增溶齊?。此外，每一種止血敷料還可選擇地進(jìn)一步包括包含脫模劑和/或襯墊材料的脫模層。
[0259]根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，止血敷料的每一層可選擇地包含一種或多種適合的填料例如蔗糖。止血敷料的每一層也可選擇地包含一種或多種適合的結(jié)合劑例如蔗糖。每一種止血敷料也可選擇地進(jìn)一步包括包含脫模劑的脫模層。示例性的脫模劑是蔗糖。止血敷料的每一層也可選擇地包含一種或多種適合的增溶劑例如蔗糖。
[0260]不希望被單一的假設(shè)所限制，可選擇地通過所加入的量至少部分地測定作為本發(fā)明的一部分的蔗糖的性質(zhì)。在相對高的濃度(20-30%的蔗糖溶液)時(shí)，可將其噴霧至表面(例如繃帶)上以制備為涂抹另一種待粘合溶液(例如明膠或mTG溶液)的表面。在較低的濃度(例如2%左右)可將蔗糖加至明膠或mTG溶液以幫助這種溶液粘合至表面(例如繃帶)。
[0261]止血敷料的每一層也可選擇地包含一種或多種適合的發(fā)泡劑例如檸檬酸和碳酸氫鈉的混合物。
[0262]每一種止血敷料也可在使用敷料時(shí)在與朝向創(chuàng)傷的面相反的敷料面上進(jìn)一步包括襯墊材料。襯墊材料可用生理上可接受的粘合劑固定或可自我粘合(例如通過帶有表面靜電荷)。襯墊材料可是可吸收的材料或不可吸收的材料，例如硅酮片或塑料片，和/或可選擇地被插入身體的裝置例如血管導(dǎo)管和/或其他類型的醫(yī)療裝置。
[0263]可將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層涂抹于第一明膠層，以使它是與第一明膠層非共同擴(kuò)張的和/或當(dāng)涂抹第二明膠層時(shí)是與第二明膠層非共同擴(kuò)張的。例如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層可占到第一明膠層的表面積的約5%至約95%和/或第二明膠層的表面積的約5%至約95%?？蓪⑥D(zhuǎn)谷氨酰胺酶以明膠層上的單個(gè)點(diǎn)或一系列點(diǎn)涂抹于明膠層以使轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶點(diǎn)的總表面積占到第一明膠層的表面積的約5%至約95%和/或第二明膠層的表面積的約5%至約95%。
[0264]這種轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的單個(gè)點(diǎn)或多個(gè)點(diǎn)可具有任何幾何形狀，例如填滿的或未填滿的圓、矩形、三角形、線、不規(guī)則形狀或其組合。可將這種點(diǎn)以有序或隨機(jī)的樣式涂抹于第一明膠層。以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的總表面積是第一明膠層的表面積的約5%至約95%和/或第二明膠層的表面積的約5%至約95%為條件，多個(gè)點(diǎn)可形成各種形狀和樣式中的任何一種，例如陣列、網(wǎng)格、系列同心點(diǎn)(例如同心的圓或正方形)、交錯(cuò)的系列點(diǎn)(例如交錯(cuò)的圓)、從一個(gè)軸放射出的輻線或任何其他的構(gòu)型。通常，與少量的大點(diǎn)相比，大量的小點(diǎn)是優(yōu)選的。例如，占同樣的總表面積時(shí)，20乘20的點(diǎn)陣通常是比10乘10的點(diǎn)陣優(yōu)選的。但是以轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的總表面積是第一明膠層的表面積的約5%至約95%和/或第二明膠層的表面積的約5%至約95%為條件，點(diǎn)可具有任何尺寸。例如，取決于敷料的總尺寸，點(diǎn)在直徑、寬度或長度上可是(非限制性的)至少約0.01,0.1,0.5、l、2、3、4、5、6、7、8、9、10mm或更大的。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，4個(gè)具有2-3mm直徑的圓形點(diǎn)每個(gè)可占一平方厘米的敷料。各種其他的構(gòu)型是本發(fā)明范圍內(nèi)的并且容易被本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員所使用。
[0265]可選擇地將敷料制備為各種尺寸和形狀中的任何一種。通常敷料具有容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員處理的尺寸和形狀，通常在沿任何一面的長度上小于12〃，例如1〃xl"、1"x2〃、4〃Χ4〃等等。敷料的濕度水平通常小于8% (例如，小于7、6、5、4、3、2或1%)。
[0266]本發(fā)明中可選擇地使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種可吸收性材料中的任何一種。例如可吸收性材料可是蛋白質(zhì)物質(zhì)，諸如纖維蛋白、角蛋白、膠原蛋白和/或明膠，或者糖類物質(zhì)，諸如藻酸鹽、甲殼質(zhì)、纖維素、蛋白多糖(例如聚-N-乙酰葡萄糖胺)、乙醇酸聚合物、乳酸聚合物或乙醇酸/乳酸共聚物。例如可吸收性材料可是糖類物質(zhì)?？晌招圆牧系氖纠詫?shí)例以商品名VICRYL.TM.和DEX0N.TM被出售。
[0267]通常，止血敷料的不同層可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并可用的任何方式相互固定。例如，可選擇并優(yōu)選地，將明膠層和/或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層涂抹為一系列迅速冷凍的水性溶液層并隨后凍干或冷凍干燥(例如在每一層的涂抹之后以及在整體敷料的組裝時(shí))?？赏ㄟ^各種技術(shù)中的任何一種涂抹層，所述技術(shù)包括噴霧、移液(例如用多道移液器)、噴灑、使用障板、靜電沉積、使用微量注射點(diǎn)陣系統(tǒng)或使用具有產(chǎn)生高密度點(diǎn)陣的孔的分散多支管進(jìn)行分散。
[0268]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，當(dāng)使用模具制備敷料時(shí)，在涂抹敷料的第一層之前將脫模劑例如蔗糖涂抹至模具。這種實(shí)施方案中，止血敷料進(jìn)一步包括包含所述脫模劑的脫模層。
[0269]可選擇地，可將生理上可接受的粘合劑涂抹于隨后固定在那里的可吸收性材料和/或襯墊材料(當(dāng)存在時(shí))和明膠層和/或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層。
[0270]在敷料的一個(gè)實(shí)施方案中，生理上可接受的粘合劑具有以便在向創(chuàng)傷組織施用敷料后可將可吸收性材料和/或襯墊材料與明膠層分離的剪切強(qiáng)度和/或結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生理上可接受的粘合劑具有以便在向創(chuàng)傷組織施用敷料后不可將可吸收性材料和/或襯墊材料與明膠層分離的剪切強(qiáng)度。
[0271]每創(chuàng)傷面積的明膠濃度取決于許多因素，包括但不限于繃帶的最終結(jié)構(gòu)、所使用的材料等等。
[0272]根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方案，提供了通過可選擇并優(yōu)選地提供第一明膠層，向第一明膠層涂抹轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層，以及向轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層涂抹第二明膠層來制備止血敷料的方法，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層與第一明膠層非共同擴(kuò)張和/或與第二明膠層非共同擴(kuò)張。
[0273] 相似地，本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括通過提供具有粘合于其上的第一明膠層的可吸收性或非可吸收性襯墊層；在明膠層的與可吸收性或非可吸收性襯墊層連接的側(cè)面相反的側(cè)面上向所述第一明膠層涂抹轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層；以及向轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層涂抹第二明膠層來制備止血敷料的方法，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層與第一明膠層非共同擴(kuò)張和/或與第二明膠層非共同擴(kuò)張。
[0274]Ih血裝置
[0275]本發(fā)明的另一個(gè)示例性實(shí)施方案是關(guān)于止血裝置(例如用于在快速流血的患者的外科手術(shù)環(huán)境下止血)的，其包括:(i)多孔可吸收性或非可吸收性基質(zhì)；(ii)粉末、顆?；蚱渌腆w形式的明膠；(iii)粉末、顆?；蚱渌腆w形式的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；其中明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶包含在所述基質(zhì)中。
[0276]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是關(guān)于止血裝置(例如用于在快速流血的患者的外科手術(shù)環(huán)境下止血)的，其包括:(i)多孔可吸收性或非可吸收性基質(zhì)；(ii)明膠；(iii)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；其中 明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶粘合于所述基質(zhì)。
[0277]本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括通過已接受的密封材料施用的方法施用止血/密封材料混合物。這種方法可選擇地包括作為明膠、泡沫或噴霧的一部分的混合物的施用。使用這些方法的止血/密封材料混合物的施用可選擇地例如通過分開儲存混合物組分并在施用前即時(shí)混合它們；和/或例如可選擇地通過以無活性形式一起儲存組分和在施用前即時(shí)活化它們來完成。無活性形式的密封材料組分可選擇地被提供為冷凍溶液、需要重新構(gòu)成的凍干的粉末、需要重新構(gòu)成的噴霧干燥的粉末和/或任何其他適合的形式的無活性密封材料混合物中的一種或多種。
[0278]Ih血裝置制各
[0279]根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可選擇地將冷凍干燥和/或凍干技術(shù)應(yīng)用于將根據(jù)本發(fā)明的密封材料組分粘合或固定在任何導(dǎo)管、套管針或植入物或者實(shí)際上任何其他這種醫(yī)療裝置的表面上。這可選擇地促進(jìn)穿透創(chuàng)傷處的止血和其閉合，這可選擇地對例如動(dòng)脈導(dǎo)管/裝置來說是有用的。對于已經(jīng)用抗凝藥物治療過的和更易于發(fā)生流血并發(fā)癥的患者來說，動(dòng)脈手術(shù)后的止血是關(guān)鍵的。本發(fā)明的止血組合物是不依賴于血液凝固的，因此對避免過度流血提供了額外的幫助。
[0280]裝置、組合物或繃帶的使用
[0281]在止血敷料、裝置或劑的使用期間，可將明膠和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在敷料、裝置或顆?；旌衔锉皇┯糜趧?chuàng)傷組織時(shí)通過出血的或滲出的創(chuàng)傷漏出的患者的內(nèi)源流體(例如血液、氣、膽汁、腸液)活化?？蛇x擇地，在從創(chuàng)傷組織損失的流體不足以提供蛋白層的充分的水合的情況下，可在向創(chuàng)傷組織施用止血敷料、裝置或劑之前通過施用生理上可接受的液體(例如水、緩沖液、鹽水)(可選擇地包含任何必要的輔助因子和/或酶)而活化明膠和/或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
[0282]參考附圖和隨附說明，可更好的理解本發(fā)明的原理和操作。
[0283]現(xiàn)在參考附圖，圖1是根據(jù)本發(fā)明的示例性繃帶的示意方框圖。如所示的，繃帶100優(yōu)選地以至少一個(gè)以及優(yōu)選地多個(gè)明膠層102(僅為了示例性說明而無任何限制性意圖的目的顯為兩個(gè)這樣的層)為特征。還優(yōu)選地提供至少一個(gè)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層104 ;在這一實(shí)例中，僅為了示例性說明而無任何限制性意圖的目的，將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層104顯示為被夾在多個(gè)明膠層102之間。還顯示了適合的襯墊106，其優(yōu)選地為繃帶100提供機(jī)械強(qiáng)度?？蛇x擇地將襯墊106做成多元醇酸網(wǎng)狀物或片，例如諸如作為Dexon?或Vicryl?所提供的。[0284]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的示例性繃帶的主視圖，所述繃帶用可選擇的吸收性襯墊和可選擇的塑料封套覆蓋；
[0285]圖3是根據(jù)本發(fā)明的示例性止血裝置的示意方框圖，所述裝置包含多孔基質(zhì)。如所示的，止血裝置300優(yōu)選地以至少一個(gè)以及優(yōu)選地多個(gè)明膠層302(僅為了示例性說明而無任何限制性意圖的目的顯為兩個(gè)這樣的層)為特征。還優(yōu)選地提供至少一個(gè)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層304 ;在這一實(shí)例中，僅為了示例性說明而無任何限制性意圖的目的，將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層304顯示為被夾在多個(gè)明膠層302之間。還顯示了適合的襯墊306，其優(yōu)選地為繃帶300提供機(jī)械強(qiáng)度?？蛇x擇地將襯墊306做成任何類型的生物可分解材料。
[0286]現(xiàn)在參考下文的實(shí)施例，構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的各種組合物并測試它們減少流血和誘導(dǎo)止血的能力。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，發(fā)現(xiàn)所測試的組合物是非常強(qiáng)有力的并能夠停止流血甚至是動(dòng)脈流血。
[0287]實(shí)施例1
[0288]示例性i兌明的粘合劑的制備
[0289]這一實(shí)施例涉及根據(jù)本發(fā)明的示例性說明的、非限制性的粘合劑的制備。這一實(shí)施例使用具有100U/gm的比活性水平的不依賴鈣的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(批號L-04207，Ajinomoto USA, Chica go, IL)。并且，所測試的明膠是來自豬皮的A型明膠，300布盧姆(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)。
[0290]下列方法被用于制備示例性說明的粘合劑:制備PBS中的20%w/w的明膠(磷酸鹽緩沖鹽水；將20g明膠加入80g的PBS中)。接下來制備PBS中的20%w/v的mTG(將Img的mTG加入5mL的PBS中)。之后將5g明膠溶液和0.5mL的mTG溶液混合(換句話說，10:1的比率)。
[0291]圖4顯示不同百分比的明膠對粘合劑的粘合強(qiáng)度的影響。通過將豬皮樣品粘合至第二個(gè)這樣的樣品，在結(jié)合處上放置47.5g的重量，并且之后立即將其浸沒入水中120分鐘來測量粘合強(qiáng)度。浸沒期之后，以5mm/分鐘施加拉力以測定最大的粘合強(qiáng)度(Mcdermott等人，Biomacromolecules2004,5，1270-1279)。
[0292]如圖5中所證實(shí)的，微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的最佳反應(yīng)性水平是在50_55°C的范圍內(nèi)。在37°C的生理水平，反應(yīng)性水平僅為最佳水平的約60%。這樣，使用放熱劑升高反應(yīng)的溫度將升高反應(yīng)性水平并由此加速明膠交聯(lián)。因此，可選擇并優(yōu)選地，放熱劑是本發(fā)明的一部分。
[0293]鈣可優(yōu)選地可被用作這種劑的一部分，因?yàn)槁然}在溶解時(shí)釋放熱但不足以熱得損傷組織。并且，如前文所述的，鈣可能以不依賴于其放熱的溶解的其他方法幫助加速反應(yīng)。
[0294]可選擇地，具有一種或多種交聯(lián)因素的繃帶中可包括無毒性放熱物質(zhì)?？蛇x或另外地，如之前所描述的，在繃帶襯墊后可選擇地加入一種或多種非可吸收性放熱劑。
[0295]實(shí)施例2
[0296]體外破裂壓力試驗(yàn)
[0297]這一實(shí)施例證明了依照本發(fā)明的組合物作為其耐高壓動(dòng)脈血流的代表的耐破裂的能力。如下文所描述的，為了模擬高壓血流，開發(fā)了破裂壓力系統(tǒng)，用熱的PBS取代血液對豬皮樣品上的創(chuàng)傷施加壓力。因?yàn)樯硌獕簬缀蹩偸切∮?00mmHg，耐200mmHg的壓力2分鐘被認(rèn)為是成功標(biāo)準(zhǔn)。這些破裂試驗(yàn)結(jié)果證明根據(jù)本發(fā)明的組合物適合用于處理血流，包括高壓動(dòng)脈流。
[0298]大多數(shù)樣品(8/10)耐受200mmHg的施壓2分鐘。沒有通過的那些樣品可能與人為或系統(tǒng)誤差有關(guān)，平均破裂壓力是320±50mmHg，但這一數(shù)字是保守的，因?yàn)橛捎?54mmHg是通過實(shí)驗(yàn)室設(shè)備能夠測量的最大壓力，沒有破裂的樣品被指定為354mmHg的數(shù)值。這些結(jié)果證明根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案的粘合組合物被用于止血目的的能力，甚至是在嚴(yán)格的試驗(yàn)條件下。
[0299]材料
[0300]從Sigma-Aldrich (St.Louis，M0)獲得的明膠(來自豬的A型，布盧姆值300)。不依賴鈣的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(mTG)混合物TG-TI是從Ajinomoto獲得的并且沒有進(jìn)一步純化而被使用。制造商報(bào)道這些酶具有100U/gm的比活性。豬皮組織是從當(dāng)?shù)厥畴s店購買的。
[0301]樣品制備
[0302]在將豬皮切割成直徑約6-6.5cm的圓盤形狀之前，用稀釋的NaOH處理豬皮一小時(shí)。用外科手術(shù)刀除去皮上的脂肪。在皮切片的中心打一個(gè)2mm的孔以模仿創(chuàng)傷。將皮用大量的水和PBS緩沖液清洗，并且儲存在具有約ImL的PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中以使皮保濕直到使用。對于本文所描述的所有的實(shí)驗(yàn)，使用具有7.4的pH的Dulbecco’ s磷酸鹽緩沖鹽水作為PBS緩沖液。
[0303]每天新鮮制備于PBS緩沖液的明膠溶液(25%w/w)并在使用前于65°C儲存。制備于PBS緩沖液的mTG (20%w /w)的儲存液并分裝在2ml的小瓶中，儲存于_18°C。使用前將酶溶液于室溫解凍。
[0304]在施用粘合劑前用實(shí)驗(yàn)室組織擦拭布將皮表面擦干。在2ml小瓶中通過將Iml明膠和0.5ml的mTG混合制備粘合劑。制備了兩種不同的組合物。組合物“A”使用了來自Ajinomoto的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶,而組合物“B”使用了來自(Yiming Biological ProductsC0.(Jiangsu, China ;如上文所述的優(yōu)選的產(chǎn)品)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。將0.6ml所得的混合物(根據(jù)本發(fā)明的示例性組織粘合劑)施用在豬皮表面上，覆蓋孔。施用粘合劑后，將皮組織于37°C孵育30分鐘。孵育后立即進(jìn)行破裂試驗(yàn)。
[0305]破裂試驗(yàn)
[0306]組裝前將自制的裝置在溫緩沖液(~44°C )中平衡。迅速地將孵育的皮裝進(jìn)裝置后，將約50ml的42°C的PBS緩沖液倒入裝置，在皮組織上。手動(dòng)控制氮流以增加壓力。破裂試驗(yàn)的整個(gè)程序如下:
[0307]步驟1-將壓力增加至200mmHg并保持2分鐘；
[0308]步驟2-將壓力增加至300mmHg并保持2分鐘；
[0309]步驟3-將壓力增加至>354mmHg (可測量的最大壓力)。
[0310]作為對照，純的明膠溶液被施用在皮上并被允許在室溫下通過形成物理凝膠而膠凝(即定型)30分鐘。明膠-溫的是指能溶解物理明膠凝膠的42°C緩沖溶液的使用。
[0311]結(jié)果
[0312]圖6顯示基于組合物A的組織粘合劑的代表性的破裂壓力測量。圖6中顯示了樣品M和#5的數(shù)據(jù)。表2中給出了組合物A的破裂試驗(yàn)結(jié)果的概要，而表3中顯示樣品的完整列表。
[0313]表2.化合物A的破裂試驗(yàn)結(jié)果的概要
【權(quán)利要求】
1.一種止血的或密封的敷料，包括:轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和明膠，所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與所述明膠是分離的直到所述敷料的活性需要或期望所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與所述明膠的相互作用；以及至少一種非可吸收性襯墊或可吸收性材料層。
2.如權(quán)利要求1所述的敷料，其中所述明膠存在于至少第一明膠層；且其中所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶存在于與所述第一明膠層相鄰的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層；其中所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層與所述第一明膠層共同擴(kuò)張或非共同擴(kuò)張。
3.如權(quán)利要求2所述的敷料，還包括與所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層相鄰的第二明膠層，其中所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層與所述第二明膠層共同擴(kuò)張或非共同擴(kuò)張。
4.如權(quán)利要求2所述的敷料，還包括在所述第一明膠層之前的可吸收性或非可吸收性材料層。
5.如權(quán)利要求2-4所述的止血的或密封的敷料，還包括襯墊且其中所述襯墊和所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層、所述明膠層和任選地所述可吸收性或非可吸收性材料層一起形成繃帶。
6.如權(quán)利要求2-4所述的止血的或密封的敷料，還包括硅酮襯墊或塑料襯墊且其中所述襯墊和所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層、所述明膠層和任選地所述可吸收性或非可吸收性材料層一起形成片。
7.如權(quán)利要求5或6所述的止血的或密封的敷料，還包括釋放層以便從所述襯墊釋放所述敷料。
8.如權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的止血的或密封的敷料，其中所述可吸收性材料選自由纖維蛋白、角蛋白、膠原蛋白、明膠、藻酸鹽、甲殼質(zhì)、纖維素、蛋白多糖、乙醇酸聚合物、乳酸聚合物或乙醇酸/乳酸共聚物組成的組。
9.如權(quán)利要求2至8任一項(xiàng)所述的止血的或密封的敷料，其中所述明膠層或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層的一種或多種是干燥的且任選地在所述敷料組裝之前凍干。
10.如權(quán)利要求2至9任一項(xiàng)所述的止血的或密封的敷料，其中所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層和所述明膠層是密封的以便阻止轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或明膠擴(kuò)散到所述敷料的外面。
11.如權(quán)利要求2至10任一項(xiàng)所述的止血的或密封的敷料，其中所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶層排列成單一的點(diǎn)、點(diǎn)陣、單條線或多條線。
12.如權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的止血的或密封的敷料，還包括合適的填料、結(jié)合劑、發(fā)泡劑或穩(wěn)定劑中的一種或多種。
13.如權(quán)利要求12所述的止血的或密封的敷料，其中所述填料包括麥芽糖糊精、水解的脫脂乳蛋白、另外的蛋白物質(zhì)、氯化鈉、紅花油、磷酸三鈉、酪蛋白酸鈉或乳糖或者其組合中的至少一種。
14.如權(quán)利要求1所述的止血的或密封的敷料，還包括可吸收性或非可吸收性基質(zhì)；其中所述明膠和所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶包含于所述基質(zhì)中或粘合于所述基質(zhì)。
15.如權(quán)利要求14所述的止血的或密封的敷料，其中所述基質(zhì)是多孔的或非多孔的。
【文檔編號】A61L24/10GK103933606SQ201410081747
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2007年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2006年12月15日
【發(fā)明者】奧萊恩·普里斯-布魯姆, 艾沙伊·艾塔, 納塔利·伊萊姆 申請人:生命連結(jié)有限公司