增強針對艾美球蟲屬的免疫反應的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及增強針對艾美球蟲屬的免疫反應的組合物和方法。提供了包含TRAP多肽的疫苗以及包含TRAP多肽的腸炎沙門氏菌載體。疫苗還可以包含能與CD40結合的CD154多肽。本發(fā)明還提供了增強針對頂復門寄生蟲的免疫反應的方法及降低與頂復門寄生蟲感染相關的發(fā)病率的方法。
【專利說明】增強針對艾美球蟲屬的免疫反應的組合物和方法
[0001]本申請是申請?zhí)枮?00880116875.0，申請日為2008年11月3日，發(fā)明名稱為“增強針對艾美球蟲屬的免疫反應的組合物和方法”的中國專利申請的分案申請。
[0002]相關申請的交叉參考
[0003]本申請要求于2007年11月I日提交的美國臨時申請系列號60/984，612的優(yōu)先權，該臨時專利的全部內容在此通過引用并入本文。
[0004]關于聯邦資助研究的聲明
[0005]無。
【技術領域】
[0006]本發(fā)明涉及增強針對艾美球蟲屬的免疫反應的組合物和方法?！颈尘凹夹g】
[0007]球蟲病導致世界范圍的問題，其為由頂復門(Apicomplexan)原生動物寄生蟲艾美球蟲屬(Eimeria)引起的家禽、豬和牛的傳染病。就其對家禽工業(yè)的經濟影響而言，球蟲病位于家禽的前十大傳染病之內。頂復門家族的其它成員也引起疾病，包括瘧原蟲屬(Plasmodium)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)和弓形體屬(Toxoplasma),它們分別是痕疾、隱孢子蟲病和弓形體病的致病體。目前可用的抗艾美球蟲屬的疫苗以可控的低劑量的艾美球蟲屬寄生蟲為基礎，該寄生蟲實質上是完整毒力但對藥物敏感。用目前的基于艾美球蟲屬的疫苗接種產生大量的疫苗反應發(fā)病率并引起接種畜群的經濟損失。因此，需要有效的低毒力的抗艾美球蟲屬的疫苗。對艾美球蟲屬有效的疫苗也可能被證明作為抗其它的頂復門寄生蟲的疫苗是有用的。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明公開了包含編碼TRAP多肽或其免疫原性片段的第一多核苷酸序列的疫苗。TRAP多肽可以包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3，或其免疫原性片段。疫苗可選地還包括編碼能與⑶40結合⑶154多肽的第二多核苷酸序列。⑶154多肽包括50個以下的氨基酸，并包含140-149位氨基酸或其同源物。
[0009]根據本發(fā)明所述的疫苗可包含于載體內，例如病毒、細菌或脂質體。在一個方面，本發(fā)明提供了包含腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)的疫苗,該腸炎沙門氏菌包含編碼TRAP多肽的第一多核苷酸序列。
[0010]在另一方面，本發(fā)明包括通過施用本發(fā)明所述的疫苗增強受試者中針對頂復門寄生蟲的免疫反應的方法。
[0011]在又一方面，本發(fā)明包括通過施用本發(fā)明所述的疫苗降低受試者中與頂復門寄生蟲感染相關的發(fā)病率的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】[0012]圖1描述了在腸炎沙門氏菌中進行定點突變的方案。
[0013]圖2A至圖2B描述了重疊延伸PCR方法的設計方案，其用于產生插入至IamB多核苷酸的環(huán)區(qū)9中的TRAP和TRAP-CD154插入物。
[0014]圖3為柱形圖，其顯示以表達所示的艾美球蟲屬TRAP序列的沙門氏菌載體接種后，巨型艾美球菌(Eimeria maxima)感染后5天的死亡百分率。經過IO4/禽形成孢子的巨型艾美球菌卵囊刺激21日齡的Broiler雞在刺激之后5天的死亡率。在本實驗中，孵化日的雞不進行接種(對照)或者以沙門氏菌載體(表達來自巨型艾美球菌TRAP蛋白序列1、2、3，如附錄中描述)進行接種。在第21天以完全相同劑量的巨型艾美球菌刺激所有的雞。尸檢表明所有的死亡均與巨型艾美球菌感染相關。用表達序列2的載體進行接種的小組中死亡率明顯且顯著降低。
【具體實施方式】
[0015]重組DNA技術能使對許多細菌及病毒物種的操作相對容易。一些細菌及病毒有輕微的致病性或無致病性，卻能夠產生強烈的免疫反應。這些細菌及病毒是誘導針對抗原的免疫反應的有吸引力的疫苗。細菌或病毒疫苗能夠模擬自然感染并產生強烈的和持久的粘膜免疫性。生產和施用疫苗通常相對廉價。此外，這樣的載體經常能攜帶一個以上的抗原，而且可以提供針對多種傳染性試劑的保護。
[0016]在一個方面，本發(fā)明提供了包含編碼TRAP多肽或其免疫原性片段的第一多核苷酸序列的疫苗。TRAP多肽可包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 11的免疫原性片段。疫苗包括任何包含編碼能夠誘導對多肽的免疫反應的抗原性多肽的多核苷酸的組合物。在另一方面，本發(fā)明公開了載體(例如細菌載體)的用途，用于接種和產生針對艾美球蟲屬或其它頂復門寄生蟲如瘧原蟲屬(瘧疾的致病體)、弓形體屬和隱孢子蟲屬的免疫反應。沙門氏菌菌株是適當的載體，因為可以使細菌基因發(fā)生突變或使其毒性減弱以產生對被感染或免疫的受試者有低致病性或沒有致病性但同時保持免疫原性的細菌。
[0017]已經證明來自巨型艾美球菌(EmTFP250)的高分子量、無性階段抗原為母體抗體的靶標，所述母源抗體通過飼養(yǎng)被該原生動物寄生蟲感染的雌雞而產生。抗原的氨基酸序列分析揭示TRAP (凝血栓蛋白相關的無名蛋白)家族的新成員，其含有16個凝血栓蛋白I型重復和31個表皮生長因子樣鈣結合結構域。EmTFP250或TRAP還包含兩個低復合親水區(qū)域，其富含谷氨酸和甘氨酸殘基，以及與寄生蟲滑行運動相關的跨膜結構域/細胞質尾部(其在頂復門微線體蛋白內高度保守)。選出數個潛在表位并在SEQ ID N0:l-3和11中列出。由于這個抗原的保守性質，通過載體表達這些表位可誘導針對多個頂復門寄生蟲的保護性免疫力。
[0018]沙門氏菌可提供有用的載體，因為它能夠在宿主的胃腸道存活并引起粘膜免疫反應。使用沙門氏菌載體的口服疫苗產生強烈的粘膜免疫反應，而且對動物和人類施用都相對容易。然而，與其毒性更強的對應體(counterpart)比較，許多目前的沙門氏菌疫苗菌株在產生強烈的保護性免疫反應方面不那么有效。強毒性菌株提供強烈的免疫反應但也可引起接種的受試者的顯著的發(fā)病率。可以用作有效的粘膜(例如口服)接種的沙門氏菌菌株可提供一種載體，其能夠容易地對受試者進行接種從而抵抗一種或多種致病體，例如頂復門寄生蟲。[0019]本發(fā)明描述了可用作載體的腸炎沙門氏菌菌株，以及使用這個菌株制成的各種重組載體。具體地，本發(fā)明提供了能表達外源TRAP多肽的腸炎沙門氏菌13A(SE13A)。此外，本發(fā)明公開了疫苗和通過施用疫苗增強受試者的免疫反應的方法，所述疫苗包含編碼TRAP多肽的TRAP多核苷酸序列和編碼能夠與CD40結合的CD154多肽或其同源物的CD154多核苷酸序列。疫苗可以用于增強針對艾美球蟲屬或另一個頂復門寄生蟲(如瘧原蟲屬、弓形體屬或隱孢子蟲屬)的免疫反應，或用于降低與頂復門寄生蟲引起的感染相關的發(fā)病率。
[0020]基于在雞體內引起粘膜定殖(colonization)和粘膜下易位的不尋常的能力(使相關抗原或表位在商業(yè)化雞體內強烈地呈遞)，選擇了沙門氏菌的野生型分離體，腸炎沙門氏菌13A (SE13A)(于2006年9月13日保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，保藏號為PTA-7871)。重要地是，該野生型沙門氏菌分離體在商業(yè)化雞體內不引起臨床可檢測的疾病或性能的喪失，表明該野生型沙門氏菌對脊椎動物的致病潛在可能性低。
[0021]可通過滅活細菌的在實驗室或生產條件之外持續(xù)復制必需的至少一個基因使SE13A分離體進一步減毒。能用作載體的減毒或變異的沙門氏菌菌株如下所述。SE13A用于產生減毒的沙門氏菌菌株以開發(fā)疫苗并產生增強的免疫反應。SE13A對家禽具有侵入性、無致病性，而且不造成可檢測的發(fā)病率。與非侵入性細菌載體相比，這些特性導致增強的免疫反應。通過使限制細菌傳播能力的基因突變而使SE13A減毒可以提高疫苗的安全性。具有aroA或htrA突變的SE13A菌株保留產生免疫反應的能力，但在宿主中的復制受到限制。因此，減毒提高了載體的安全性而未使其免疫原性下降。
[0022]可以在多種其它沙門氏菌基因中進行突變，這些基因包括但不限于cya、crp、asd、0(11:、口110?、口110(>)、011^|1?、外膜蛋白、(^111、111:^ 或其它應激相關基因、aro、pur 和 gua。如實施例中所示，發(fā)現aroA和htrA突變可以使SE13A減毒。aro基因是涉及莽草酸酯(shikimate )生物合成途徑或芳香酶 途徑的酶，而aro突變體是芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的營養(yǎng)缺陷型。htrA是編碼降解異常蛋白的細胞周質蛋白酶的應激反應基因。htrA突變體也是減毒的并表現出對過氧化氫敏感性增加。
[0023]實施例中描述的aroA和htrA突變是缺失突變，但可以以各種方式產生突變。適當地，突變?yōu)椴荒芡ㄟ^單一步驟修復的非回復突變(non-reverting mutation)。適當的突變包括缺失、反轉、插入及置換。載體可以包括一種以上突變，例如載體可以同時包含aroA及htrA突變。產生這種突變的方法是本領域熟知的。
[0024]可以將編碼TRAP多肽抗原和來自任何數目的致病生物的其它抗原的多核苷酸插入載體(例如，SE13A)中并由細菌表達。通過載體表達的這些多核苷酸使得在受試者免疫后產生抗原性多肽。可將多核苷酸插入細菌的染色體中，或在質?；蚱渌旧w外DNA上編碼。本領域技術人員將理解，存在大量方法以獲得載體(例如沙門氏菌)中多核苷酸的表達。多核苷酸可以通過本領域技術人員已知的方法與啟動子(例如，組成型啟動子、可誘導啟動子等等)可操作地連接。適當地，可將編碼TRAP抗原的多核苷酸插入被表達的細菌的多核苷酸中。適當地，細菌的多核苷酸編碼跨膜蛋白，將編碼TRAP抗原的多核苷酸插入至細菌多核苷酸序列中，以允許TRAP抗原在細菌表面表達。例如，編碼TRAP的多核苷酸可以按照處于閱讀框內的方式插入至編碼跨膜蛋白外環(huán)區(qū)的區(qū)域中的細菌多核苷酸中，從而使細菌多核苷酸序列保留在閱讀框中。參見實施例1。
[0025]或者，可將編碼TRAP抗原的第一多核苷酸插入編碼分泌多肽的多核苷酸中。本領域的技術人員將理解，編碼TRAP抗原的多核苷酸可以插入眾多的細菌多核苷酸中，以使TRAP抗原表達并呈遞至經過疫苗治療的受試者的免疫細胞。在實施例中，將編碼TRAP多肽的第一多核苷酸插入SE13A的IamB基因的環(huán)區(qū)9中。編碼TRAP抗原的多核苷酸可以可包含于單一拷貝或一個以上的拷貝中。也可產生包含插入至IamB的環(huán)區(qū)9中的多個拷貝的TRAP抗原的細菌載體?；蛘撸梢詫⒍鄠€拷貝的表位插入到細菌載體中一個以上的位置。
[0026]適當地，第一多核苷酸編碼TRAP多肽的一部分或整個TRAP多肽?？蓪⒍嗪塑账岵迦氲捷d體中。在實施例中，將3個多肽(SEQ ID N0:1-3)加入到SE13A中。適當地，插入至載體的TRAP多肽部分是免疫原性片段。免疫原性片段是能夠激發(fā)細胞或體液免疫反應的肽或多肽。適當地，TRAP的免疫原性片段可以是全長蛋白序列的6個或更多個連續(xù)的氨基酸、10個或更多個氨基酸、15個或更多個氨基酸，或者20個或更多個氨基酸。
[0027]其它適當的包含于疫苗(其具有包含于載體內的TRAP)中的表位包括但不限于，編碼其它艾美球蟲屬相關多肽的多核苷酸。本領域的技術人員將理解，多種序列可以與任何其它抗原聯合使用，而且也可以與編碼免疫刺激肽(如CD154多肽)的多肽結合使用。
[0028]如以下更詳細描述，包括載體的疫苗可包括⑶154多肽，⑶154多肽能夠與受試者內的CD40結合并刺激受試者對載體及其相關抗原產生反應。樹突狀細胞(DC)的參與對于有力的免疫反應的啟動是必需的，因為其具有激活原態(tài)T細胞的獨特的能力，引起T細胞擴增并分化為效應細胞。DC的作用(DC是機體的幾乎所有組織中發(fā)現的抗原遞呈細胞(APC))是捕獲抗原，將抗原運送到相關的淋巴組織，然后把抗原遞呈給原態(tài)T細胞。被DC激活后，T細胞擴增、分化為效應細胞、離開次級免疫器官并進入外周組織。激活的細胞毒性T細胞(CTL)能破壞感染了病毒的細胞、腫瘤細胞或者甚至是被細胞內寄生蟲(例如沙門氏菌)感染的APC，并被證明在抗病毒感染的保護中至關重要。CD40是TNF受體家族分子的成員并在多種細胞類型上表達，包括專職的抗原遞呈細胞(APC)Jf^B DC和B細胞。⑶40與其配體⑶154的相互作用是極其重要的，對于體液和細胞免疫都有刺激作用。可以通過抗⑶40抗體模擬在DC表面表達的CD40對DC的刺激。然而在體內這是通過在激活的T細胞表面表達的⑶40的天然配體(即⑶154)相互作用發(fā)生的。有趣的是，已經鑒定了⑶154的⑶40結合區(qū)。CD154的CD40結合區(qū)可以在載體(如沙門氏菌載體)的表面表達，并可導致對共遞呈的肽序列增強的免疫反應。
[0029]如上所述，可將編碼CD154多肽的多核苷酸插入載體的染色體中或保持在染色體外。⑶154多肽可以是⑶154全長蛋白的一部分或整個⑶154蛋白。適當地，⑶154多肽能夠與CD40結合。本領域技術人員將理解，可以按照處于閱讀框內的方式將這些多核苷酸插入到多種多核苷酸中并在載體的不同部分表達或被分泌。編碼能夠增強對TRAP的免疫反應的CD154多肽的多核苷酸也可以編碼TRAP抗原?？梢詫⒕幋aCD154多肽的多核苷酸與編碼TRAP抗原的多核苷酸連接起來，從而在載體中CD154多肽和TRAP抗原存在于同一多核苷酸上。在實施例中，編碼能夠與CD40結合的CD154多肽的多核苷酸也編碼TRAP抗原。參見所附序列表中SEQ ID NO: 1，2，3和11。在實施例中，將編碼TRAP抗原的多核苷酸(SEQID NO: 13-15)和編碼⑶154多肽的多核苷酸都插入IamB基因的環(huán)區(qū)9中。本領域技術人員將理解，也可以使用編碼其它跨膜蛋白和IamB基因的其它環(huán)區(qū)的細菌多核苷酸。
[0030]如上所述，疫苗中可以包括編碼能夠增強對抗原的免疫反應的CD154多肽的⑶154多核苷酸。適當地，⑶154多肽長度為50個氨基酸以下，更適當地是40個以下、30個以下或是20個以下氨基酸的長度。多肽可介于10至15個氨基酸之間、10至20個氨基酸之間或10至25個氨基酸長度之間。CD154序列和CD40結合區(qū)在各種物種間不是高度保守的。雞和人的CD154序列分別見于SEQ ID NO: 10及SEQ ID N0:4。
[0031]已經確定了一些物種的⑶154的⑶40結合區(qū)，包括人、雞、鴨、小鼠和牛，分別見于SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8 和 SEQ ID NO: 9。雖然不同物種之間的CD40結合區(qū)的序列有可變性，但人CD154多肽能夠增強雞的免疫反應。因此，人們可以使用物種特異性CD154多肽或異源CD154多肽來實施本發(fā)明。
[0032]在實施例中制備了幾種SE13A重組細菌。在每種同時含有TRAP和⑶154多核苷酸的SE13A菌株中，TRAP多肽和⑶154多肽被編碼在同一多核苷酸上，而且它們彼此處于閱讀框內并與其所插入至的沙門氏菌IamB多核苷酸處于閱讀框內。在替代的【具體實施方式】中，⑶154多肽和TRAP多肽可被不同的多核苷酸編碼。SE13A的aroA htrA TRAP包含aroA和htrA的缺失并同時編碼TRAP表位(SEQ ID NO: 1-3)和可選地插入至IamB的環(huán)區(qū)9 的 CD154 多肽(SEQ ID N0:4)。
[0033]本發(fā)明還提供了包含減毒的沙門氏菌菌株和藥學上可接受的載體的組合物。藥學上可接受的載體是任何適合體內施用的載體。藥學上可接受的適合用于組合物中載體的例子包括但不限于，水、緩沖溶液、葡萄糖溶液或細菌培養(yǎng)液。組合物的附加成份可以適當地包括，例如，賦形劑如穩(wěn)定劑、防腐劑、稀釋劑、乳化劑和滑潤劑。藥學上可接受的載體或稀釋劑的例子包括穩(wěn)定劑，如碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、右旋糖苷)、蛋白(如白蛋白或酪蛋白)、含蛋白試劑(如牛血清或脫脂乳)和緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖液)。特別是在組合物中添加這樣的穩(wěn)定劑時，該組合物適合冷凍干燥或噴霧干燥。
[0034]本發(fā)明還提供了通過施用包含TRAP多肽和能夠與⑶40結合并激活⑶40的⑶154多肽的疫苗而增強受試者免疫反應的方法。向受試者施用有效量的包括編碼能夠與CD40結合的⑶154多肽的多核苷酸的疫苗以增強受試者對疫苗的免疫反應。適當地，疫苗包含編碼包括人類⑶154多肽(SEQ ID N0:4)的140-149位氨基酸的多肽或其同源物的多核苷酸。因此，源自一個物種的140-149位氨基酸的同源物可用于刺激不同物種中的免疫反應。
[0035]在本文中鑒定出幾種合適的多肽。適當地，多核苷酸編碼來自于與受試者同一物種的⑶154多肽。適當地，將編碼SEQ ID NO:5的多肽的多核苷酸用于人類受試者，將編碼SEQ ID N0:6的多肽的多核苷酸用于雞，將編碼SEQ ID NO:7的多肽的多核苷酸用于鴨，將編碼SEQ ID N0:8的多肽的多核苷酸用于小鼠，和將編碼SEQ ID N0:9的多肽的多核苷酸用于牛。在實施例中，在雞疫苗載體中使用人類⑶154多肽(SEQ ID N0:5)，而且證明可增強對外源抗原的免疫反應。因此，CD154多肽和受試者的其它異源組合可用于本發(fā)明的方法。CD154多肽可用于增強受試者對任何外源抗原或存在于疫苗載體中的除TRAP多肽之外的抗原性多肽的免疫反應。本領域技術人員將理解，CD154多肽可用于增強對存在于疫苗中的一種以上抗原性多肽的免疫反應。
[0036]來自⑶154的多肽至少 部分通過與其受體⑶40的結合而刺激免疫反應。在實施例中使用了與CD154多肽同源的多肽，其在受試者免疫細胞上表達并且能夠與巨噬細胞和其它抗原遞呈細胞上的CD40受體結合。這個配基-受體復合物的結合刺激巨噬細胞(和巨噬細胞譜系細胞，例如樹突狀細胞)以增強吞噬作用和抗原呈遞，并同時增加已知能夠激活其它局部免疫細胞(如B淋巴細胞)的細胞因子的分泌。因此，CD154肽相關分子是免疫反應及擴大的抗體產生的優(yōu)選祀標。
[0037]本方法可用的潛在載體包括但不限于沙門氏菌屬(腸炎沙門氏菌)、志賀菌屬(Shigella)、埃希桿菌屬(Escherichia)(大腸桿菌)、耶爾森菌屬(Yersinia)、博德特氏菌屬(Bordetella)、乳球菌屬(Lactococcus)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、弧菌屬(Vibrio)(霍亂弧菌)、李斯特菌屬(Listeria)、腺病毒(adenovirus)、痕病毒(poxvirus)、抱疫病毒(herpesvirus)、甲病毒(alphavirus)及腺相關病毒。
[0038]此外，本發(fā)明公開了增強針對頂復門寄生蟲的免疫反應的方法和降低與隨后感染頂復門寄生蟲相關的發(fā)病率的方法。簡言之，該方法包括向受試者施用有效量的包含編碼TRAP多肽的第一多核苷酸序列的疫苗。TRAP多肽可以包括SEQ ID N0:l_3和11。可以以本領域的技術人員熟悉的多種方式將TRAP多肽插入載體，包括但不限于在BMCBiotechnol.2007Sept, 17:7 (I): 59 中描述的無痕定點突變系統(scarless site-directedmutation system),腸炎沙門氏菌染色體中的無痕定點誘變(Scarless and Site-directedMutagenesis)，其全部內容通過引用并入本文。也可以工程化載體使其表達TRAP多肽以及如上所述的能夠增強免疫反應的其它多肽(如SEQ ID N0:4和SEQ ID NO: 10)。特別的，載體可以表達能夠結合CD40的CD154的多肽以增強受試者對TRAP多肽的免疫反應?？蛇x地，載體是細菌，例如腸炎沙門氏菌。
[0039]將施用的疫苗的有用劑量將根據受試者的年齡、體重和物種、施用的模式及途徑、以及尋找對其產生免疫反應的病原體類型而變化?？梢砸匀魏巫阋约ぐl(fā)免疫反應的劑量施用組合物。對于細菌疫苗而言，預計IO3至IOltl個細菌、IO4至IO9個細菌、或IO5至IO7個細菌的劑量范圍是適當的。組合物可以只施用一次，或可以施用兩次或更多次以增強免疫反應。例如，組合物可以施用兩次或更多次，每次隔一周、隔兩周或隔三周或隔更多周。在施用之前使細菌適當地存活，但在一些【具體實施方式】中，在施用之前將細菌殺死。在一些【具體實施方式】中，細菌能夠在受試者體內復制，而在其它【具體實施方式】中，細菌不能在受試者體內復制。
[0040]對于向動物或人類的施用而言，可以以多種手段施用組合物，這些手段包括但不限于鼻內、粘膜、通過噴霧、皮內、非腸道、皮下、口服、通過氣霧或肌內。點眼施用或添加到飲水或食物中也是適當的。對于雞而言，可以將組合物施用到卵中。
[0041]本發(fā)明的一些【具體實施方式】提供增強受試者免疫反應的方法。適當的受試者包括但不限于脊椎動物，適當的哺乳動物、適當的人類和禽類，適當的家禽如雞。也可以使用其它的動物感染模型。增強免疫反應包括但不限于，誘導受試者的免疫系統介導的治療性或預防性效應。特別地，增強免疫反應包括但不限于抗體的產生增加、抗體重鏈的類別轉換增強、抗原呈遞細胞的成熟、輔助性T細胞的刺激、溶細胞性T細胞的刺激或T及B細胞記憶的誘導。
[0042]預計將來自相同或不同病原體的幾個表位或抗原在單一疫苗中組合施用，以產生針對多個抗原的增強的免疫反應。重組疫苗可以編碼來自多種病原體微生物、病毒或腫瘤相關抗原的抗原。施用能夠表 達多種抗原的疫苗具有同時誘導抵抗兩種或更多種疾病的免疫力的優(yōu)點。例如，活的減毒細菌(如腸炎沙門氏菌13A)為激發(fā)抵抗多種抗原的免疫反應提供了適當的載體。[0043]可以使用編碼抗原的外源多核苷酸構建細菌疫苗，可以使用本領域中廣為人知的方法將所述多核苷酸插入至細菌基因組中的任何非必需位點或可選地質粒上攜帶。一個適當的插入多核苷酸的位點是在跨膜蛋白的外部部分內或將該多核苷酸與靶向用于分泌途徑的外源多核苷酸的序列偶聯。一個用于插入多核苷酸的適當的跨膜蛋白的例子是IamB基因。在實施例中，TRAP和⑶154多核苷酸插入IamB序列的環(huán)區(qū)9中。
[0044]外源多核苷酸包括但不限于，編碼選自致病性微生物或病毒的抗原的多核苷酸，并包括以產生有效免疫反應的方式表達的多核苷酸。這樣的多核苷酸可以來自致病性病毒，如流感病毒(例如M2e、紅細胞凝集素、或神經氨酸酶)、皰疹病毒(例如編碼皰疹病毒的結構蛋白的基因)、逆轉錄病毒(例如gpl60包膜蛋白)、腺病毒、副粘液病毒、冠狀病毒等等。外源多核苷酸也可以獲自致病性細菌，例如編碼細菌蛋白(如毒素)和外膜蛋白的基因。此外，來自寄生蟲(例如其它頂復門寄生蟲)的外源多核苷酸是用于載體疫苗的理想候選物。
[0045]載體中也可以包括編碼參與激發(fā)免疫系統的多肽的多核苷酸，如活的減毒的沙門氏菌疫苗。多核苷酸可以編碼已知具有刺激效應的免疫系統分子，如白細胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素，或是另一種參與免疫調節(jié)的多核苷酸。疫苗也可包括編碼已知刺激免疫反應的肽(例如本文描述的CD154多肽)的多核苷酸。
[0046]以下實施例只是示例性的，而不是限制本發(fā)明或所附權利要求的范圍。
[0047]實施例
[0048]實施例1.TRAP和TRAP/CD154插入物的構建
[0049]菌株和培養(yǎng) 條件
[0050]除非另有說明，否則首先將所有質粒保持在T0P10大腸桿菌細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中。使用腸炎沙門氏菌13A引入突變。腸炎沙門氏菌菌株13A是從USDA/APHIS/NVSL獲得的田野分離體，并以保藏號PTA-7871保藏于ATCC。攜帶質粒pKD46的細菌在30°C生長。其它細菌在37°C生長。質粒消除在37°C實施。
[0051]將Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基用于細胞的常規(guī)生長，SOC培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)用于電穿孔之后的表型表達。在適當時，將以下抗生素添加到培養(yǎng)基中:氨比西林(Amp) 100 μ g/ml、卡那霉素(Km) 50 μ g/ml和氯霉素(Cm) 25 μ g/ml ο
[0052]質粒
[0053]以前描述過質粒pKD46、pKD13 和 pBC-1-Scel (Datsenko 和Wanner, PNAS2000, 97:6640-6645 和 Kang 等人，J Bacteriol2004, 186:4921-4930，二者通過引用全文并入本文)。質粒PKD46編碼Red重組酶酶類，其介導引入的線性DNA與染色體DNA之間的同源重組。這個質粒還包含氨比西林抗性基因而且對溫度敏感，所以其需要30°C的溫度以在細胞中維持生長。質粒pKD13用作重疊PCR反應中Km抗性(Kmlr)基因的擴增模板。質粒pBC-1-SceI(在37°C維持在細胞中)產生1-SceI酶，1-SceI酶剪切以下18個堿基對的稀有識別序列:5' -TAGGGATAACAGGGTAAT-3' (SEQ ID NO: 16)。質粒pBC-1-SceI還包含氯霉素抗性(Cnf )基因。
[0054]PCR
[0055]在表1中列出了用于PCR的所有引物。通常，PCR的反應條件如下:在總體積50 μ L中含有大約0.1 μ g純化的基因組DNA、質?；騊CR產生的DNA(Qiagen，Valencia, CA, USA)、IX 克隆的 Pfu 聚合酶緩沖液、5U Pfu 聚合酶(Stratagene La Jolla, CA, USA)、ImM dNTP(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.，Piscataway, NJ)和每個引物 1.2 μ M。使用 DNA 引擎熱循環(huán)儀(Bio-Rad，Hercules, CA, USA)在以下擴增條件下進行擴增:94°C，2分鐘；94°C持續(xù)30秒、58°C持續(xù)60秒、72°C持續(xù)90秒(每lkb)，共進行30個循環(huán)；和72°C持續(xù)10分鐘以進行最后的延伸。每個PCR產物經過凝膠純化(Qiagen，Valencia, CA, USA)，并以25 μ L的EB緩沖液洗脫以制備用于重疊延伸PCR的模板，或者以50 μ L的EB緩沖液洗脫，經乙醇沉淀，并重懸于5μ L的ddH20中，以使其通過電穿孔進入腸炎沙門氏菌中。
[0056]表1引物序列
[0057]
【權利要求】
1.一種疫苗，其包含編碼TRAP多肽的第一多核苷酸序列，其中所述TRAP多肽是SEQ IDN0:2。
2.根據權利要求1所述的疫苗，還包含: 編碼能與CD40結合的CD154多肽的第二多核苷酸序列，所述的CD154多肽具有50個以下的氨基酸并包含SEQ ID NO:4的140-149位氨基酸，或其中所述⑶154多肽選自SEQID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 中的一個。
3.根據權利要求2所述的疫苗，其中疫苗包含: 一個以上拷貝的第一多核苷酸序列， 一個以上拷貝的第二多核苷酸序列，或 二者皆有。
4.根據權利要求2所述的疫苗，其中第一多核苷酸序列與第二多核苷酸序列按照處于閱讀框內的方式連接。
5.根據權利要求1-4任一項所述的疫苗，其中第一多核苷酸包含于載體內。
6.根據權利要求5所述的疫苗，其中載體選自病毒、細菌和脂質體。
7.根據權利要求6所述的疫苗，其中載體是細菌。
8.根據權利要求7所述的疫苗，細菌在其表面上包含TRAP多肽。
9.根據權利要求7或8所述的疫苗，其中細菌選自沙門氏菌屬、桿菌屬、埃希氏菌屬和乳酸菌屬。
10.根據權利要求1-4任一項所述的疫苗，其中第一多核苷酸插入到編碼跨膜蛋白的外部部分的多核苷酸序列中。
11.根據權利要求1-4任一項所述的疫苗在制備用于增強受試者中針對艾美球蟲屬寄生蟲的免疫反應的藥物中的用途。
12.根據權利要求11所述的用途，其中疫苗通過選自口服、鼻內、或卵內的方法施用。
13.根據權利要求11所述的用途，其中增強的免疫反應包括增強的抗體反應或增強的T細胞反應。
14.根據權利要求11所述的用途，其中受試者是家禽類物種或哺乳動物的成員。
15.根據權利要求11所述的用途，其中在向受試者施用前殺死包含疫苗的載體。
16.根據權利要求11所述的用途，其中包含疫苗的載體在受試者體內不能復制。
17.根據權利要求1-4任一項所述的疫苗在制備用于降低受試者中與艾美球蟲屬寄生蟲感染相關的發(fā)病率的藥物中的用途。
18.根據權利要求 11所述的用途，其中疫苗通過腸胃外的方法施用。
【文檔編號】A61K39/012GK103893747SQ201410081760
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2008年11月3日 優(yōu)先權日:2007年11月1日
【發(fā)明者】W·博特吉, B·哈格斯, L·博格曼, Y·M·權, K·喬菜, M·考克斯, S·萊頓, S·艾-阿什拉姆, J·巴爾塔, G·特列斯 申請人:阿肯色大學評議會, 德克薩斯A&M大學體系, 圭爾夫大學