雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉，發(fā)明人從馬尾藻中制備了馬尾藻多糖可溶性粉。試驗證明，本發(fā)明馬尾藻多糖可溶性粉對人工感染雞大腸桿菌病有預(yù)防和治療作用：在易發(fā)病的時間針對性使用，可起到預(yù)防作用；在疾病發(fā)生時使用，可達到治療效果。用法用量：馬尾藻多糖可溶性粉按100～400mg/kg體重飲水給藥，1次/d，連續(xù)給藥5天。本發(fā)明可作為一種防治雞大腸桿菌病的中藥制劑，具有純天然提取、低殘留、無毒副作用、防治效果良好等優(yōu)點。
【專利說明】雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥提取物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉。
【背景技術(shù)】
[0002]禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌(E.Coli)引起禽類不同類型疾病的總稱，包括急性敗血癥、肉芽腫、囊炎、肝周炎、心包炎、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、眼球炎、關(guān)節(jié)炎、腸炎以及肺炎等，最常見的是急性敗血癥和卵黃性腹膜炎。近年來，隨著我國集約化養(yǎng)雞業(yè)的不斷發(fā)展，飼養(yǎng)密度增加，大腸桿菌病的發(fā)生呈上升趨勢，特別是雛雞的發(fā)病率和病死率均較高，常常因敗血癥而急性死亡，給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。因大腸桿菌的血清型很多，菌苗的免疫效果尚不理想，藥物防治仍然是控制該病的主要手段。目前，臨床常用抗生素和其他化學(xué)抗菌藥進行治療，但病原產(chǎn)生耐藥性日趨嚴重，藥物殘留亦帶來食品安全問題，中草藥提取物多糖因其作為純天然提取藥物，低殘留，低耐藥，無毒副作用，防治效果良好而越來越受到人們的關(guān)注，可作為未來畜禽疾病防治的一個重點研究方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種純天然提取、低殘留、低耐藥、無毒副作用、防治效果良好的雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉，按以下方法制備:將馬尾藻多糖用蒸餾水配成質(zhì)量濃度5%的溶液，置沸水浴中水浴20min ;取出冷卻后，2000r/min離心10min，收集上清液；按質(zhì)量比1:20在離心后殘渣中加入蒸餾水，繼續(xù)在沸水浴中水浴20min，冷卻，2000r/min離心10min，收集上清液；合并兩次上清液，過濾，充分溶解后使用噴霧干燥儀進行干燥，即得馬尾藻多糖可溶性粉。
`[0005]馬尾藻多糖采用水煎醇沉法制備。
[0006]水提醇沉法按以下操作進行:稱取馬尾藻粉末，加20倍蒸餾水拌勻，浸泡過夜，于60~90°C水浴加熱6~9h,提取液經(jīng)3000r/min離心10min,所得上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到1/4體積,加入3倍量體積95%乙醇,沉淀過夜,3000r/min離心10min,棄上清液，
沉淀物真空冷凍干燥即得馬尾藻多糖。
[0007]上述馬尾藻多糖可溶性粉在制備防治雞大腸桿菌病藥物方面的應(yīng)用。
[0008]針對雞大腸桿菌病缺乏安全有效藥物的問題，發(fā)明人從馬尾藻中制備了馬尾藻多糖可溶性粉。紙層析證明，其中含有吡喃多糖、木聚糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖等；紅外線光譜顯示馬尾藻多糖主要為吡喃多糖，其多糖分子結(jié)構(gòu)中存在β-2糖苷鍵，還存在a-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰。試驗證明，本發(fā)明馬尾藻多糖可溶性粉對人工感染雞大腸桿菌病有預(yù)防和治療作用:在易發(fā)病的時間針對性使用，可起到預(yù)防作用；在疾病發(fā)生時使用，可達到治療效果。用法用量:馬尾藻多糖可溶性粉按100~400mg/kg體重飲水給藥，I次/d，連續(xù)給藥5天。本發(fā)明可作為一種防治雞大腸桿菌病的中藥制劑，具有純天然提取、低殘留、無毒副作用、防治效果良好等優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0009]實施例1
[0010]〈1>制備馬尾藻多糖
[0011]稱取馬尾藻粉末，加20倍蒸餾水拌勻，浸泡過夜，于80°C水浴加熱8h，提取液經(jīng)3000r/min離心10min,所得上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到1/4體積,加入3倍量體積95%乙醇，沉淀過夜，3000r/min離心10min,棄上清液,沉淀物真空冷凍干燥即得馬尾藻多糖。
[0012]〈2>制備馬尾藻多糖可溶性粉
[0013]將步驟〈1>制得的馬尾藻多糖用蒸餾水配成質(zhì)量濃度5%的溶液，置沸水浴中水浴20min ;取出冷卻后，2000r/min離心10min，收集上清液；按質(zhì)量比1:20在離心后殘渣中加入蒸餾水，繼續(xù)在沸水浴中水浴20min，冷卻，2000r/min離心10min，收集上清液；合并兩次上清液，過濾，充分溶解后使用噴霧干燥儀進行干燥，即得馬尾藻多糖可溶性粉。
[0014]實施例2
[0015]基本同實施例1，僅步驟〈1>中于70°C水浴加熱9h。
[0016]實施例3
[0017]基本同實施例1，僅步驟〈1>中于90°C水浴加熱6h。
[0018]實施例4`[0019]基本同實施例1，僅步驟〈1>中于75 °C水浴加熱8h。
[0020]將實施例1至4所得馬尾藻多糖可溶性粉分別按100、200、300、400mg/kg體重飲水給藥，I次/d,連續(xù)給藥5天。結(jié)果:400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg組對人工感染雞大腸桿菌肉雞的保護率分別為80.0%、60%、50% ;預(yù)防高、中、低三組的存活率依次為86.7%、70.0%、56.7%，與感染對照組相比，存活率和保護率均明顯高于感染對照組的33.3%。雛雞于攻毒發(fā)病后按400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg體重的劑量,飲水給藥，I次/d,連續(xù)5天,可使病情得到控制，并逐漸趨于緩解，48h后病雞臨床癥狀基本消失，食欲逐漸恢復(fù)正常，活動增加。3個劑量的治療組對人工感染雞大腸桿菌肉雞的治愈率分別為86.7%,76.7%,66.7%，極顯著優(yōu)于感染對照組。
[0021]馬尾藻多糖可溶性粉對人工感染雞大腸桿菌肉雞的防治試驗
[0022]1.材料與方法
[0023]1.1 材料
[0024]1.1.1馬尾藻多糖可溶性粉，由廣西大學(xué)和廣西北斗星動物保健品有限公司研制(按實施例1制備)，廣西北斗星動物保健品有限公司中試生產(chǎn)，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)獸藥監(jiān)察所檢驗符合規(guī)定。主要成分:馬尾藻多糖。批號:2011011601。規(guī)格:100g/包。
[0025]1.1.2氧氟沙星可溶性粉，由河北新世紀藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準文號:獸藥字(2007)030292633 ;生產(chǎn)日期:2012年2月13日(有效期2年)，批號:12021301，規(guī)格:100g,含氧氟沙星5g/瓶。
[0026]1.1.3菌株及標準血清
[0027]雞大腸桿菌02株(CVCC251)與大腸桿菌“O”抗原定型血清，購自中國獸藥監(jiān)察所。
[0028]1.1.4其它試劑[0029]細菌微量生化反應(yīng)管，購自杭州微生物試劑有限公司。普通瓊脂、麥康凱瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。鮮血瓊脂平板，購自蘭州麥迪生物科技公司。
[0030]1.1.5試驗雞種
[0031]未經(jīng)雞大腸桿菌疫苗免疫的I日齡健康嶺南黃雛雞300羽，雌雄兼有，由蘭州華隴農(nóng)牧生態(tài)科技有限公司提供。在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所大洼山動物實驗場飼養(yǎng)觀察12d，確認雞群無任何大腸桿菌病癥狀和其它病癥后用于試驗。
[0032]1.1.6飼料及飼養(yǎng)管理
[0033]飼料為不含任何抗生素的肉用仔雞全價可溶性粉料，購自蘭州正大有限公司。實驗雞按常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食、飲水，雞舍保持通風(fēng)。
[0034]1.2 方法
[0035]1.2.1大腸桿菌02株復(fù)壯
[0036]將凍存的大腸桿菌02開啟后接種于營養(yǎng)肉湯，經(jīng)37°C培養(yǎng)20h后，取3只健康雛雞，胸肌注射肉湯培養(yǎng)物1.0ml/只。無菌采集臨床癥狀和病理變化典型的死亡雞只的肝臟和心臟血，分別接種于普通瓊脂、麥康凱瓊脂和伊紅-美蘭瓊脂上，經(jīng)37°C培養(yǎng)20h后，觀察培養(yǎng)的細菌菌落形態(tài)，對具有特征性的單個菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，最后將分離純化的大腸桿菌接種于血斜面，37°C培養(yǎng)20h后作為母菌種，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0037]1.2.2生化鑒定
[0038]將具有特征性形態(tài)和革蘭氏染色陰性的菌落接種于營養(yǎng)肉湯，進行12項生化指標的鑒定。
[0039]1.2.3凝集試驗
[0040]按照中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所大腸桿菌O抗原定型血清使用說明書制備抗原和稀釋血清進行凝集試驗操作，明顯凝集者記為陽性反應(yīng)，以菌液與0.5石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝現(xiàn)象。將鑒定正確的大腸桿菌02株接種于血斜面，37°C培養(yǎng)20h后，置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0041]1.3雞大腸桿菌感染模型的建立
[0042]1.3.1 預(yù)攻毒
[0043]調(diào)取斜面保存的大腸桿菌02株，接種于營養(yǎng)肉湯，37°C培養(yǎng)20h，菌液濃度調(diào)整為 5X108cfu/ml、lX108cfu/ml、0.2X108cfu/ml 和 0.04X 108cfu/ml4 個攻毒劑量組，每組10只雛雞，胸肌注射攻毒菌液1.0ml0攻毒6h后，雛雞開始出現(xiàn)精神不振、縮頸扎堆癥狀，12h開始有雞只死亡，具體如下:5X108cfu/ml劑量組(12h死亡3只，24h全部死亡)、
IX 108cfu/ml (12h 死亡 2 只，24h 全部死亡)、(λ 2X 108cfu/ml (12h 死亡 I 只，24h 死亡 5只，存活4只，72h全部死亡)，0.04X 108cfu/ml (24h死亡2只，存活8只，其中瀕死2只；48h存活8只，其中瀕死5只； 72h死亡3只，存活5只，其中瀕死2只)。
[0044]1.3.2最佳攻菌量確定
[0045]將0.2X108cfu/ml至0.04X 108cfu/ml之間的菌液濃度調(diào)整為5個濃度組，分別為 15X106cfu/ml、12.5 X 106cfu/ml UOX 106cfu/ml,7.5 X 106cfu/ml,5 X 106cfu/ml,每組10只雛雞，胸肌注射攻毒菌液1.0ml0攻毒12h后，雛雞開始出現(xiàn)精神不振、縮頸扎堆癥狀，100%發(fā)病，根據(jù)每組肉雞發(fā)病和死亡情況確定最佳感染量，以O(shè)~72h內(nèi)死亡率60-70%為最佳感染量，并將其作為判定標準。其次，結(jié)合生產(chǎn)實際中雞大腸桿菌的死亡率，最終選擇
5.2X106cfu/ml作為建立雞大腸桿菌感染模型的攻毒劑量。
[0046]1.4正式試驗分組及方法
[0047]試驗雞除正常接種疫苗(大腸桿菌病疫苗除外)，未用任何藥物。在試驗雞舍飼養(yǎng)至7日齡，期間剔除弱雛，選擇300羽健康供試雞隨機分為10組，每組30只，分組及處理方法見表1。
[0048]表1試驗動物分組及處理方法
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉，其特征在于按以下方法制備:將馬尾藻多糖用蒸餾水配成質(zhì)量濃度5%的溶液，置沸水浴中水浴20min ;取出冷卻后，2000r/min離心10min，收集上清液；按質(zhì)量比1:20在離心后殘渣中加入蒸餾水，繼續(xù)在沸水浴中水浴20min，冷卻，2000r/min離心10min，收集上清液；合并兩次上清液，過濾，充分溶解后使用噴霧干燥儀進行干燥，即得馬尾藻多糖可溶性粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉，其特征在于:所述馬尾藻多糖采用水煎醇沉法制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述雞用防治大腸桿菌病的馬尾藻多糖可溶性粉，其特征在于所述水提醇沉法按以下操作進行:稱取馬尾藻粉末，加20倍蒸餾水拌勻，浸泡過夜，于60~90°C水浴加熱6~9h,提取液經(jīng)3000r/min離心10min,所得上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到1/4體積,加入3倍量體積95%乙醇,沉淀過夜,3000r/min離心10min,棄上清液,沉淀物真空冷凍干燥即得馬尾藻多糖。
4.權(quán)利要求1所述馬尾`藻多糖可溶性粉在制備防治雞大腸桿菌病藥物方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K31/715GK103860477SQ201410088169
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】胡庭俊, 崔月明, 韋現(xiàn)色 申請人:廣西大學(xué)